CN104853669B - 具有荧光及生物发光源的交叉形态加权特征的漫射介质成像的系统、方法及设备 - Google Patents

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Abstract

在某些实施例中，本发明涉及用于荧光探针及/或生物发光报道子的活体内断层成像的系统及方法，其中荧光探针及生物发光报道子在空间上共同定位(例如，以等于或小于光的散射平均自由程的距离定位)于漫射介质(例如，生物组织)中。根据本文中所描述的方法组合从生物发光形态与荧光形态获得的测量。

Description

具有荧光及生物发光源的交叉形态加权特征的漫射介质成像 的系统、方法及设备
相关申请案
本申请案主张2012年10月15日申请的第61/714,198号美国临时专利申请案的优先权及权益并将所述临时专利申请案以全文引用方式并入本文中。
技术领域
本发明大体上涉及活体内成像系统及方法。更特定来说，在某些实施例中，本发明涉及采用共同定位的荧光源及生物发光源的断层成像系统。
背景技术
漫射介质中的成像主要由于其在生物学及医学方面的应用而成为有吸引力的研究领域，其在例如癌症研究、药品开发、炎症及分子生物学方面显示出巨大潜力。随着高度特定可激活荧光探针的发展，在活体内以分子水平获取信息的新方式已成为可能。由于组织中存在的固有散射以光学波长进行，所以光在组织中经多重散射的且其原始传播方向在称作散射平均自由程lsc(一段表示组织的不同成分的散射的密度及效率的距离)的距离之后被随机化。即使可记录来自组织的荧光或生物发光发射的图像，但由于散射的存在，这些图像与荧光探针或生物发光报道子的浓度、大小及位置存在非线性关系，从而导致称作病态问题的问题。近来开发的方法及系统通过引入荧光对激发的空间依赖性且通过漫射近似法对组织中的光传播进行适当建模来利用断层成像途径减轻此病态性，从而能够恢复具有约为散射平均自由程(lsc)或更好的分辨率的荧光浓度的空间分布。在理想状况下，假设在测量荧光时可完全阻断激发光，这些断层成像技术的灵敏度将仅取决于检测器效率及探针亮度以及存在于组织中的吸收。在这种理想情况下，由于发射强度及激发强度彼此成比例(至少对于小动物成像可接受的功率来说如此)，所以可通过增大激光功率来提高灵敏度，这可确保在组织内不会出现明显的加热。
然而，活体内测量的实际情况是完全不同的。由于组织中始终存在着周围自发荧光的激发，所以系统的灵敏度在很大程度上取决于区分归因于荧光探针而引起的特定信号与周围自发荧光的非特定信号的能力。这种问题在以反射模式激发时变得更加明显，这是因为更大的自发荧光贡献将来自最靠近相机的组织切片。实际上，断层成像数据或一般来说荧光数据的任何集合的灵敏度由自发荧光在与特定信号相比时的水平确定。这个问题通过使用远红外或近红外(NIR)荧光信号而在一定程度上得到克服，这是因为组织自发荧光在光谱的这一部分中稍微减少，其中额外优点是组织在光谱的这一部分中呈现较低的吸收特性。这是使用在光谱中的远红外或近红外部分中发射的荧光探针时的情况，所述荧光探针在存在特定的分子活动时被激活。这种类型探针的优点是其提供了高信噪比。然而，在大多数实际例子中，可检测到的信号的数量取决于有多少特定信号超出周围组织自发荧光。
为了将特定信号的贡献与非特定信号的贡献分离，最常见的途径是在假设发射光谱已知的情况下运用多光谱测量。尽管这种途径稍微提高了灵敏度，但问题依然存在；在所测量的每一发射波长处，存在来自组织自发荧光的未知贡献。特定信号越弱，自发荧光的影响越占主导地位。
生物发光报道子提供以下显著优点：不需要外部照明以将其置于激发态使得其将发射光。由于是通过化学反应达到激发态，所以发射的光表示成像问题的无背景解决方案，这类似于先前段落提到的荧光的理想情况。生物发光的此固有益处也存在一些缺陷，特定来说与上文所提到的病态问题相关。由于当前不可能有效地引入对此发射的强度的空间依赖性(然而这在荧光的情况下是可能的)，所以不可能同时恢复生物发光探针浓度的空间分布。因此，因为主要目标是恢复探针浓度的空间分布，所以在生物发光的情况下无法像在荧光的情况下那样实质上减少病态问题。
需要一种光学成像系统，在所述光学成像系统中，可将生物发光探针的低背景及不存在自发荧光与由荧光探针展现出的特定性、高量子产率及发射强度调制的外部能力相结合。
发明内容
在某些实施例中，本发明涉及用于荧光探针及/或生物发光报道子的活体内断层成像的系统及方法，其中荧光探针及生物发光报道子在空间上共同定位(例如，以等于或小于光的散射平均自由程的距离定位)于漫射介质(例如，生物组织)中。根据本文中所描述的方法组合从生物发光形态与荧光形态获得的测量。
在一个方面中，本发明提供一种用于对漫射物体的靶区域进行成像的方法，所述方法包括：(a)向物体施用生物发光底物(及/或化学发光底物)；(b)通过所述物体的所述靶区域中的生物发光报道子检测从所述物体发射的生物发光光(及/或化学发光光)(例如，使用外部检测器)；(c)向物体施用包括荧光物质(及/或联合的荧光/生物发光物质)的探针；(d)在多个位置处及/或以多个角度将激发光引导到所述物体中，借此激发所述荧光物质；(e)检测荧光光(例如，作为检测器位置、激发光源位置或检测器位置及激发光源位置两者的函数)，所述检测到的荧光光已由于所述激发光的激发而由所述漫射物体的靶区域中的所述荧光物质发射；(f)检测激发光(例如，作为检测器位置、激发光源位置或检测器位置及激发光源位置两者的函数)，所述检测到的激发光已透射穿过所述漫射物体的所述区域(透射式照明)或已从所述漫射物体的所述区域反射(落射式照明)；及(g)处理对应于所述检测到的生物发光光、所述检测到的荧光光及所述检测到的激发光的数据以提供所述漫射物体内的所述靶区域的图像。
在某些实施例中，生物发光报道子是内源性的。在某些实施例中，生物发光报道子在物体内部由生物发光细胞系表示。在某些实施例中，生物发光报道子是外源性地施用的。在某些实施例中，生物发光报道子作为串联生物发光-荧光探针的组件向所述物体施用。
在某些实施例中，在步骤(c)之后，生物发光报道子中的至少一些与(荧光)探针中的至少一些实质上共同定位于所述物体的靶区域中。在某些实施例中，在步骤(c)之后，所述生物发光报道子也存在于所述物体中不与所述(荧光)探针实质上共同定位的一或多个位置处。在某些实施例中，步骤(c)中的探针包括荧光物质及与荧光物质串联的生物发光报道子两者(例如，生物发光报道子及荧光探针包括单一构造)。在某些实施例中，不要求生物发光报道子及荧光物质在FRET型距离内成对或共同定位。共同定位可意味着定位于宏观层面的距离内。举例来说，在某些实施例中，甚至在生物发光报道子及荧光物质分离达宏观层面的距离(举例来说，长达约1mm或长达约2mm，而非如在FRET及BRET中长达约5到10nm)的情况中也可使用所述方法。
在某些实施例中，漫射物体包括活的生物组织(活体内成像)。在某些实施例中，漫射物体是哺乳动物。在某些实施例中，所述靶区域的图像是断层成像图像。在某些实施例中，所述方法进一步包括在步骤(b)、(d)、(e)及(f)之前将所述物体放置在固持器内。举例来说，在某些实施例中，所述靶区域的图像是断层成像图像，且其中所述物体的表面至少部分由所述固持器保形使得所述表面可由连续函数表征(例如，以笛卡尔坐标、极坐标或柱面坐标)，借此促进断层成像重构。
在某些实施例中，步骤(b)包括使用定位于所述物体外部的检测器检测生物发光光。在某些实施例中，步骤(b)包括根据检测器位置检测生物发光光。在某些实施例中，步骤(b)包含使用与所述物体光学接触的检测器(例如，检测器的组件与物体本身或与所述物体物理接触的透明表面物理接触，且/或使用光导、光纤引导件、光学匹配流体及/或透镜使得光学接触在检测期间得以维持)检测生物发光光。在某些实施例中，步骤(b)包括使用检测器检测生物发光光，所述检测器经定位使得在所述检测器与所述物体之间存在非漫射介质(例如，空气层)。在某些实施例中，步骤(b)包括使用发射滤光片检测生物发光光。在某些实施例中，步骤(b)包括在不使用发射滤光片的情况下检测生物发光光。
在某些实施例中，步骤(c)中的所述探针是可见光探针或近红外荧光探针(例如，NIRF分子探针、红色剂等)。
在某些实施例中，步骤(d)包括将可见光及/或近红外光引导到所述物体中。在某些实施例中，步骤(d)包括将激发光的点源引导到所述物体中。在某些实施例中，步骤(d)包括同时将激发光的多个源引导到所述物体中。在某些实施例中，步骤(d)包括将结构化激发光引导到所述物体中。在某些实施例中，步骤(d)包括在多个离散位置处(例如，位置阵列)及/或以多个离散角度(例如，角度阵列)将激发光引导到所述物体中，将激发光引到物体中的每一例子在离散时间处发生。
在某些实施例中，所述方法包括在离散位置处及/或以离散角度将激发光引导到所述物体中的每一例子之后执行步骤(e)及(f)。在某些实施例中，步骤(d)包括同时在多个离散位置处(例如，位置阵列)及/或以多个离散角度(例如，角度阵列)将所述激发光引导到所述物体中。在某些实施例中，步骤(d)包括扫描所述物体上方的所述激发光。在某些实施例中，在步骤(f)中检测到的所述激发光包括连续波(CW)光、时间分辨(TR)光及强度调制(IM)光中的至少一者。
在某些实施例中，步骤(e)包括使用定位于所述物体外部的检测器检测从所述物体的所述靶区域发射的荧光光。在某些实施例中，步骤(e)包括检测在与步骤(d)中激发光被引导到其中的侧相同的物体的侧上的荧光光(例如，落射式照明)。在某些实施例中，步骤(e)包括检测在与步骤(d)中激发光被引导到其中的侧相对的所述物体的侧上的荧光光(例如，透射式照明)。在某些实施例中，步骤(e)包括使用与所述物体光学接触的检测器(例如，所述检测器的组件与所述物体本身或与所述物体物理接触的透明表面物理接触，且/或使用光导、光纤引导件、光学匹配流体及/或透镜使得光学接触在检测期间得以维持)检测从所述物体的所述靶区域发射的荧光光。在某些实施例中，步骤(e)包括使用检测器检测从所述物体的所述靶区域发射的荧光光，所述检测器经定位使得在所述检测器与所述物体之间存在一非漫射介质(例如，空气层)。
在某些实施例中，步骤(f)包括使用定位于所述物体外部的检测器检测透射穿过所述物体的所述靶区域或从所述物体的所述靶区域反射的激发光。在某些实施例中，步骤(f)包括使用与所述物体光学接触的检测器(例如，所述检测器的组件与所述物体本身或与所述物体物理接触的透明表面物理接触，且/或使用光导、光纤引导件、光学匹配流体及/或透镜使得光学接触在检测期间得以维持)检测透射穿过所述物体的所述靶区域或从所述物体的所述靶区域反射的激发光。在某些实施例中，步骤(f)包括使用检测器检测透射穿过所述物体的所述靶区域或从所述物体的所述靶区域反射的激发光，所述检测器经定位使得在所述检测器与物体之间存在非漫射介质(例如，空气层)。
在某些实施例中，步骤(e)包括从多个投影及/或视图检测所述荧光光。在某些实施例中，步骤(f)包括从多个投影及/或视图检测所述激发光。
在某些实施例中，所述物体的所述靶区域是三维区域且步骤(g)包括提供对应于所述三维靶区域中的荧光物质的断层成像图像。在某些实施例中，所述断层成像图像指示探针(例如，其中所述探针包括荧光物质及/或联合的荧光/生物发光物质)在所述靶区域内的三维空间分布。在某些实施例中，所述断层成像图像指示随在所述物体的所述靶区域内的位置而变化的探针的浓度。在某些实施例中，所述断层成像图象指示作为三维位置的函数的探针的浓度。
在某些实施例中，所述物体的所述靶区域是三维区域且步骤(g)包括提供对应于三维靶区域中的生物发光报道子的断层成像图像。在某些实施例中，所述断层成像图像指示生物发光报道子在所述靶区域内的三维空间分布。在某些实施例中，所述断层成像图像指示随在所述物体的所述靶区域内的位置而变化的生物发光报道子的浓度。
在某些实施例中，所述生物发光报道子及所述荧光物质具有不同的发射光谱。
在某些实施例中，步骤(g)包括利用对应于所述检测到的生物发光光的数据将对应于所述检测到的荧光光的数据进行加权，及利用对应于所述检测到的激发光的数据将对应于所述检测到的荧光光的数据进行正规化。在某些实施例中，步骤(g)包括利用对应于所述检测到的生物发光光的数据将对应于所述检测到的荧光光的数据进行加权，及接着利用对应于所述检测到的激发光的数据将所述所得加权数据正规化，接着对相关联的权重矩阵进行求逆以获得所述物体的所述靶区域中的所述荧光物质的断层成像图像/所述断层成像图像。在某些实施例中，步骤(g)包括利用对应于所述检测到的生物发光光的数据将对应于所述检测到的荧光光的数据进行加权，及利用对应于所述检测到的生物发光光的数据将相关联的权重矩阵进行加权，接着对所述权重矩阵进行求逆以获得所述物体的所述靶区域中所述荧光物质的断层成像图像/所述断层成像图像。在某些实施例中，步骤(g)包括利用对应于所述检测到的荧光光且以对应于所述检测到的激发光的数据进行正规化的数据将对应于所述检测到的生物发光光的数据进行加权，接着对相关联的权重矩阵进行求逆以获得所述物体的所述靶区域中的所述生物发光报道子的断层成像图像/所述断层成像图像。
在某些实施例中，在与步骤(e)及(f)中的检测不同的时间处执行步骤(b)中的检测(例如，因为探针的药物动力学与底物的药物动力学可能是不同的)。在某些实施例中，为了捕获单一的“时间点”，将测定生物发光底物及荧光探针的施用(例如，注射)时间使得两种形态的图像可紧接着执行。经由两个模式的成像不需要在(例如)经装备以在两种形态中均成像的仪器中精确地同时发生。可使用两个接近的单形态仪器进行成像，使得可执行在一个仪器中成像物体(例如，活的动物)，且所述动物可(例如，在几分钟内)穿梭到第二个仪器。举例来说，可使用动物固持器，例如，以引用方式并入本文中的第US 2011/0071388号美国专利申请公开案中描述的动物固持器。
在另一方面中，本发明提供一种用于对漫射物体的靶区域进行成像的方法，所述方法包括：(a)向物体施用生物发光底物(及/或化学发光底物)；(b)通过所述物体的所述靶区域中的生物发光报道子检测从所述物体发射的生物发光光(及/或化学发光光)(例如，使用外部检测器)；(c)向物体施用包括荧光物质(及/或联合的荧光/生物发光物质)的探针；(d)检测荧光光(例如，随检测器位置而变化)，所述检测到的荧光光已由于所述生物发光光的激发(例如，通过辐射转移的荧光的生物发光刺激)由所述漫射物体的所述靶区域中的所述荧光物质发射；及(e)处理对应于所述检测到的生物发光光及所述检测到的荧光光的数据以提供在所述漫射物体内的所述靶区域的图像。
在某些实施例中，所述方法进一步包括将光(例如，在激发波长处)引导到所述物体中及检测已透射穿过所述漫射物体的所述区域(透射式照明)或已从所述漫射物体的所述区域反射(落射式照明)的光(例如，以提供一种代理衰减映射)，及使用对应于步骤(g)中的所述检测到光的数据(例如，使用代理衰减映射)以及对应于所述检测到的生物发光光及所述检测到的荧光光的数据以提供所述漫射物体内的所述靶区域的图像。
在另一方面中，本发明提供一种用于对漫射物体内的靶区域进行成像的系统，所述系统包括：激发光源；光学成像设备，其经配置以在多个位置处及/或以多个角度将来自激发光源的光引导到所述漫射物体中；一或多个检测器，所述一或多个检测器个别地或共同地经配置以检测及/或测量(例如，随检测器位置、激发光源位置或检测器位置及激发光源位置两者而变化)以下光：(i)从所述物体发射的生物发光(及/或化学发光)光；(ii)由于所述激发光的激发由所述漫射物体的靶区域中的荧光物质发射的荧光光；及(iii)已透射穿过所述漫射物体的所述区域或已从所述漫射物体的所述区域反射的激发光；及处理器，其经配置以处理对应于所述检测到的生物发光光、所述检测到的荧光及所述检测到的激发光的数据以提供所述漫射物体内的所述靶区域的图像。
在另一方面中，本发明提供一种用于重构漫射物体的靶区域内的探针的断层成像表示的设备，所述设备包括：存储器，其存储定义指令集的代码；及处理器，其执行所述指令借此处理对应于以下操作的数据：(a)使用以下数据建立从激发光源到所述物体的所述靶区域内的探针的激发光传播及从所述探针到检测器的发射光传播的正演模型：(i)对应于来自所述探针的检测到的荧光光的数据；(ii)对应于已透射穿过所述漫射物体的所述区域或已从所述漫射物体的所述区域反射的检测到的激发光的数据；及(iii)对应于从生物发光报道子发射的检测到的生物发光光的数据，其中生物发光报道子中的至少一些与(荧光)探针中的至少一些实质上共同定位于所述物体的所述靶区域中，且其中正演模型作为权重矩阵而建立；及(b)对所述权重矩阵进行求逆以获得所述漫射物体的靶区域内的所述探针的断层成像表示。
在另一方面中，本发明提供一种非暂时性计算机可读媒体，所述非暂时性计算机可读媒体在其上具有指令，所述指令在由处理器执行时致使所述处理器执行以下操作：(a)使用以下数据建立从激发光源到所述物体的所述靶区域内的探针的激发光传播及从所述探针到检测器的发射光传播的正演模型：(i)对应于来自探针的检测到的荧光光的数据；(ii)对应于已透射穿过所述漫射物体的所述区域或已从所述漫射物体的所述区域反射的检测到的激发光的数据；及(iii)对应于从生物发光报道子发射的检测到的生物发光光的数据，其中生物发光报道子中的至少一些与(荧光)探针中的至少一些实质上共同定位于所述物体的所述靶区域中，且其中正演模型作为权重矩阵而建立；及(b)对权重矩阵进行求逆以获得漫射物体的所述靶区域内的探针的断层成像表示。
在另一方面中，本发明提供一种用于对漫射物体的靶区域进行成像的方法，所述方法包括：(a)通过所述物体的靶区域中的生物发光报道子检测从所述物体发射的生物发光(及/或化学发光)光(例如，使用外部检测器)；(b)在多个位置处及/或以多个角度将激发光引导到所述物体中，借此激发漫射物体的靶区域中的探针(例如，荧光探针或荧光/生物发光串联探针)的荧光物质；(c)检测随检测器位置、激发光源位置或检测器位置及激发光源位置而变化的荧光光，所述检测到的荧光光已由于所述激发光的激发而由荧光物质发射；(d)检测随检测器位置、激发光源位置或检测器位置及激发光源位置两者而变化的的激发光，所述检测到的激发光已透射穿过所述漫射物体的所述区域或已从漫射物体的所述区域反射；及(e)处理对应于检测到的生物发光光、检测到的荧光光及检测到的激发光的数据以提供所述漫射物体内的所述靶区域的图像。
来自本发明的一个方面的实施例的元素可在本发明的其它方面中使用(例如，取决于一个独立权利要求的权利要求的元素可使用于进一步指定其它独立权利要求的实施例)。本发明的其它特征及优点将从以下图式、详细描述及所附权利要求书变得明了。
参考下文描述的图式及所附权利要求书可更好地理解本发明的目的及特征。在图式中，贯穿各种视图使用相同数字来指示相同部分。
附图说明
图1为描绘由生物发光源产生的图像及由荧光源产生的图像之间的比较的示意图，其强度可通过改变激发源的强度来外部调制。两个信号的形状应在不存在自发荧光时相同，唯一的差异在于其绝对强度值方面。
图2为描绘当荧光信号通过自发荧光及背景信号的贡献降级时可如何以生物发光分布识别仅仅归因于荧光团的信息的示意图。
图3为描绘自发荧光的贡献如何随着源位置变化而荧光发射在强度方面变化但不在分布方面变化的示意图。
图4为根据本发明的说明性实施例的描绘组合生物发光与正规化荧光测量以获得荧光及/或生物发光源的3D图像的实例方法的框流程图。
图5展示根据本发明的说明性实施例的组合生物发光与正规化荧光测量以在不存在非特定背景荧光信号的情况下获得准确荧光源的准确3D图像的模拟的结果。
图6展示可用于本文中描述的各种实施例中的漫射光学断层成像系统的示意图。
具体实施方式
预期本文中所描述的方法、系统及工艺涵盖使用来自本文中所描述的实施例的信息所发展的变动及调整。
在整个描述中，在将系统及组合物描述为具有、包含或包括特定组件的情况下，或在将工艺及方法描述为具有、包含或包括特定步骤的情况下，预期：另外存在实质上由所引述的组件组成或由所引述的组件组成的本发明的系统及组合物，或另外存在实质上由所引述的处理步骤组成或由所引述的处理步骤组成的本发明的工艺及方法。
在本文中(例如，在背景技术部分中)提及任何出版物并不承认所述出版物作为相对于本文中呈现的权利要求中的任一权利要求的现有技术。背景技术部分出于清楚目的而呈现且并不意在作为相对于任何权利要求的当前技术的描述。
标题在本文中用于帮助读者且并不意在限制所描述的标的物的解释。
如本文中所使用，术语“图像”理解为表示视觉显示或可经解译以用于视觉显示的任何数据表示。举例来说，三维图像可包含在三个空间维度中变化的具有给定量的值的数据集。三维图像(例如，三维数据表示)可在二维中(例如，在二维屏幕上或在二维打印输出上)显示。
术语“断层成像图像”可指代(例如)光学断层成像图像、x射线断层成像图像、由磁共振、正电子发射断层成像术(PET)、磁共振(MR)、单光子发射计算机化断层成像术(SPECT)及/或超声波产生的断层成像图像及任何这些断层成像图像的任何组合。
如本文中所使用，术语“检测器”包含任何电磁辐射检测器，其包含但不限于，CCD摄像机、光电倍增管、光电二极管及雪崩光电二极管。
如本文中所使用，术语“正演模型”理解为表示在给定介质中(例如)从源到检测器的光传播的物理模型。
本文中描述组合从漫射介质中共存的生物发光及荧光信号获得的信息的测量及分析方法。这些方法增加了漫射介质中的断层成像重构的准确性且增强了在小动物活体内成像研究中获得的定量信息、三维结构信息、功能及分子信息。通过减少生物发光成像的病态性来获得这种准确性的增加，以便在荧光的帮助下从生物发光信号的测量获得三维(3D)重构。
在不存在背景信号的情况下生物发光信号与探针特定荧光信号应在形态方面等价而不是在强度方面等价。提供重构所需的3D信息的是荧光发射的强度，而生物发光发射提供无背景空间信号分布。通过组合生物发光及荧光两者的检测，可检索到由于不存在背景信号而具有优越的生物发光信噪比的3D荧光探针信息。在一些实施例中，本发明进一步实现使用分析工具来组合通过生物发光及荧光测量获得的信息，导致来自两种类型的光源的成像重构的可行性提高。这些工具将通过使用正规化荧光测量向活体内动物光学成像设置提供3D信息，同时在生物发光的帮助下同时提供无自发荧光测量。
成像漫射介质时的主要分析方面中的一者是同时恢复关于一批发光报道子(即，荧光或生物发光)的位置、浓度及分布(或大小)的信息的可行性。在单一激发源的情况下或在不存在单一激发源的情况下(如在生物发光的情况下)，存在将产生完全相同的测量的浓度、位置及大小的无限组合，这导致病态问题。这种病态性的本质根本上由信息在光传播期间丢失的方式表示，如由传递函数指示，所述函数使傅里叶空间中空间频率K在平面z’处的强度的空间分布与另一平面z处的强度的空间分布相关：
H(K，z-z′)＝exp(iq(K)|z-z′|) (1)
一种减少病态问题的方法是以受控方式改变发射强度，使得空间依赖性被引入。在荧光的情况下，这可直接通过激发源Uexc(r)来完成：
S(r)＝σabs[C(r)φ(λem)Uexc (2)
其中σabs表示荧光团的吸收截面，[C(r)]表示其浓度，Φ(λem)表示其量子产率，且Uexc(r)表示激发强度的空间分布。然而，这可能无法在生物发光中完成。由于在生物发光反应的发射中不能引入空间依赖性，所以恢复生物发光探针的位置、浓度或大小的问题将仍然是极度病态的。这是生物发光的主要缺陷。
在某些实施例中，本文中所描述的方法使用从以与散射平均自由程lsc类似或比散射平均自由程lsc短的距离共同定位的共存生物发光及荧光断层成像信号获得的信息。这导致两个重要的结果。第一，其允许使用由荧光激发源引入的空间依赖性以减小生物发光成像的病态性。这对生物发光探针空间位置及大小的恢复具有直接影响，从而允许在荧光测量的帮助下获得的生物发光数据的3D重构。第二，此方法允许使用生物发光信号高度特定性以通过提供将允许区分特定荧光信号与背景信号或自发荧光信号的信息来提高共同定位的荧光信号的断层成像的重构的准确性。这增加且提高了荧光断层成像的分辨率、定量化，并且最重要的是，增加且提高了荧光断层成像的灵敏度。
举例来说，所述方法可用于以下情况：在存在或缺乏背景自发荧光信号或非特定信号(例如，通过发射滤光片泄漏的激发光)时使用串联生物发光-荧光探针或单个或多个共同定位的生物发光报道子及荧光探针。下文呈现可用于组合生物发光与荧光测量的途径的三个实例，从而展现方法的可行性，但不限于这些途径。以下第四实例描述用于获取用于其它实例中的数据的途径，但不将本申请案限于此途径。
生物发光加权荧光数据
作为第一途径，在荧光测量中通过假设针对由Ufl(rs，rd)表示的每一源位置rs及检测器rd存在经测量的生物发光分布Ubio(rd)(在生物发光的情况下仅对检测器具有依赖性)而引入权重。在此情况下，实例途径将把权重确定为：
这将保证权重在[0，1]范围内。待用于重构的荧光测量将为如下：
存在多种选择权重h的方法。另一途径为设定测量中的阈值，使得h定义为：
其中H是亥维赛函数，其将针对高于阈值的测量值产生1。此阈值将传播到所有荧光测量，在这种情况下，用于荧光重构的实际值不取决于于经测量的荧光信号而是取决于是否具有实际生物发光(及因此无噪声)信号。一旦定义了经加权的荧光测量，即刻执行常规重构方法，首先通过激发Uexc(rs，rd)正规化经加权的荧光：
这种经加权的正规化荧光可用于通过对以下方程式进行求逆来恢复无噪声(或特定)荧光分布F(r)：
Unw(rs，rd)＝∫V W(rs，r′，rd)F(r′)dr′ (7)
其中W是表示组织体积V的每一点对针对以rs为中心的源分布的rd处的测量的期望贡献，且通常称为加权函数。rs及rd两者定位于表面上或与所述表面非常接近。因为存在离散数目的源及检测器，所以以上方程式可经离散化且作为方程组来求解：
取决于对加权函数的选择，可包含关于体积V的不均一性的信息，在这种情况下，以上方程式是非线性的或方程组可经线性化，从而达到玻恩近似(Born Approximation)。
在图5中说明在存在非特定荧光背景的情况下使用串联生物发光及荧光构造将此实例应用于模拟数据。
生物发光加权荧光数据及权重矩阵
在先前实例中，未引入对生物发光报道子及荧光探针的发射光谱的考虑。在特定情况下，当生物发光报道子及荧光探针两者在不同光谱范围处发射时，两者的实际发射分布将是不同的。引入归因于生物发光的权重附带以下假设：荧光光谱及生物发光谱两者是等价的。为使所述假设更一般且实际上完全独立于生物发光光谱，一种准确途径是以下方式加权荧光及权重矩阵两者：
Unw(rs，rd)＝h(rd)∫V W(rs，r′，rd)F(r′)dr′ (9)
在数学术语中，这将给出与不使用权重h时相同的结果，其中显著差别为这权重使不仅仅归因于特定探针的那些贡献归零。当对方程组进行求逆时：
因此没有使用不包含于加权函数h中的那些测量。在一些实施例中，这种途径在与h的选择无关的情况下产生定量数据，只要其是基于生物发光测量且此测量非零即可。
荧光加权生物发光重构
因为3D分布的恢复的基础是基于通过引入空间依赖性以调制光发射的能力，所以可通过利用荧光测量将所述光发射调制引入到生物发光测量中。为此，一种途径将为测量由针对每一源的生物发光测量加权的所发射的平均正规化荧光，即：
其中Nd为检测器的数目。在进行以上测量时，确定固定的强度分布(由生物发光图像给出)，且强度通过由给出的激发源来调制。如在荧光的情况下，生物发光的3D分布现可通过以下方程式进行恢复：
其中B表示底物的空间分布加上生物发光反应的酶浓度，且W为如针对荧光断层成像情况所定义。接着以上实例，对方程组进行求逆：
实验设计及数据获取
在以上三个实例中，做出以下假设：获取生物发光信号以及荧光激发光源及荧光信号的测量。此实例描述了可如何获取这些数据。
第一步是制备用于成像的动物。通过注射一种组合式生物发光及荧光探针、通过注射单独生物发光及荧光探针及/或通过将荧光探针注射到已含有生物发光细胞(例如，表达荧光素酶的转基因细胞)的动物模型中来将生物发光报道子及荧光探针引入到所述动物中。在这些情况中的任何者中，还在适当时间注射生物发光底物(例如，荧光素)以按顺序实现荧光成像及生物发光成像两者。因为探针及底物的药物代谢动力(PK)可能是不同的，所以这些注射可能需要在不同的时间执行。
在获取噪声图像之后获取生物发光图像，所述图像为使用每一光源的激发及荧光发射波长下的图像。作为对生物发光图像的替代，可获取没有外部光源的荧光图像，其中经由从生物发光发射器到荧光接受器的辐射转移产生荧光发射。德拉格文(Dragavon)等人(2010)已在国际光学工程学会目录(Proc.Of SPIE)7902卷中使用首字母缩写FUEL描述在活体内背景中通过辐射转移对荧光进行生物发光刺激。这种途径具有双重优点：消除了上文第二个实例中所述的光谱失配且经测量的荧光将限于直接由生物发光报道子刺激的荧光。
最后，荧光图像将由其对应激发图像正规化，如(例如)第6,615,063号美国专利；第7,383,076号美国专利中描述。
在某些实施例中，本发明的方法可与光学成像形态及测量技术一起使用，其包含但不限于：内窥镜检查；荧光内镜；发光成像；生物发光断层成像；时间分辨透射成像；透射成像；非线性显微术；共焦成像；声光成像；光声成像；反射光谱法；光谱法；相干干涉法；干涉法；光学相干断层成像；漫射光学断层成像及荧光介导分子断层成像(连续波、时域频域系统及早期光子)及光散射、吸收、偏振、发光、荧光寿命、量子产率及猝熄的测量。
可用于采用本文中所描述的系统及方法的可商用系统包含但不限于以下：eXplore OptixTM、及(ART-先进研究技术，加拿大)、 II LB(伯托技术(Berthold Technologies)，德国)、NanoSPECTTM、NanoPET/CTTM及(生物扫描(Bioscan)，华盛顿(特区))、Photo ImagerTM、Beta ImagerTM、Micro Imager、GammaImager(生物空间实验室(Biospace Lab)，法国)、 FLEX及 FLEX(坎布里奇研究及仪器(Cambridge Research and Instrumentation)-沃本，马萨诸塞州)、LightSpeedTM、BrightSpeedTM及MR系列、eXplore系列、TriumphTM(医疗，联合王国)、活体内成像FX系统、活体内多光谱成像FX系统及图像站4000系列(及罗切斯特，纽约)、(滨松，日本)、及LILA成像系统(成像诊断系统-IMDS，种植园，佛罗里达州)、红外成像系统、成像器(LI-COR，林肯市，内布拉斯加州)、神经系统(加拿大)、(莫尼克亚山技术(Manua Kea Technologies)，法国)、及系统、HELIOSTM、LUNATM、及成像系统(内达华，加拿大)、DYNOT成像系统(NIRx，哥伦黑德，纽约)、OV100及IV100(奥林巴斯公司，日本)、(光度测定(Photometrics)，图森，亚利桑那洲)及系统、3D、 Kinetics、光谱及 Lumina(阿拉米达，加利福尼亚州及生命科学，霍普金顿，马萨诸塞州)、(UVP，阿普兰，加利福尼亚州)及VisEn FMT-1、VisEn FMT 1500TM及VisEn FMT2500TM LX(VisEnTM医药，贝德福德，马萨诸塞州)。
图6显示可用于本文中所描述的各种实施例中的漫射光学断层成像系统600的示意图。光学数据收集系统602包含一或多个光源604，例如，提供给定波长(例如，在650nm到900nm范围内)下的近红外激发光的激光器。可使用多个波长的激发光。光源604照射成像室610内的物体612，且来自物体的光由一或多个光检测器606所检测。举例来说，光检测器606可为CCD摄像机，例如，时间门控增强CCD摄像机(iCCD)。
成像室610容纳被成像的物体612。所述成像室可经设计以允许物体612与光源604及检测器606之间的直接光学接触，或在物体612与光源604及/或检测器606之间可存在自由空间(例如，空气)。
数据处理器608为光学数据收集系统602的一部分以预处理或处理图像数据，且/或单独图像处理器614可用于处理图像数据。对应于透射穿过物体612的激发光(即，透射式照明激发光)的数据可连同荧光光及/或生物发光光图像一起经处理来提高准确性。可校正背景光且可执行校准以实现成像结果的可重复性及准确性。建立正演问题且执行断层成像重构以提供断层成像图像。根据本文中描述的方法，可处理检测到的生物发光光、检测到的荧光光及/或检测到的激发光以提供所得断层成像图像。可将所得断层成像图像显示在标准显示器616上。可使用滤光片。
本发明的系统可包含执行软件的计算机，所述软件控制一或多个指令的操作及/或处理由系统所获得的数据。所述软件可包含记录在机器可读媒体(例如，举例来说，磁盘、磁带、CD-ROM及半导体存储器)上的一或多个模块。所述机器可读媒体可驻留在计算机之内或可通过通信链路(例如，经由因特网链路接入)连接到计算机。然而，在替代实施例中，可以呈硬接线逻辑形式的计算机指令替代软件，或可以固件(例如，记录在例如PROM、EPROM、EEPROM或类似物等的装置上的计算机指令)替代软件。如本文中使用的术语机器可读指令希望涵盖软件、硬接线逻辑、固件、目标代码及类似物。
所述计算机优选为通用计算机。举例来说，所述计算机可为嵌入式计算机、个人计算机(例如，膝上型计算机或桌上型计算机)或能够运行软件、发出合适控制命令及/或实时记录信息的另一类型的计算机。所述计算机可包含：显示器，其用于向仪器的操作者报告信息(例如，显示断层成像图像)；键盘，其用于使得操作者能够输入信息及命令；及/或打印机，其用于提供由系统进行的测量的打印输出或永久记录及用于打印(例如)诊断结果以包含在患者的病历中。在某些实施例中，经键盘键入的一些命令使得用户能够执行某些数据处理任务。在某些实施例中，数据获取及数据处理是自动化的且在初始化系统之后需要极少用户输入或不需要用户输入。
在某些实施例中，本发明以用于选择性地同时成像含有两个或两个以上成像探针的对象的活体内成像方法为特征，其中在同一时间或按顺序将两个或两个以上成像探针施用到对象。所述成像探针可为光学成像剂或其它成像剂的任何组合。单个成像剂可充当光学或其它成像形态剂(例如，双重成像剂)。因此所述方法允许记录多个生物过程、功能或目标。本发明的方法可用于确定若干标记，包含跟踪对象中的成像探针随时间的定位或评估对象中的成像探针的新陈代谢及/或排泄随时间的变化或变更。所述方法还可用于通过成像分子事件及由用于此类疾病的疗法调制的生物路径来遵循所述疗法，包含但不限于确定功效、最佳时机、最佳剂量水平(包含针对个别患者或测试对象)、药效参数及疗法组合的协同效应。
在某些实施例中，本发明可与其它成像途径(例如，使用包含但不限于多种镜(显微镜、内窥镜)、导管及光学成像设备(例如，用于断层成像呈现的基于计算机的硬件)的装置)一起使用。
举例来说，本发明的实施例可用于帮助内科医生、外科医生或其它医务人员或研究者识别及描绘疾病(例如，关节炎、癌症、转移的或易受攻击的或不稳定的斑块)的区域的特征，以区分患病组织与正常组织，例如，检测难以检测的肿瘤边缘。
在某些实施例中，本发明的方法可用于疾病(尤其是早期疾病)的位置、疾病或与疾病相关联的状况的严重性、疾病的分期的检测、表征及/或确定、及监测及指导多种治疗性干预(例如，外科手术)、及监测及/或开发药物疗法及给药(包含基于细胞的疗法)。本发明的方法还可用于疾病或疾病状况的预知。关于前述中的每一者，可(在治疗之前、期间或之后)检测或监测的此类疾病或疾病状况的实例包含炎症(例如，由关节炎(例如，风湿性关节炎)引起的炎症)、癌症(例如，结直肠癌、卵巢癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、宫颈癌、睾丸癌、皮肤癌、脑癌、胃肠癌、胰腺癌、肝癌、肾癌、膀胱癌、胃癌、血癌、口腔癌、食管癌、骨癌，包含癌细胞转移)、心血管疾病(例如，血管的动脉粥状硬化及发炎状况、局部缺血、中风、血栓、散播性血管内凝血)、皮肤病(例如，卡波西肉瘤、牛皮癣、变应性皮炎)、眼科疾病(例如，黄斑变性、糖尿病视网膜病变)、传染病(例如，细菌、病毒、真菌及寄生虫感染，包含获得性免疫缺陷综合症、瘴气、查加斯病、血吸虫病)、免疫疾病(例如，自身免疫性疾病、淋巴瘤、多发性硬化、风湿性关节炎、糖尿病、红斑狼疮、重症肌无力、格雷夫斯病)、中枢神经系统疾病(例如，神经变性疾病，例如帕金森病或老年痴呆症、亨廷顿病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、脘病毒病)、遗传性病、代谢性疾病、环境性疾病(例如，铅中毒、水银中毒及放射性中毒、皮肤癌)、骨相关疾病(例如，骨质疏松症、原发及转移性骨肿瘤、骨关节炎)、神经变性疾病及手术相关并发症(例如，移植排斥、器官排斥、伤口愈合的变更、纤维化或与外科植入物相关的其它并发症)。因此本发明的方法可用于(例如)确定肿瘤细胞的存在及肿瘤细胞的位置及转移、炎症的存在及位置(包含活化巨噬细胞在(例如)动脉粥状硬化或关节炎中的存在)、血管疾病的存在及位置(包含存在冠状动脉及外周动脉的急性闭塞(易受攻击的斑块)风险的区域、扩大动脉瘤的区域、颈动脉中的不稳定斑块及局部缺血区及支架血栓)。本发明的方法及组合物还可用于识别及评价细胞死亡、损伤、凋亡、坏死、缺氧及血管新生。本发明的方法及组合物还可用于监测某些细胞类型(包含T-细胞、肿瘤细胞、免疫细胞、干细胞及其它细胞类型)的运输及定位。特定来说，所述方法可用于监测基于细胞的疗法。本发明的方法及组合物还可用作光动力疗法(包含成像、光活化及疗法监测)的一部分。
在某些实施例中，本文中所描述的系统及方法可用于成像对象中的内源性荧光。举例来说，编码荧光蛋白质的基因(例如，绿色、红色或红外荧光蛋白质)可经包含而邻近于待使用标准基因疗法及转基因技术在动物或人类对象中表达的所关注基因。可通过成像荧光蛋白质间接确定所关注基因的表达。如果此蛋白质得到表达，那么所关注基因也已得到表达。内源性荧光蛋白质的荧光性质在以下文献中予以描述：吉普曼(Giepmans)等人所著的《科学(Science)》，312：217-224，2006；沙纳(Shaner)等人所著的《自然方法(NatureMethods)》2：905-909，2005；及张(Zhang)等人所著的《自然分子生物评论(Nat.Rev.Mol.Biol.)》3：906-918，2002；艾(Ai)等人所著的《生物化学(Biochemistry)》46：5904-5910，2007；沙纳(Shaner)等人所著的《自然生物技术(Nat.Biotech)》22：1567-1572，2004；坎贝尔(Campbell)等人所著的《美国国家科学院学报(Proc.Nat.Acad.Sci.)》99：7877-7882，2002；海卡尔(Heikal)等人所著的《美国国家科学院学报(Proc.Nat.Acad.Sci.)》97：11996-12001，2000；贝尔德(Baird)等人所著的《美国国家科学院学报(Proc.Nat.Acad.Sci.)》97：11984-11989，2000；钱(Tsien)所著的《生物化学年鉴(Ann.Rev.Biochem.)》67：509-44，1998；海姆(Heim)等人所著的《当代生物学(Curr.Biol.)》6：178-182，1996；丘比特(Cubitt)等人所著的《生物化学趋势(TrendsBiochem Sci.)》11：448-455，1995；海姆(Heim)等人所著的《美国国家科学院学报(Proc.Nat.Acad.Sci.)》91：12501-12504，1994；相关文本以引用的方式并入本文中。
在某些实施例中，本文中所描述的系统及方法可与第6,615,063号美国专利；第7,383,076号美国专利；及第8,190,241号美国专利中所描述的系统及方法一起使用，所述专利涉及使用荧光染料及光学断层成像方法从活的哺乳动物及患者提取定量三维分子信息。这些专利描述一起使用检测到荧光图像与透射式照明激发光的图像以获得靶区域的更准确的断层成像图像。
在某些实施例中，本文中所描述的系统及方法可与第US 2007/0238957号美国专利申请公开案中描述的系统及方法一起使用，所述美国专利申请公开案涉及使用X射线数据以光学断层成像术考虑不同组织类型及密度。
在某些实施例中，本文中所描述的系统及方法可与第2005/0283071号美国专利申请公开案、第8,170,651号美国专利及第2013/0114069号美国专利申请公开案中所描述的系统及方法一起使用，所述专利及专利申请公开案涉及用于以非接触式断层成像术成像具有任意几何形状的体积的计算系统及方法。
在某些实施例中，本文中所描述的系统及方法可与第8,401,618号美国专利中所描述的系统及方法一起使用，所述专利涉及用于采用混合途径进行断层成像以实现快速重构的活体内系统及方法。在此混合途径中，大断层成像数据集中的一或多个子集在频率空间(例如，傅里叶空间)中经选择，而一或多个子集维持在实空间中，接着对权重矩阵进行求逆经以获得实空间中的对象内的所关注区域的断层成像表示。这实现快速的计算时间同时维持良好的断层成像重构性能。
在某些实施例中，本文中所描述的系统及方法可与第8,401,619号美国专利中描述的系统及方法一起使用，所述专利涉及采用虚拟索引匹配技术的活体内成像系统及方法。
成像探针(荧光物质)
所述成像系统及方法可与若干不同荧光成像探针一起使用(或，如在使用串联生物发光报道子/荧光探针的实施例中，与其荧光物质一起使用)，举例来说：(1)在目标接触(例如，结合或相互作用)之后被激活的探针(维斯勒德尔(Weissleder)等人所著的《自然生物技术(Nature Biotech)》，17：375-378，1999；布雷默(Bremer)等人所著的《自然医学(Nature Med.)》，7：743-748，2001；坎普(Campo)等人所著的《光化学光生物学(Photochem.Photobiol.)》83：958-965，2007)；(2)波长位移信标(泰亚吉(Tyagi)等人所著的《自然生物技术(Nat.Biotechnol.)》18：1191-1196，2000)；(3)多色(例如，荧光)探针(泰亚吉(Tyagi)等人所著的《自然生物技术(Nat.Biotechnol.)》，16：49-53，1998)；(4)与目标具有高结合亲和力的探针(例如，当非特定探针被从身体内清除掉时保留在靶区域内的探针(阿奇勒夫(Achilefu)等人所著的《调查放射学(Invest.Radiol.)》，35：476-485，2000；贝克尔(Becker)等人所著的《自然生物技术(Nature Biotech)》，19：327-331，2001；布加(Bujai)等人所著的《生物医学光学杂志(J.Biomed.Opt.)》6：122-133，2001；巴卢(Ballou)等人所著的《生物技术进展(Biotechnol.Prog.)》13：649-658，1997；及内里(Neri)等人所著的《自然生物技术(Nature Biotech)》，15：1271-1275，1997)；(5)基于量子点或纳米颗粒的成像探针，包含多价成像探针及荧光量子点(例如，胺T2MP(EvidentTechnologies)或纳米晶体(InvitrogenTM))；(6)非特定成像探针，例如，吲哚菁绿、(唯新医药(VisEn Medical))；(7)标记细胞(例如，使用外源性荧光团(例如，VivoTagTM680、纳米颗粒或量子点)或通过从基因方面操纵细胞表达荧光或生物发光蛋白质(例如，绿色或红色荧光蛋白质)来标记的细胞)；及/或(8)X射线、MR、超声波、PET或SPECT对比剂(例如钆、金属氧化物纳米颗粒)、X射线对比剂(包含基于碘的成像剂或呈金属(铜、镓、铟、锝、钇及镥)形式的放射性同位素(包含但不限于99m-Tc、111-In、64-Cu、67-Ga、186-Re、188-Re、153-Sm、177-Lu及67-Cu)。上文参考的文献的相关文本以引用的方式并入本文中。另一组合适的成像探针是镧系金属配体探针。荧光镧系金属包含铕及铽。镧系元素的荧光性质描述于莱克沃维茨(Lackowicz)在1999年所著的《荧光光谱学原理(Principles ofFluorescence Spectroscopy)》(第二版，威科学术出版社(Kluwar Academic)，纽约)中，相关文本以引用的方式并入本文中。在本发明的方法中，可通过注射成像探针或通过局部或其它局部施用路径(例如，喷射)系统地或局部地施用成像探针。此外，在本发明的申请案中使用的成像探针可与能够诱发光动力治疗的分子共轭。这些分子包含(但不限于)光敏素、叶黄素、激素制剂、氨基乙酰丙酸、金丝桃素、卟啉衍生物及选择卟啉。
一般来说，本发明的实践中所使用的荧光量子点是含有半导体材料(包含但不限于含有镉及硒、硫化物、或碲；硫化锌、铟-锑、硒化铅、砷化镓及二氧化硅或硅酸盐的半导体材料)的若干原子的纳米晶体，所述纳米晶体已涂覆有硫化锌以改善荧光剂的性质。
特定来说，分子成像探针是成像探针的优选类型。分子成像探针是瞄准其与之混合的生物标记、分子结构或生物分子(例如细胞表面受体或抗原、细胞内的酶或特定核酸(例如，DNA))的探针。举例来说，可由成像探针瞄准的生物分子包含抗体、蛋白质、糖蛋白、细胞受体、神经递质、整合素、生长因子、细胞因子、淋巴因子、凝集素、选择蛋白、毒素、碳水化合物、内化受体、酶、蛋白酶、病毒、微生物及细菌)。
在某些实施例中，光学成像探针具有红色及近红外光谱中的在550nm到1300nm或约400nm到1300nm或约440nm及约1100nm、在约550nm与约800nm之间、在约600nm与约900nm之间的范围内的激发及发射波长。使用这部分的电磁光谱通过生理上丰富的吸收剂(例如血红蛋白(小于650nm)及水(大于1200nm))最大化组织穿透性且最小化吸收性。具有其它光谱(例如，可见光及紫外线光谱)中的激发及发射波长的光学成像探针也可用于本发明的方法中。特定来说，荧光团(例如，某些羰花青或聚甲炔荧光染料或染料)可用于重构光学成像剂，例如授予卡普托(Caputo)等人的第6,747,159号美国专利(2004)；授予卡普托(Caputo)等人的第6,448,008号美国专利(2002)；授予黛拉·恰纳(Della Ciana)等人的第6,136,612号美国专利(2000)；授予索斯维克(Southwick)等人的第4,981,977号美国专利(1991)；授予瓦格纳(Waggoner)等人的第5,268,486号美国专利(1993)；授予瓦格纳(Waggoner)的第5,569,587号美国专利(1996)；授予瓦格纳(Waggoner)等人的第5,569,766号美国专利(1996)；授予瓦格纳(Waggoner)等人的第5,486,616号美国专利(1996)；授予瓦格纳(Waggoner)的第5,627,027号美国专利(1997)；授予布拉什(Brush)等人的第5,808,044号美国专利(1998)；授予雷丁顿(Reddington)等人的第5,877,310号美国专利(1999)；授予沈(Shen)等人的第6,002,003号美国专利(1999)；授予莱昂(Leung)等人的第6,004,536号美国专利(1999)；授予瓦格纳(Waggoner)等人的第6,008,373号美国专利(1999)；授予明登(Minden)等人的第6,043,025号美国专利(2000)；授予明登(Minden)等人的第6,127,134号美国专利(2000)；授予瓦格纳(Waggoner)等人的第6,130,094号美国专利(2000)；授予瓦格纳(Waggoner)等人的第6,133,445号美国专利(2000)；授予理查(Licha)等人的第7,445,767号美国专利(2008)；授予理查(Licha)等人的第6,534,041号美国专利(2003)；授予美和(Miwa)等人的第7,547,721号美国专利(2009)；授予美和(Miwa)等人的第7,488,468号美国专利(2009)；授予川上(Kawakami)等人的第7,473,415号美国专利(2003)；以及WO 96/17628、EP 0 796 111 B1、EP1 181 940 B1、EP0 988 060 B1、WO 98/47538、WO 00/16810、EP1 113 822 B1、WO 01/43781、EP1 237 583 A1、WO 03/074091、EP1 480 683 B1、WO 06/072580、EP1 833 513 A1、EP1 679 082 A1、WO 97/40104、WO 99/51702、WO 01/21624及EP1065 250 A1；及《四面体通讯(Tetrahedron Letters)》41，9185-88(2000)。
举例来说，光学成像探针的示范荧光染料包含以下：Cy5.5、Cy5、Cy7.5及Cy7(医疗)；AlexaFluor660、AlexaFluor680、AlexaFluor790及AlexaFluor750(英杰公司(Invitrogen))；VivoTagTM680、VivoTagTM-S680、VivoTagTM-S750(唯新医药(VISEnMedical))；Dy677、Dy682、Dy752及Dy780547及/或647(皮尔斯(Pierce))；HiLyte FluorTM 647、HiLyte FluorTM 680及HiLyte FluorTM 750 800CW、800RS、700DXADS780WS、ADS830WS及ADS832WS(美国染料源(American Dye Source))；XenoLight CFTM 680、XenoLightCFTM750、XenoLight CFTM 770及XenoLinght DiR(生命科学)；及650、 X-SIGHT 691、 X-SIGHT 751(健康)。
等效物
虽然已参考特定优选实施例特定展示及描述本发明，但所属领域的技术人员应理解，可在不背离如由所附权利要求书界定的本发明的精神及范围的情况下做出的形式及细节上的各种改变。本文中所引用的所有参考、专利及专利申请案的相关教示以全文引用的方式并入本文中。

Claims (54)

1.一种用于对漫射物体的靶区域进行成像的方法，所述方法包括：
(a)通过所述物体的所述靶区域中的生物发光报道子检测从所述物体发射的生物发光光及/或化学发光光；
(b)在多个位置处及/或以多个角度将激发光引导到所述物体中，借此激发包括所述物体的所述靶区域中的荧光物质及/或联合的荧光/生物发光物质的探针的所述荧光物质；
(c)检测荧光光，所述检测到的荧光光已由于所述激发光的激发而由所述漫射物体的所述靶区域中的所述荧光物质发射；
(d)检测激发光，所述检测到的激发光已透射穿过所述漫射物体的所述区域或已从所述漫射物体的所述区域反射；以及
(e)处理对应于所述检测到的生物发光光、所述检测到的荧光光及所述检测到的激发光的数据以提供所述漫射物体内的所述靶区域的图像，其中步骤(e)包括以下至少一者：
(i)利用对应于所述检测到的生物发光光的数据将对应于所述检测到的荧光光的数据进行加权，以及对相关联的权重矩阵进行求逆以获得所述物体的所述靶区域中的所述荧光物质的断层成像图像；
(ii)利用对应于所述检测到的生物发光光的数据将对应于所述检测到的荧光光的数据进行加权，以及利用对应于所述检测到的生物发光光的数据将相关联的权重矩阵进行加权，接着对所述权重矩阵进行求逆以获得所述物体的所述靶区域中所述荧光物质的断层成像图像/所述断层成像图像；以及
(iii)利用对应于所述检测到的荧光光且以对应于所述检测到的激发光的数据进行正规化的数据将对应于所述检测到的生物发光光的数据进行加权，接着对相关联的权重矩阵进行求逆以获得所述物体的所述靶区域中的所述生物发光报道子的断层成像图像/所述断层成像图像。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物发光报道子是内源性的。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述生物发光报道子在所述物体内由生物发光细胞系表示。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物发光报道子是外源性的。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述生物发光报道子是串联生物发光-荧光探针的组件。
6.根据权利要求1到5中任一权利要求所述的方法，其中所述生物发光报道子中的至少一些与所述探针中的至少一些实质上共同定位于所述物体的所述靶区域中。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述生物发光报道子也存在于所述物体中不与所述探针实质上共同定位的一或多个位置处。
8.根据权利要求1到5中任一权利要求所述的方法，其中所述探针包括所述荧光物质及与荧光物质串联的生物发光报道子两者。
9.根据权利要求1到5中任一权利要求所述的方法，其中所述漫射物体包括活的生物组织。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述漫射物体是哺乳动物。
11.根据权利要求1到5中任一权利要求所述的方法，其中所述靶区域的所述图像是断层成像图像。
12.根据权利要求1到5中任一权利要求所述的方法，其进一步包括在步骤(a)、(b)、(c)及(d)之前将所述物体放置在固持器内。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述靶区域的所述图像是断层成像图像且其中所述物体的表面至少部分由所述固持器保形使得所述表面可由连续函数表征，借此促进断层成像重构。
14.根据权利要求1到5中任一权利要求所述的方法，其中步骤(a)包括使用定位于所述物体外部的检测器检测生物发光光。
15.根据权利要求1到5中任一权利要求所述的方法，其中步骤(a)包括根据检测器位置检测生物发光光。
16.根据权利要求1到5中任一权利要求所述的方法，其中步骤(a)包括使用与所述物体光学接触的检测器检测生物发光光。
17.根据权利要求1到5中任一权利要求所述的方法，其中步骤(a)包括使用检测器检测生物发光光，所述检测器经定位使得在所述检测器与所述物体之间存在非漫射介质。
18.根据权利要求1到5中任一权利要求所述的方法，其中步骤(a)包括使用发射滤光片检测生物发光光。
19.根据权利要求1到5中任一权利要求所述的方法，其中步骤(a)包括在不使用发射滤光片的情况下检测生物发光光。
20.根据权利要求1到5中任一权利要求所述的方法，其中所述探针是可见光探针或近红外荧光探针。
21.根据权利要求1到5中任一权利要求所述的方法，其中步骤(b)包括将可见光及/或近红外光引导到所述物体中。
22.根据权利要求1到5中任一权利要求所述的方法，其中步骤(b)包括将激发光的点源引导到所述物体中。
23.根据权利要求1到5中任一权利要求所述的方法，其中步骤(b)包括同时将激发光的多个源引导到所述物体中。
24.根据权利要求1到5中任一权利要求所述的方法，其中步骤(b)包括将结构化激发光引导到所述物体中。
25.根据权利要求1到5中任一权利要求所述的方法，其中步骤(b)包括在多个离散位置处及/或以多个离散角度将所述激发光引导到所述物体中，将所述激发光引导到所述物体中的每一例子在离散时间处发生。
26.根据权利要求25所述的方法，其包括在离散位置处及/或以离散角度将激发光引导到所述物体中的每一例子之后执行步骤(c)及(d)。
27.根据权利要求1到5中任一权利要求所述的方法，其中步骤(b)包括同时在多个离散位置处及/或以多个离散角度将所述激发光引导到所述物体中。
28.根据权利要求1到5中任一权利要求所述的方法，其中步骤(b)包括使所述激发光在所述物体上方扫描。
29.根据权利要求1到5中任一权利要求所述的方法，其中在步骤(d)中检测到的所述激发光包括连续波CW光、时间分辨TR光及强度调制IM光中的至少一者。
30.根据权利要求1到5中任一权利要求所述的方法，其中步骤(c)包括使用定位于所述物体外部的检测器检测从所述物体的所述靶区域发射的荧光光。
31.根据权利要求30所述的方法，其中步骤(c)包括检测在与步骤(b)中激发光被引导到其中的侧相同的所述物体的侧上的荧光光。
32.根据权利要求30所述的方法，其中步骤(c)包括检测在与步骤(b)中激发光被引导到其中的侧相对的所述物体的侧上的荧光光。
33.根据权利要求1到5中任一权利要求所述的方法，其中步骤(c)包括使用与所述物体光学接触的检测器检测所述物体的所述靶区域发射的荧光光。
34.根权利要求1到5中任一权利要求所述的方法，其中步骤(c)包括使用检测器检测从所述物体的所述靶区域发射的荧光光，所述检测器经定位使得在所述检测器与所述物体之间存在非漫射介质。
35.根据权利要求1到5中任一权利要求所述的方法，其中步骤(d)包括使用定位于所述物体外部的检测器检测透射穿过所述物体的所述靶区域或从所述物体的所述靶区域反射的激发光。
36.根据权利要求1到5中任一权利要求所述的方法，其中步骤(d)包括使用与所述物体光学接触的检测器检测透射穿过所述物体的所述靶区域或从所述物体的所述靶区域反射的激发光。
37.根据权利要求1到5中任一权利要求所述的方法，其中步骤(d)包括使用检测器检测透射穿过所述物体的所述靶区域或从所述物体的所述靶区域反射的激发光，所述检测器经定位使得在所述检测器与所述物体之间存在非漫射介质。
38.根据权利要求1到5中任一权利要求所述的方法，其中步骤(c)包括从多个投影及/或视图检测所述荧光光。
39.根据权利要求1到5中任一权利要求所述的方法，其中步骤(d)包括从多个投影及/或视图检测所述激发光。
40.根据权利要求1到5中任一权利要求所述的方法，其中所述物体的所述靶区域是三维区域，且步骤(e)包括提供对应于所述三维靶区域中的所述荧光物质的断层成像图像。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述断层成像图像指示所述探针在所述靶区域内的三维空间分布。
42.根据权利要求40所述的方法，其中所述断层成像图像指示随在所述物体的所述靶区域内的位置而变化的所述探针的浓度。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述断层成像图像指示随三维位置而变化的所述探针的浓度。
44.根据权利要求1到5中任一权利要求所述的方法，其中所述物体的所述靶区域是三维区域，且步骤(e)包括提供对应于所述三维靶区域中的所述生物发光报道子的断层成像图像。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述断层成像图像指示所述生物发光报道子在在靶区域内的三维空间分布。
46.根据权利要求44所述的方法，其中所述断层成像图像指示随在所述物体的所述靶区域内的位置而变化的所述生物发光报道子的浓度。
47.根据权利要求1到5中任一权利要求所述的方法，其中生物发光报道子及所述荧光物质具有不同的发射光谱。
48.根据权利要求1到5中任一权利要求所述的方法，其中在与步骤(c)及(d)的所述检测不同的时间执行步骤(a)中的所述检测。
49.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(c)包括作为检测器位置、激发光源位置或检测器位置及激发光源位置两者的函数来检测荧光光。
50.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(d)包括作为检测器位置、激发光源位置或检测器位置及激发光源位置两者的函数来检测激发光。
51.一种用于对漫射物体的靶区域进行成像的方法，所述方法包括：
(a)通过所述物体的所述靶区域中的生物发光报道子检测从所述物体发射的生物发光光及/或化学发光光；
(b)检测荧光光，所述检测到的荧光光已由于所述生物发光光的激发而由包括所述漫射物体的所述靶区域中的荧光物质及/或联合的荧光/生物发光物质的探针的所述荧光物质发射；以及
(c)处理对应于所述检测到的生物发光光及所述检测到的荧光光的数据以提供所述漫射物体内的所述靶区域的图像，其中步骤(c)包括以下至少一者：
(i)利用对应于所述检测到的生物发光光的数据将对应于所述检测到的荧光光的数据进行加权，以及对相关联的权重矩阵进行求逆以获得所述物体的所述靶区域中的所述荧光物质的断层成像图像；
(ii)利用对应于所述检测到的生物发光光的数据将对应于所述检测到的荧光光的数据进行加权，以及利用对应于所述检测到的生物发光光的数据将相关联的权重矩阵进行加权，接着对所述权重矩阵进行求逆以获得所述物体的所述靶区域中所述荧光物质的断层成像图像/所述断层成像图像；以及
(iii)利用对应于所述检测到的荧光光的数据将对应于所述检测到的生物发光光的数据进行加权，接着对相关联的权重矩阵进行求逆以获得所述物体的所述靶区域中的所述生物发光报道子的断层成像图像/所述断层成像图像。
52.根据权利要求51所述的方法，其进一步包括将光引导到所述物体中及检测已透射穿过所述漫射物体的所述区域或从已从所述漫射物体的所述区域反射的光，及使用对应于步骤(c)中的所述检测到光的数据连同对应于所述检测到的生物发光光及所述检测到的荧光光的所述数据以提供所述漫射物体内的所述靶区域的所述图像。
53.一种用于对漫射物体内的靶区域进行成像的系统，所述系统包括：
激发光源；
光学成像设备，其经配置以在多个位置处及/或以多个角度将来自激发光源的光引导到漫射物体中；
一或多个检测器，所述一或多个检测器个别地或共同地经配置以检测及/或测量：(i)从所述物体发射的生物发光光及/或化学发光光；(ii)由于所述激发光的激发由所述漫射物体的所述靶区域内的荧光物质发射的荧光光；及(iii)已透射穿过所述漫射物体的所述区域或已从所述漫射物体的所述区域反射的激发光；以及
处理器，经配置以处理对应于所述检测到的生物发光光、所述检测到的荧光光及所述检测到的激发光的数据以提供所述漫射物体内的所述靶区域的图像，其中所述处理对应于所述检测到的生物发光光、所述检测到的荧光光及所述检测到的激发光的数据以提供所述靶区域的图像包括以下至少一者：
(i)利用对应于所述检测到的生物发光光的数据将对应于所述检测到的荧光光的数据进行加权，以及对相关联的权重矩阵进行求逆以获得所述物体的所述靶区域中的所述荧光物质的断层成像图像；
(ii)利用对应于所述检测到的生物发光光的数据将对应于所述检测到的荧光光的数据进行加权，以及利用对应于所述检测到的生物发光光的数据将相关联的权重矩阵进行加权，接着对所述权重矩阵进行求逆以获得所述物体的所述靶区域中所述荧光物质的断层成像图像/所述断层成像图像；以及
(iii)利用对应于所述检测到的荧光光且以对应于所述检测到的激发光的数据进行正规化的数据将对应于所述检测到的生物发光光的数据进行加权，接着对相关联的权重矩阵进行求逆以获得所述物体的所述靶区域中的所述生物发光报道子的断层成像图像/所述断层成像图像。
54.一种用于重构漫射物体的靶区域内的探针的断层成像表示的设备，所述设备包括：
存储器，用以存储定义指令集的代码；及
处理器，用以执行所述指令借此处理对应于以下操作的数据：
(a)使用以下数据建立从激发光源到所述物体的所述靶区域内的所述探针的激发光传播及从所述探针到检测器的发射光传播的正演模型：(i)对应于来自所述探针的检测到的荧光光的数据；(ii)对应于已透射穿过所述漫射物体的所述区域或已从所述漫射物体的所述区域反射的检测到的激发光的数据；及(iii)对应于从生物发光报道子发射的检测到的生物发光光的数据，其中所述生物发光报道子中的至少一些与所述探针中的至少一些实质上共同定位于所述物体的所述靶区域中，且其中所述正演模型作为权重矩阵而建立；
(b)利用对应于检测到的生物发光光的数据将对应于来自所述探针的检测到的荧光光的数据进行加权，以及利用对应于检测到的生物发光光的数据将所述权重矩阵进行加权；及
(c)对所述权重矩阵进行求逆以获得所述漫射物体的所述靶区域内的所述探针的所述断层成像表示。
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