CN209264567U - 使用荧光纳米金刚石的成像系统 - Google Patents

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Abstract

公开了使用荧光纳米金刚石的成像系统。该成像系统包括：成像台，用于安装试样；辐射源，被配置为激发荧光金刚石且被引导到试样上；荧光检测器，被配置为检测金刚石荧光且被配置为检测来自试样的荧光；以及被配置为向试样施加时变磁场的装置。

Description

使用荧光纳米金刚石的成像系统
相关申请的交叉引用
本申请要求于2015年4月9日提交的美国临时申请No.62/145,466的优先权，其全部内容出于所有目的通过引用结合于此。
关于在联邦资助的研究与开发下的发明权利的声明
本主题在美国政府的支持下而做出。美国政府享有这个主题的某些权利。这项工作经来自美国国家卫生研究院国家心肺和血液研究所(National Heart,Lung,and BloodInstitute,National Institutes of Health)的基金号 HL006087-02BBC支持。
技术领域
本实用新型涉及成像系统。
背景技术
由于重叠的发射光谱，来自自然存在的荧光生物分子和固定剂的自体荧光使得难以将有用的荧光与不需要的荧光分离。因此，自体荧光限制了组织和动物成像的能力。即使精细的光谱解混技术不能总是可靠且准确地将有用信号与背景荧光分离。
实用新型内容
本实用新型的一个方面提供了一种成像方法，包括：a)获取用荧光纳米金刚石浸渍(impregnate)的感兴趣的对象的第一荧光图像；(b)向荧光纳米金刚石施加磁场以便减少荧光纳米金刚石的荧光；(c)获取感兴趣的对象的第二荧光图像；以及(d)从第一荧光图像减去第二荧光图像以产生所得的图像。
这个方面可以具有各种实施例。感兴趣的对象可以是生物目标。生物目标可以选自包括细胞、多个细胞、组织、器官和生物体的组。
磁场可由永磁体生成。磁场可以由电磁体生成。
可以在施加磁场期间获取第二荧光图像。
步骤(d)可以基于逐个像素进行。
该方法还可以包括多次重复步骤(a)-(d)并对所得的图像进行平均的附加步骤(e)。该多次可以大于10次。
步骤(a)和(c)可以包括将吸收波长施加到感兴趣的对象。本实用新型的另一方面提供了一种包含可由处理器执行的程序指令的非瞬态计算机可读介质。该计算机可读介质包括：a)获取用荧光纳米金刚石浸渍的感兴趣的对象的第一荧光图像的程序指令；(b)向荧光纳米金刚石施加磁场以便减少荧光纳米金刚石的荧光的程序指令；(c)获取感兴趣的对象的第二荧光图像的程序指令；以及(d)从第一荧光图像减去第二荧光图像以产生所得的图像的程序指令。
这个方面可以具有各种实施例。可以在施加磁场期间获取第二荧光图像。
本实用新型的另一个方面提供了一种成像方法，包括：(a)将时变磁场施加到用荧光纳米金刚石浸渍的感兴趣的对象以调制荧光纳米金刚石的荧光；(b)获取感兴趣的对象的多个荧光图像；以及(c)对于该多个荧光图像中的每个对应像素，使用锁定(lock-in)技术计算荧光强度。
这个方面可以具有各种实施例。该感兴趣的对象可以是生物目标。该生物目标可以选自包括细胞、多个细胞、组织、器官和生物体的组。
磁场可由永磁体生成。磁场可以由电磁体生成。
步骤(b)可以包括将吸收波长施加到感兴趣的对象。该多个荧光图像可以通过宽场(wide-field)照相机获得。该多个荧光图像可以通过共焦显微镜获得。
本实用新型的另一方面提供了一种包含可由处理器执行的程序指令的非瞬态计算机可读介质。该计算机可读介质包括：(a)将时变磁场施加到用荧光纳米金刚石浸渍的感兴趣的对象以调制荧光纳米金刚石的荧光的程序指令；(b)获取感兴趣的对象的多个荧光图像的程序指令；以及(c) 对于该多个荧光图像中的每个对应像素，使用锁定技术计算荧光强度的程序指令。
本实用新型的另一个方面提供了一种成像方法，包括：(a)将吸收波长施加到用荧光纳米金刚石浸渍的感兴趣的对象；以及(b)在至少约6纳秒的延迟之后，获取感兴趣的对象的荧光图像。
这个方面可以具有各种实施例。该感兴趣的对象可以是生物目标。生物目标可以选自包括细胞、多个细胞、组织、器官和生物体的组。
该延迟可以大于约10纳秒。该延迟可以大于约10纳秒和约20纳秒之间。
吸收波长可以由脉冲激光器生成。该吸收波长可以在约450nm和约 650nm之间或在约900nm和约1300nm之间。该吸收波长可以在约450nm 和约650nm之间或在约850nm和约1350nm之间。
本实用新型的另一个方面提供了一种成像方法，包括：(a)将吸收波长施加到用荧光纳米金刚石浸渍的感兴趣的对象；以及(b)在至少约4纳秒的延迟之后，获取感兴趣的对象的荧光图像。
这个方面可以具有各种实施例。该感兴趣的对象可以是生物目标。生物目标可以选自包括细胞、多个细胞、组织、器官和生物体的组。
该延迟可以大于约10纳秒。该延迟可以大于约10纳秒和约20纳秒之间。
该吸收波长可以由脉冲激光器生成。该吸收波长可以在约450nm和约 650nm之间或在约900nm和约1300nm之间。
该吸收波长可以在约450nm和约650nm之间或在约850nm和约 1350nm之间。
本实用新型的另一方面提供了一种包含可由处理器执行的程序指令的非瞬态计算机可读介质。该计算机可读介质包括：(a)将吸收波长施加到用荧光纳米金刚石浸渍的感兴趣的对象的程序指令；以及(b)在至少约 6纳秒的延迟之后获取感兴趣的对象的荧光图像的程序指令。
在某些方面，公开了成像系统，包括：用于安装试样的成像台；辐射源，该辐射源被配置为激发荧光纳米金刚石的三重激发态且被引导到试样上；荧光检测器，该荧光检测器被配置为检测三重态-三重态(triplet-triplet) 的荧光纳米金刚石荧光且被配置为检测来自试样的荧光；以及被配置为向试样施加时变磁场的装置。
附图说明
为了更全面地了解本实用新型的性质和所期望的目标，参考以下结合附图的具体描述，在附图中相同的附图标记在以下视图中表示相对应的部分。
图1描绘了金刚石氮-空位中心的吸收(激发)光谱和发射光谱。
图2描绘了根据本主题的实施例的成像方法。
图3描绘了根据本主题的实施例的从第一荧光图像逐像素减去第二荧光图像的示例。
图4描绘了根据本主题的另一实施例的成像方法。
图5描绘了根据本主题的另一实施例的成像方法。
图6描绘了根据本主题的实施例的成像方法。
图7A描绘了带负电荷的氮空位(NV)中心的能级图。图7B描绘了含有FND的视场。图7C描绘了在施加具有0.1Hz频率和100高斯振幅的调制磁场时的图7A所描绘的FND的强度调制。
图8A是在载玻片表面上的FND的扫描共焦图像。图8B是在添加～1μΜ ALEXA647染料(其具有与FND的发射光谱可比较的发射光谱) 之后的在相同视场的相同成像条件下拍摄的扫描共焦图像。来自高浓度的 ALEXA647染料的荧光使FND的荧光完全模糊。图8C是在处理存在有高ALEXA647染料背景(如图8B中)的图像之后的相同视场的无背景的图像。计算在具有和没有磁场情况下收集的图像对之间的差别，并将这些差别图像中的1000个图像在一起求平均以生成经处理的图像。经过这种处理，图8A所示的金刚石的图像从具有像图8B的高背景的图像中被恢复。
图9A是通过扫描共焦显微镜拍摄的影片的帧。图9B示出了在使用锁定算法逐像素地处理影片之后的宽场无背景图像。图9C描绘了向对应于FND的亮像素(从图9A中的图像的左上角的水平坐标,x＝109以及垂直坐标,y＝111)的锁定算法的应用。图9D示出了应用于对应于背景的暗像素 (从图9A中的图像的左上角的水平坐标，x＝137以及垂直坐标，y＝107) 的相同的锁定算法。
图10A描绘了在注射FND之后使用常规光谱解混合技术获得的老鼠前肢的荧光图像。该图像是背景通道(左上)与FND通道(右上)的覆盖图 (overlay)。FND的注射部位在复合物中可见，但淋巴结无法被区分。图 10B示出了用成对图像减法技术成像的相同的老鼠。该淋巴结在经处理的图像(右上)中是清晰可见的，该经处理的图像是通过在磁场开启和关闭的情况下荧光图像(左上)的成对减法产生的。图10C描绘了用宽场锁定技术获得的与图10B相同的图像。图10D描绘了用成对减法无背景检测获得的打开的老鼠胸腔的图像。该淋巴结和初始注射点(白色箭头)是清晰可见的。图10B描绘了用宽场锁定无背景检测获得的与图10D相同的图像。图10F描绘了存在FND(1和3)和两个背景斑点(2和4)的图像中的点的作为时间的函数的强度。四个点的位置在图10B和图10D中的图像上指示。
图11A是在不施加磁场的情况下使用二氧化硅涂覆的FND注射的淋巴结(LN)的图像。图11B是在施加～100高斯的磁场期间的相同视场的图像。图11C示出了从图11A的20个图11B的减法图像的总和。在原本暗的场中，FND被观察为亮斑点。图11D和11E分别描绘了当磁场始终为关和开时的20个这种减法的总和。
图12A是在图11A至图11E中使用的相同LN的不同区域的双光子 FLIM图像。较长寿命(由红色指示)被认为是由于FND，它的报告的寿命范围为～10-20ns。图12B是通过相减在没有和有磁场情况下的图像并且添加10个这样的减法所获得的相同视场的无背景图像。
图13示出了根据某些实施例的包括交变磁场装置和全内反射荧光显微镜的成像系统。
图14是示出了调制磁场荧光成像装置的一般部件的示意图。
图15示出了根据某些实施例的用于施加调制磁场的各种配置。
图16是示出根据某些实施例的小型动物成像仪器的元件的示意图。
图17是示出根据某些实施例的修改用于磁场调制的小型动物成像仪器的元件的示意图。图18是示出根据某些实施例的用于磁场调制的小型动物成像仪器的元件的示意图。
图19示出了根据某些实施例的调制磁场荧光成像装置。
图20示出了根据某些实施例的调制磁场荧光成像装置。
图21示出了根据某些实施例的调制磁场荧光成像装置。
图22是示出根据某些实施例的手持式调制磁场荧光成像装置的元件的示意图。
定义
参考以下定义最清楚地理解本主题：
如本文中所使用的，单数形式“一(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数指代物，除非上下文明确地另作规定。
除非具体声明或从上下文中显而易见，如本文所用的，术语“约(about)”理解为在本领域的正常公差范围内，例如在平均值的2个标准偏差内。“约”可以理解为在所声明的值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、 2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％内。除非从上下文中另外清楚说明，否则本文中提供的所有数值均由术语“约”修饰。
如本文所使用的，术语“无背景图像”是指具有足够高的信噪比(SNR) 的图像，使得荧光纳米金刚石的荧光可以从诸如内源性蛋白质之类的背景元素的荧光中被区分开。合适的SNR包括大于约1:1、约1.5:1、约2:1、约 3:1、约4:1、约5:1、约6:1、约7:1、约8:1、约9:1和约10:1的那些SNR。
如本文所使用的，术语“包括(comprises)”、“包括(comprising)”、“含有(containing)”、“具有(having)”等可以具有美国专利法赋予他们的意思且可以意味着“包括(includes)”、“包括(including)”等。
如本文所用，术语“荧光图像”是指表示一个或多个荧光发射的图像。例如，荧光发射可以在约625nm和约825nm之间。通常，通过将吸收波长施加于感兴趣的对象并且同时地或在延迟之后捕捉荧光发射的图像而获得荧光图像。可以使用包括荧光显微镜的各种设备获得荧光图像。在一些实施例中，荧光图像可以是由多个像素组成的二维图像，每个像素可以是在特定位置处的荧光强度的数值表示。
如本文所用，术语“荧光纳米金刚石”(简写为“FND”)是指当暴露于适当的吸收(激发)光谱时显示荧光的纳米金刚石。这种荧光可以由氮-空位(NV)中心的存在而引起，其中氮原子位于纳米金刚石中的空位旁边。在图1中描绘了具有约100nm的直径的二氧化硅涂覆的FND的吸收 (激发)光谱和发射光谱。吸收(激发)光谱通常位于约450nm与约600nm 之间，其中激发峰在约565nm处。(FND也可以通过在约900nm和约1300nm 之间的波长区域中的双光子过程来激发。)发射光谱通常位于约625nm与约750nm之间，其中发射峰在约700nm处。(在本文所述的工作示例中，在575nm处激发样品且使用PTI荧光计来获得激发光谱。)
如本文所用，术语“纳米金刚石”是指具有小于约100um的最大尺寸的金刚石。例如，纳米金刚石的最大尺寸可以小于：约100nm、约90nm、约80nm、约70nm、约60nm、约50nm、约40nm、约30nm、约20nm、约 20nm、约10nm等。
如本文所用，术语“感兴趣的对象”是指期望荧光图像的任何对象。感兴趣的对象可以是生物目标，例如，活体或生物样品。感兴趣的对象可以是生物体、一个或多个器官、一个或多个组织和/或一个或多个细胞。虽然本文所述的示例主要涉及生物成像，但是可以使用本文所述的FND和方法来增加可以将调制磁场施加到样品的任何成像应用中的信噪比。例如，本文描述的FND和方法可以用于在高背景环境中成像和研究流动或形态。
除非明确声明或从上下文中显而易见，否则本文所用的术语“或”被理解为包容性的。
“特异性结合”是指识别和结合到目标(例如，多肽、细胞、表面抗原等)，但其没有实质性地识别和结合样品(例如，生物样品)中的其它分子。
本文所用的术语“受试者(subject)”是指适合于通过本文所述的方法被成像的任何生物体。这些生物体包括但不限于人、狗、猫、马、牛、绵羊、山羊、老鼠、大鼠、豚鼠、猴、禽鸟、爬行动物、细菌、真菌、病毒等。
本文所用的术语“组织”是指受试者的身体。组织的非限制性示例包括来自诸如脑、心、肺、肝、胃、胰腺、结肠、直肠、肠、血管、动脉等之类的器官的组织。
本文所提供的范围被理解为在该范围内的所有值的速记。例如，1至 50的范围被理解为包括从包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、 29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、 45、46、47、48、49或50(以及其分数，除非上下文清楚地另有说明)的组中的任何的数字、数字的组合或子范围。
具体实施方式
纳米金刚石中的氮空位中心是不光漂白或闪烁的独特的荧光源。值得注意的是，这些荧光纳米金刚石的荧光强度可以通过中等强度(～0.01T) 的磁场来调制。此外，纳米金刚石的荧光寿命(～10-20ns)比促成自体荧光的大多数荧光团的寿命(<5-6ns)长。纳米金刚石的这些性质都可用于实现无背景成像。利用所施加的磁场调制荧光强度是荧光纳米金刚石的独特特征，其与它们的其他特征相结合能够实现许多新颖的成像应用。无背景成像是这些应用中的一个应用。
该发现允许在组织样品和活体中的荧光纳米金刚石的无背景成像，其中由于背景荧光，传统的成像是困难的。我们提出了通过利用荧光纳米金刚石的性质来减少或消除背景荧光的几种技术。具体地，荧光强度的磁场调制提供了在各种成像模式(即荧光显微镜、共焦荧光显微镜和宽场荧光动物成像)中获得无背景成像的一种简单、稳健且易于适应的方法。
在本主题的一个实施例中，从在其他相同条件下收集的在没有磁场情况下的图像中减去有磁场情况下获取的图像消除了恒定的背景荧光，同时突出了在一个图像中特别地减少的金刚石荧光。
在另一个实施例中，当获取图像时，场被正弦地调制。然后可以通过对基于照相机的成像的后处理或通过基于共焦的成像中的锁定技术来实现经调制强度的相敏检测。这个技术可以适用于宽场和共焦成像系统。
重要的是，这种技术利用传统的连续波照明。
又一个实施例利用荧光纳米金刚石的长激发态寿命来抑制较短寿命的背景荧光。这种技术依赖于脉冲激光和时间门控(time-gated)或寿命成像。荧光纳米金刚石可以用双光子方法成像，促进这些基于寿命的背景抑制技术。
现在参考图2，提供了成像方法200。
在步骤S202中，获取用荧光纳米金刚石浸渍的感兴趣的对象的第一荧光图像。可以使用如本文所述的常规荧光成像设备获取荧光图像。
在步骤S204中，向荧光纳米金刚石施加磁场以便降低荧光纳米金刚石的荧光。可以例如用永磁体或电磁体来施加该磁场。该磁场调制荧光纳米金刚石的荧光强度，使得荧光纳米金刚石的荧光强度小于第一荧光图像中的荧光强度。
在步骤S206中，获取感兴趣的对象的第二荧光图像。
优选地，除了由于施加磁场而导致的降低的荧光纳米金刚石的荧光强度以外，第二荧光图像具有与第一荧光图像相同的参数。第二荧光图像是在施加磁场时获取的。
在步骤S208中，从第一荧光图像减去第二荧光图像以产生所得的图像。可以基于逐个像素来进行减法。例如，如图3中概念地所示，可以从第一 10×10像素荧光图像减去第二10×10像素荧光图像，以产生所得的图像。因为第一荧光图像和第二荧光图像之间的唯一区别是荧光纳米金刚石的调制，所以背景荧光(例如，来自内源性蛋白质)将通过减法抵消以产生无背景的荧光图像。
可以手动执行或可以自动执行逐个像素的减法。各种可商购的计算机程序(包括例如可从马萨诸塞州内蒂克市(Natick)的MathWorks公司获得的软件以及在http://rsb.web.nih.gov/ij/从美国国家卫生研究院 (National Institutes ofHealth)获得的IMAGEJ软件)可以执行图像减法。
在步骤S210中，重复步骤S202至S208多次(例如，大于10次)，并且基于逐个像素地对所得的图像求平均以提高成像质量。
现在参考图4，提供了另一成像方法400。
在步骤S402中，对用荧光纳米金刚石浸渍的感兴趣的对象施加时变磁场，以调制荧光纳米金刚石的荧光。时变磁场可以周期性地变化。例如，磁场的大小可以正弦变化。可以通过调制施加到电磁体的电流或通过调制磁体(永磁体或电磁体)与感兴趣的对象之间的距离来改变磁场。
在步骤S404中，获取感兴趣的对象的多个荧光图像。优选地，在周期内的多个点处获取该多个荧光图像。采样可以以规则的或不规则的间隔发生，且可以但不需要与相位修改的磁场的频率匹配。可以使用诸如共焦显微镜之类的点成像器逐像素地获取该多个荧光图像或使用宽场成像器每次多像素地获取该多个荧光图像。
在步骤S406中，使用锁定技术来计算每个像素的荧光强度。锁定技术将该多个荧光图像的每个像素中的荧光强度乘以每个相应荧光图像当时的磁场幅度，然后计算适当地被过滤或被处理的所得积的强度。所有背景荧光将不会在相位上随所有图像上的磁场调制波动，并且因此将平均为零。荧光纳米金刚石的荧光强度将在相位上随磁强度而变化，且因此平均为磁强度的一半幅度。
锁定技术在诸如Richard Burdett的Handbook of Measuring System Design(2005)中的"Amplitude Modulated Signals-The Lock-in Amplifier"以及在 http://www.thinksrs.com/downloads/PDFs/ApplicationNotes/AboutLIAs.pdf获得的斯坦福研究系统公司(Stanford Research Systems,Inc.)的"About Lock-In Amplifiers:Application Note#3"之类的出版物中被描述。
一般来说，从点检测器获得的单像素输入可以由可从诸如加利福尼亚州桑尼维尔市(Sunnyvale)的斯坦福研究系统公司(Stanford Research Systems,Inc.)之类的供应商获得的常规锁定放大器直接处理，而可以使用诸如之类的软件编写算法以单步调试一系列荧光图像中的每组对应像素，并执行锁定技术以产生所得的无背景图像。
如果逐像素地获取荧光图像，则可以在获取另一像素之前对该特定像素应用锁定技术。如果使用宽场成像器获取图像，则可以在获取所有图像之后基于逐个像素地应用锁定技术。
现在参考图5，提供了另一成像方法500。
在步骤S502中，将吸收波长(例如，5ns或以下的短脉冲)应用到用荧光纳米金刚石浸渍的感兴趣的对象。这种吸收波长将激发FND，但也可以激发诸如内源性蛋白质之类的各种背景元素。
在步骤S504中，在至少约6纳秒的延迟之后，获取感兴趣的对象的荧光图像。在6纳秒之后，大多数(如果不是全部)的背景荧光将已消散，而FND继续发射光子。因此，无需上述图像处理算法即可获取无背景图像。
现在参考图6，本文描述的方法可以在硬件和/或软件中实施。例如，图6描绘了包括诸如荧光显微镜之类的荧光成像设备602和计算机604的系统600。荧光成像装置602可以包括激发光源、图像传感器(例如，包括电荷耦合设备(CCD)、互补金属氧化物半导体(CMOS)芯片、光电倍增管(PMT)或雪崩光电二极管(APD))、一个或多个透镜，以及适于阻挡不期望的波长的滤光器。计算机604可以是专用计算机或通用计算机，可以通过诸如并行或串行端口、通用串行总线(USB)、USB 2.0、火线、以太网、千兆以太网等的通信标准与荧光成像设备602通信地耦合。
如本领域技术人员所理解的，计算机604可以包括诸如显示设备、处理器和/或存储设备之类的各种部件。
显示设备可以是能够显示图形和/或文本的任何设备。显示装置的示例包括阴极射线管(CRT)、等离子体显示器、液晶显示器(LCD)、有机发光二极管显示器(OLEO)、发光二极管(LED)显示器、电致发光显示器(ELD)、表面传导电子发射显示器(SED)、场发射显示器(FED)、纳米发射显示器(NED)、电泳显示器、双色球显示器(bichromal ball display)、干涉式调制器显示器、双稳态向列液晶显示器等。
处理器是能够执行存储为硬件和/或软件的指令的电子设备(也称为中央处理单元或微处理器)。合适的处理器可从诸如加利福尼亚州圣克拉拉市(Santa Clara)的英特尔公司或加利福尼亚州桑尼维尔市的Advanced Micro Devices(AMD)公司之类的制造商获得。
存储设备可以包括诸如磁性介质(例如，磁带、磁盘)、光学介质(例如，CD-ROM、CD-R、CD-RW、DVD、HD DVD、(BLU-RAY )、激光盘(Laserdisk))、穿孔卡等之类的永久存储设备。存储设备还可以包括被称为存储器(例如，随机存取存储器)的临时存储设备。
在一些实施例中，运动校正被应用来补偿照相机和/或受试者中的运动。例如，运动校正可以被应用于图像的时间序列以在子像素级别下校正平面内运动。
在一个实施例中，使用光学流方法在每个图像和共同参考图像之间成对地计算非刚性变形图，其迭代地使不同分辨率下的局部互相关图像子集最大化。初始时间帧可以被选择为在外部场开(ON)和关(OFF)情况下所获取的两个图像序列的共同参考，使得ON和OFF图像被共同注册。可以使用基于子像素样条(spline)的内插法来应用非刚性变形以使空间分辨率的损失最小化。在运动校正之后，可以对图像的时间序列进行平均以减少由于噪声引起的随机波动，由此创建对于ON和OFF的平均图像。ON 和OFF运动校正的平均值之间的差异图像可以用于通过背景组织的减法来分析探测信号的对比度。然后，可以将来自纳米金刚石的此信号覆盖在起始图像上。
如本文所述，本实用新型涉及使用荧光纳米金刚石以对感兴趣的对象进行成像。适用于本实用新型中使用的荧光纳米金刚石和制备这种荧光分子的方法是本领域公知的。参见，例如：Nanodiamonds:Applications in Biology and Nanoscale Medicine(D.Ho编写,Springer 2009)；Molecular Imaging(R.Weissleder等编写,2010)；MedicalNanotechnology and Nanomedicine(Perspectives in Nanotechnology)(H.F.Tibbals编写,CRC出版社2010)；
Molecular Fluorescence(B.Valeur编写,Wiley-VCH 2012)；Introduction toNanomedicine and Nanobioengineering(Wiley Series in Biomedical Engineeringand Multi-Disciplinary Integrated Systems)(P.N.Prasad编写, Wiley 2012)；Yu等,J.Am.Chem.Soc.127:17604-17605(2005)；Mochalin等, Nature Nanotechnology 7:11-23(2012)；Epstein等,Nature Physics 1:94-98 (2005)；Chow等,Sci.Transl.Med.3:73ra21(2011)；Awschalom等,Sci.Am. 297:84-91(2007)；和Wilson,Phys.Today 64:17-18(2011).
荧光纳米金刚石可以提供为溶液、乳液、悬浮液、微球体、颗粒、微颗粒、纳米颗粒、脂质体等。
在本实用新型的方面，荧光纳米金刚石与样品直接接触(例如，当在体外、离体、原位等的样品中浸渍荧光纳米金刚石时)。例如，荧光纳米金刚石可以通过注射(例如，显微注射)或使用递送载体浸渍在样品中。合适的递送载体在本领域是公知的。非限定性示例包括脂质囊泡或其它聚合物载体材料、脂复合物(参见，例如，美国专利申请公开No.2003/0203865；
和Zhang等,J.Control Release,100:165-180(2004)),
pH敏感脂复合物(参见，例如，美国专利申请公开No.2002/0192275)，可逆掩蔽的脂复合物(参见，例如，美国专利申请公开No.2003/0180950)，基于阳离子脂质的组合物(参见，例如，美国专利No.6,756,054和美国专利申请公开No.2005/0234232)
阳离子脂质体(参见，例如，美国专利申请公开号No.2003/0229040、 No.2002/0160038和No.2002/0012998；美国专利No.5,908,635和国际公开 No.WO 01/72283)，阴离子脂质体(参见，例如，美国专利申请公开No. 2003/0026831)，
pH敏感脂质体(参见，例如，美国专利申请公开No.2002/0192274和澳大利亚公开No.2003/210303)，抗体包被脂质体(参见，例如，美国专利申请公开No.2003/0108597和国际公开No.WO 00/50008)，
细胞类型特异性的脂质体(参见，例如，美国专利申请公开No. 2003/0198664)，包含核酸和肽的脂质体(参见，例如，美国专利No. 6,207,456)，
包含用可释放的亲水性聚合物衍生化的脂质的脂质体(参见，例如，美国专利申请公开No.2003/0031704)，捕获脂质分子(参见，例如，国际公开No.WO 03/057190和No.WO03/059322)，
脂质包封分子(参见，例如，美国专利申请公开No.2003/0129221和美国专利No.5,756,122)，其他脂质体组合物(参见，例如，美国专利申请公开No.2003/0035829和No.2003/0072794和美国专利No.6,200,599)，
脂质体和乳剂的稳定混合物(参见，例如，欧洲公开No.EP 1304160)，乳剂组合物(参见，例如，美国专利No.6,747,014)和微乳剂(参见，例如，美国专利申请公开No.2005/0037086)。
在本实用新型的一些方面，将荧光纳米金刚石在体内给予到受试者(例如，将荧光纳米金刚石递送到受试者内的目标对象，包括但不限于目标细胞、组织、器官、生物体、传染剂、病毒、细菌、真菌、寄生虫等)。当向受试者给予时，可以提供荧光纳米金刚石作为包括药学上可接受的载体的药物组合物。术语“药学上可接受的”是指由管理机构批准或在美国药典或在动物(且更具体地在人类)中使用的其他普遍认可的药典中列出。术语“载体”是指利用其给予治疗剂的稀释剂、佐剂、赋形剂或载剂。这样的药物载体可以是诸如水和油之类的无菌液体，无菌液体包括诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油、橄榄油、凝胶(例如水凝胶)等之类的石油、动物、植物或合成来源的那些。当静脉内给予药物组合物时，盐水是示例性的载体。盐水溶液和右旋糖水溶液和甘油溶液也可被采用为液体载体，特别是用于可注射溶液。
合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩(chalk)、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。如果需要，组合物也可含有少量润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可采取溶液剂、混悬剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、粉末剂、缓释制剂等形式。口服制剂可含有诸如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等之类的标准运载体。合适的药物载体的示例在E.W.Martin的“Remington's Pharmaceutical Sciences”(《雷明顿药物科学》)中描述，其全部内容通过引用结合于此。
在实施例中，成像剂可以通过不同途径给予，包括但不限于口服、肠胃外、口颊和舌下、直肠、气雾、鼻腔、肌内内、皮下、皮内和局部。本文所用术语“胃肠外”包括例如眼内、皮下、腹膜内、皮内、静脉内、肌肉内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内和颅内注射，或其他输注技术。本领域普通技术人员将容易理解该制剂应适合给予方式。
适用于给予的制剂包括水性和非水性的无菌溶液，其可以包含使该制剂与预期接受者的血液等渗的抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和溶质，以及可以含有助悬剂和增稠剂的水性和非水性无菌混悬剂。可以用单位剂量或多剂量容器例如密封的安瓿和药瓶提供该制剂，也可以冷冻－干燥(冻干)条件保存该制剂，临用前只需要加入无菌液体载体(例如，水)。临时用的溶液和混悬液可以由本领域普通技术人员通常使用的无菌粉末、颗粒和片剂进行制备。
对于以片剂或胶囊形式的口服给药，荧光纳米金刚石可以与诸如乳糖、淀粉、蔗糖、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、磷酸氢钙、硫酸钙、甘露糖醇、山梨糖醇等之类的口服、非毒性的药学上可接受的惰性载体组合。对于以液体形式的口服给药，荧光纳米金刚石可以与如乙醇、甘油和水等之类的任何口服、非毒性的药学上可接受的惰性载体组合。此外，当需要或必须时，也可以将合适的粘合剂、润滑剂、崩解剂和着色剂掺入混合物中。合适的粘合剂包括淀粉、明胶、诸如葡萄糖或β-乳糖之类的天然的糖、玉米甜味剂、诸如阿拉伯胶、黄芪胶或藻酸钠之类的天然和合成树胶、羧甲基纤维素、聚乙二醇和蜡等。这些剂型中使用的润滑剂包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠和氯化钠等。崩解剂包括但不限于淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土和黄原胶等。
在本实用新型的方法中使用的荧光纳米金刚石也可以以脂质体递送系统的形式给予。这种递送系统在本领域中是众所周知的，并且包括但不限于单层囊泡、大单层囊泡和多层囊泡。脂质体可以由诸如胆固醇、硬脂胺或磷脂酰胆碱之类的多种磷脂形成。向受试者给予荧光纳米金刚石可以通过一般或局部给予途径。例如，荧光纳米金刚石可以被给予受试者，使得其在整个身体中递送。可替换地，荧光纳米金刚石可以被给予感兴趣的特定器官或组织。
荧光纳米金刚石应具有足够的发射以确保可靠的诊断。与样品接触的或被引入受试者以便提供检测的荧光纳米金刚石的量可以容易地由本领域技术人员确定。例如，荧光纳米金刚石的增加量可以被应用于或给予受试者，直到通过选择的检测方法检测到荧光纳米金刚石。此外，本领域技术人员还熟悉确定足以使荧光纳米金刚石变得与目标对象相关联的时间量。可以通过将可检测量的荧光纳米金刚石引入受试者，然后在给予后的不同时间检测荧光纳米金刚石来容易地确定必须的时间量。
在一些方面，荧光纳米金刚石可以与优先结合目标对象的分子相关联。这种分子在惯例中是众所周知的，并且包括但不限于具有一个或多个目标识别部分的目标结合剂，该目标识别部分用于目标结合剂(和荧光纳米金刚石)与目标分子的选择性结合。该目标识别部分被配置为与特定细胞、组织、器官、受体、表面抗原、生物体/传染剂等的目标分子特异性结合。
目标识别部分的示例包括但不限于抗原、配体、受体、特异性结合对的一员、聚酰胺、肽、碳水化合物、寡糖、多糖、低密度脂蛋白(LDL) 或LDL的脱辅基蛋白、类固醇、类固醇衍生物、激素、激素模拟物、凝集素、药物、抗生素、适体、DNA、RNA、脂质、抗体、抗体相关的多肽等。在实施例中，靶向(targeting)部分是多肽、碳水化合物或脂质。靶向部分也可以是抗体、抗体片段或纳米体。在其它实施例中，目标识别部分可以是与特定组织、受体、生物体/传染剂等优先关联或结合的分子或大分子结构(例如脂质体、胶束、脂质囊泡等)。
本领域普通技术人员将容易地理解如何制备本文中预期的荧光纳米金刚石偶联物。例如，荧光纳米金刚石可以与目标结合剂/部分共价地或非共价地相关联。参见Vaijayanthimalal等,Nanomedicine 4:47-55(2009)； Vaijayanthimalal等,Biomaterials 33:7794-7802(2012)；Hartmann等, Chemistry-A European Journal 18:21,6485-6492(2012)；Mochalin等,Nat. Nanotechnology 7:11-23(2012)；Weng等,Diamond and Related Materials 22:96-104(2012)；Alhaddad等,Small 7:3087-3095(2011)；Krueger,J Mater. Chem.21:12571-12578(2011)和Liu等,Nanoscale ResearchLetters 5:1045-1050(2010)；Rurack,Supramolecular Chemistry Meets Hybrid (Nano)Materials:A Brief Look Ahead(超分子化学遇见混合(纳米)材料：简要展望),TheSupramolecular Chemistry of Organic-Inorganic Hybrid Materials(有机-无机混合材料的超分子化学)(Wiley,2010)的689-700页。
在一些实施例中，FND是二氧化硅涂覆的FND。创建二氧化硅涂覆的纳米金刚石的方法在以下论文中被描述：A.Bumb等,"Silica encapsulation of fluorescentnanodiamonds for colloidal stability and facile surface functionalization(用于胶体稳定性和易于表面功能化的荧光纳米金刚石的二氧化硅包封)"135Journal of theAmerican Chemical Society 7815-18 (2013)。
工作示例#1–FND发射的磁调制
图7A描绘了显示自旋-三重态(ms＝0和ms＝±1)的基态和激发态以及单态亚稳态的金刚石中的NV-中心的能级图。NV-中心可以在宽范围的波长 (450-650nm)(绿色箭头)上被光学激发。相比于衰变到基态的ms＝±1 子能级，处于激发态的ms＝±1子能级中的NV-中心具有较高的可能性经由亚稳态衰变(灰色虚线箭头)。
从亚稳态，NV-中心主要跃迁到基态的ms＝0子能级而不发射可见光。因此，在不存在磁场的情况下，当被激发时，NV-中心被快速地泵送到基态的ms＝0子能级中。这导致当达到稳定状态时荧光发射强度的初始增加。在存在磁场的情况下，ms＝0和ms＝±1态混合，使得通过亚稳态单态的衰变通路可达，因此降低了荧光发射强度。
图7A描绘了含有FND的视场。图7B描绘了在施加具有0.1Hz频率和 100高斯振幅的调制磁场时的图7A所描绘的FND的强度调制。
为了显示FND发射的磁调制，用FND制备了盖玻片。500μl的PBS缓冲液中的1mg/ml聚-L-赖氨酸(PLL)与二氧化硅涂覆的FND混合，沉积在#1盖玻片上，且培养过夜。使用双面胶带制造流动池，以将盖玻片附接到载玻片上。
使用CARLLSM5LIVE显微镜获得影片。影片的每一帧是250 毫秒时间分辨率的扫描共焦图像使用具有0.3NA(EC Plan-Neofluar)的10 倍物镜来引入激发光以刺激FND并收集FND的发射。样品在 532nm下激发，使用长通滤波器LP650过滤发射，并使用光电倍增管(PMT) 检测该发射。
电磁体(APW公司，项目#EM400-12-212,4.0"直径圆形电磁体 (Diameter RoundElectromagnet))由振幅为0或12V和零偏移的方波电压信号供电。样品被置于离磁体面～13mm处，其中磁场强度为～100高斯。
工作示例#2–通过具有和不具有磁场的帧的成对减法的无背景成像
图8A是如图7B中成像的具有含有～15NV-的～40nm FND的视场图像。图8B是将～1μΜALEXA647染料溶液引入流动池中之后的相同视场的图像。该染料具有与FND类似的发射特性，因此来自FND的荧光被ALEXA647染料的高浓度的背景荧光掩蔽。图8C是存在高 ALEXA647染料背景(如图8B中)时处理图像之后的相同视场的图像。计算在有和没有磁场情况下收集的图像对之间的差别，并将这些差别图像中的1,000个图像在一起求平均以生成经处理的图像。经过这种处理，图8A所示的金刚石的图像从具有如图8B的高背景的图像中被恢复。
工作示例#3-使用宽场锁定检测的无背景成像
图9A示出了由扫描共焦显微镜拍摄的影片的帧(具有时间分辨率为 0.25s的1000帧)。成像的细节与上文图7B中的那些相同。在获取影片期间施加了具有0.1Hz频率和100高斯幅度的调制磁场。
图9B示出了在使用锁定算法逐个像素地处理影片之后的宽场无背景图像。
图9C描绘了向对应于FND的亮像素(从图9A中的图像的左上角的水平坐标,x＝109以及垂直坐标,y＝111)的锁定算法的应用。图9C的左上面板示出了作为时间的函数的像素值。图9C的右上面板示出了作为频率的函数的快速傅里叶变换(FFT)。图9C的左中面板描绘了来自左上面板的像素值乘以参考正弦波1+sin(2π×0.1×t)。图9C的右中面板描绘了相对应的FFT。图9C的左下面板示出了像素值乘以参考余弦波1+cos(2π×0.1×t)。图9C的右下面板描绘了相对应的FFT。
图9D示出了应用于对应于背景的暗像素(从图9A中的图像的左上角的水平坐标,x＝137以及垂直坐标,y＝107)的相同的锁定算法。
参考图9C和9D两者，在0.2Hz处的垂直虚线是用于指示参考频率两倍处的值的辅助线。对于每个像素计算正弦和余弦FFT中的在0.2Hz周围的三个点的平均值。图9B中的无背景图像对应于以正交相加的正弦和余弦平均值，即，i＝sqrt(icos2+isin2),其中i是平均强度且icos和isin分别对应于从信号的FFT计算的平均值乘以余弦和正弦函数。在应用锁定算法之前，对于在(109,111)和(137,107)处的像素，在1000帧上的像素值的平均值为173和18，从而给出～10的信噪比。在应用锁定算法之后，对于在(109,111)和 (137,107)处的像素，在0.2Hz周围的三个点的FFT振幅的平均值为21.42 和0.28，从而给出～77的信噪比。因此，锁定算法将信噪比提高了～8倍。计算在软件中实现。
工作示例#4–使用宽场成对图像减法和锁定检测的体内前哨(sentinal) 淋巴结的无背景成像
图10A描绘了使用将FND的发射(右上插图，覆盖图中的红色)与背景荧光(左上插图，覆盖图中的白色)分开的常规光谱解混合方法所得的老鼠的前肢图像。经皮肤在引流腋淋巴结中没有检测到FND。图10B描绘了通过对在有和没有磁场情况下的475个成对相减图像进行平均所得的相同老鼠的图像。经处理的图像(右上插图，覆盖图中的红色)叠加在磁场关闭情况下获得的未处理图像上(左上插图，覆盖图中的白色)。白色箭头指向脚掌中的注射部位和辅助(前哨)淋巴结的位置。来自淋巴结中的 FND的信号被清楚地检测到。图10C描绘了通过来自FND的发射的锁定检测所得的图像，该发射来自用于使用图9中所描述的算法生成图10B(右上插图，覆盖图中的红色)(被叠加在磁场关闭情况下获得的未处理图像(左上插图，覆盖图中的白色)上)的相同图像。图10D描绘了通过对成对相减有和没有磁场下的图像所获得的图像求平均的相同老鼠的打开的胸腔的图像。经处理的图像(底插图，覆盖图中的红色)叠加在磁场关闭情况下获得的未处理图像上(上插图，覆盖图中的白色)。白色箭头指向前脚掌中的注射部位和辅助淋巴结的位置。图10E描绘了从来自FND的发射的锁定检测所得的图像，该发射来自用于生成被叠加在磁场关闭情况下所得的未处理图像(上插图，覆盖图中的白色)上的图10D(底插图，覆盖图中的红色)的相同图像。在部分剖开的老鼠中，可以清楚地看到FND到淋巴结的定位(localization)。图10F描绘了对应于图10B和图10D中的所选点的作为时间的函数的像素值。所选择的像素在(1)腋淋巴结和(2) 图10B中的皮肤上的阴性对照(negative control)以及(3)腋淋巴结和 (4)图10D中的肋骨上的阴性对照之上。施加的磁场所导致的信号调制在经皮肤的淋巴结中以及当胸腔被打开时清晰可见。同时，皮肤和肋骨显示出对于阴性对照将被预期的随机信号。
雌性无胸腺(nu/nu)老鼠购自Charles River实验室，年龄4-6周，且容纳在特定无病原体的美国实验动物护理协会(American Association for Laboratory Animal Care)批准的设施中。所有实验都被国家癌症研究所的动物护理与使用委员会(National CancerInstitute's Animal Care and Use Committee)批准。使用在O2中含有1.5-2.5％异氟烷的气体混合物将老鼠麻醉，以在注射过程中保持-30bpm的呼吸速率。体积为10μL的PBS(pH7.4) 中的～80mg/mL二氧化硅涂覆的纳米金刚石(～100nm)溶液被皮内注射到每只老鼠的前脚掌中。先前的研究已经表明，来自该注射部位的主要引流 LN是腋LN和侧边胸LN。
在注射后24小时，处死老鼠，并使用MAESTROTM CRi光谱光学照相机(激发滤光器523nm、发射滤光器675nm长通)进行光学成像。还在配备有多光谱光源(激发滤光器525nm、发射滤光器650nm长通) 且由达到～1mW/cm2强度的绿色激光器(#DPSS-100)提供额外照明的成像系统中采用磁性调制拍摄图像。将每只老鼠在非磁性台上的仪器中成像，永磁体(目录号#DZ08-N52，K&J磁学 (K&JMagnetics))可以在该非磁性台下滑入和滑出。在磁场关和开的情况下连续捕捉图像且影片用在http://rsb.info.nih.gov/ij可得的ImageJ软件拼接在一起。
图11A是在没有施加磁场的情况下用二氧化硅涂覆的FND注射的淋巴结(LN)的图像。图11B是在施加～100高斯的磁场期间的相同视场的图像。随后从图11A减去图11B。图11C描绘了20张这种减法图像的总和。在原本暗的场中，FND被观察为亮斑点。图11D和图11E描绘了当磁场分别一直关和开时的20张这种减法的总和。
雌性无胸腺(nu/nu)老鼠购自马萨诸塞州威尔明顿市(Wilmington) 的CharlesRiver实验室，年龄4-6周，且容纳在特定无病原体的美国实验动物护理协会(AmericanAssociation for Laboratory Animal Care)批准的设施中。动物在6到8周龄之间被使用，且实验被国家癌症研究所的动物护理与使用委员会(National Cancer Institute'sAnimal Care and Use Committee) 批准。进行老鼠的腋淋巴结和侧边胸淋巴结(LN)的淋巴结切除术。用二氧化硅涂覆的FND注射被切除的LN。然后，将LN固定在10％的福尔马林中3天，用PBS洗涤，并使用(从飞世尔科技(Fisher Scientific)获得的)培养基载置在(从VWR获得的)SUPERFROST载玻片上以粘附盖玻片。
通过使用(从宾夕法尼亚州的K&J Magnetics of Jamison获得的)钕(Neodymium)永磁体获得无背景图像。使用CARLLSM5LIVE 显微镜以获得影片。影片的每一帧是具有1秒时间分辨率的扫描共焦图像。使用具有0.3NA(EC Plan-Neofluar)的10倍物镜以激发FND并收集FND的发射。样品在532nm处被激发。使用长通滤光器(带通为 560-675nm)对发射进行滤光，并使用PMT检测该发射。
工作示例#5–使用荧光寿命成像(FLIM)的无背景成像
图12A是在图11A至图11E中使用的相同LN的不同区域的双光子 FLIM图像。较长寿命(由红色指示)被认为是由于FND，它的报告的寿命范围为～10-20ns。图12B是通过相减在没有和有磁场情况下的图像并且添加10个这样的减法所获得的相同视场的无背景图像。
TCS SP5扫描共焦系统被定制以获得荧光寿命成像显微镜 (FLIM)图像(图12A)和使用钕永磁体施加磁场(～100高斯)的无背景共焦图像(图12B)两者。对于图12B，添加具有和没有磁场情况下的10 张图像的减法以获得最终图像。使用油浸物镜(HCX PL APO CS 40.0X 1.25NA油(Oil)UV)既激发发射又收集发射。对于FLIM图像，使用MAI激光器在930nm处激发样品。对于FLIM成像，使用带通滤光器(BP 607-683nm)对来自LN中的FND的发射进行滤光，并使用装配有单光子雪崩二极管(SPAD)的PICOQUANTTM PICOHARPTM 300时间相关单光子计数(TCSPC)系统检测该发射。对于相同视场(FOV)的扫描共焦图像(400Hz扫描速度)，在561nm处激发样品，且使用带通滤光器(600-789nm)过滤发射并使用PMT检测该发射。
本主题提供了独特、简炼的方法，该方法可以容易地与现有的显微镜或动物成像系统结合而不与样品接触。不需要复杂且易出错的光谱解混合。常用的着色剂和标签的荧光不能使用磁场选择性地被调制。诸如GFP和染料之类的常用标签的化学或光学修改是可能的，但是这些修改是难以实施的、具有侵入性的，且可能引起不期望的变化。
尽管已参照其优选实施例对本主题进行了描述，然而本领域内技术人员将理解，可在不背离本主题的范围的情况下作出各种变化并用等效物替代其中的元件。此外，在不脱离其本质范围的情况下，可以进行许多修改以使特定情况或材料适应本主题的教导。因此，本主题旨在不限于被考虑作为实施本主题的最佳模式所公开的特定实施例，而是本主题旨在将包括落入所附权利要求的范围内的所有实施例。
在替代实施例中，多个元件的功能可以由更少的元件或单个元件来执行。类似地，在一些实施例中，任何功能元件可以执行相比关于所示实施例所描述的更少的或不同的操作。此外，为了说明的目的而示出为不同的功能元件(例如，模块、数据库、计算机等)可以被并入在不同硬件中分离的或分布在特定实施中的其他功能元件内。
图13示出了调制磁场荧光成像系统的元件。感兴趣的生物样品被安装在AFM台11上。用于施加调制磁场的装置安装在AFM台的上方。由AFM 计算机13控制的AFM控制器10控制磁体场施加器。使用XYZ闭环扫描器9监测磁场的位置。聚光器和透射照明器安装在AFM台的上方并照明生物样品。
将全内反射荧光(TIRF)成像装置安装在AFM台11的下方。TIRF照明可以通过光学耦合到滤光器16、望远镜15、光纤18和TIRF照明器19 的Ar/Kr激光器23来提供。来自TIRF照明器19的辐射入射在分束器上，该分束器将Ar/Kr激光辐射引导经过透镜以聚焦在生物样品上。Ar/Kr激光器23用水冷却系统24冷却。可替换地，样品可以用诸如Lambda LS照明器(萨特仪器公司(Sutter Instrument Co.))之类的氙弧灯来照射。来自氙弧25的辐射可以使用Epi-IRM照明器12进行准直，且被引导到分束器上并被聚焦到生物样品上。
通过共焦显微镜或其它合适的成像系统收集荧光，且使用CCD照相机 14和摄像机22检测荧光。使用显微镜计算机8控制成像光学器件且获取成像数据。
图13所示的调制磁场荧光成像系统示出了合适的成像系统的一般元件。通常地，该系统被配置为使得时间调制的磁场被施加到生物样品。该磁场可以被施加到整个生物样品或生物样品的一部分。该系统被配置为照射整个生物样品或生物样品的一部分以使生物样品发出荧光。该系统还被配置为收集荧光。
在某些实施例中，使用荧光纳米金刚石以对生物样品成像。生物样品可以用功能化的荧光纳米金刚石来标记。时变磁场以足以在高场强下混合 +/-1和0三重态的磁场强度来施加。
图14是概述调制磁场荧光成像系统的元件的示意图且包括调制磁场装置、成像仪器、诸如生物样品之类的试样和软件分析模块。该调制磁场可以用永磁体或电磁体来施加。在某些实施例中，永磁体可以相对于试样移动以提供时变磁场。在某些实施例中，电磁体用于施加具有不同波形的时变磁场。
图14所参照的成像仪器可以包括诸如用于共焦显微镜、光学显微镜、 TIRF显微镜和FLF显微镜之类的合适的显微镜成像光学器件，或包括诸如透射照明扫描器或反射扫描器之类的动物成像系统。适当地，成像仪器可以包括例如光学滤波器、透镜、准直器和分束器。成像仪器还可以包括用于检测荧光和光学地成像样品的设备。还包括用于照射样品以诱导荧光的光学器件和用于移动磁体、光学器件、辐射源和/或成像部件的平移台。
各种部件可以由软件控制。图像处理可以涉及具有施加到样品的磁场和没有施加到样品的磁场的情况下获得的图像的比较，或者涉及比较在低磁场强度和高磁场强度下获得的荧光。
图15示出了相对于样品台的磁体的各种配置。例如，在某些实施例中，可以将电磁体安装在样品台的上方、下方和/或侧面。电磁体可用于施加时变磁场。在另一种配置中，永磁体可以安装在样品台的上方、下方和/或侧面，并且物理地朝向样品台和远离样品台移动，以改变施加到样品上的磁场的强度。如第三种方案所示，永磁体可以安装在被配置为围绕样品旋转磁体以提供时变磁场的装置上。在某些实施例中，永磁体可以是静止的，并且可以在磁体和样品之间设置磁屏蔽以提供时变磁场。
图16是示出小型动物光学成像仪器的一般元件的示意图。成像仪器包括光源、诸如生物样品之类的试样、检测器、用于控制光源和(多个)检测器的软件以及用户界面。该光源可以包括用于控制激发辐射的波长范围的多个激发滤光器，并且检测器可以包括用于选择荧光的波长范围的多个滤光器。
图17是示出用于获得时间调制的磁场荧光图像的小型动物成像仪器的一般元件的示意图。图17所示的仪器包括光源、诸如生物样品之类的试样、 (多个)检测器、用于控制光源和(多个)检测器的软件、用户界面和用于控制用于向试样施加磁场的磁场施加器的软件界面。该光源可以包括用于控制激发辐射的波长范围的多个激发滤光器，并且检测器可以包括用于选择荧光的波长范围的多个滤光器。在某些实施例中，激发波长范围和检测波长范围经选择为优化磁场修改的NV-中心纳米金刚石荧光的对比度。磁场施加器可以包括被配置为向试样施加时变磁场的永磁体或电磁体。软件添加物可用于将试样的磁场依赖图像与试样的光学图像相关联，并执行图像处理以提供试样的图像。在基于具有磁场和无磁场或具有较低强度磁场的情况下所获得的试样的或试样的一部分的磁场修改的NV-中心纳米金刚石荧光图像的成像的情况下，可以比较它们以减少或消除并非源自NV- 中心荧光纳米金刚石的背景荧光。
图18示出了用于磁场调制的小型动物成像仪器的另一个实施例，该仪器包括光源、试样、检测器、磁场施加器、用于控制光源、检测器和磁场施加器的软件以及用户界面。在该实施例中，光源包括源和/或光学系统，被配置为优化NV-中心荧光纳米金刚石三重态的激发以及检测器和光学器件，包括例如滤光器，经选择为优化NV-中心荧光纳米金刚石荧光的检测。
图19-21示出了光源、试样、检测器和磁场施加器的各种配置。图19 示出了从旋转台下方施加磁场的处于线性配置的光源、试样和检测器。图 20示出了处于共焦配置的光源、试样和检测器，其中激发源和(多个)检测器位于试样的相同侧，并且磁场施加器在试样的相对侧。图21示出了成像仪器的示例，其中检测器位于试样的周围并且具有单个光源和磁场施加器。在某些实施例中，检测器、光源和磁场施加器可围绕样品旋转。在图 21所示的某些实施例中，可以有多个光源和磁场施加器。
调制磁场荧光成像装置可以是静止系统，其中试样或生物样品被安装在台上且成像仪器是独立的系统。在某些实施例中，本公开所提供的成像装置可以是诸如手持式扫描器之类的便携式设备。例如，如图22所示，临床手持式扫描器可以包括光源、磁场施加器、照相机或检测器、被配置为获得患者的调制磁场荧光图像的软件，以及临床医生和软件之间的界面。在某些实施例中，扫描器的元件被优化为获得磁场修改的NV-中心纳米金刚石荧光的图像。
在某些实施例中，荧光纳米金刚石是二氧化硅涂覆的。二氧化硅涂覆的纳米金刚石和制备二氧化硅涂覆的纳米金刚石的方法在例如WO 2014/014970A1中被公开，其通过引用被整体并入。类似的方法可用于二氧化硅涂覆荧光纳米金刚石。
二氧化硅涂覆的荧光纳米金刚石可以用探针、亲和分子或可结合至生物样品的特定目标的其他实体进行功能化。这些功能化的二氧化硅涂覆的荧光纳米金刚石可被应用于诸如组织样品或细胞之类的生物试样，以用功能化的纳米金刚石染色试样。在其它实施例中，可以在体内给予功能化的纳米金刚石，并通过患者的皮肤测量功能化的二氧化硅涂覆的纳米金刚石的磁性上修改的荧光。某些实施例中，在向受试者体内给予功能化的纳米金刚石之后，组织或生物流体可从受试者被移除，且被评估功能化的纳米金刚石的存在。功能化的二氧化硅涂覆的纳米金刚石可用于类似于使用荧光探针的方式探测目标。
虽然已经描述了根据本主题的某些实施例，但是本主题不限于仅有的所描述的实施例。在不脱离本主题的精神或范围的情况下，可以对所描述的实施例中的任何一个进行各种改变和/或修改。此外，即使所描述的实施例的元件、步骤、特征和/或方面的各种组合在本文中没有被明确地标识，这些组合是可能的且可构想的。

Claims (25)

1.一种成像系统，其特征在于，包括：
成像台，用于安装试样；
辐射源，被配置为激发荧光金刚石且被引导到所述试样上；
荧光检测器，被配置为检测金刚石荧光且被配置为检测来自所述试样的荧光；以及
被配置为向所述试样施加时变磁场的装置。
2.根据权利要求1所述的成像系统，其特征在于，包括包含被安装在所述成像台上的所述金刚石的所述试样。
3.根据权利要求1所述的成像系统，其特征在于，所述辐射源选自由激光器和氙弧灯组成的组。
4.根据权利要求1所述的成像系统，其特征在于，所述荧光金刚石是荧光纳米金刚石，且包括二氧化硅涂覆的荧光金刚石或功能化的二氧化硅涂覆的荧光金刚石。
5.根据权利要求1所述的成像系统，其特征在于，所述荧光金刚石是荧光纳米金刚石，且包括功能化的二氧化硅涂覆的荧光纳米金刚石。
6.根据权利要求1所述的成像系统，其特征在于，被配置为施加时变磁场的所述装置包括永磁体，所述永磁体相对于所述试样旋转。
7.根据权利要求1所述的成像系统，其特征在于，被配置为施加所述时变磁场的所述装置包括被配置为相对于所述试样移动且被定位在所述试样的上方、下方或旁边的永磁体。
8.根据权利要求1所述的成像系统，其特征在于，被配置为施加时变磁场的所述装置包括电磁体。
9.根据权利要求1所述的成像系统，其特征在于，包括用于处理来自数据的图像的成像处理单元，所述数据来自所述荧光检测器。
10.根据权利要求9所述的成像系统，其特征在于，所述成像处理单元被配置为将用由所述装置向所述试样提供的第一施加磁场获得的图像与用由所述装置向所述试样提供的第二施加磁场获得的荧光图像进行比较。
11.根据权利要求10所述的成像系统，其特征在于，所述第一施加磁场和所述第二施加磁场具有不同的强度。
12.根据权利要求1所述的成像系统，其特征在于，所述成像系统是便携式的。
13.根据权利要求1所述的成像系统，其特征在于，所述成像系统被配置为对具有从1cm至10cm的尺寸的所述试样的一部分进行成像。
14.根据权利要求1所述的成像系统，其特征在于，所述成像系统被配置为对具有至少1cm的尺寸的所述试样的一部分进行成像。
15.根据权利要求1所述的成像系统，其特征在于，所述成像系统被配置为对具有小于0.1cm的尺寸的所述试样的一部分进行成像。
16.根据权利要求1所述的成像系统，其特征在于，所述成像系统被配置为对具有从0.01cm至0.1cm的尺寸的所述试样的一部分进行成像。
17.根据权利要求1所述的成像系统，其特征在于，所述辐射源和所述荧光检测器被配置为相对于所述试样移动。
18.根据权利要求1所述的成像系统，其特征在于，所述辐射源、所述荧光检测器和配置为施加时变磁场的所述装置被配置为相对于所述试样移动。
19.根据权利要求1所述的成像系统，其特征在于，所述系统包括多个包括荧光检测器的检测器。
20.根据权利要求1所述的成像系统，其特征在于，所述系统包括围绕所述试样布置的多个荧光检测器，所述多个荧光检测器被配置为围绕所述试样旋转且接收来自所述试样的荧光信号。
21.根据权利要求1所述的成像系统，其特征在于，所述系统包括多个荧光检测器，且所述多个荧光检测器、所述辐射源和所述装置围绕所述试样布置并且被配置为当所述系统处于操作时围绕所述试样旋转。
22.根据权利要求1所述的成像系统，其特征在于，所述金刚石是纳米金刚石。
23.根据权利要求1所述的成像系统，其特征在于，被配置为向所述试样施加时变磁场的所述装置还在同一时间向所述金刚石施加所述时变磁场，所述金刚石是纳米金刚石。
24.根据权利要求1所述的成像系统，其特征在于，所述荧光金刚石是荧光纳米金刚石且包括功能化的荧光纳米金刚石。
25.根据权利要求1所述的成像系统，其特征在于，进一步包括被配置为向所述试样施加时变磁场的多个装置。
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