TWI745593B - 包覆式功能化鑽石晶體 - Google Patents

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Abstract

本發明是一種在高離子強度溶液中具有高分散性及／或具有特定標靶能力的功能化的鑽石晶體，其包含鑽石晶體和脂肪酸層。脂肪酸層起介面活性劑的作用並為鑽石晶體提供專一性的標靶特徵。介面活性劑的特徵使得鑽石晶體易於分散在生物周圍（例如，磷酸鹽緩衝液）中，並且專一性標靶能力的特徵為鑽石晶體提供專一性的識別特定標靶。本發明允許研究人員使用鑽石晶體作為專一性標記的指標。

Description

包覆式功能化鑽石晶體
本非臨時申請案要求以下美國臨時申請案之優先權：於2017年5月25日提交，申請號為62/511,034。前述案件和所有其他本文所提及的外部文獻皆通過引用而將其整體納為本申請案揭露之一部分。
本發明是一種功能化的鑽石晶體，其在生理環境下具有高分散性及/或具有專一性標靶能力，是鑽石晶體的改良物。
首先，應該注意的是，所有本文所載之公開文獻皆通過引用而納為本文揭露之一部，如同每一個別的公開文獻或專利申請案係具體地及個別地被指示藉由引用而納入本文揭露之一部一樣。凡參考文獻中術語的定義或用法與本文所提供的該術語的定義不一致或相反時，該術語的定義係以本文所提供者為準，而不適用參考文獻中的定義。
細胞表面覆蓋有各種類型的抗原，前述抗原可當作分子標記來鑑定不同細胞類型，以及當作診斷和治療的標靶。例如，紅血球係根據其細胞表面多醣抗原的遺傳差異來分類1。另一方面，人類白血球抗原(或CD抗原)係為膜蛋白，其在免疫反應中扮演重要角色2。這些分子的重要性刺激了細胞酵素連結免疫吸附法(cell-enzyme-linked immunosorbent assay，cell-ELISA)的發展，其為一種免疫酶技術，用來對細胞表面抗原進行定量分析3。然而，該方法無法對於目標抗原在細胞表面的定位提供任何資訊。相反地，原子力顯微鏡4和光學顯微鏡對於後者來說相當適用5,6，但它們無法以足夠的準確度來測定抗原濃度。
螢光奈米鑽石(Fluorescent nanodiamonds，FNDs)是以碳為基礎的奈米顆粒，其含有負電氮空位(nitrogen-vacancy，NV-)缺陷的高密度總體，以作為螢光中心7。與分子螢光團如有機染料和螢光蛋白不同，負電氮空位中心 是光穩定的、磁光的(magneto-optical)，並且在水和生理介質的螢光壽命相對較長(約20ns)8。它們係鑲嵌於化學惰性鑽石基質的深處，因此免於受到環境影響。它們的螢光特性在很大程度上不受室溫下水溶液中強酸和強鹼處理的影響9。因為保有這些獨特特性，所以藉由時間框通和磁性調變，可以讓螢光奈米鑽石在細胞和組織樣品中進行無背景成像以及檢測10-12。其為活細胞表面抗原的絕對定量和奈米級定位提供了強大的新工具。
在將螢光奈米鑽石用作光穩定的抗原標靶試劑時，需要克服兩個障礙：(1)在細胞培養基中的顆粒聚集，和(2)細胞表面上非目標蛋白分子的非專一性結合；這兩者都將導致偽陽性結果。目前已經有許多研究嘗試來解決這兩個問題13-16，所開發的方法包括以聚合物-如超支化聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)15,16，或聚[N-(2-羥丙基)甲基丙烯醯胺]13,14-與羧化螢光奈米鑽石進行共價鍵結，以形成具有高度生物相容性的蛋白質耐受披覆層。儘管Chang等人17已經應用前一種方法及其變異來合成聚乙二醇化的生物素化螢光奈米鑽石，以標記人類肝癌細胞株上的CD44抗原，但是仍需要更通用和有效的方法。
為了克服如上所述的限制，本公開內容已經開發了一種技術，其不僅能夠進行細胞表面抗原的絕對定量，且還能夠以奈米等級的解析度來對這些抗原進行空間定位。與細胞ELISA相比，本方法不涉及酵素、放射性物質和抗原萃取。這項新技術的關鍵組成部分是脂質包覆式的螢光奈米鑽石(FND)。
本發明是一種功能化的鑽石晶體，其在生理溶液中具有高分散性及/或具有專一性的標靶能力，這是鑽石晶體的改良物。為了使鑽石晶體具有靶向能力，係透過添加所需的官能基(例如，生物素、抗體等)來修飾鑽石晶體的表面。修飾後，功能化的鑽石晶體能夠識別特定的生物物質，並在生物流體環境中保持良好的分散性。
本發明可以應用於體外和體內的專一性標靶、生物標記、及生物成像。與商售生物成像試劑相比，基於鑽石晶體的生物成像試劑因其發光中心穩定，也可用於光學顯微鏡、電子顯微鏡或相關光-電子顯微鏡(correlative light-electron microscopy，CLEM)。
此外，本文提供了簡單且有效地將螢光奈米鑽石包覆在生物功能化脂質層中的方法。本發明不是使用薄膜水合技術(thin-film hydration technique)18，而是利用了Ouzo效應19，其是一種自乳化現象，已在許多研究領域中使用，如合成聚合物奈米膠囊和前驅藥20-22。它涉及將疏水性溶質和水混溶性溶劑的混合物加入水中以形成穩定的微滴。前述微滴可以用來當作如螢光奈米鑽石等目標化合物的載體。在本文中使用了由蛋卵磷脂、聚乙二醇化的1,2-二硬脂醯基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺和膽固醇所組成的脂質層，來當作疏水性溶質(圖1)23。其係溶解在四氫呋喃(即水混溶性溶劑)中，然後加到含有表面氧化的螢光奈米鑽石的水中以形成乳液。隨後在真空中蒸發四氫呋喃，以使脂質層披覆在螢光奈米鑽石上。該方法不僅能夠形成堅固的披覆層，且能夠合成出具有所需官能基(如生物素)的脂質披覆螢光奈米鑽石。該顆粒在磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)和細胞培養基中表現出高分散性，非常適合應用於專一性抗原標記和標靶應用。
為達上述目的，本發明的一實施例揭露一種奈米鑽石顆粒複合物，其包括一兩親性膠囊以及一奈米鑽石顆粒。奈米鑽石顆粒包覆在前述兩親性膠囊中。兩親性膠囊包括複數個脂肪酸分子，複數個脂肪酸分子形成單層、部分單層或微胞狀結構，且奈米鑽石顆粒具有至少一個氮空位中心。
為達上述目的，本發明的一實施例揭露一種用於標靶一生物樣品的試劑盒。試劑盒包括如前所述的一奈米鑽石顆粒複合物，被配置為具有專一性地識別該生物樣品的能力。
為達上述目的，本發明的一實施例揭露一種用於標靶一生物樣品的方法。該方法包括以下步驟：用如前所述的奈米鑽石顆粒複合物處理生物樣品，奈米鑽石顆粒複合物被配置為具有專一性地識別該生物樣品的能力。
為達上述目的，本發明的一實施例揭露一種如前所述的奈米鑽石顆粒複合物用於作為光學顯微鏡、電子顯微鏡或相關光-電子顯微鏡中的標記試劑的用途。
為達上述目的，本發明的一實施例揭露一種如前所述的奈米鑽石顆粒複合物用於量化一樣品中的一特定分子的用途。
為達上述目的，本發明的一實施例揭露一種量化一樣品中如前所 述的奈米鑽石顆粒複合物的濃度的方法，包括：提供待測的一樣品；將奈米鑽石顆粒複合物應用於樣品；以及測量由奈米鑽石顆粒複合物所發射的一螢光信號，以決定樣品中奈米鑽石顆粒複合物的濃度。
為達上述目的，本發明的一實施例揭露一種用於一樣品成像的方法。該方法包括以下步驟：用如前所述的奈米鑽石顆粒複合物標記樣品；用激發的能量照射標記的樣品；以及產生至少一部分樣品的圖像，圖像是基於從被激發的樣品收集的信號所生成，其中奈米鑽石顆粒複合物的直徑為1nm至1mm且具有至少一個氮空位中心。
綜上所述，本發明提供了一種奈米鑽石顆粒複合物、用於標靶生物樣品而包含有前述奈米鑽石顆粒複合物的試劑盒，以及透過使用前述奈米鑽石顆粒複合物標靶生物樣品的方法。如以下實驗結果所證明的，本發明所提供的奈米鑽石顆粒複合物已被證實是可作為具有獨特磁光性質的生物相容性奈米探針，其具有極高的光穩定性，可磁調變的螢光強度和長螢光壽命。如果奈米顆粒具有特定的標靶能力，與前述性質綜合起來，可以使其用來進行高品質和無背景的奈米等級細胞組成成像和定位。本文顯示，透過利用Ouzo效應，可以容易地將在空氣中表面氧化的螢光奈米鑽石包覆在脂質中。並且，這些脂質包覆的螢光奈米鑽石，在將脂質層適當地接上生物活性分子(如生物素)後，可用來作為專一性細胞標靶劑。前述脂質包覆的螢光奈米鑽石已經應用於以CLEM來對HeLa細胞膜上的CD44抗原進行絕對定量和奈米級定位，以證明該原理。該方法是通用且適用於其他生物分子，因為現在各種脂質衍生物都是商售可得的，且在對本發明中所示的方案進行微小修改後都能起很好的作用。
後述的實施例將透過詳細說明和對應之圖式更全面地被理解，以下描述和圖式僅用於說明，而非對本發明的限制，並且其中：圖1A至圖1B：生物素化的脂質披覆的FND(biotinylated lipid-coated FND，bL-FND)的結構。
圖2A至圖2E：(圖2A、圖2B)100nm FND的TEM圖像，不具有脂質披覆的圖像(圖2A)或具有脂質披覆的圖像(圖2B)。(圖2C、圖2D和圖 2E)在DDW或PBS中披覆脂質之前和之後的100nm(圖2C)、50nm(圖2D)和35nm(圖2E)FND的尺寸分佈。
圖3：用含有1% DSPE PEG200生物素的100nm bL-FND標記的HeLa細胞，其亮視野和Z-堆疊共軛焦顯微鏡圖像。用生物素-抗-CD44抗體、DyLight488-NA和bL-FND(A至F)標記的細胞的圖像。
圖4A至圖4C：流式細胞儀分析結果，其係使用或不使用100nm bL-FND來標記HeLa細胞，所述bL-FND帶有不同莫耳百分比的生物素。用含有0%(圖4A)、0.5%(圖4B)和1%(圖4C)生物素的bL-FND所標記的HeLa細胞。灰色曲線表示僅以細胞進行的實驗結果(cell-only)，藍色曲線表示用生物素-抗-CD44抗體和bL-FND所標記的細胞，紅色曲線表示用生物素-抗-CD44抗體、DyLight488-NA和bL-FND所標記的細胞。
圖5：流式細胞儀分析結果，其係以不同濃度100nm bL-FND(帶有1%生物素)來標記HeLa細胞。
圖6A至圖6C：(圖6A)磁性調變之前和之後的35nm FND在水中的螢光光譜，FND濃度為5μg/mL。(圖6B)HeLa細胞表面上CD44抗原的定量結果，CD44的測定量隨著bL-FND粒徑從35、50到100nm的增加而降低，標記中使用的顆粒濃度均為100μg/mL，且顆粒的相對數量在右垂直軸中顯示。藍色箭頭表示用PE分析獲得的結果。(圖6C)用生物素-抗-CD44抗體、中性卵白素和35nm bL-FND來標記HeLa細胞的流式細胞儀分析結果(紅色)。對照組實驗係按照相同的標記程序進行，但沒有中性卵白素(藍色)，僅以細胞進行的實驗結果(cell-only)顯示為灰色。
圖7：HeLa細胞的TEM圖像(A)，用生物素-抗CD44抗體、中性卵白素，接著用bL-FND(B至D)所標記的HeLa細胞的TEM圖像。
圖8：用生物素抗-CD44抗體、中性卵白素，接著用bL-FND標記的懸浮HeLa細胞的(a)TEM、(b)螢光，和(c)CLEM圖像。用於拍攝TEM圖像的電子能量為120kV，比例尺：5μm(a、c)。
圖9：(a至f)HeLa細胞在被用Alexa Fluor 488染料來標記MICA/MICB抗原，接著用bL-FND透過免疫染色來標記CD44抗原的亮視野和Z-堆疊 共軛焦顯微鏡圖像。在使用SEM觀察前(a至c)和SEM觀察後(d至f)的HeLa細胞影像。(c、f)，在用SEM觀察之前(c)和SEM觀察之後(f)的局部放大的細胞之螢光圖像。注意，細胞樣品在使用SEM成像後，該樣品的型態有顯著的變化和綠色螢光發射的消失(f)。(g至i)MICA/MICB-和CD44所標記的HeLa細胞的SEM圖像。(h)放大的SEM圖像和(i)透過在(f)和(h)中疊圖獲得的CLEM圖像。將(f)旋轉23°後，(f)與(h)上的FND可相互完全重疊(i)。(j至l)使用eC-CLEM軟體對LM圖像(c)進行非線性轉換，用於執行非線性變換的變形網格如(j)中所示，並且所得到的LM和CLEM圖像分別在(k)和(l)中顯示。比例尺：20μm(a、b、d、e、g)和5μm(c、f、h、i)。
圖10：用生物素抗牛痘病毒抗體、中性卵白素，接著用bL-FNDs所標記的被牛痘病毒感染的HeLa細胞圖像：(a和d)SEM圖像、(b)亮視野圖像、(c)為(b)的放大圖、(f)螢光圖像，(e)CLEM圖像。
圖11：根據本發明的另一實施例之脂質披覆FND的結構。
圖12：HeLa細胞的免疫染色圖像(左圖：對照結果；右圖：實驗結果)，其係以脂質披覆的FND來標記，所披覆的脂質係經順丁烯二醯亞胺修飾，且接合有抗CD44抗體。
圖13：根據本發明又一實施例的脂質披覆FND的結構。
圖14：根據本發明又一實施例的脂質披覆FND的結構。
圖15：根據本發明的又一實施例的脂質批覆FND的結構。
圖16：在細胞實驗中，B-FND標記實驗的步驟。
圖17：用100nm bL-FND標記的HeLa細胞的亮視野和共軛焦顯微鏡圖像，所述bL-FND帶有不同莫耳百分比的生物素。用含有0%(A及B)、0.5%(C及D)和1%(E及F)生物素的bL-FND來標記細胞。上圖顯示來自FND的信號，下圖顯示bL-FND、DyLight488-NA和CD44抗原的共定位。
圖18：用100μg/mL的100nm bL-FND(帶有1%生物素)所標記的細胞，其於0、0.5、1、2和4小時所偵測到的平均紅色螢光強度。紅色曲線代表用生物素-抗-CD44抗體、中性卵白素和bL-FND所標記的細胞，黑色曲線 代表用生物素-抗-CD44抗體和bL-FND所標記的細胞。誤差槓表示三個獨立的實驗。
圖19：100nm bL-FND所標記的HeLa細胞的(A)共軛焦顯微鏡和(B)亮視野圖像，所述bL-FND含有1% DSPE PEG200生物素但不含DyLight488-NA。
圖20：流式細胞儀分析結果，其係以生物素-抗-CD44抗體、中性卵白素和bL-FND(B、D、F)或生物素Atto542(A、C、E)所分別標記的HeLa(A及B)、ASB145-1R(C及D)和MCF7(E&F)細胞。對照組實驗係按照相同的標記程序進行，但沒有中性卵白素(藍色)或生物素-抗CD44抗體(橙色)。僅用細胞所進行的實驗結果(cell-only)顯示為灰色。
圖21：磁性鎖定檢測螢光光譜儀的實驗裝置，用於對細胞和組織中的FND進行超靈敏定量。
以下將參照相關圖式，說明本發明的實施例，其中相同的元件將以相同的參照符號加以說明。
本文數個示例性的實施例，說明如下。
奈米鑽石顆粒複合物
本發明一實施例係提供一種奈米鑽石顆粒複合物，包括一兩親性膠囊以及一奈米鑽石顆粒。奈米鑽石顆粒包覆在前述兩親性膠囊中。兩親性膠囊包括複數個脂肪酸分子。複數個脂肪酸分子形成單層、部分單層或微胞狀結構。奈米鑽石顆粒複合物的直徑介於1奈米(nm)至1微米(um)之間。奈米鑽石顆粒可具有至少一個氮空位中心，且每個脂肪酸分子可與鄰近的脂肪酸分子形成共價連接。
在本實施例中，至少一個脂肪酸分子被一官能基修飾，官能基被配置為與一識別分子接枝，並且識別分子被配置為具有專一性地識別生物樣品的能力。然而，在本實施例中，也可能沒有任何脂肪酸分子被上述任何官能基所修飾。此外，這種奈米鑽石顆粒複合物被發現可以在生理溶液或高離子強度溶液中具有高分散性，甚至所有脂肪酸分子都不被官能基修飾。官能基可以是羥基、 羧基、生物素基團、三聚氯化氰修飾基團、硫基基團、順丁烯二醯亞胺基團、炔、疊氮基團、抗體、鹵素配體或其任何組合。此外，脂肪酸分子可以是飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、磷脂、乙二醇、膽固醇或其任何組合。前述磷脂可以例如但不限於是卵磷脂(phosphatidylcholine)、磷脂醯乙醇胺(phosphatidylethanolamine)、磷脂醯甘油(Phosphatidylglycerol)、Lyso脂質(Lyso Lipids)、磷脂酸(Phosphatidic acid)、神經脂質(Sphingolipids)、磷脂醯絲胺酸(Phosphatidylserine)，1,2-雙(10,12-tricosadiynoyl)-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼(1,2-bis(10,12-tricosadiynoyl)-sn-glycero-3-phosphocholine)、1-棕櫚醯基-2-(10,12-二十三碳二炔酸)-sn-甘油基-3-磷醯乙醇胺(1-palmitoyl-2-(10,12-tricosadiynoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)、1-棕櫚醯基-2-(10,12-二十三碳二炔酸)-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(1-palmitoyl-2-(10,12-tricosadiynoyl)-sn-glycero-3-phosphocholine)及其任何組合。
在本實施例中，兩親性膠囊更包括一聚乙二醇化的1,2-二硬脂醯基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamines，DSPE)或一10,12-二十三碳二炔酸(10,12-Tricosadiynoic acid)，且該聚乙二醇化的1,2-二硬脂醯基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DSPE)或該10,12-二十三碳二炔酸可以被官能基標記，並且官能團可以是羥基、羧基、生物素基團、三聚氯化氰修飾基團、硫基基團、順丁烯二醯亞胺基團、炔、疊氮基團、抗體、鹵素配體及其任何組合。當官能基是生物素基團時(即「生物素標記的」或「生物素綴合的」或「生物素化的」)，生物素基團的莫耳比例優選地大於0%且小於20%。此外，聚乙二醇化的1,2-二硬脂醯基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺係PEG2000-DSPEs，且其被生物素所標記的PEG2000-DSPEs(生物素-PEG2000-DSPEs)和未用生物素標記的PEG2000-DSPEs(PEG2000-DSPEs)之間的含量比例為1：0.001至1：10。
試劑盒
本發明另一實施例係提供一種用於標靶一生物樣品的試劑盒。試劑盒包括如前述實施例所述的奈米鑽石顆粒複合物，且前述奈米鑽石顆粒複合物被配置為具有專一性地識別生物樣品的能力。生物樣品可以是細胞、病毒、核酸片段、肽、半抗原、抗原、組織或其任何組合。奈米鑽石顆粒複合物的濃度介於0.01μg/mL至2000μg/mL之間。更具體地，奈米鑽石顆粒複合物的濃度可以 是100μg/mL且包括1%生物素-PEG2000-DSPE以及9% PEG2000-DSPE。
在本實施例中，試劑盒更可包括一識別分子(例如抗體)，識別分子被配置為具有專一性地識別生物樣品的能力，以及一接枝分子，接枝分子被配置為具有與識別分子及奈米鑽石顆粒複合物結合的能力。接枝分子可以是卵白素類化合物，例如卵白素、鏈酶卵白素(streptavidin)或中性卵白素(neutravidin)。此外，卵白素類化合物可以進一步與螢光化合物綴合，例如DyLight488。
此外，奈米鑽石顆粒複合物的各種構型與前述實施例中描述的類似。因此，於此不再重複贅述。
標靶生物樣品的方法
此外，本發明還提供了另一個實施例，其是一種用於標靶一生物樣品的方法。該方法包括以下步驟：用如前所述的奈米鑽石顆粒複合物處理生物樣品。前述奈米鑽石顆粒複合物被配置為具有專一性地識別該生物樣品的能力。生物樣品可以是細胞、病毒、核酸片段、肽、半抗原、抗原、組織或其任何組合。
在本實施例中，該方法可更包括以下步驟：用一第一試劑及一第二試劑依序處理生物樣品，第一試劑包含一識別分子(例如抗體)，識別分子被配置為具有專一性地識別生物樣品的能力，第二試劑包含一接枝分子(例如卵白素類化合物)，接枝分子被配置為能夠與前述抗體等的識別分子結合，然後執行如前所述以奈米鑽石顆粒複合物來處理生物樣品的步驟。
接下來，該方法可以進一步包括，以適合的洗滌緩衝液來清洗掉未結合及非專一性結合的識別分子的步驟。
接下來，該方法可以進一步包括，用適合的洗滌緩衝液來清洗掉未結合接枝分子的步驟。
接下來，該方法可以進一步包括，用適合的洗滌緩衝液來清洗掉未結合及非專一性結合的奈米鑽石顆粒複合物的步驟。
接下來，該方法可以進一步包括一步驟：在用第一試劑、第二試劑及第三試劑處理後，將生物樣品以能量源來照射。當奈米鑽石顆粒複合物透過識別分子和接枝分子來識別抗原時，會從被照射的生物樣品產生出光學信號。此外，能量源優選地是波長為200nm至1200nm的光，或者能量源可以是電子束。
此外，該方法可以進一步包括，用光學顯微鏡、電子顯微鏡或相關光-電子顯微鏡觀察用奈米鑽石顆粒複合物處理的生物樣品的步驟。
此外，奈米鑽石顆粒複合物的各種構型與前述實施例中所描述的類似。因此，於此不再重複贅述。
此外，本發明更進一步提供了一實施例，係關於一種將前述奈米鑽石顆粒複合物用於作為光學顯微鏡、電子顯微鏡或相關光-電子顯微鏡中標記試劑的用途，以及提供一實施例，係關於一種將前述奈米鑽石顆粒複合物用於定量一樣品中一特定分子的用途。此外，在將前述奈米鑽石顆粒複合物用於定量特定分子的用途中，特定分子的測定量是透過於外加磁場的協助下所測量到的樣品中奈米鑽石顆粒複合物的濃度來計算。
量化樣品中奈米鑽石顆粒複合物的濃度的方法
此外，本發明更進一步提供了另一實施例，其是一種定量前述奈米鑽石顆粒複合物於一樣品中濃度的方法。樣品可以是含水樣品及/或生物樣品。該方法包括以下步驟：提供待測的一樣品；將奈米鑽石顆粒複合物應用於該樣品；以及測量由奈米鑽石顆粒複合物所發射的一螢光信號，以決定樣品中該奈米鑽石顆粒複合物的濃度。
在本實施例中，奈米鑽石顆粒複合物的螢光信號可以是於一磁場下進行測量。
用於樣品成像的方法
此外，本發明更進一步提供了另一實施例，其是一種用於一樣品成像的方法。該方法包括以下步驟：用前述奈米鑽石顆粒複合物來標記樣品；用一激發能量來照射經標記的樣品；以及，產生樣品至少一部分的圖像，該圖像是從被激發能量照射樣品所收集到的信號來生成。奈米鑽石顆粒複合物的直徑為1奈米(nm)至1毫米(mm)，且具有至少一個氮空位中心。信號可包括響應於激發能量從鑽石顆粒發射的螢光。
在本實施例中，激發能量是電子、光、微波、無線電波、紅外線、X射線、伽馬射線、宇宙射線或其組合。
此外，奈米鑽石顆粒複合物的各種構型與前述實施例中描述的類 似。因此，於此不再重複贅述。
以下所述的幾個實驗例，係用以說明前述實施例所述的奈米鑽石顆粒複合物的合成方式，包含有奈米鑽石顆粒複合物的試劑盒，以及用於標靶生物樣品的方法。
實驗例1：bL-FND合成
本實驗例係先進行經生物素基團(bL-FND)功能化的脂質披覆FND的合成，其係基於薄膜水合方法24。先前研究發現，以這種方式製備的bL-FND，可以很好地分散在高離子強度溶液中(例如PBS)，但在進行細胞標記時，存在許多非專一性標靶結果(數據未顯示)，這可能是顆粒脂質包覆不完全的結果。FND是一種碳基材料，其表面的疏水性可透過化學修飾來進行適當的調整25。磷脂是一種雙極性材料，具有親水性頭部和兩個疏水性尾部。將這兩種化合物混合在一起會使許磷脂的疏水尾部與FND結合，且其親水性頭部朝向水。因此，在本實驗例中，嘗試透過使用基於Ouzo效應的溶劑蒸發方法來生產bL-FND，其係先將脂質混合物溶解在四氫呋喃(tetrahydrofuran，THF)中，然後將脂質溶液滴入FND懸浮液中，接著透過真空蒸發來除去有機溶劑。
用於合成的脂質混合物係由膽固醇(廣泛用於微脂體的穩定劑)和磷脂(來自雞蛋的L-α-卵磷脂，Egg PC)組成，莫耳比例為1：1。另一方面，FND是在空氣中氧化的。FND在450℃下空氣氧化2小時，使鑽石表面端有效地接上氧(表面碳原子的30%)，以保持顆粒在水中的良好分散性。鑽石的其餘sp3碳原子使磷脂的疏水性尾部與奈米材料形成強烈的相互作用。圖1A和1B23顯示了L-FND的預期結構；透過脂質配方的微小變化，可以在FND表面上形成脂質層，並且添加上任何所需的官能基(例如，生物素、羧基等)。
為了優化用於L-FND製備的脂質/FND比例，透過流式細胞儀測量其大小。對於直徑為100nm、經空氣氧化的FND，脂質/FND比例為32：1重量比時，被發現具有最佳的分散性。接著，檢驗清洗次數(即去除脂質-FND溶液中游離微胞的步驟)是否會影響L-FND在PBS中的穩定性。對在蒸餾去離子水(distilled deionized water，DDW)和PBS中的L-FND進行DLS測量顯示，在清洗3至6次後，L-FND仍然可以很好地分散在PBS中。為了用生物素來功 能化L-FND，將1%生物素化的PEG2000-DSPE加到脂質混合物中，以形成生物素化的L-FND(bL-FND)。然而，bL-FND容易在PBS中聚集(表1)。如先前文獻所述26，膠體顆粒在溶液中的穩定性，取決於各種力的整合，包括凡得瓦爾力、雙電層力及立體阻礙力。因此，本實驗例係提高FND表面上的立體阻礙力以解決該問題。實際上，如果bL-FND含有更高百分比的PEG2000-DSPE，則可以在很大程度上解決聚集問題(表1)。對於含有9% PEG2000-DSPE和1%生物素-PEG2000-DSPE(總共10% PEG2000-DSPE)的bL-FND，穿透電子顯微鏡(TEM)的成像結果顯示，顆粒上有非常薄的脂質層(圖2A)。前述bL-FND在DDW和PBS中的尺寸分佈分別為146±5nm至157±3nm(圖2B)，顯示脂質披覆FND可以穩定地分散在高離子強度介質中。相反地，沒有脂質披覆的FND，其尺寸分佈從DDW中的92nm急劇增加到PBS中的924nm。50nm FND在披覆前(在DDW中為45nm，而在PBS中為479nm)和用bL披覆後(DDW中為60nm，而PBS中為77nm)也有類似的結果(圖2C)。
Figure 107118058-A0305-02-0013-1
如圖11所示，本發明另一實施例提供了一種脂質披覆FND。該脂質披覆FND在其表面係以順丁烯二醯亞胺修飾，並包含有順丁烯二醯亞胺修飾的脂質(即兩親性)膠囊和功能化鑽石晶體核心。詳細而言，脂質膠囊含有4%的L-α-卵磷脂(蛋PC)、9%的1,2-二硬脂醯基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[甲 氧基(聚乙二醇)-2000(PEG2000-DSPE)、1%的1,2-二硬脂醯基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[順丁烯二醯亞胺(聚乙二醇)-2000](PEG2000-DSPE-順丁烯二醯亞胺)及50%膽固醇。PEG2000-DSPE-順丁烯二醯亞胺在本實施例中係提供接枝的功能。當經順丁烯二醯亞胺修飾的脂質披覆FND與抗人類CD44抗體綴合時，它們能夠專一性標靶/標記HeLa細胞(ATCC® CCL-2TM)表面上的CD44抗原。免疫染色結果如圖12所示。
如圖13所示，本發明又一實施例提供了一種脂質披覆FND。該脂質披覆FND是以DOTAP(1,2-二油醯基-3-三甲基銨-丙烷)對其表面修飾，且包含有DOTAP-修飾的脂質(即兩親性)膠囊和功能化鑽石晶體核心。詳細而言，脂質膠囊含有40%或45%的L-α-卵磷脂(蛋PC)、1%或5%的1,2-二油醯基-3-三甲基銨-丙烷(DOTAP)及50%的膽固醇。該脂質披覆FND的尺寸分佈顯示於下表2中。DOTAP分子可能有助於提高本實施例的脂質披覆FND的表面電位(ζ-電位)。如下表3所示，當脂質膠囊中DOTAP的含量增加時，脂質披覆FND的表面電位會逐漸從負變為正。
Figure 107118058-A0305-02-0014-2
表3：由下列比例所製成的脂質披覆FND在DDW中的表面電位(ζ-電位)：(A)僅FND、(B)50% EGG PC及50%膽固醇、(C)49% EGG PC、50%膽固醇及1% DOTAP、(D)45% EGG PC、50%膽固醇和5% DOTAP。
Figure 107118058-A0305-02-0015-3
如圖14所示，本發明又一實施例提供一種脂質披覆FND。該脂質披覆FND其表面係被硬脂酸修飾，且包含有硬脂酸修飾的脂質(即兩親性)膠囊及功能化鑽石晶體核心。詳細而言，脂質膠囊含有硬脂酸及膽固醇。
如圖1527所示，本發明又一實施例提供了一種脂質披覆FND。該脂質披覆FND包含功能化鑽石晶體核心及包覆該功能化鑽石晶體核心的膠囊，並且該膠囊係由複數個兩親性脂肪酸分子所形成。如圖中所示，每個脂肪酸分子包含有親水性頭部和兩個脂質尾部。每個脂肪酸分子與附近的(即相鄰的)脂肪酸分子形成共價連接。此外，每個脂質尾部也與其相鄰的脂質尾部形成共價連接。該脂質披覆FND是光交聯脂質所披覆的FND(FND-PCL)。簡言之，前述脂質披覆FND可以下列方式合成：首先將FND、1,2-雙(10,12-tricosadiynoyl)-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼(二炔PC)及膽固醇溶解在去離子蒸餾水(DDW)和四氫呋喃(THF)的混合溶液中。透過蒸發除去THF後，脂質會透過Ouzo效應自動排列在FND表面上，產生脂質披覆的FND。接著用254nm的UV照射溶液，獲得FND-PCL。在UV照射後，每個脂質尾部與其相鄰的脂質尾部交聯。前述光交聯脂質所披覆的FND(FND-PCL)的合成方式、特性及應用可參考Hsieh F-J等人的論文「以脂質包覆螢光奈米鑽石的相關光-電子顯微鏡檢測方法來進行細胞表面抗原的奈米定位」(Anal Chem 2018 90(3)：1566-1571)，該文獻通過引用整體併入本文。
實驗例2：免疫染色
在將bL-FND用來作為螢光標記物的說明中，係以三明治免疫染色法將bL-FND用來標記HeLa細胞表面上的CD44抗原(圖16)。簡言之，首先將HeLa細胞用4%聚甲醛固定。接著，將細胞依序用生物素化的抗-CD44抗體、DyLight488綴合的中性卵白素及bL-FND以100μg/mL的顆粒濃度染色30 分鐘(圖16)。細胞的共軛焦螢光成像結果，顯示FND和DyLight488(圖3中的B)共同定位於細胞膜上，證實了顆粒的高專一性標記能力。以488nm的雷射來激發DyLight488而以561nm的雷射來激發FND，並且分別在500至550nm和600至800nm收集對應的螢光訊號以獲得螢光圖像。為了決定FND表面上生物素的最佳含量，以不同生物素莫耳比例(即0%、0.5%或1%)所製備的bL-FND，來標記HeLa細胞上的CD44抗原。流式細胞儀(圖4A至圖4C)的分析結果顯示，含有較高量生物素的bL-FND，具有較高的標靶效率，但效果在1%就到達平原期。基於上述結果，選擇含有1%生物素-PEG2000-DSPE和9%PEG2000-DSPE的bL-FND用於後續研究。
接著，透過流式細胞儀來研究標記的劑量依賴性，主要是要解決非專一性標記的問題。如圖5所示，在HeLa表面上的FND量，隨著顆粒濃度增加至700μg/mL平穩增加。
儘管較高濃度的bL-FND將螢光強度從100至700μg/mL提高了約4倍，但非專一性標記也使信號提高。在700μg/mL時，非專一性標記佔總信號的6%。為了避免表面CD44的非專一性標記，後續表面抗原的奈米級定位實驗所使用的bL-FND濃度為100μg/mL。
bL-FND已被證實在濃度為100μg/mL時沒有非專一性標記，圖3中所顯示的圖像係經過放大來分別檢測顆粒(圖3中的D)。大多數的紅色螢光斑點係具有繞射限制尺寸(diffraction-limited size)，表示其為單顆的FND顆粒。前述顆粒沒有光褪色(圖3中的E)，與DyLight488(圖3中的F)形成鮮明對比，其在激發雷射的第二次掃描期間幾乎無法檢測到螢光發射以獲得圖像。如對照實驗所示，在HeLa細胞的表面基本上沒有出現CD44的非專一性bL-FND標靶(圖19)。
將以ND為基礎的免疫染色技術進一步應用於其他細胞，並將其性能與染料標記(例如Atto542-生物素)的性能進行比較。在本實驗中，係使用兩種類型的乳癌細胞株：MCF7及ASB145-1R。已知前述細胞在細胞表面表現不同量的CD44。用Atto542-生物素(圖20中的A、C及E)或bL-FND(圖20中的B、D及F)所標記的HeLa細胞其流式細胞儀分析結果顯示，這兩種免疫標 記試劑都可以專一性地標靶細胞表面上的CD44抗原。100-nm bL-FND的表現明顯優於Atto542-生物素，儘管其尺寸較Atto542-生物素大得多。
實驗例3：絕對定量
即使在700μg/mL的濃度下，仍觀察到表面抗原未被完全標靶或飽和的結果(圖5)，其顯示顆粒的數量太低而無法標記。對於100-nm的bL-FND來說，700μg/mL的濃度相當於4 x 1011顆粒/mL，其低於DyLight488(1mM)超過6個量級。為了克服這一限制，並保持重量濃度相同為100μg/mL，將顆粒尺寸減少到100、50到35奈米，能有效地將顆粒數量增加了1倍、8倍到24倍。(圖6A至圖6C)接下來，以發明人所製備的這三種顆粒類型，來對HeLa細胞表面上的bL-FND進行絕對定量，其係使用如先前文獻中所述的磁性調變螢光技術28。簡言之，標記有bL-FND的細胞係透過音波處理以從膜上釋放顆粒，接著用具有磁調變功能的自製螢光光譜儀來測量經音波處理後的細胞懸浮液，以消除背景螢光(圖21)。當顆粒濃度低-小於1μg/mL時-此特徵尤其重要，其中水的拉曼峰在光譜中占主導地位(圖6A)28。接著將測得的總螢光強度與各個樣品的校正曲線進行比較，以獲得顆粒數。
圖6B顯示了三種標記試劑的測量結果。對於100nm的bL-FND來說，在每個HeLa細胞表面上測到有5.3 x 103個bL-FND，其僅代表細胞膜上CD44抗原的一部分。接下來，嘗試由50-nm顆粒製成的bL-FND。在相同的質量單位下，FND包覆過程中所使用的脂質量增加了2倍，因為FND的專一性表面積隨著粒徑的減小而線性增加。當標記中使用了35-nm的bL-FND時，檢測到的抗原數量急劇增加至3.2 x 104個並進一步攀升至6.2 x 104個。令人滿意地，增加的趨勢與細胞培養基中三種顆粒之間的相對數量一致(圖6B)，顯示使用100nm的bL-FND來進行標記也不是擴散限制過程。由於表面上有如此大量的抗原，透過流式細胞儀可以容易地檢測到螢光信號，如圖6C所示。
為了驗證用35-nm bL-FND作為生物標記細胞表面抗原的絕對定量方法的可靠性，將本方法與其他方法進行比較是至關重要的。為此目的，將實驗例的結果與QuantiBRITE-PE方法的結果進行比較，前述QuantiBRITE-PE方法係使用帶有已知數量R-藻紅素(R-phycoerythrin，R-PE)分子的胺基功能化(amino-functionalized)聚(甲基丙烯酸甲酯)(poly(methyl methacrylate)，PMMA)小珠，以流式細胞儀來分析與細胞結合的R-PF綴合抗體數量29,30。因為不會自 猝熄且可以形成明確定義的抗體綴合物，所以選擇R-PE作為定量螢光染料。與FND定量類似，細胞的抗體結合能力(antibody-binding capacity，ABC)，可以將流式細胞儀的信號與R-PE綴合PMMA小珠(直徑6μm)的校正曲線進行比較來決定。以這種商售的試劑盒，測出ABC為6.9 x 104，其與使用35-nm bL-FND的ABC(6.9 x 104)測定值密切吻合。前述的吻合現象顯示本實驗例的bL-FND奈米珠，可作為定量固定細胞抗體結合能力的工具，而無需使用R-PE。細胞表面上的大多數表位，可以附著於奈米珠的抗體來偵測。
實驗例4：相關光電子顯微鏡(CLEM)
傳統上，細胞表面分子的檢測和定位係透過如R-PE等螢光蛋白分子的單顆粒成像來進行31,32。然而，該分子的光褪色現象，使得它們無法用於長時間追踪。CLEM是最近開發的一種技術，允許用光學顯微鏡(light microscopy，LM)和電子顯微鏡(electron microscopy，EM)分析相同的樣品。與陰極發光不同，圖像是用兩種截然不同的儀器獲得的，因此對相同的物體進行微米級的定位相當重要。因此，必須將膠體金顆粒(例如直徑為15nm)添加到網格(及切片)中作為樣本對準基標(fiducial marker)。另外，為了保持樣品的形態，最好將LM的樣品嵌入後再進行EM。然而，後嵌入方法需要在TEM網格上以重金屬進行染色，之後對切片進行直接LM成像。雖然有一些螢光蛋白33及化學標籤34的成功案例，這種研究仍然是一個挑戰。
FND是一種奈米材料，其具有高螢光能力和透過EM可見的緻密碳核心。此外，以螢光成像所進行的奈米材料檢測相容於後嵌入技術，其係涉及用重金屬(如醋酸鈾)來染色樣品，以在EM中進行結構保存。其高相容性係導因於FND的螢光中心係深埋在鑽石基質內部，且其性質對環境變化不敏感。圖7顯示未標記HeLa細胞的TEM圖像，以及用生物素-抗CD44抗體、中性卵白素、接著以bL-FND來標記的HeLa細胞TEM圖像。在薄切樹脂包埋樣品中，可以在細胞表面上單獨識別出100-nm的FND顆粒，其解析度優於10nm。更重要的是，EM圖像(圖8A)及LM圖像(圖8B)可以使用FND作為基準點而容易地重疊(圖8C)。當螢光圖像傾斜17°時，有多達30個顆粒顯示兩個圖像對齊良好。本實驗例也顯示了螢光斑點的放大圖，且其符合點擴散函數(數據未顯示)。由於100-nm的bL-FND具有高亮度及完美光穩定性，所以可以高於50nm的準確度來進行CD44抗原的位置定位(數據未顯示)。LM及EM的組合分析， 能夠以前所未有的精準度來對HeLa細胞表面的CD44抗原進行定位。圖9是透過疊加SEM和LM圖像所完成的另一個CLEM的實例。由於FND的堅固結構，FND可以作為基標，以在嚴格的環境下標記出細胞表面上抗原的位置。相較之下，在樣品製備及EM觀察後，常規染料(即Alexa螢光)即會褪色。圖10顯示以FND來標定牛痘病毒在HeLa細胞表面上的位置。
綜上所述，本發明提供的奈米鑽石顆粒複合物已被證明可作為具有獨特磁光性質的生物相容性奈米探針，其具有極高的光穩定性，可磁調變的螢光強度和長螢光壽命。如果奈米顆粒具有特定的標靶能力，與前述性質綜合起來，可以使其用來進行高品質和無背景的奈米等級細胞組成成像和定位。本文顯示，透過利用Ouzo效應，可以容易地將在空氣中表面氧化的螢光奈米鑽石包覆在脂質中。並且，這些脂質包覆的螢光奈米鑽石，在將脂質層適當地接上生物活性分子(如生物素)後可用作專一性細胞標靶劑。前述脂質包覆的螢光奈米鑽石已經應用以CLEM來對HeLa細胞膜上的CD44抗原進行絕對定量和奈米級定位，以證明該原理。該方法是通用且適用於其他生物分子，因為現在各種脂質衍生物都是商售可得的，且在對本發明中所示的方案進行微小修改後都能起很好的作用。
本領域所屬領域具有通常知識者應當明瞭，在不脫離本發明概念的情況下，可以對上述實施例進行修改。因此，應當理解的是，本發明不限於所公開的特定實施例，任何未脫離本發明之精神與範疇，而對其進行之等效修改或變更，均應包含於後附之申請專利範圍中。
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Claims (14)

  1. 一種奈米鑽石顆粒複合物，包括：一兩親性膠囊，該兩親性膠囊包括複數個脂肪酸分子，該複數個脂肪酸分子形成部分單層微胞結構，其中該兩親性膠囊更包括一聚乙二醇化的1,2-二硬脂醯基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamines，DSPE)或一10,12-二十三碳二炔酸(10,12-Tricosadiynoic acid)，且該聚乙二醇化的1,2-二硬脂醯基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DSPE)或該10,12-二十三碳二炔酸可以被官能基標記，並且該官能團可以是羥基、羧基、生物素基團、三聚氯化氰修飾基團、硫基基團、順丁烯二醯亞胺基團、炔、疊氮基團、抗體、鹵素配體及其任何組合，該官能基被配置為與一識別分子接枝，並且該識別分子被配置為具有專一性地識別生物樣品的能力；以及一奈米鑽石顆粒，該奈米鑽石顆粒封裝在該兩親性膠囊中，其中該奈米鑽石顆粒具有至少一個氮空位中心。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的奈米鑽石顆粒複合物，其中該聚乙二醇化的1,2-二硬脂醯基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺係PEG2000-DSPEs，且其被生物素標記的PEG2000-DSPEs(生物素-PEG2000-DSPEs)和未用生物素標記的PEG2000-DSPEs(PEG2000-DSPEs)之間的含量比例為1：0.001至1：10。
  3. 如申請專利範圍第1項所述的奈米鑽石顆粒複合物，其中該奈米鑽石顆粒複合物的直徑介於1nm至1μm之間。
  4. 一種用於標靶一生物樣品的試劑盒，包括：如申請專利範圍第1項至第3項任一項所述的一奈米鑽石顆粒複合物；該識別分子，被配置為具有專一性地識別該生物樣品的能力；以及一接枝分子，被配置具有與該識別分子及該奈米鑽石顆粒複合物結合的能力，其中該奈米鑽石顆粒複合物的濃度介於0.01μg/mL至2000μg/mL之間。
  5. 一種用於標靶一生物樣品的方法，包括以下步驟：用如申請專利範圍第1項至第3項任一項所述的奈米鑽石顆粒複合物處理該生物樣品，該奈米鑽石顆粒複合物被配置為具有專一性地識別該生物樣品的能力。
  6. 如申請專利範圍第5項所述的方法，更包括以下步驟： 以光學顯微鏡、電子顯微鏡或相關的光電子顯微鏡觀察經該奈米鑽石顆粒複合物處理的該生物樣品。
  7. 如申請專利範圍第5項所述的方法，更包括以下步驟：用一第一試劑及一第二試劑依序處理該生物樣品，該第一試劑包含該識別分子，該識別分子被配置為具有專一性地識別該生物樣品的能力，該第二試劑包含一接枝分子，該接枝分子被配置為能夠與該識別分子結合，然後執行用該奈米鑽石顆粒複合物處理該生物樣品的步驟。
  8. 一種如申請專利範圍第1項至第3項任一項所述的奈米鑽石顆粒複合物用於作為光學顯微鏡、電子顯微鏡或相關光-電子顯微鏡中的標記試劑的用途。
  9. 一種如申請專利範圍第1項至第3項任一項所述的奈米鑽石顆粒複合物用於量化該生物樣品中的一細胞表面抗原的用途。
  10. 如申請專利範圍第9項所述的用途，量化該細胞表面抗原的量是藉由一外加磁場的協助下測量該生物樣品中的該奈米鑽石顆粒複合物的濃度來計算。
  11. 一種量化一生物樣品中如申請專利範圍第1項至第3項任一項所述的奈米鑽石顆粒複合物的濃度的方法，包括：提供待測的該生物樣品；將該奈米鑽石顆粒複合物應用於該生物樣品；以及測量由該奈米鑽石顆粒複合物所發射的一螢光信號，以決定該生物樣品中該奈米鑽石顆粒複合物的濃度。
  12. 如申請專利範圍第11項所述的方法，該奈米鑽石顆粒複合物的該螢光信號是於一磁場下進行測量。
  13. 一種用於一生物樣品成像的方法，包括：用如申請專利範圍第1項至第3項任一項所述的奈米鑽石顆粒複合物標記該生物樣品；用激發的能量照射標記的該生物樣品；以及 產生至少一部分該生物樣品的圖像，該圖像是基於從被激發的該生物樣品收集的信號所生成，其中該奈米鑽石顆粒複合物的直徑為1nm至1mm且具有至少一個氮空位中心。
  14. 如申請專利範圍第13項所述的方法，其中該激發的能量是電子、光、微波、無線電波、紅外線、X射線、伽馬射線、宇宙射線或其組合。
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