CN102414116B - 用于制备尺寸可控的纳米颗粒的超分子方法 - Google Patents
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Abstract
开发了用于由三种不同分子构建块来制备尺寸可控的纳米颗粒的超分子方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2009年2月26日提交的美国临时申请No.61/155,784(其完整内容通过引用并入本文)和2010年1月29日提交的美国临时申请No.61/299,753(其完整内容通过引用并入本文)的优先权。
本发明在国家卫生研究院-国家癌症研究院给予的基金号U54Ca119347-02的政府支持下完成。政府享有本发明的某些权利。
背景
技术领域
本发明涉及利用构建块的分子识别特性来制备的超分子结构,也称为超分子纳米颗粒(supramolecular nanoparticles,SNP)。本发明还包括利用分子识别来产生超分子结构的方法以及控制所产生纳米颗粒尺寸的方法。本发明还包括超分子结构来递送基因、治疗性化合物和光热治疗剂的使用方法。
背景技术
纳米颗粒治疗剂通常是包含治疗性实体(如小分子药物、肽、蛋白质和核酸)以及与治疗性实体装配在一起的组分(如脂类和聚合物)的颗粒。此类纳米颗粒与其所含治疗性实体相比,能够具有增强的抗癌效果。这要归因于通过改进药物代谢动力学和药效动力学带来的特异性更高的肿瘤组织靶向以及主动的细胞内递送。这些特性依赖于纳米颗粒的尺寸和表面特性(包括靶向配体的存在)。
虽然本领域中有极大量的研究,但大部分工作还不能转移至临床应用。一些主要的障碍包括使用了免疫刺激性组分,使用了对大规模情况下的现行生产质量管理规范(current good manufacturing practice,cGMP)有障碍和/或在明确限定的化学结构的开发、生产和控制测定中有困难的组分。数量有限的纳米颗粒系统已达到临床应用要求,并且已经有信息可用于开始理解将这些实验系统移用至人的一些问题。
在过去的几十年中,人们已经致力于探索纳米颗粒在生物学和医学领域中的应用。若干不同类型的纳米颗粒已经成功地进入动物的临床前研究、患者的临床试验甚至是用于常规临床实践的成功的商业化产品(Davis等,Nat.Rev.Drug Discov.2008,vol.7,771页)。例如,携带靶标特异性配体的金纳米壳(Loo等,Technol.Cancer Res.Trea,vol.3,33页,2004)、量子点(Gao等,Nat.Biotechnol,vol,22,969页,2004;Nie等,Annu.Rev.Biomed.Eng.,vol.9,257页,2007)和超顺磁性纳米颗粒(Jun等,Angew.Chem.,vol.120,5200页,20080;Jun等,Angew.Chem.Int.Ed,vol.47,5122页,2008)已被用于体内癌症成像;药物分子可包装在基于聚合物的纳米颗粒和/或脂质体中(Heath等,Annu.Rev.Med.,vol.59,251页,2008;Torchilin等,Nat.Rev.Drug Discov.,vol.4,145页,2005)以达到在病灶位点的受控释放(Napier等,Poly.Rev.,vol.47,321页,2007;Gratton等,Acc.Chem.Res.,vol.41,1685页,2008);带正电的纳米颗粒可作为体外和体外遗传操作和编程的非病毒递送系统(Davis等,Nat.Rev.Drug Discov.,vol.7,771页,2008;Green等,Acc.Chem.Res.,vol.41,749页,2008;Pack等,Nat.Rev.Drug Discov.,vol.4,581页,2005)。不过,还迫切地需要开发新的合成方法以生产新一代纳米颗粒,所述新一代纳米颗粒具有:(i)可控的尺寸和形态;(ii)低毒性、相容的免疫原性和体内可降解性,和(iii)用于增强生理稳定性和延长循环时间的适当表面电荷和化学性质。
已考虑将具有独特光物理特性的贵金属纳米结构作为癌症光热疗法的主要候选药剂(Anderson等,Science,vol.220,524页,1983;Jain等,Acc Chem Res,vol.41,1578页,2008;An等,Nano Today,vol.4,359页,2009;LaI等,Acc Chem Res,vol.41,1842页,2008)。一般地,这些纳米结构的光热特性可通过操纵其尺寸和形状来控制(Lal等,AccChem Res,vol.41,1842页,2008;Skrabalak等,Acc Chem Res,vol.41,p.1587,2008)。在过去的二十年中,科学家已为生产各种金(Au)纳米结构作出了极大的努力,例如:纳米颗粒(Lapotko等,Laser Surg Medl,vol.38,631页,2006;Huang等,Lasers Med Sci,vol.23,217页,2008)、纳米微壳(Gobin等,Nano Lett,vol.7,1929页,2007;Hu等,J Am ChemSoc,vol.131,14186页,2009;Kim等,Angewandte Chemie-InternationalEdition,vol.45,7754页,2006)、纳米棒(Dickerson等,Cancer Letters,vol.269,57页,2008;Huang等,Langmuir,vol.24,11860页,2008)和纳米笼(Skrabalak等,Acc Chem Res,vol.41,1587页,2008;Chen等,Nano Lett,vol.7,1318页,2007;Au等,ACS Nano,vol.2,1645页,2008),它们能够克服基于有机染料的光热药剂的局限性(例如光吸收低和光漂白不理想)(Huang等,Lasers Med Sci,vol.23,217页,2008)。为了捕获/产生足够的能量来破坏肿瘤细胞,要求这些基于纳米结构的药剂尺寸在几十到几百纳米范围内(Lowery等,Clin Cancer Res,vol.11,9097s页,2005)。不过,相对“大”的药剂尺寸通常生物清除性较差(即在肝、脾和肾中累积),成为其在体内应用的主要障碍(Mitragotri等,Nat Mater,vol.8,15页,2009;Choi等,Nat Biotechnol,vol.25,1165页,2007;NeI等,Nat Mater,vol.8,543页,2009)。或者,贵金属纳米结构可通过自组装形成聚集体而系统地改变其光物理特性(Khlebtsov等,Nanotechnology,vol.17,5167页,2006;Lu等,J Mater Chem,vol.19,4597页,2009;Zhuang等,Angew Chem Int Ed Engl,vol.47,2208页,2008;Troutman等,Adv Mater,vol.20,2604页,2008;Ofir等,Chem Soc Rev,vol.37,1814页,2008;Elghanian等,Science,vol.277,1078页,1997;Lin等,Adv Mater,vol.17,2553页,2005;Katz等,Angew Chem Int Ed Engl,vol.43,6042页,2004;Cheng等,NatureNanotechnology,vol.3,682页,2008;Maye等,J Am Chem Soc,vol.127,1519页,2005;Niemeyer,Angewandte Chemie-International Edition,vol.40,4128页,2001;Klajn等,Nat Chem,vol.1,733页,2009)。已观察到金纳米颗粒在细胞膜或细胞内环境中的抗体辅助聚集导致光热性能增强,这是由与组装后结构相关的集体效应引起的(Govorov等,NanoToday,vol.2,30页,2007;Richardson等,Nano Lett,vol.9,1139页,2009)。因此,小的贵金属构建块(即尺寸与肾清除率相容(<8nm)的贵金属胶体)(Mitragotri等,Nat Mater.,vol.8,15页,2009;Choi等,Nat Biotechnol,vol.25,1165页,2007;NeI等,Nat Mater,vol.8,543页,2009)的自组装将提供开发新型贵金属光热剂的有前景的方法。
基因治疗通常需要能够满足下列条件的递送载体:(i)携带/保护遗传物质,如DNA和siRNA,和(ii)向目的组织或细胞亚类进行靶标特异性递送(Kim等Nat Rev Genet,vol.8,173-184页,2007)。在过去的几十年中,科学家已作出了极大的努力,致力于开发非病毒基因递送载体(Glover等,Nat Rev Genet,vol.6,299-310页,2005;Rosi等,Chem.Rev.,vol.105,1547-1562页,2005),作为其相应病毒载体的替代选择,所述病毒载体的应用由于其潜在的安全性问题和复杂的制备过程而受到限制。在现有的非病毒基因递送系统中(Niidome等,Gene Ther.,vol.9,1647-1652页,2002;Prata等,Chem.Commun.,1566-1568页,2008;Woodrow等,Nat.Mater.,vol.8,526-533页,2009;Chen等,Chem.Commun.,4106-4108页,2009;Torchilin等,Proc Natl Acad Sci U S A,vol.100,1972-1977页.2003),基于纳米颗粒的基因递送载体(Liang等,Proc Natl Acad Sci U S A,vol.102,11173-11178页,2005;Kumar等,Chem.Commun.,5433-5435页,2009;Bazin等,Chem.Commun.,pp.5004-5006,2008;Cheon等,Acc.Chem.Res.,vol.41,1630-1640页,2008)已获得广泛关注。纳米颗粒被认为是将核酸有效且安全地递送到特定类型细胞或组织中的大有前景的转染试剂,其提供了病毒递送的基因操作/治疗策略的替代选择。不过,缓慢且多步骤的合成方法限制了已有递送载体材料的多样性,成为达到最佳转染性能的主要障碍。
发明内容
本发明的一些方面包括超分子结构,也称为超分子纳米颗粒(SNP),其具有:(1)适于为所述超分子结构至少提供一些机械结构的多个结构组件;(2)多个结合组件,各自具有适于与所述多个结构组件结合的多个结合区域;和(3)多个终止组件,各自适于与所述多个结合组件之一的结合区域相结合。所述结构组件和结合组件在彼此接触时自组装形成超分子结构。在终止组件相对于结合组件的结合区域以足够量存在时,终止组件用于占据结合组件的结合区域以终止进一步的结合。在一些实施方案中,所述结构组件包含多个结合元件,其与结合组件中的结合区域相结合。在一些实施方案中,所述终止组件具有单个结合元件,其与一个结合组件上的一个结合区域相结合。在一些实施方案中,所述超分子结构具有两个或更多个不同的终止组件。
在一些实施方案中,所述(结合组件上的)结合区域与终止组件或结合组件相结合,并形成分子识别对。
在一些实施方案中,结构组件、结合组件或终止组件中至少一种还具有功能元件。在一些实施方案中,所述超分子结构具有两个或更多个不同的功能元件。
在一些实施方案中,所述超分子结构还包括载荷。
本发明的另一些方面包括将基因递送至细胞的方法,其通过使所述细胞接触具有质粒载荷的超分子结构来实现。
本发明的另一些方面包括将治疗性化合物递送至细胞的方法,其通过使所述细胞接触具有治疗性化合物作为载荷的超分子结构来实现。
本发明的另一些方面包括生产超分子结构的方法,其通过制备结构组件与结合组件的悬液以及向所述悬液中加入终止组件来实现。结构组件与结合组件与终止组件之间量的比例根据所述超分子结构的预定尺寸来选择。结构组件、结合组件和终止组件自组装成基本具有所述预定尺寸的所述超分子结构。
附图说明
图1显示制备尺寸可控的超分子纳米颗粒(SNP)的一种便捷、灵活且模块化的合成方法。采用基于金刚烷(Ad)和β-环糊精(CD)的分子识别系统来组装三种构建块:(i)n-Ad-PAMAM,(n=4*或8)(ii)CD-PEI和(iii)Ad-PEG。
图2显示PBS缓冲液(pH 7.2)中SNP的尺寸依赖性ζ电位变化。
图3显示SNP尺寸与混合比例之间的关系。3A显示了总结SNP尺寸与两种分子构建块(n-Ad-PAMAM/CD-PEI)混合比例之间的关系的量变图。采用动态光散射(DLS)测定SNP尺寸。空心圆:观察八取代树状聚合物构建块8-Ad-PAMAM的量变图;实心圆:观察四取代树状构建块4*-Ad-PAMAM的量变图。各数据点的标准差至少来自于三次重复。所得不同尺寸SNP的TEM图像:8-Ad-PAMAM的32±7nm(3B),4*-Ad-PAMAM的61±17nm(3C),8-Ad-PAMAM的104±16nm(3D),8-Ad-PAMAM的340±46nm(3E)。比例尺:100nm。
图4显示30和100nm SNP在生理离子强度(I=150mM)条件下在PBS(pH 7.2)中的时间依赖性尺寸变化。
图5显示PBS缓冲液(pH=7.2,I=150mM NaCl)中温度从7上升至50℃时,30和100nm SNP的温度依赖性尺寸变化。
图6显示30和100nm的SNP分别在pH值为0.84-10.28范围内的缓冲溶液(I=100mM)中的pH依赖性尺寸变化。
图7显示声处理对30和100nm SNP的尺寸变化的影响。
图8显示SNP的可逆尺寸可控性的示意图。
图9显示以30nm和100nm 64Cu标记的SNP在注射小鼠后不同时间点的MicroPET/CT研究。图9A显示将SNP经由尾静脉全身注射小鼠后的SNP体内生物分布研究。左侧图:30nm SNP;右侧图:100nm SNP。图9B为经由前掌足垫注射的SNP淋巴结递送研究。30和100nm SNP分别注射到小鼠足垫的异侧。注射后立即进行MicroPET/CT 40分钟(左侧图),并在注射后20小时再进行一次(右侧图)。
图10显示1小时动态扫描的时间分辨MicroPET/CT成像图。上侧图显示了小鼠经由尾静脉注射30nm DOTA接枝的SNP的图像。下侧图显示了小鼠经由尾静脉注射100nm DOTA接枝SNP的图像。
图11显示经由尾静脉和足垫注射小鼠后30nm和100nm SNP的生物分布。图11C的卡通示意图阐释尾静脉和足垫注射。图11A和11B显示分别接受30nm和100nm SNP尾静脉注射后小鼠的时间-活性曲线。图11D显示接受30nm和100nm SNP前足垫皮下注射后小鼠的时间-活性曲线。
图12显示所述在0-19不同氮-磷(N/P)比例下带有负电荷DNA的阳离子Ad-PAMAM/CD-PEI水凝胶的凝胶电泳。电泳中观察到的质粒DNA的两条带分别代表质粒的缺刻环和超螺旋形式。
图13显示由PBS溶液(1mL)中的Et(400ng/mL)和DNA(20μg/mL)组成的DNA-EtBr的荧光强度变化,在加入不同量的Ad-PAMAM/CD-PEI水凝胶和其他对照(CD-PEI和CD-PEI/Ad-PEG混合物)后在590nm处进行测定。
图14显示以DLS测得的PBS(pH 7.2)溶液中100nm和300nm的SNP-DNA和RGD-SNP-DNA的流体动力学尺寸。100-0 SNP-DNA和300-0 SNP-DNA的DLS曲线分别见图14A和图14B。
图15显示100nm SNP-DNA(图15A)和300nm SNP-DNA(图15B)的TEM显微照片。插图:各自的更高放大倍数TEM图。比例尺:100nm。图15C和15D的直方图总结了100nm SNP-DNA和300nm SNP-DNA在干燥状态下的尺寸分布。
图16显示PBS缓冲溶液(pH 7.2)中SNP-DNA和RGD-SNP-DNA的ζ电位变化,误差线来自于3次独立测定值。
图17显示细胞生存力结果。图17A显示转染48小时后由细胞生存力测试测定的SNP-DNA和RGD-SNP-DNA转染的3T3细胞与未处理3T3细胞的生存力。误差线来自于3次独立测定值。图17B显示了100-5%RGD-SNP-DNA的转染3T3细胞在48小时后的荧光显微图像。绿色和红色荧光表达细胞分别表示活细胞与死细胞。
图18显示用于制备尺寸可控且RGD配体覆盖度可调的包裹有DNA的超分子纳米颗粒小文库(SNP-DNA和RGD-SNP-DNA)的两步式模块组装方法。
图19显示转染效率。图19A显示一系列SNP-DNA与RGD-SNP-DNA连同对照递送系统对两种αvβ3高表达细胞(U87和刮板收集的3T3细胞)和两种αvβ3低表达细胞(MCF7和0.25%胰蛋白酶处理的3T3细胞)的EGFP转染效率。在5mol%(图19B)RGD接枝的100nm RGD-SNP-DNA(100-5%)处理的αvβ3高表达3T3细胞和1mol%(图19C)RGD接枝的300nm RGD-SNPs-DNA(300-1%)处理的αvβ3低表达3T3细胞中分别观察到转染效率为57±11%和9±4%的代表性荧光显微图像。
图20显示了产生包裹有DNA的超分子纳米颗粒(DNA-SNP,1)的组合文库的自组装方法示意图,其中可通过系统地改变5种功能性分子构建块(即CD-PEI(2),Ad-PAMAM(3),Ad-PEG(4),RGD-PEG-Ad(5)和TAT-PEG-Ad(6)),以及DNA质粒(7a:增强的绿色荧光蛋白(EGFP)和7b:萤火虫萤光素酶(FLuc))的混合比例而将广泛的结构/功能多样性设计在单个DNA-SNP(1)中。
图21显示基因转染性能。图21A显示不同N/P比例和RGD覆盖率时,RGD-SNP-EGFP-DNA基因转染性能的3D图。图21B显示不同N/P比例和TAT覆盖率时,TAT-SNP-EGFP-DNA基因转染性能的3D图。图21C显示不同N/P比例及RGD和TAT覆盖率时,TAT/RGD-SNP-EGFP-DNA基因转染性能的4D图。跨越最佳性能区的XY、YZ和XZ面被简化,示意为2D图。图21D显示不同N/P比例及RGD和TAT范围时,TAT/RGD-SNP-FLuc-DNA基因转染效果的4D图。跨越最佳性能区的XY、YZ和XZ面被简化,示意为2D图。
图22显示颗粒尺寸和ζ电位。图22A和22B显示所得42±4、86±9和160±13nm的不同尺寸SNP的TEM和SEM图像。比例尺:100nm。图22C显示用于测定SNP流体动力学尺寸的动态光散射(DLS)。图22D显示SNP在PBS缓冲液(pH 7.2,含有1.5mM KH2PO4、155mM NaCl和2.7mM Na2HPO4)中的尺寸依赖性ζ电位变化。
图23显示SNP在不同条件下的稳定性研究。图23A显示SNP在pH值分别为4.05±0.03至8.23±0.03范围的缓冲溶液中的pH依赖性尺寸变化。误差线来自于3次独立测定值。图23B显示PBS缓冲液(pH=7.2)中的40和80nm SNP在室温、37和60℃的不同温度下的温度依赖性尺寸变化。图23C显示40和80nm SNP在含10%血清的DMEM培养基存在和不存在情况下的尺寸变化。误差线来自于3次独立测定值。
图24显示了不同时间和不同pH值条件下的尺寸变化。
图25显示了用于制备尺寸可控的金超分子纳米颗粒(Au-SNP)的超分子合成方法示意图。基于金刚烷(Ad)和β-环糊精(CD)的分子识别系统用于组装三种构建块,即:Ad接枝的2nm Au胶体、CD-PEI和Ad-PEG。原位配体交换方法用于将Ad-PEG-RGD引导至Au-SNP上,得到可识别带有膜αvβ3整联蛋白受体的某些类型肿瘤细胞的RGD-Au-SNP。
图26显示了范围为40±5nm、59±6nm、78±5nm、99±7nm、118±23nm的不同尺寸Au-SNP的TEM图像和直方图。比例尺:300nm。
图27显示了透射电镜(TEM)图像分析。图27A显示Ad接枝的2nmAu胶体是Au-SNP的无机构建块。图27B显示通过超分子合成方法得到的118nm Au-SNP。图27C为量变图,总结了Au-SNP尺寸与Au胶体和CD-PEI混合比例之间的关系。图27D显示118nm Au-SNP稳定性的温度效应,图27E显示pH效应。
图28显示Au-SNP在PBS缓冲液中的尺寸依赖性ζ电位变化。误差线来自于3组独立测定值。
图29显示Au-SNP在不同温度下的稳定性。图29A显示从7-100℃的不同温度下40和118nm Au-SNP的尺寸变化。其他依次为118nmAu-SNP在25℃(图29B)、50℃(图29C)和100℃(图29D)下的TEM直方图。
图30显示脉冲激光系统设置的图解。
图31显示Au-SNP的光学特性。图31A显示2nm Au胶体和118nmAu-SNP的吸收光谱。图31B的时间分辨亮视野显微图像显示了脉冲激光扫描过程中的118nm Au-SNP悬液,而图31C显示了Ad接枝的2nm Au胶体悬液(6ns,532nm,32mJ/cm2(118-nm Au-SNP)和265mJ/cm2(Ad接枝的2nm Au胶体))。
图32显示荧光显微图像。图32A显示经118nm RGD-Au-SNP处理的U87细胞(αvβ3+)的荧光显微图像。图32B显示经118nm RGD-Au-SNP处理的MCF7细胞(αvβ3-)的荧光显微图像,图32C显示经RGD接枝的2nm Au胶体处理的U87细胞在脉冲激光照射(6ns,120mJ/cm2)后的显微图像。使用防护罩限制激光束直径为1mm(如白色虚线圈所示)。
图33显示U87和MCF7细胞混合物的光热处理。图33A显示含有1∶1的U87和MCF7细胞的混合物的荧光显微图像。RGD-Au-SNP处理和后续的培养基更换后,将细胞混合物用脉冲激光照射。培养2小时后在激光照射区域中,U87细胞耗尽,而剩下的MCF7细胞在基质中存活。图33B显示在其细胞突出处接枝有118nm RGD-Au-SNP的αvβ3+U87细胞的时间分辨图像。在6ns脉冲激光(120mJ/cm2)照射后,观察到细胞突出处的快速收缩,这是微气泡形成所引起的局部机械性破坏的结果。
发明详述
以下详细讨论本发明的某些实施实施方案。描述实施方案时,为明晰起见而使用了特定术语。不过,本发明并不限于这些所选的特定术语。相关领域技术人员会认识到,也可使用其他等同组件,并可开发其他方法而不脱离本发明的广泛概念。本说明书中任何地方所引用的文献均通过参考单独并入本文。
本发明的一些方面包括超分子结构,也称为超分子纳米颗粒(SNP),其具有:(1)适于为所述超分子结构至少提供一些机械结构的多个结构组件;(2)多个结合组件,各自具有适于与所述多个结构组件结合的多个结合区域;和(3)多个终止组件,各自适于与所述多个结合组件之一的结合区域相结合。所述结构组件和结合组件在彼此接触时自组装形成超分子结构。在终止组件相对于结合组件的结合区域以足够量存在时,终止组件用于占据结合组件的结合区域以终止进一步的结合。
结构组件与结合组件的结合区域相结合。结构组件可以与单个结合组件的多个结合区域结合、可与多个结合组件结合,或是两者皆有。通常,结构组件与多个结合组件的多个结合区域相结合,并自发地进行自组装,在结构组件与结合组件之间形成交联网络或水凝胶。终止组件也与结合组件的结合区域相结合。这样,当终止组件以足够浓度存在时,终止组件竞争结合组件上的结合区域,从而限制交联网络的持续增长。这样,终止组件即可终止交联网络的增长,形成离散的颗粒。
所述至少三种组件通过一种或多种分子间作用力相互结合。分子间作用力的实例包括疏水相互作用、生物分子相互作用、氢键相互作用、π-π相互作用、静电相互作用、偶极-偶极相互作用或范德华力。生物分子相互作用的实例包括DNA杂交、蛋白质-小分子相互作用(例如,蛋白质-底物相互作用(例如,链霉亲和素-生物素相互作用)或蛋白质-抑制剂相互作用)、抗体-抗原相互作用或蛋白质-蛋白质相互作用。其他相互作用的实例包括络合物或包合物,例如金刚烷-β-环糊精络合物或重氮苯-α-环糊精络合物。通常,结合超分子结构组件的分子间作用力不是共价键。
结构组件
在一些实施方案中,结构组件具有与结合组件上的结构区域结合的多个结合元件。结合元件为通过一种或多种分子间相互作用与结合组件上的结合区域相结合的化学部分。结构组件的结合元件以及结合元件的结合区域是特别选择来相互结合的,可利用分子识别特性来确定结合区域。
在一些实施方案中,结构组件为无机或有机芯核中的至少一种。
在一些实施方案中,所述无机芯核包括无机纳米颗粒,如金属纳米颗粒(例如,金纳米颗粒、银纳米颗粒、硅纳米颗粒,或其他金属)。其他无机纳米颗粒包括金属氧化物纳米颗粒(例如,二氧化硅纳米颗粒或氧化铁纳米颗粒)和其他无机化合物的纳米颗粒。也可使用功能性纳米颗粒,如磁性纳米颗粒、量子点(例如,CdS或CdSe纳米颗粒),或半导体氧化物颗粒。
在一些实施方案中,所述无机芯核为球形。在另一些实施方案中,所述无机芯核的形态可为三角形、立方体、星状、棒状、壳状、菱形、碟状、锥形、不规则形或笼状结构。
在一些实施方案中,无机芯核的最大尺度小于约100nm。无机芯核的最大尺度可小于约70nm、小于约50nm、小于约25nm、小于约10nm,或小于约5nm。无机芯核的尺寸可能因超分子结构的功能而异。
对于本发明提供的数值范围,应理解除非上下文有明确规定,否则本发明也包含各个介于该范围上限和下限之间的中间数值(包括低至下限单位十分之一的数值)以及其他所述的或在所述范围内的中间数值。任何范围的端值也包括在该范围之内。
本领域内有许多已知的无机纳米颗粒。无机芯核与结合组件的结合区域相结合。在一些实施方案中,所述结合组件具有与无机芯核直接结合的结合区域。在另一些实施方案中,无机芯核表面以多个结合元件进行衍生化,所述结合元件与结合组件的结合区域通过一种或多种分子间作用力结合。
在一些实施方案中,超分子结构中存在多个无机芯核颗粒。此种情况下,所述多个无机芯核颗粒与多个结合组件相结合,形成交联网络或水凝胶。通过也与结合组件的结合区域相结合的终止组件来限制或终止交联网络的持续增长。
在一些实施方案中,结构组件为有机芯核。有机芯核包括树枝状聚合物、聚合物、蛋白质、寡糖、胶束、脂质体或囊泡。在一些实施方案中,所述有机芯核为树枝状聚合物、聚合物或多肽。在一些实施方案中,结构组件为树枝状聚合物(例如聚酰胺树枝状聚合物或PAMAM)、分枝状聚乙烯亚胺(PEI)、直链聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、聚丙交酯、聚丙交酯-乙交酯共聚物、聚酐、聚-ε-己内酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚N-异丙基丙烯酰胺或多肽。在一些实施方案中,所述有机芯核为聚酰胺树枝状聚合物。在一些实施方案中,所述有机芯核为多聚L-赖氨酸聚合物。
在一些实施方案中,所述结合组件的结合区域与作为有机芯核结构一部分的结合元件相结合。在另一些实施方案中,所述有机芯核以多个结合元件进行衍生。结合元件通过一种或多种分子间作用力与结合组件的结合区域结合,并自组装成交联网络或水凝胶。通过也与结合组件的结合区域相结合的终止组件来限制或终止交联网络的持续增长。结合元件和结合区域可根据期望的结合类型进行选择,在一些实施方案中可利用分子识别特性。
本领域中已知有许多树枝状聚合物。树枝状聚合物结构芯核的优点在于其快速合成以及易于被结合元件官能化的能力。可将树枝状分子合成为包括结合元件作为结构的一部分。或者,在树枝状聚合物合成过程中,各终止点具有可通过化学部分终止的反应功能性,所述化学部分作为发挥结合元件功能与结合组件的结合区域相结合。具体的树枝状聚合物实例包括聚酰胺树枝状聚合物或PAMAM。
本领域中已知有许多聚合物。聚合物的优点在于其快速合成以及易于被结合元件官能化的能力。可将聚合物合成为包括结合元件作为结构的一部分。或者,聚合物上的反应性官能团可使用作为结合元件的化学部分进行衍生。例如,含赖氨酸残基的多肽具有可使用结合元件进行官能化的反应性胺基(-NH2)。一个具体实例为聚L-赖氨酸。
在一些实施方案中,存在两种或更多种不同的结构组件,只要它们均具有与结合组件相结合的结合元件即可。
在一些实施方案中,结构组件为用结合元件如金刚烷衍生的聚酰胺(polyamidoamine)树枝状聚合物。在另一些实施方案中,结构组件为用金刚烷衍生的无机(例如,金)纳米颗粒。
终止组件
在终止组件相对于结合组件的结合区域以足够量存在时,终止组件占据结合组件的结合区域以限制交联网终的持续增长。结合组件和结构组件自组装成超分子结构,而终止组件占据结合区域并阻止结合组件与结构组件之间的进一步自组装。终止组件对自组装过程的限制程度取决于终止组件上结合元件与结合元件上结合区域数量的相对浓度。当终止组件浓度达到足够水平时,三种组件的自组装导致形成颗粒,而不是交联网络或水凝胶。这种制备纳米颗粒的超分子方法的优点在于,最终颗粒的尺寸易于通过调整制备混合物中各组件的相对浓度来调节。
在一些实施方案中,终止组件具有单个结合元件,其与结合组件上的一个结合区域相结合。这些情况下,每个终止组件仅含有一个结合元件。结合元件是通过一种或多种分子间作用力与结合组件的结合区域相结合的化学部分。这些终止组件仅与结合组件上一个结合区域相结合。这样可避免终止组件与结合组件之间的交联。
在一些实施方案中,终止组件为聚合物、多肽、寡糖或小分子,只要终止组件与结合组件的结合区域相结合即可。在一些实施方案中,终止组件是以结合元件进行衍生的聚合物。在一些实施方案中,终止组件是以结合元件(如金刚烷)进行衍生的聚乙二醇。
在一些实施方案中,超分子结构可具有两个或更多个终止组件。这些实施例中,超分子结构可具有2、3、4、5或6个种不同的终止组件。各终止组件可具有相同的结合元件,或者它们可具有不同的结合元件,但各结合元件都将与结合组件上的结合区域相结合。
结合组件
结合组件具有与结构组件和终止组件相结合的多个结合区域。结合区域是通过一种或多种分子间作用力与结构组件和终止组件相结合的化学部分。
在一些实施方案中,可使用两种或多种不同的结合组件,只要两者均具有与结构组件和终止组件相结合的结合区域即可。
在一些实施方案中,结合组件为聚合物、寡糖或多肽。可使用任何包含多个结合区域的适合材料。在一些实施方案中,结合组件为聚合物。在一些实施方案中,结合组件是以多个结合区域进行衍生的聚乙烯亚胺或分枝聚乙烯亚胺。结合组件的一个具体实例是以β-环糊精衍生的分枝聚乙烯亚胺。结合组件的另一个实例是以β-环糊精衍生的多聚L-赖氨酸。
分子识别
在一些实施方案中,结合区域和/或结合元件为分子识别元件。换言之,结合区域与结构组件或终止组件上的结合元件形成分子识别对。
分子识别是指两个或更多个分子之间通过一种或多种分子间作用力发生的特异性相互作用。涉及分子识别的分子表现出分子互补性,被称为一个分子识别对或主-宾复合物。此种情况中,术语“主”和“宾”不表明任何特定的关系,仅描述具有分子互补性(即:通过分子识别而彼此结合)的两种化合物。“主”与“宾”可彼此结合,但两个“主”化合物不能。分子识别是特异性的相互作用,意味着各分子识别元件将与具有特定结构特征的互补分子相结合。通常,分子识别对的结合比非特异性结合更紧密,因为两分子识别元件之间发生了多重相互作用。
分子识别对的实例包括小分子主-宾复合物(包括但不限于包合物)、互补性寡核苷酸序列对(例如,通过杂交作用彼此结合的DNA-DNA、DNA-RNA或RNA-RNA)、抗体-抗原、蛋白质-底物、蛋白质-抑制剂和蛋白质-蛋白质相互作用(如α-螺旋肽链和β-折叠肽链)。
在一些实施方案中,超分子结构通过分子识别进行自组装。这种情况下,结合组件上的结合区域与结构组件上的结合元件形成分子识别对。终止组件上的结合元件也与结合组件上的结合区域相结合而形成分子识别对。结合组件与结构组件之间形成的分子识别对和结合组件与终止组件之间形成的分子识别对可以相同或不同。换言之,结构组件上的结合元件与终止组件上的结合元件可以相同,或者它们可以不同,但两者的结合元件均与结合组件上相同的结合区域发生结合。
分子识别对的具体实例包括金刚烷-β-环糊精复合物或重氮苯-α-环糊精复合物。其他分子识别对包括分子复合物(例如,环糊精中的类固醇、芘、罗丹明或阿霉素)。分子识别对的其他实例包括生物素-链霉亲和素和互补寡核苷酸。
功能元件
在一些实施方案中,结构组件、结合组件或终止组件中至少一种还包括功能元件。功能元件为赋予超分子结构以额外功能或活性的化学部分,所述额外功能或活性在该功能元件缺失时不存在。在一些实施方案中,所述功能元件为发光(即荧光或磷光)化合物。荧光和磷光标记的超分子结构可用于如体外或体内成像研究。在另一些实施方案中,功能元件可以是具有放射性或磁活性的同位素。例如,正电子发射同位素(如64Cu)可用于测量超分子结构的生物分布。其他适用的同位素对本领域技术人员而言将是很明显的。
在一些实施方案中,所述功能元件为靶向元件,其功能为将超分子结构靶向至特定细胞。此类靶向元件包括与细胞表面蛋白结合的肽、寡核苷酸、抗体和小分子。通常,任何特异性地与一种或多种细胞表面蛋白结合的化学部分均可并入超分子结构中。细胞表面蛋白可以是如癌细胞或者细菌或真菌上的蛋白。细胞靶向部分的具体实例包括RGD和EGF、叶酸、转铁蛋白,以及靶向细胞表面标志物的抗体(例如用于乳腺癌细胞上Her2的赫塞汀)。
在一些实施方案中,所述功能元件为细胞通透元件,其功能是增强细胞膜通透。增加细胞膜通透的配体的具体实例包括TAT配体。也可使用其他细胞膜通透配体。
在一些实施方案中,超分子结构具有两个或更多个功能元件。例如,超分子结构可具有两个靶向元件,提高细胞靶向选择性,或是通过靶向多于一种细胞表面蛋白而提高结合的亲和力。其他实例包括具有靶向元件和细胞通透元件的超分子结构,综合了更强的细胞靶向和更高的细胞通透效果。另一个实例可为具有成像元件(发光或放射性同位素)和用于靶细胞成像的靶向元件的超分子结构。据此,易于预想其他组合,如两种靶向元件和细胞通透元件、两种靶向元件和可视化元件等。
在一些实施方案中,超分子结构包括两种或更多种终止组件,每种终止组件进一步包括功能元件。这样,可利用多种终止组件掺入多种功能元件。例如,超分子结构可具有不含功能元件的终止组件和含有靶向元件的终止组件。可通过用第二终止组件或其他终止组件的混合物处理该超分子结构而使不含功能元件的终止组件与含有功能元件的终止组件发生交换。同样地,该超分子结构可用终止组件的混合物来制备,其中每种终止组件都将并入该超分子结构中。
载荷
在一些实施方案中,所述超分子结构进一步包括载荷。所述载荷为包裹在超分子结构中并从超分子结构中释放的化学部分。载荷材料可与结构组件、结合组件或终止组件中的一种或多种结合,但不干扰纳米颗粒的自组装,因为它们不与结合组件的结合区域特异性结合。载荷化合物可以是小分子,如治疗性化合物(例如用于癌症治疗的阿霉素、紫杉醇、雷帕霉素或顺铂)、蛋白质、肽、寡核苷酸(如siRNA)或质粒(用于基因递送)。超分子结构可向靶标细胞递送治疗性蛋白质和寡核苷酸,保护治疗性化合物、蛋白质或寡核苷酸在递送前免于降解。
在一些实施方案中,所述超分子结构可包括两种或更多种载荷化合物。在一些情况下,可包括两种或更多种治疗性化合物,从而允许通过调整超分子结构中治疗性化合物的比例而将治疗性化合物以确定的比例递送至细胞。在另一些情况下,可以掺入质粒和小分子。也可以使用其它组合。
制备
本发明的实施方案包括制备上述超分子结构的方法,其通过制备结构组件和结合组件的悬液并向所述悬液中加入终止组件来实现。结构组件、结合组件和终止组件的量的比例根据所述超分子结构的预定尺寸来选择。结构组件、结合组件和终止组件自组装成基本具有所述预定尺寸的所述超分子结构。在一些实施方案中,预定尺寸为至少约30nm并小于约500nm。
超分子结构可容易地通过将各组件组合在一起来制备。所述至少三个组件自组装成超分子结构。也可使用额外的组件(结构组件、结合组件或终止组件)或载荷化合物,只要基本元件存在即可。所述额外组件可包括一种或多种功能元件。
超分子结构形成后,可通过用其他组件处理该超分子结构而与其他具有适当结合元件或结合区域的组件发生交换。例如,终止组件可通过用其他终止组件(例如,带有功能元件的)处理超分子结构而发生交换。同样地,结构组件或结合组件可通过用额外的结构组件或结合组件处理超分子结构而发生交换。组件的悬液或溶液可进行声处理以加速或协助其组件交换反应。
超分子结构的尺寸可容易地通过改变制备超分子结构所用组件的比例来调整。可以容易地制备种类繁多的不同尺寸超分子结构。这使得可以进行组合合成,因为超分子结构阵列可根据其特定功能进行测定以优化其活性。
利用组件交换,超分子结构的尺寸可在超分子结构形成后通过用额外组件处理预先形成的超分子结构来进行调整。例如,如果以额外的结合组件处理预先形成的超分子结构,则尺寸会变小。如果以额外的结构组件处理预先形成的超分子结构,则尺寸会增大。该效应的实例见下文实施例。
根据本发明中一些实施方案的情况,超分子结构可在体外和体内环境下解聚。
功能元件也可容易地利用该方法进行调整。在许多情况下,用于制备超分子结构的混合物中可包含带有功能元件的组件。功能元件在超分子结构中的存在程度可容易地通过改变具有功能元件的组件与无功能元件的组件之间的比例来调整。例如,如果功能元件存在于结合组件上,则有功能元件的结合组件与无功能元件的结合组件之间的比例决定了所形成超分子结构中该功能元件的存在程度。当功能元件存在于终止组件或结构组件上时也是这样。
当功能元件存在于终止组件上时,可用有功能元件的终止组件处理之前组装的超分子结构。一部分终止组件将发生交换以产生带有该功能元件的超分子结构。具有多种不同功能元件的多种终止组件可以类似方式加入。所得超分子结构上功能元件的存在程度由用于处理预先形成之超分子结构的终止组件的浓度决定。
各个组件可容易地利用本领域已知化学方法来制备。结构元件根据将各组件结合在一起所需分子间作用力的类型来选择,也可根据意愿来选择。分子识别提供了许多可用作结合元件或结构区域的化学部分的实例。对结构组件而言,必要时,无机芯核可用本领域已知方法进行衍生以在表面上提供结合元件。有机化合物(如聚合物和树枝状聚合物)可用适当的结合元件合成。或者,有机芯核(包括聚合物、树枝状聚合物、多肽等)可制备成带有反应性官能团,其可按需求用适当的结合元件或结构区域进行衍生。
存在许多用适当结构元件衍生有机化合物的方法。例如,可使有机化合物上的反应性官能团(如羟基、巯基、胺、羧酸、卤化物、烯烃、炔烃、叠氮化物及其他)与多种其他官能团反应(或对其进行激活以发生反应)而形成共价键。例如,具有游离NH2基团的含胺化合物可以与带有胺反应性基团(如异氰酸酯、异硫氰酸酯和活化酯(如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯))的结合元件发生反应。这样,可以容易地将结合元件加到任何组件上。特定组件上的结合元件数量会因反应位点数量以及用于制备该组件的反应性结合元件的数量而异。具体实例见下文所述实施例。
例如,分枝状聚乙烯亚胺上的胺可与活化的环糊精(如甲苯磺酸环糊精)反应,以制备以环糊精衍生的环聚乙烯亚胺结合组件(见实施例1中CD-PEI)。类似地,其他聚合物(如聚L-赖氨酸)可与活化的环糊精(如甲苯磺酸环糊精)结合,以制备以环糊精结合元件衍生的聚L-赖氨酸组件。在另一些实例中,胺类(如聚酰胺树枝状化合物中或聚L-赖氨酸中的那些)可与其他活化的结合元件(如金刚异氰酸酯)反应,以制备以金刚烷结合元件衍生的化合物。
通常用于衍生蛋白质的化学方法也可用于将结合元件加到蛋白质、肽或抗体上。例如,金刚烷接枝或硫醇-烯接枝可用于产生不可逆键合。
一些情况下可能需要连接剂。本领域技术人员熟知多种用于与蛋白质共价连接的双功能交联剂,它们均可使用。例如,异双功能交联剂如4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)和马来酰亚胺基丁酸-N-琥珀酰亚胺酯(GMBS)可用于与胺进行反应(通过琥珀酰亚胺酯),随后与游离巯基形成共价键(通过马来酰亚胺)。其他交联剂如3-(2-吡啶基二硫基)丙酸琥珀酰亚胺酯(SPDP)可与胺反应(通过琥珀酰亚胺酯),并通过巯基交换与游离巯基形成共价键。其他双功能交联剂包括辛二酸双(N-羟基琥珀酰亚胺酯),可与两个胺发生反应。其他带有多种表面修饰的可用双功能和异双功能交联剂对于本领域技术人员来说是很明显的。
在本发明的一些实施方案中,期望包括可逆(可断裂的)连接剂,多种此类连接剂对本领域技术人员来说是很明显的。例如,4-烯丙氧基-4-氧代丁酸的一端含有烯烃基,其可用于与硫醇进行硫醇-烯偶联,它的另一端为羧基,可与胺偶联。该连接剂中央有酯基,在生理条件下会随时间缓慢水解。本领域技术人员显而易见其他可断裂交联剂。它们包括例如在还原后断裂的二硫键。
用途
超分子结构具有多种用途,尤其在生物学应用上。产生超分子结构所需要的简单方法使得能够快速制备各种尺寸或带有特定功能元件的超分子结构。用于结构组件、结合组件和终止组件的不同材料的使用使得广泛应用成为可能。
根据本发明的某些实施例,超分子结构可在体外和体内环境中解聚。这使得载荷材料可以从超分子结构中释放出来。
超分子结构可通过将基因或质粒递送到细胞中而用于基因治疗(体内)或细胞转染(体外)。
本发明实施方案包括通过用本文所述带有质粒载荷的超分子结构与细胞接触而将基因递送至细胞的方法。用超分子结构处理细胞导致该超分子结构内化,随后将质粒释放到细胞中。这可导致目的质粒对靶细胞的有效“转染”。通常,带有任何基因的任何质粒都能以此种方式导入细胞。同样地,靶向和/或细胞渗透元件可提高细胞特异性和/或内化。
本发明的实施方案包括通过用本文所述带有治疗性化合物载荷的超分子结构处理细胞来递送治疗性化合物的方法。治疗性化合物可以是例如蛋白质或肽(包括抗体)、寡核苷酸(例如siRNA),或小分子。小分子可以是例如抗癌剂(例如阿霉素、泰素、紫杉醇、顺铂或雷帕霉素)、抗生素、抗菌剂或抗真菌剂。超分子结构上的功能元件可改善细胞靶向、内化或分布。多于一种治疗性化合物可在单个超分子结构中运送,并且如果需要,可控制治疗性化合物的比例。
其他使用本发明所述超分子化合物的方法包括光热疗法,其通过用本发明所述具有以金纳米微粒为结构组件的超分子结构处理细胞来实现。
其他使用本发明所述超分子化合物的方法包括以具有磁性纳米微粒为结构组件的超分子结构处理细胞、蛋白质或肽来进行细胞、蛋白质或肽的分选。靶向功能元件允许超分子结构与特定细胞、蛋白质或肽结合,允许进行磁性分离。
超分子纳米微粒可用于分子成像(例如PET),其中使用带功能元件的组件,所述功能元件带有一个或多个合适的同位素或发光化合物。同样,超分子结构可用于放射治疗,其中一个或多个组件包括带有治疗性同位素的功能元件。细胞靶向和细胞通透功能元件可进一步提高这些超分子结构的效果。
药物组合物
本文所述超分子结构或纳米颗粒可配制成多种组合物,以用于诊断或治疗性处理方法。所述组合物(例如药物组合物)可装配成药盒。通常,本发明药物组合物包含有效量(例如药物学有效量)的本发明组合物。
本发明组合物可配制成药物组合物,其包含本发明组合物和可药用载体。“可药用载体”意为不由于生物学原因或其他原因而不期望的材料,即该材料可向受试者施用而不会导致任何不期望的生物效应或以有害方式与其所含药物组合物的其他成分产生任何相互作用。本领域技术人员熟知,该载体当然将选择成尽量减少活性成分的降解并尽量减少受试者中的任何有害副作用。可药用载体和药用组合物的其他成分的讨论参见如Remington′s Pharmaceutical Sciences,第十八版,Mack PublishingCompany,1990。本领域技术人员显然可知某些合适的药用载体,例如:水(包括无菌水和/或去离子水)、适当的缓冲液(如PBS)、生理盐水、细胞培养基(如DMEM)、人造脑脊液等。
除本发明组合物外,本发明药物组合物或药盒还可包含其他药物。其他药剂可在处理过程中的任何适当时间向患者施用,同时或先后给药均可。
本领域技术人员会认识到,具体的制剂一部分依赖于所用的特定药剂和所选的给药途径。据此,本发明的组合物可有多种不同适用剂型。
适于在CNS中直接局部给药的制剂包括:合适的液体载体,或霜剂、乳剂、乳胶、悬浮剂、溶液、凝胶、霜剂、糊剂、泡沫、润滑剂或喷雾剂。在CNS因创口或手术过程中打开时可进行CNS中局部给药。
本领域技术人员会认识到,可基于具体应用选择、改良或开发合适或适当的制剂。本发明组合物的剂量可以为单位剂量形式。本文所述术语“单位剂量形式”涉及适于作为动物(如人类)受试者的剂量单元的物理分离单位,每个单位含有预定量的本发明药剂(单独或与其他治疗剂组合)和可药用稀释剂、载体或赋形剂,所述预定量以足以产生预期效果的量计算。
本领域技术人员可容易地决定所用组合物确切制剂的合适剂量、方案和给药方法,以及达到个体患者体内药剂的期望有效量或有效浓度。
在本发明情况下,本发明所述组合物向动物(尤其是人类)给药的剂量应当足以在合理时限内在个体中产生至少可检测量的诊断或治疗应答。用于达到期望效果的剂量由多种因素决定,包括所施用特定药剂的效力、宿主中与药剂相关的药效学情况、感染个体的病症严重性、向受试者施用的其他药物等。剂量大小还由是否存在任何可能伴随所用特定药剂或组合物的有害副作用决定。只要可能,通常期望使有害副作用尽可能保持最小。生物学活性物质的剂量会变化;每种特定药剂的合适量对于本领域技术人员而言是很明显的。
本发明的另一实施方案为可在体外或体内用于任何本发明所述方法的药盒。这种药盒可包含一种或多种本发明组合物。任选地,所述药盒包含执行该方法的说明书。本发明药盒的任选元件包括合适的缓冲剂、可药用载体等、容器,或包装材料。该药盒的试剂可在使其保持稳定的容器内,例如以冻干形式或稳定的液体中。试剂还可为单次使用形式,例如单剂量形式。
据前文所述,显而易见可对本文所述的本发明进行变更和修改以使其适用于多种用途和条件。此类实施方案也在下述权利要求的范围内。
本文任何变量定义中列举的元件列表包括所述变量作为任何单个元件或所列元件的组合(或亚组合)。本文所列举的实施方案包括该实施方案作为任何单个实施方案或与任何其他实施方案或其部分相组合。
无数量词修饰的名词均包含复数含义,除非上下文特别说明为其他情况。
以下所述实施例用以说明本发明,但不限于其范围。本发明的其他变体对本领域技术人员来说显而易见,并包括在所附权利要求的范围之内。本文为所有目的而言引用的所有刊物、数据库和专利均通过参考并入本文。
用于制备、表征和使用本发明化合物的方法展示于以下实施例中。起始材料根据本领域所知方法或如本文所示制备。提供以下实施例以使得可以更充分地理解本发明。这些实施例仅用于说明,而不应以任何方式理解为对本发明进行限制。
实施例
实施例1——超分子纳米颗粒(SNP)的制备
概述
试剂和溶剂购于Sigma-Aldrich(St.Louis,MO),除非另有说明,均以收货状态未经进一步纯化直接使用。分枝状聚乙烯亚胺(PEI,MW=10kD)购于polysciences Inc(Washington,PA)。聚合物包含伯胺、仲胺和叔胺基团,其比例约为25/50/25。溶于20%wt甲醇溶液的带有1,4-二氨基丁烷芯核和胺末端的第一代聚酰胺树枝状聚合物(PAMAM)购于Dendritic Nanotechnologies,Inc(Mount pleasant,MI)。1-金刚烷胺盐酸盐和β-环糊精(β-CD)购于TCI America(San Francisco,CA)。以N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)功能化的甲氧基聚乙二醇(mPEG-NHS,MW=5kD)来自于NANOCS Inc(New York,NY)。1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸单(N-羟基琥珀酰亚胺酯)(DOTA-NHS)购于Macrocycles(Dallas,TX)。6-单甲苯磺酰-β-环糊精(6-OT-β-CD)依据文献报道的方法(R.C.Petter,J.S.Salek,C.T.Sikorski,G.Kumaravel,F.T.Lin J.Am.Chem.Soc.1990,112,3860-3868)制备。干CH2Cl2通过在CaH2中回流并在使用前新鲜蒸馏获得。
用Bruker Avance 400光谱仪在氘化溶剂中记录1H NMR光谱。使用Applied Biosystems Voyager DE-STR MALDI-TOF质谱仪(Framingham,MA,USA)获取质谱数据。动态光散射在Coulter N4 Plus亚微米颗粒分拣器(Beckman Coulter,Inc.,USA)上进行。在Zetasizer纳米仪(Malvern Instruments Ltd.,UK)测量超分子纳米颗粒(SNP)的ζ电位。透射电镜(TEM)图像在以120kV加速电压操作的Philips CM120电子显微镜上测量。
构建块的合成
CD-PEI的合成
向分支状PEI(100mg,10μmol溶于100ml DMSO中)溶液中加入6-OT-β-CD(12.9g,1mmol)。在70℃下反应3天后,将混合物转移至Slide-A-Lyzer透析盒(MWCO,10kD)中,在去离子(DI)水中透析6天。透析结束后,将反应混合物进行过滤以除去未反应的呈白色沉淀物状的6-OT-β-CD,滤液冻干过夜,以83%产率提供呈白色松软固体状的CD-PEI(150mg,8.3μmol)。1H NMR(400MHz,D2O):δ4.92(br,CD的C1 H),3.27-3.66(m,CD的C2·6 H),2.3-3.0(br,PEI的OCH 2)。根据CD中C1H与PEI中CH2的质子整合来计算CD-PEI分子中CD/PEI的比例。
8-Ad-PAMAM的合成
将含有PAMAM(20%wt,100mg,0.069mmol)的甲醇溶液加入圆底烧瓶中。使甲醇在真空中蒸发,将粘性固体重溶于10ml干THF中。将含1-金刚烷异腈(244.6mg,1.38mmol)的10ml干THF直接加入PAMAM溶液中。反应混合物在室温下搅拌2小时后,真空除去溶剂。向反应残留物中加入乙醚(100ml)以产生白色沉淀,过滤收集沉淀。以乙醚清洗白色沉淀(100ml×3),干燥后以85%得率产生白色固体状8-Ad-PAMAM(169mg,0.059mmol)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.82-7.98(m,8H,CONH),6.10(s,4H,NHCONH),5.37(s,4H,NHCONH),3.24(br,32H,COCH2),2.34-2.76(m,68H,NCH 2),1.64-2.03(m,120H,Ad上的质子)。ESI-MS:C152H252N34O20[M+H]+的计算值:m/z=2875.98;实测值2875.78。
4-Ad-PAMAM的合成
用注射泵(以10ml/h的注射速率)向10ml PAMAM(100mg,0.069mmol)的THF溶液中缓慢加入10ml含1-金刚烷异腈化物(50.1mg,0.283mmol)的干THF溶液。通过乙醚沉淀纯化后,以60%产率产生白色固体状4-Ad-PAMAM(89.7mg,0.041mmol)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.83-7.95(m,8H,CONH),6.14(s,2H,NHCONH),5.42(s,2H,NHCONH),3.35(br,32H,COCH 2),2.35-2.81(m,68H,NCH2),1.60-2.01(m,6OH,Ad上的质子)。ESI-MS:C108H192N30O16[M+H]+计算值:m/z=2167.52;实测值2167.18。
Ad-PEG的合成
向溶于10ml CH2Cl2的1-金刚烷胺盐酸盐(187.7mg,1mmol,5当量)溶液中依次加入三乙胺(105mg,1.04mmol,5.1当量)和mPEG-NHS(1g,0.2mmol,1当量)。反应混合物在室温下搅拌2小时。反应完成后,在真空中除去溶剂,并向反应残留物中加入水。将溶液转移至离心管中,以10,000rpm离心10分钟以除去未反应的金刚烷胺。将溶液用Slide-A-Lyzer透析盒中(MWCO,10kD)在水中透析过夜,冻干后以91%产率产生白色粉末状Ad-PEG(0.92g,0.18mmol)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ3.42-3.54(br,440H,OCH2),1.13-1.18(br,15H,Ad上的质子)。
纳米颗粒的制备
SNP的制备
向Ad-PEG(6.3mg,1.26μmol,5当量)在750μL DI水或PBS缓冲液中的溶液中,通过Hamilton注射器在剧烈搅拌下缓慢注射加入15μL含不同量n-Ad-PAMAM的DMSO。将CD-PEI(4.3mg,0.25μmol,1当量)的750μL DI水溶液或PBS缓冲液加入混合物以得到从30到450nm的不同尺寸SNP。见图1。
动态光散射
用装备有10nW氦氖激光器(λ=632.8nm)和热电温度控制器的Coulter N4 Plus DLS设备进行DLS试验。在90°散射角时进行测量。用于DLS的SNP样品用各自的溶液稀释以产生5×104~1×106点/S范围内的90°散射强度。组装的SNP的尺寸和标准差通过至少三次测量的平均值来计算。对温度依赖性试验,各样品在不同温度下平衡>20分钟。
ζ电位(ξ)测量
用Zetasizer Nano仪器(Malvern Instruments,Malvern,Worcestershire,UK)通过光子相关光谱学来确定SNP的ζ电位。测量在25℃下以90°检测角进行测量,随后将原始数据与用Zetasizer软件包的累积分析获得Z平均尺寸相关联。所有分析均使用以过滤DI水适当稀释的样品进行。通过多价Ad/CD识别相互作用,CD-PEI和8-Ad-PAMAM的铵基赋予SNP以正电荷。SNP直径从30nm增加到450nm时,ζ电位从17.1mV增加到28.3mV(图2)。
透射电子显微术(TEM)
SNP的形态和尺寸可通过透射电子显微术直接观察。研究在PhilipsCM 120电子显微镜上进行,以120kV加速电压操作。TEM样品通过将2μL SNP溶液滴落包被在碳包覆铜网上来制备。液滴接触到铜网45秒后,以滤纸除去过量的液滴。随后,在进行TEM研究前,将表面有沉积的SNP用2%乙酸双氧铀负染45秒。如图3B-E所示,TEM成像表明SNP呈球形,尺寸分布范围窄(图4)。这与用DLS观察到的结果相符。
SNP稳定性(基于八取代PAMAM树枝状聚合物8-Ad-PAMAM)
超分子方法的使用赋予自组装的SNP以动力学特性。为理解SNP的动力学稳定性,用实时DLS测量来监控不同温度、pH值以及生理离子强度介质中30nm和100nm SNP(由基于8-Ad-PAMAM的树枝状聚合物组成)的尺寸变化。首先,温度变量的DLS测量表明,SNP在广泛温度范围(7-50℃)内稳定(图5)。其次,在改变pH值(pH3.8-8.3)和生理离子强度条件时观察到SNP的尺寸变化可忽略不计(图4和图6)。这些SNP的稳定可归因于多价CD/Ad识别,其将各个分子构建块保持在各SNP中。进行两组试验以检测这些SNP的动力学特性(即竞争性解聚和可逆的尺寸可控性),进一步证实该超分子方法的分子机制。首先,向含有30nm或100nm SNP的溶液中引入100当量的竞争剂(即1-金刚烷盐酸盐)。声处理10分钟后,通过DLS观察由于游离1-金刚烷盐酸盐包裹进CD-PEI的竞争性而导致的SNP解聚。作为对照,仅声处理而不加1-金刚烷盐酸盐不能使SNP解聚(图7)。其次,从100nm SNP(8-Ad-PAMAM/CD-PEI=1∶1,mol/mol)开始,通过原位添加聚合物组件CD-PEI(8-Ad-PAMAM/CD-PEI=1∶2,mol/mol)将SNP尺寸降至30nm,或是通过原位添加树枝状聚合物组件8-Ad-PAMAM(8-Ad-PAMAM/CD-PEI=2∶1,mol/mol)将SNP尺寸增至140nm(图8)。在这些研究中,采用10分钟声处理以利于三种尺寸SNP之间的转换。
生理离子强度条件下SNP的稳定性(I=150mM NaCl)
为确保SNP的体内稳定性,研究了生理离子强度条件(I=150mMNaCl)下的尺寸变化。在150mM NaCl的离子强度(I)条件下的PBS溶液(pH=7.2)中制备30nm和100nm的SNP。将三种分子构建块以各自比例混合后,采用实时DLS测量来监测不同时间30nm和100nmSNP的尺寸变化。每4分钟记录一次SNP尺寸,共36分钟。结果(图4)表明SNP在生理离子强度的溶液中表现出良好的稳定性。
不同温度下SNP的稳定性
为理解SNP的热稳定性,采用实时DLS测量来监测7-50℃不同温度下的PBS(pH=7.2,1=150mM NaCl)中30nm和100nm SNP的尺寸变化。在每种情况下,在数据采集前,将样品在给定温度下平衡20分钟。结果(图5)表明SNP在7-50℃温度范围内表现出良好的热稳定性,允许SNP在体温为36-38℃的活生物体内使用。
不同pH值下SNP的稳定性
需要不同pH环境中SNP的稳定性信息来理解其在生理条件下的特性,并为进一步实验的SNP化学修饰提供合理的pH范围。SNP的pH依赖性稳定性在0.84-10.28的pH范围内通过DLS分析来测定。将PBS缓冲液中的原始SNP贮存溶液用不同pH值的缓冲溶液稀释至适宜浓度以进行DLS检测。如下缓冲液用于调节样品的pH值:100mM HCl-KCl缓冲液(pH 0-2.0)、100mM甘氨酸-HCl缓冲液(pH 2.2-3.6)、100mMCH3COOH-CH3COONa缓冲液(pH 3.7-5.6)、100mM Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(pH 5.8-8.0)、100mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.0-9.0)和100mM Na2CO3-NaHCO3缓冲液(pH 9.2-10.8)。用pH计测量最终pH值。如图6所示,SNP在3.8-8.3的广泛pH值范围内显示出极好的稳定性,表明SNP在生物环境中足够稳定。在较低(pH<3.8)和较高(pH>8.3)值时,100nm尺寸的SNP膨胀成超过400nm。同时,30nm SNP的尺寸完全解聚,不能检测到显著的散射光信号。
声处理稳定性
为检测SNP的动力学特性(即竞争性解聚和可逆的尺寸可控性),进一步验证该超分子方法的分子机制,采用声处理以提供能跨越SNP重组所需能垒的能量。在SNP声处理之前和室温下处理10分钟之后分别通过DLS对PBS(pH 7.2,1=150mM)缓冲液中的30nm和100nm SNP进行监测。实验条件下未观察到显著的尺寸变化(图7),表明仅声处理本身不能使SNP解聚。
体内生物分布
通过将SNP经由尾静脉全身性注射入小鼠体内(图11C)来测定30nm和100nm64Cu标记的SNP(由基于8-Ad-PAMAM的树枝状聚合物组成)的体内生物分布(图9A和图10)。MicroPET/CT研究表明,30nm和100nm SNP的生物分布模式非常相似(图11A和S8B)。这两种情况下,均通过肝累积观察到快速血液清除(注射后5分钟内,30-50%ID/g的SNP在肝内累积),且肾(16-20%ID/g)和肺(8-12%ID/g)中有较少累积。SNP血浆浓度的非线性双相衰减拟合得出30nm和100nm SNP的初始消减半衰期分别为0.87分钟和1.1分钟。最终消减半衰期也差异很大(30nm SNP为68分钟,100nm SNP为108分钟)。总之,结果表明,30nm SNP的体内清除快于100nm SNP。
淋巴结递送
为研究SNP在免疫调节中的用途,调查经前足垫皮下注射64Cu标记的30nm和100nm SNP的淋巴结递送(图11C)。从足垫注射开始的淋巴排泄途径已众所周知,因此这是研究免疫药剂递送的常见方法(Peek等,Adv.Drug Deliv.Rev.,vol.60,915页,2008)。从小鼠足垫的不同侧注射30nm和100nm SNP,在刚刚注射后(图9B,左侧)和注射后20小时(图9B,右侧)进行40分钟的microPET/CT成像。30nm SNP被排泄至腋下淋巴结并在注射后5分钟达到58.6±15.6%ID/g的信号累积峰值(图11D)。这一信号在注射后40分钟降至26.6±5.8%ID/g,并在注射后20小时内进一步减少到7.0±2.2%ID/g。同侧注射100nm SNP的淋巴结中未检测到显著性累积。除了足垫注射部位和淋巴结(其中30nm SNP排泄至此),SNP在注射后1小时内不会向其他体内区域分散。结果显示SNP的尺寸是其淋巴结递送的关键因素。
64
Cu标记的SNP的制备
为进行PET成像研究,制备30nm和100nm的64Cu标记的SNP。30和100nm DOTA接枝的SNP可通过三种不同分子构建块的自组装制备,三种构建块即:(i)8-Ad-PAMAM,(ii)CD-PEI-DOTA和(iii)Ad-PEG。
CD-PEI-DOTA的合成
向CD-PEI(1.7mg,0.1μmol,1当量)的PBS缓冲液(pH 7.2)中加入DOTA-NHS(0.5mg,1μmol,10当量),将反应混合物在室温下搅拌2小时。反应完成后,通过在DI水中透析(Slide-A-Lyzer透析盒,MWCO,10kD)过夜来纯化混合物,并冻干以产生CD-PEI-DOTA。
30nm DOTA嫁接的SNP的制备
通过Hamilton注射器在剧烈搅拌下向750μL Ad-PEG(6.3mg,1.26μmol,5当量)的DI水溶液中缓慢注射溶于15μL DMSO中的8-Ad-PAMAM(0.39mg,0.12μmol,0.5当量)。随后向混合物中加入750μLCD-PEI-DOTA(4.3mg,~0.25μmol,1当量)的DI水溶液,以得到30nm DOTA接枝的SNP。
100nm DOTA接枝的SNP的制备
以与制备30nm DOTA接枝SNP的相似方法将Ad-PEG(6.3mg,1.26μmol,5当量)、8-Ad-PAMAM(0.78mg,0.25μmol,1当量)和CD-PEI-DOTA(4.3mg,~0.25μmol,1当量)混合以制备100nm DOTA接枝的SNP。
DOTA接枝的SNP的
64
Cu标记
所有液体用Chelex-100(Bio-Rad,Herchules,CA)预处理以除去微量金属污染。将64Cu氯化物(MDS Nordion,Vancouver,Canada)与NH4OAc缓冲液(pH 5.5,I=0.1M)混合,然后向上述溶液中加入800倍过量的纳米微粒。将混合物在60℃下孵育1小时,然后通过分子量截流滤器(Centricon YM10,Billerica,MA)以10000g的转速离心10分钟来纯化64Cu标记的SNP产品。通过分别测量滤器、滤液和残留物的放射性来确定标记产率(>90%)。随后用PBS重悬64Cu标记的SNP以备体内注射之用。
Micro-PET/CT成像
C57BL/6小鼠购于Jackson Laboratory(Bar Harbor,ME)。所有动物操作均以无菌技术进行,并经加利福尼亚大学洛杉矶动物研究委员会批准。使用micro-PET FOCUS 220 PET扫描装置(Siemens,Malvern,PA))和MicroCAT 11 CT扫描装置(Siemens)进行Micro-PET/CT成像。成像前15分钟,在预热(30℃)感应室中用1.5-2%异氟烷麻醉小鼠,然后转移至热的隔离/成像室中。将麻醉了的动物放置在扫描装置的板上,经尾静脉或经足垫注射64Cu(100-300μCi),进行1小时的动态PET扫描(图10)。尾静脉注射所用体积为~100μL,足垫注射所用体积<20μL。将小鼠移至同一隔离/成像室内的micro-CT仪上。通过过滤反投射重建PET图像,使用梯度过滤器以产生分辨率为1.7mm的图像。micro-PET扫描完成后立即对小鼠进行7分钟的micro-CT扫描,其中使用常规成像采集参数。micro-CT扫描用于通过micro-PET对64Cu随着时间的组织浓度进行解剖学定位。为解剖学配准,次日(注射后18-24小时)用另一micro-CT获取静态的micro-PET扫描。
为确定不同组织中示踪物浓度的时间变化,将目标椭球体区域置于目测所得显示最高64Cu活性的区域。为确定精确的解剖学定位,将目标区域置于由AMIDE软件合成的micro-PET/CT融合图像上。为尽量减少部分容积效应,注意不要将器官的解剖学边界包括在内。考虑到所研究器官和肿瘤的尺寸以及PET扫描仪的空间分辨率,预期部分容积效应不会对定量分析结果产生重大影响。活性浓度以每cm3组织的经衰减修正的注射活性来表示(可用ID/g百分比来近似估算),使用AMIDE软件,将这些数值标准化至以全鼠绘制的目标椭圆柱形区内。
讨论
本文描述了制备尺寸可控的超分子纳米微粒(SNP)的便捷、灵活且模块化的合成方法(图1)。采用CD/Ad识别使源自三种不同分子构建块的SNP进行自组装,即(i)Ad接枝的第一代聚酰胺树枝状聚合物,n-Ad-PAMAM,(ii)β-CD接枝的分枝状聚乙烯亚胺(MW=10kD),CD-PEI,和(iii)Ad-功能化PEG化合物(MW=5kD),Ad-PEG。以与之前报道的“砖块和灰泥”策略(Boal等,Nature,vol.404,746页,2000)相似地构建交联网络(Belloc等,Bioconjugate Chem.,vol.15,1201页,2004)。加帽/溶解基团Ad-PEG的使用一方面与树枝状聚合物模块n-Ad-PAMAM竞争以限制交联网络的持续增长,另一方面赋予SNP以水溶性。通过调谐PBS水溶液(pH=7.2,含有1.5mM KH2PO4,155mMNaCl和2.7mM Na2HPO4)中三种分子构建块的混合比,可改变交联网络片段的增长/聚集与加帽/溶解之间的平衡,允许随意控制水溶性SNP的尺寸。基于聚合物的纳米颗粒的生产(Sun等,Adv.Mater.,vol.19,3157页,2007;Ferreira等,Cell Stem Cell,vol.3,136页,2008;Bertin等,J Am.Chem.Soc,vol.128,4168页,2006)中,需要大量合成努力以制备特定类型的聚合物构建块,以实现期望的尺寸可控性,与之相反,三组件超分子方法提供了合成的便捷、灵活和模块性,以改变SNP尺寸和表面化学。基于此种超分子方法,得到许多30-450nm范围的可控尺寸SNP。进行进一步研究以揭示这些SNP的独特性质,包括:(i)其在不同温度和pH值条件下以及生理离子强度介质中的稳定性,(ii)Ad分子存在时的竞争性解聚,和(iii)通过原位改变分子构建块混合比例获得的可逆尺寸控制性。最后,用microPET/CT成像方法进行小鼠内64Cu标记的30和100nm SNP的全身生物分布和淋巴结排泄研究。结果显示,SNP的尺寸为关键因素,会影响各SNP的体内特性。
据其1H NMR谱显示,在聚合物构建块CD-PEI中,有约7至8个CD构建区域或识别单元接枝在分枝状PEI骨架上。CD修饰可增PEI化合物的生物相容性并降低其毒性(Davis等,Nat.Rev.Drug Discov.,vol.3,1023页,2004)。这些实验中,平行测试了两个不同的树枝状构建块,即带有8个取代Ad基序的8-Ad-PAMAM和带有4个Ad基序(据基1H NMR谱显示的平均数)的4*-Ad-PAMAM(据MS分析,4*-Ad-PAMAM由6种不同的Ad取代PAMAM组成,包括2-Ad-PAMAM、3-Ad-PAMAM、4-Ad-PAMAM、5-Ad-PAMAM、6-Ad-PAMAM和7-Ad-PAMAM)。为检验Ad-PAMAM与CD-PEI的混合比例如何影响所得SNP的尺寸,利用动态光散射(DLS,N4 plus,USA)测量来分析新鲜制备的SNP。为确保足量的加帽/溶解基团供应,向各混合物中加入过量的Ad-PEG。不存在Ad-PEG时,n-Ad-PAMAM与CD-PEI的直接混合导致了聚集和沉淀。最先测试八取代树枝状聚合物8-Ad-PAMAM。这种情况下,向含有Ad-PEG(840μM)和不同量(84至672μM)8-Ad-PAMAM的混合物中缓慢加入CD-PEI(168μM)的PBS缓冲液。如图3A所示,获得了30-450nm范围内不同尺寸的水溶性SNP集合。同时,通过在PBS缓冲液(Zetasizer Nano,MalvernInstruments Ltd)中测量ζ电位(ξ)来确定SNP(30-450nm范围内)的表面电荷密度,表明SNP带有范围为16.8±1.2~28.5±1.1mV的ζ电位(图2)。为测试树枝状聚合物芯核中Ad取代基团的数目如何影响相应SNP的尺寸,还检验了四取代树枝状聚合物4*-Ad-PAMAM。在类似于自组装的条件下获得了相对小的SNP(30-120nm)。
实施例2——通过超分子纳米颗粒(SNP)进行基因递送
概述
试剂和溶剂购自Sigma-Aldrich(St。Louis,MO),除非另有说明,以收货状态未经进一步纯化直接使用。分枝状聚乙烯亚胺(PEI,MW=10kD)购于Polysciences Inc(Washington,PA)。聚合物包含伯胺、仲胺和叔胺基团,其比例约为25/50/25。溶于20%wt甲醇溶液的带有1,4-二氨基丁烷芯核和胺末端的第一代聚酰胺树枝状聚合物(PAMAM)购于Dendritic Nanotechnologies,Inc(Mount pleasant,MI)。1-金刚烷胺盐酸盐和β-环糊精(β-CD)购于TCI America(San Francisco,CA)。N-羟基琥珀酰亚胺(SCM)与马来酰亚胺(MAL)杂合功能化聚乙二醇(SCM-PEG-MAL,MW=5kD)来自于NANOCS Inc(New York,NY)。样品制备所用磷酸盐缓冲液(PBS,1×,pH 7.2±0.05)、电泳试验所用UltraPureTM 10×TBE缓冲液(包括1M Tris、0.9M硼酸和0.01M EDTA)和DNA稀释所用1×TE缓冲液(包括含有1mM EDTA的10mMTris-HCl)购于Invitrogen(Carlsbad,CA)。6-单甲苯磺酰-β-环糊精(6-OT-β-CD)依据文献报道的方法(Petter等,J.Am.Chem.Soc.,vol.112,3860-3868,1990)制备。八Ad接枝的聚酰胺树枝状聚合物(Ad-PAMAM)、CD接枝的分枝状聚乙烯亚胺(CD-PEI)和Ad接枝的聚乙二醇(Ad-PEG)如上述方法制备。干CH2Cl2通过在CaH2中回流并在使用前新鲜蒸馏获得。MCF7乳腺癌细胞系、U87脑癌细胞系和NIH3T3小鼠成纤维细胞系购于美国典型培养物保藏中心。Dulbecco′sModified Eagle Medium(DMEM)培养基、Earl′s Modified Eagle′sMedium(EMEM)生长培养基、Opti-MEM减血清培养基和青霉素/链霉素购于Invitrogen(Carlsbad,CA)。胎牛血清(FBS)和编码EGFP的质粒DNA(pMAX EGFP,3.4kb)购于Lonza Walkerrsville Inc(Walkerrsville,MD)。4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)购于Invitrogen(Carlsbad,CA)。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-半胱氨酸(RGDC)肽购于GenScript Corp.(Piscataway,NJ)。
用Bruker Avance 400光谱仪记录在氘化溶剂中的1H NMR光谱。使用Applied Biosystems Voyager DE-STR MALDI-TOF质谱仪(Framingham,MA)获取质谱数据。SNP-DNA和RGD-SNP-DNA的动态光散射和ζ电位在Zetasizer纳米仪(Malvern Instruments Ltd.,UK)上测量。透射电镜(TEM)图像在以120kV加速电压操作的Philips CM120电子显微镜上测量。在分光荧光计(FluoroMax-3,Spex)上进行溴化乙锭(EtBr)排除试验。细胞成像和基因转染研究在带有CCD摄像头、X-Cite 120汞灯、自动台和三种荧光通道滤镜(W1(DAPI)、W2(EGFP和AO)和W3(PI))的Nikon TE2000S倒置荧光显微镜(Photomatrix,Cascade II)上进行。
电泳分析
阳离子Ad-PAMAM/CD-PEI水凝胶对负电DNA的DNA装载容量通过1×TBE中1.0%琼脂糖凝胶电泳分析来确定。实验在80V下进行90分钟。约50ng/μL DNA与不同量的阳离子Ad-PAMAM/CD-PEI水凝胶混合以到达期望的N/P比例。所得溶液在进行实验前孵育1小时。通过在室温下用溴化乙锭(0.5μg/mL)染色凝胶使DNA在UV光照下显色(图12)。
溴化乙锭排除测试
通过溴化乙锭(EtBr)排除测试进一步确定阳离子Ad-PAMAM/CD-PEI水凝胶对负电荷DNA的DNA装载容量。含有EtBr(400ng/mL)和DNA(20μg/mL)的PBS溶液(pH 7.2)在室温下孵育10分钟,形成稳定复合物(DNA-EtBr)。加入不同量的阳离子Ad-PAMAM/CD-PEI水凝胶以及其他对照(CD-PEI和CD-PEI/Ad-PEG混合物)后,用分光荧光计(FluoroMax-3,Spex)测量DNA-EtBr的荧光强度变化。激发和发射波长分别为510和590nm。狭缝宽度为5nm。在阳离子Ad-PAMAM/CD-PEI水凝胶存在时观察到最显著的DNA-EtBr荧光淬灭。此结果表明,相比于CD-PEI或CD-PEI/Ad-PEG混合物,阳离子Ad-PAMAM/CD-PEI水凝胶能够更有效地浓缩负电荷质粒DNA(图13)。
包裹有DNA的SNP-DNA和RGD-SNP-DNA的制备
RGD-PEG-Ad的合成
向1mL 1-金刚烷胺盐酸盐(0.94mg,5μmol,5.0当量)的CH2Cl2溶液中依次加入三乙胺(0.6mg,5μmol,5.0当量)和SCM-PEG-MAL(5mg,1.0μmol,1.0当量)。反应混合物在室温下搅拌2小时。反应完成后,真空除去溶剂,并向反应残留物中加入含RGDC(2.25mg,5.0μmol,5.0当量)的PBS缓冲溶液(1mL)。混合物在室温下再搅拌2小时,随后经过滤除去不溶的1-金刚烷胺。溶液随后用Slide-A-Lyzer透析盒(MWCO,2kD)在去离子(DI)水中透析过夜,冻干后以63%产率产生白色粉末状RGD-PEG-Ad(3.4mg,0.63μmol)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.83-9.12(br,RGD上的质子),3.42-3.54(br,PEG上的质子),1.13-1.18(br,Ad上的质子)。MS(MALDI-TOF,正离子模式,DHB):SCM-PEG-MAL中观察到的Mn值为5373.49,SCM-PEG-MAL的RGD-PEG-Ad的Mn计算值为5859.78(M+H)+;实测值:5859.33。
100-0 SNP-DNA、100-1%RGD-SNP-DNA、100-5%RGD-SNP-DNA和
100-10%RGD-SNP-DNA的制备
通过Hamilton注射器在强烈搅拌下向750μL CD-PEI(15μg,0.84nmol)的PBS溶液(pH=7.2)中缓慢加入750μL PBS溶液中的Ad-PAMAM(1.2μg,0.42nmol)、Ad-PEG(21.0μg,4.2nmol)和DNA(7.5μg,3.4pmol)。混合物在室温下孵育20分钟后得到100-0 SNP-DNA。所得溶液分成四份,其中三份分别加入含有246ng(0.042nmol)、1230ng(0.21nmol)和2460ng(0.42nmol)RGD-PEG-Ad的PBS溶液(10μL)进行原位配体交换。三种混合物在室温下再孵育20分钟以分别得到100-1%RGD-SNP-DNA、100-5%RGD-SNP-DNA和100-10%RGD-SNP-DNA。
300-0 SNP-DNA、300-1%RGD-SNP-DNA、300-5%RGD-SNP-DNA和
300-10%RGD-SNP-DNA的制备
以相似的方式,将CD-PEI(15μg,0.84nmol)、Ad-PAMAM(2.4μg,0.84nmol)、Ad-PEG(21.0μg,4.2nmol)、DNA(7.5μg,3.4pmol)混合以制备300-0 SNP-DNA。随后用246ng(0.042nmol)、1230ng(0.21nmol)和2460ng(0.42nmol)RGD-PEG-Ad分别得到300-1%RGD-SNP-DNA、300-5%RGD-SNP-DNA和300-10%RGD-SNP-DNA。
动态光散射(DLS)
用装备有10mW氦氖激光器(λ=632.8nm)和热电温度控制器的Zetasizer纳米仪(Malvern Instruments Ltd.,UK)进行DLS实验。在90°散射角时进行测量。组装的SNP-DNA和RGD-SNP-DNA的尺寸和标准差通过至少三次测量的平均值来计算(图14)。
透射电子显微镜(TEM)
SNP-DNA和RGD-SNP-DNA的形态和尺寸可通过透射电子显微镜法直接观察。研究在Philips CM 120电子显微镜上进行,以120kV加速电压操作。TEM样品通过将2μL SNP-DNA或RGD-SNP-DNA溶液滴落包被在碳包覆铜网上来制备。液滴接触到铜网45秒后,以滤纸除去过量的液滴。随后,在进行TEM研究前,将表面沉积的SNP用2%乙酸双氧铀进行负染45秒(图15)。TEM观察到的SNP-DNA尺寸为62±8nm(100-0SNP-DNA)和210±24nm的(300-0 SNP-DNA)。TEM得到的尺寸变小可归因于TEM样品制备过程中SNP-DNA的脱水(Ito,T.;Sun,L.;Bevan,M.A.;Crooks,R.M.Langmuir,2004,20,6940-6945)。
ζ电位测量
用Zetasizer纳米仪(Malvern Instruments,Malvern,Worcestershire,UK)通过光子相关光谱学来确定SNP-DNA和RGD-SNP-DNA的ζ电位。测量在25℃下以90°检测角进行测量,随后用Zetasizer软件包的累积分析将原始数据与Z平均尺寸相互关联(图16)。
细胞培养
用含10%胎牛血清(FBS)和1%青霉素/链霉素(Invitrogen,Carlsbad,CA)的DMEM对3T3和U87细胞系进行常规培养。MCF7用含10%胎牛血清(FBS)和1%青霉素/链霉素的EMEM培养。
α
v
β
3
高表达的3T3细胞
常规培养的3T3细胞传代后通过刮板收集得到αvβ3高表达的3T3细胞。通过刮板将细胞分离,导致细胞表面高密度的αvβ3整联蛋白。这些细胞被称为αvβ3高表达3T3细胞。
α
v
β
3
低表达3T3细胞
常规培养的3T3细胞传代后用0.25%胰蛋白酶处理。胰蛋白酶是一种降解蛋白的酶类,可用于裂解细胞表面的整联蛋白(Rawlings等,Meth。Enzymol.,vol。244,pp。19-61,1994)。用0.25%胰蛋白酶使细胞分离(g等,MoI.Ther.,vol.17,8282-836页,2009),导致细胞表面低密度的αvβ3整联蛋白。这些细胞被称为αvβ3低表达3T3细胞。
转染过程
细胞(1×104个细胞/孔)铺板于8孔培养室平板,使其贴壁过夜。编码EGFP的DNA以1×TE缓冲液稀释。用于基因转染研究的100和300nm的SNP-DNA单独制备。各SNP-DNA或RGD-SNP-DNA(20μL)以200μL Opti-MEM培养基稀释,随后转移到各个孔内。就对照组而言,用PBS缓冲液(20μL)制备裸DNA(2.2nM)、带有DNA(2.2nM)的CD-PEI(600nM)复合物和带有DNA(2.2nM)的CD-PEI(600nM)/Ad-PEG(3μM)复合物。各对照样品用200μL Opti-MEM培养基稀释并转移至8孔培养室(Lab-Tek,Electron Microscopy Sciences,PA)平板各孔中。RGD-jet-PEI被用作标准转染试剂,根据产品说明书进行操作。SNP-DNA和RGD-SNP-DNA和对照一起与细胞共孵育4小时,然后通过抽吸除去,并更换为400μL/孔的新鲜常规DMEM/EMEM培养基。细胞可在37℃和5%CO2气氛中生长24小时,然后固定(4%多聚甲醛在室温下固定15分钟),用PBS清洗三次,以DAPI染色,最后PBS清洗后用荧光显微镜进行EGFP表达分析。
显微镜设置、成像过程和数据分析
将8孔培养室平板置于带有CCD摄像头(Photomatrix,Cascade II)、X-Cite 120汞灯、自动台和三种荧光通道滤镜(W1(DAPI)、W2(EGFP和AO)和W3(PI))的Nikon TE2000S倒置荧光显微镜上。图像采集后,用MetaMorph(Molecular Devices,Version 7.5.6.0)对表达EGFP的细胞进行定量。MetaMorph软件的多波长细胞评分模块可进行图像分析。该模块的细胞核计数程序允许我们计算总细胞数。为确定基因转染效率,通过可分辨转染细胞与非转染细胞的MetaMorph程序对EGFP表达细胞进行计数。常规培养细胞与背景之间200-300左右的荧光强度差异被测定为基线。细胞与背景之间高于300的细胞荧光强度差异被识别为转染细胞。将EGFP表达细胞数除以总细胞数得到基因转染效率。
细胞生存力测定
为确定转染后死细胞和活细胞的数量,使用两种荧光染料。碘化丙锭(PI)是一种不能通过完整细胞膜但易于通过受损细胞膜并与DNA结合的荧光染料。PI的荧光在UV光照射下呈亮红色。细胞中存在PI表明细胞膜的完整性已破坏,细胞严重受损。红色荧光的细胞被判定为死细胞。吖啶橙(AO)是一种易于通过所有细胞膜并染色细胞质和细胞核的荧光染料,在UV光照射下呈亮绿色。绿色荧光的细胞被判定为活细胞。所有染料均根据产品说明使用。首先,向15mL管内8mL PBS溶液中加入1mL 10×AO溶液和1mL 10×PI溶液,制备AO/PI工作液。然后,取约0.5mL AO/PI工作液加入各孔。使用荧光显微镜,采集图像并估算被SNP-DNA和RGD-SNP-DNA转染的细胞和常规培养基中培养的细胞的生存力。两者生存力无显著差异,表明SNP-DNA和RGD-SNP-DNA在体外转染研究中的毒性可忽略不计(图17)。
讨论
这里,超分子装配方法被用于制备具有可控尺寸和靶向配体(即精氨本-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽)可调表面覆盖率的包裹有DNA的SNP小文库(SNP-DNA和RGD-SNP-DNA,图18)。两步制备过程为首先由Ad-PAMAM、CD-PEI、Ad-PEG和DNA产生100和300nm的SNP-DNA,然后通过RGD配体原位交换SNP-DNA以产生六种带有1、5和10mol%(基于Ad-PEG)配体覆盖率的不同RGD-SNP-DNA。在这一概念验证研究(proof-of-concept study)中,编码由CMV启动子驱动的增强绿色荧光蛋白(EGFP)的质粒DNA被用作报告系统,并采用RGD配体(Liu等,Nat.Nanotech.,vol.2,47-52页,2007)识别某些类型肿瘤细胞膜上的αvβ3整联蛋白受体。通过动态光散射(DLS)、透射电镜(TEM)和ζ电位测量分别对所得SNP-DNA和RGD-SNP-DNA的尺寸、形态和表面电荷进行表征。最后,用αvβ3高表达和低表达细胞与对照递送系统一起检验小文库中各SNP-DNA和RGD-SNP-DNA的基因转染效率和特异性。
DNA装载
测定了用于SNP-DNA和RGD-SNP-DNA制备的DNA装载容量。与基于阳离子聚合物的基因递送系统(Srinivasachari等,Biomaterials,vol.30,928-938页,2009;Li等,Adv.Mater.,vol.18,2969-2970页,2006)相似,SNP的DNA装载容量取决于内部Ad-PAMAM/CD-PEI水凝胶网络中嵌入的阳离子净电荷数。电泳分析(Zugates等,J.Am.Chem.Soc,vol.128,12726-12734页,2006)和溴化乙锭排除测定(Meyer等,J.Am.Chem.Soc,vol.130,3272-3273页,2008)被用于测定Ad-PAMAM/CD-PEI水凝胶的DNA装载容量(图12和13),导致N/P比例分别为2.6和5.0。选择5.0的N/P比例以确保完整的DNA包裹。接下来,向含有Ad-PAMAM(100nm SNP-DNA为300nM,300nmSNP-DNA为600nM)、Ad-PEG(3μM)和DNA(2.2nM)的PBS溶液中缓慢加入CD-PEI(600nM)的PBS溶液(pH=7.2),然后在室温下孵育20分钟,从而分别制备100和300nm直径的SNPs-DNA。DLS测定结果表明100和300nm SNP-DNA的流体动力学尺寸分别为106±14和312±47nm。
细胞靶向——制备
随后,各个尺寸的SNP-DNA样品被分成四份,其中三份分别加入含有30、150或300nM RGD-PEG-Ad进行原位配体交换。由此获得许多带有不同RGD覆盖率(当RGD靶标配体的混合比例为1、5和10%时,100nm RGD-SNP-DNA上实际RGD配体覆盖率分别为0.8±0.2%、2.9±0.5%和6.7±0.8%。对300nm RGD-SNPs-DNA而言,实际RGD配体覆盖率分别为0.9±0.2%、2.2±0.4%和6.7±0.6%)的RGD-SNP-DNA,即100-1%、100-5%、100-10%、300-1%、300-5%和300-10%。原位配体交换后,RGD-SNP-DNA的流体动力学显示出的变化可忽略(<5%,图14)。用TEM检验SNP-DNA和RGD-SNP-DNA的形态。TEM图像(图15)显示,SNP-DNA和RGD-SNP-DNA具有较小尺寸(100nmSNP-DNA为62±8nm,300nm SNP-DNA为210±24nm)、球状外形和窄的尺寸分布。ζ电位测量表明100和300nm SNP-DNA的表面电荷密度分别为3.7±0.4和6.8±0.5mV。配体交换后,观察到RGD-SNP-DNAζ电位的少量提高(3-11%)(图16)。
转染
对一系列SNP-DNA和RGD-SNP-DNA以及对照(即DNA以及CD-PEI、CD-PEI/Ad-PEG和RGD-jet-PEI的DNA复合物),在含两种αvβ3高表达细胞(即U87和刮板收集的3T3细胞)(Ng等,MoI.Ther.,vol.17,pp.828-836,2009)和αvβ3低表达细胞(即MCF7和0.25%胰蛋白酶处理的3T3细胞)(Xie等,J.Am.Chem.Soc,vol.130,pp.7542-7543,2008)的8孔培养室平板上进行了体外EGFP转染研究。
为比较起见,在转染研究中将等量的编码EGFP的质粒DNA(100ng)加入单个细胞培养室内。所得48个独立EGFP转染实验在37℃(5%CO2)下孵育24小时。在多聚甲醛固定和DAPI细胞核染色后,用荧光显微镜对单个细胞中的EGFP表达水平进行定量。随后将用这些表达水平确定每种载体的转染效率。转染研究重复三次,基因递送载体对不同细胞系的平均转染效率结果概述于图19。首先,基于各分子构建块(CD-PEI和CD-PEI/Ad-PEG)的DNA复合物具有与游离质粒DNA相似的非常差的转染性能,表明超分子纳米颗粒的形成是实现增强的转染效率的关键。其次,100nm RGD-SNP-DNA明显表现出比300nm类似物更高的转染效率。该发现与所报道的基于聚合物的基因递送系统(Davis等,Nat.Rev.Drug Discov.,vol.7,771-782页,2008;Yu等,Curr.Opinion MoI.Ther.,vol.11,165-178页,2009;Fukushima等,J.Am.Chem.Soc,vol.127,2810-2811页,2005)结果一致,其中10-100nm范围的载体表现出更好的基因转染效率(Wang等,Angew.Chem.Int.Ed,vol.48,4344-4348页,2009)。第三,与在SNP-DNA和其他靶标RGD-SNP-DNA中观察到的结果相比,100-5%RGD-SNP-DNA表现出最高的转染效率。100-10%RGD-SNP-DNA中观察到的转染效率降低可归因于培养基中过量的游离RGD配体,其由于竞争效应而影响了RGD-SNP-DNA的靶向性结合(Bazin等,Chem.Commun.,5004-5006页,2008)。总之,100-5%RGD-SNP-DNA表现出最高的转染效率(对αvβ3高表达的3T3和U87分别为57±11%和31±8%)。这些结果与市售RGD-jet-PEI中观察到的结果(对αvβ3高表达3T3和U87分别为64±15%和38±9%)相当,RGD-jet-PEI为公知的用于整联蛋白表达细胞系的选择性且高效的转染试剂(Erbacher等,Gene Ther,vol.6,138-145页,1999)。第四,除了高的转染效率外,100-5%RGD-SNP-DNA还表现出对αvβ3高表达细胞U87(31±8%)和3T3(57±11%)出众的递送特异性,超过αvβ3低表达细胞MCF7(21±6%)和胰蛋白酶处理3T3(15±4%)。在αvβ3高表达细胞和αvβ3低表达细胞中观察到100-5%RGD-SNP-DNA的转染效率方面4倍的差异,而在RGD-jet-PEI中仅观察到1.2倍的差异。相比于RGD-jet-PEI的非靶标特异性转染性能,100-5%RGD-SNP-DNA对U87细胞系具有比对MCF7细胞系更高的转染效率,表明RGD-SNP-DNA对αvβ3高表达细胞系具有良好的转染特异性。此外,用细胞生存力测定检验了SNP-DNA和RGD-SNP-DNA的毒性。将SNP-DNA和RGD-SNP-DNA转染的细胞与常规培养基中培养的细胞相比。未观察到细胞生存力的显著差异(97±2%),表明SNP-DNA和RGD-SNP-DNA在体外转染研究中的毒性可忽略不计(图17)。
总之,阐明了一种用于制备具有不同尺寸和RGD配体覆盖率的SNP-DNA和RGD-SNP-DNA小文库的便捷、灵活且模块化的合成方法。进行了SNP-DNA和RGD-SNP-DNA文库对αvβ3高表达细胞和αvβ3低表达细胞的基因转染研究。结果表明RGD-SNP-DNA的尺寸和靶标配体密度是靶标特异性基因递送的关键。
实施例3——组合方法优化转染
阐述了一种利用(i)基于超分子组装的组合合成方法(图20)和(ii)自动化微反应器的通往高效基因递送剂的快速开发途径(图20)。不同于产生现有多样性有限的基因递送材料所采用的缓慢和多步合成方法,超分子方法(图20)使得一种便捷、灵活且模块化的产生DNA-SNP组合文库(1)的方法成为可能,其中覆盖尺寸变化、均一性、表面化学和DNA装载容量的广泛的结构/功能多样性通过系统地改变5种功能性分子构建块(2-6)和DNA质粒(7)的混合比而被设计在单个DNA-SNP(1)中。为测试该方法的普遍适用性,采用编码由CMV驱动的增强绿色荧光蛋白(EGFP,7a)或萤火虫荧光素酶(FLuc,7b)的DNA质粒来监测DNA-SNP(1)的基因转染效率。为避免人为操作误差、加速处理程序、增强实验可靠性并实现试剂的节约使用,使用数字双核微反应器实现2-7的自动取样、稀释、计量和混合,结果在2.5小时内得到包含多至648种不同DNA-SNP(1)的文库。通过在含3T3小鼠成纤维细胞的96孔板(8,000细胞每孔)中进行单个DNA-SNP(1)的转染研究来定量/描述这些DNA-SNP(1)的递送性能。结果鉴定出一小组促进高水平基因表达的DNA-SNP(1)。对这些高效DNA-SNP基因递送剂进行了综合表征,揭示其更高的转染性能可归因于其独特的表面化学、ζ电位、确定的尺寸、均一性和DNA释放机制。与领先的基因转染剂相比,鉴定得到的高效TAT/RGD-DNA-SNP(1)在许多细胞系和原代细胞中表现出显著提高的基因转染效率和低毒性。
制备
制备并全面表征具有指定功能的5种分子构建块(图20)——CD-PEI(2)、Ad-PAMAM(3)、Ad-PEG(4)、RGD-PEG-Ad(5)和TAT-PEG-Ad(6)。如前所述,互补的CD-PEI(2)和Ad-PAMAM(3)负责构建可包裹负电荷DNA(1)形成DNA-SNP(1)芯核的阳离子CD-PEI/Ad-PAMAM水凝胶网络。可以理解,DNA-SNP(1)的DNA装载容量取决于水凝胶网络中嵌入的阳离子净电荷数,通过测量DNA-SNP(1)的氮/磷比例来确定。在该系统中,Ad-PEG(4)作为加帽/溶解剂,其不仅限制包裹DNA的水凝胶网络的持续增长,还赋予所得DNA-SNP(1)以期望的水溶性、结构稳定性和钝化性能。此类超分子装配还允许便捷地并入功能性配体,即Ad-PEG-RGD(5)和Ad-PEG-TAT(6),分别使得所得TAT/RGD-DNA-SNPs(1)的递送特异性(识别带有αvβ3整联蛋白受体的某些细胞群体)和细胞的输入能力(通过膜摄取使之内化)成为可能。通过系统地改变5种分子构建块(2-6)和DNA(7)之间的混合比例,可在所得组合性文库中将涵盖尺寸、均一性、表面化学和DNA装载容量的结构/功能多样性设计在单个TAT/RGD-DNA-SNP(1)中。与脂类基因递送材料(其中所得组合文库的多样性归因于数以百计的分子前体的二元组合)相比,具有相当多样性水平的TAT/RGD-DNA-SNP(1)文库通过仅5种分子构建块和DNA装载物的比率组合来实现。
TAT/RGD-DNA-SNPs(1)可通过吸取和混合各个分子构建块和DNA装载物进行手动制备,而潜在操作误差、有限的处理速度和显著量的样品消耗可能影响研究的通量、保真度和效率。为克服这些挑战,使用数字DCM进行系统地将结构/功能多样性设计到TAT/RGD-DNA-SNP(1)文库中。
通过使用数字DCM,可通过调节CD-PEI(2)、RGD-PEG-Ad(5)和TAT-PEG-Ad(6)与固定量的Ad-PAMAM(3)、Ad-PEG(4)和质粒DNA(7a或b)之间的比例来实现DNA-SNP(1)的系统性制备。所得DNA-SNP(1)文库在室温下96孔板中孵育20分钟,然后转移至每孔含有200μL DEME培养基培养的8000NIH 3T3细胞的96孔板中以平行进行大规模转染研究。细胞在37℃(5%CO2)下培养24小时后通过读板器或Xenogene成像系统估算基因转染效率。
在概念验证试验中,CMV驱动的编码EGFP的质粒DNA在DNA-SNP(1)中被包装。为准备用三个变量(即CD-PEI(2)、RGD-PEG-Ad(5)和TAT-PEG-Ad(6)的混合比例)进行的全面筛选,首先进行两对变量(即CD-PEI(2)和RGD-PEG-Ad(5)以及CD-PEI(2)和TAT-PEG-Ad(6))的简化研究,以分别寻找RGD-DNA-SNP和TAT-DNA-SNP的最佳转化性能。将转染结果(每种情况中96个数据点)拟合进两个三维(3D)剖面图(图21A和21B)中,其中在(i)CD-PEI(2)浓度范围为0.36-0.48μM,和(ii)RGD-PEG-Ad(5)或TAT-PEG-Ad(6)浓度范围分别为72-144nM或90-180nM两处鉴定出DNA-SNP转染3T3细胞的最高的EGFP表达水平。通过系统地设计三组变量(即CD-PEI(2)×8个浓度、RGD-PEG-Ad(5)×9个浓度和TAT-PEG-Ad(6)×9个浓度)来完成全面筛选,得到包括648种不同RGD/TAT-DNA-SNP的组合文库(1a)。产生648种不同的RGD/TAT-DNA-SNP(1a),填充于七个96孔板(8,000个NIH 3T3细胞/孔)。采用4D基因表达图来总括组合文库的全面筛选,揭示了在(i)CD-PEI(1)浓度范围为0.36-0.48μM,和(ii)RGD-PEG-Ad(5)浓度范围为72-144nM和TAT-PEG-Ad(5)浓度范围为90-180nM处具有RGD/TAT-DNA-SNP(1)的最佳转染性能。为验证该开发途径的适用性,进行相对小规模筛选以鉴定表现出递送CMV驱动编码FLuc质粒DNA最佳转染性能的RGD/TAT-DNA-SNP(1b)。在这种情况下,对三组变量(5×5×5个浓度)进行操作,得到含有125种不同RGD/TAT-DNA-SNP的组合文库(1b)。对RGD/TAT-DNA-SNP(1b)递送FLuc-DNA质粒的转染性能,观察到非常一致的结果(图21D)。所有四组筛选研究表明了生产DNA-SNP(1)的非常相似的最佳合成变量。
为理解最佳合成变量如何影响RGD/TAT-DNA-SNP(1)的结构特性以及转染性能,选择在不同浓度下产生的代表性RGD/TAT-DNA-SNP(7a)的CD-PEI(1)混合比例,在数字DCM中用相应的合成参数([CD-PEI(I)]=0.30,0.40或0.5μM,[RGD-PEG-Ad(4)]=5%和[TAT-PEG-Ad(5)]=9%)制备相对大量(80μL)的RGD/TAT-DNA-SNP(7)。数字DCM的连续操作产生足量的DNA-SNP(7)以用于随后的表征。采用透射电子显微术(TEM,图22A)和扫描电子显微术(SEM,图22B)检验所得DNA-SNP(7)的形态和尺寸。得到具有42±4、86±9和160±13nm独特尺寸的DNA-SNP(7),分别与0.30、0.40和0.5μMCD-PEI(1)浓度相对应。该结果表明,更高的CD-PEI(1)混合比例导致增强的CD-PEI(I)/Ad-PAMAM(3)水凝胶网络交联程度,产生更大的DNA-SNP(7)。这些芯片上DNA-SNP(7)的尺寸分布比手动制备的那些范围更窄。动态光散射(Zetasizer Nano,Malvern Instruments Ltd)测量值与该观察结果相符(图22C)。改进的尺寸分布可归因于微环境下取样、计量和混合过程的精确性和可重复性。这些情况下,40和80nmDNA-SNP(7)表现出最佳的转染性能。因此选择它们用于进一步鉴定,包括表面电荷、稳定性、内化机制和pH依赖性释放机制。
通过在PBS缓冲溶液(Zetasizer Nano,Malvern Instruments Ltd)中的ζ电位测量值确定SNP的表面电荷密度,结果表明SNP带有的ζ电位范围为(16.8)-(28.5)mV(图22D)。超分子方法的应用赋予自组装的SNP以动态特性。为理解SNP的动态稳定性,用实时DLS测量监测不同pH值、温度、血清和生理离子强度培养基条件下30和80nm SNP的尺寸变化。首先,不同pH值(pH 3.8-8.3)(图23A)、血清条件(图23C)和生理离子强度下观察到的SNP尺寸变化可忽略不计。其次,温度变化的DLS测量表明,SNP在广泛温度范围(室温至60℃,图23B)内稳定。这些SNP的稳定性可归因于多价CD/Ad识别以及负电荷DNA与阳离子CD-PEI和Ad-PAMAM之间的静电相互作用,其将各个分子构建块保持在各SNP中。进行两组实验以检验这些SNP的pH依赖性动态特性,进一步验证该超分子方法的分子机制(图24B-C)。
观察到的CD-PEI(1)浓度(0.36-0.48μM)对应于4-5的N/P比例。该数字与电泳分析和溴化乙锭排除测定确定的CD-PEI(1)/Ad-PAMAM(3)水凝胶网络的最大DNA装载容量一致。
实施例4——含有超分子纳米颗粒的金纳米微粒(Au-SNP)
超分子方法(方案1)被用于从三种构建块(即(i)Ad接枝的2-nmAu胶体、(ii)CD-PEI和(iii)Ad-PEG)制备尺寸可控的Au-SNP,以用作新型光热剂。采用透射电子显微镜(TEM)和ζ电位测量分别表征所得Au-SNP的尺寸/形态和表面电荷密度。进行进一步的研究以揭示Au-SNP的独特物理性质,包括:(i)在不同温度和pH值条件下的稳定性,(ii)尺寸依赖性光物理特性和(iii)热诱导的解聚。此外,进行了基于118-nm Au-SNP的激光诱发产生微泡实验,以阐明其与2-nm Au胶体相比显著增强的光热效应。以精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽为靶向配体,以αvβ3-阳性/阴性细胞为相应生物学系统,通过选择性损伤αvβ3-阳性细胞但不损伤邻近的αvβ3-阴性细胞证明了由Au-SNP原位动态配体交换产生的RGD-Au-SNP的特异性和选择性。
构建块的制备
制备并表征三种构建块Ad接枝的2-nm Au胶体(图27A)、CD-PEI和Ad-PEG。尺寸可控的Au-SNP(图27B)单独制备,通过向含不同量CD-PEI(0.0725-5.73mg/ml)和Ad-PEG(4.2mg/mL)的PBS溶液中缓慢加入含Ad接枝的2-nm Au胶体(0.0213mg/mL)的磷酸盐缓冲液(PBS,pH=7.2),随后在室温下孵育过夜。通过简单地调谐Ad接枝的2-nm Au胶体与CD-PEI之间的比例,得到一系列40-118nm不同尺寸的Au-SNP(图27C)。最初提出的SNP形成机制可解释Au-SNP中观察到的尺寸可控性。简言之,三种构建块之间的混合比例改变了Au胶体/CD-PEI水凝胶网络的增长/聚集与水凝胶网络加帽/溶解之间的平衡,产生尺寸可控的Au-SNP。
概述
试剂和溶剂购于Sigma-Aldrich(St。Louis,MO),除非另有说明,以收货状态未经进一步纯化直接使用。1-金刚烷胺盐酸盐和β-环糊精(β-CD)购于TCI America(San Francisco,CA)。N-羟基琥珀酰亚胺(SCM)与马来酰亚胺(MAL)杂合功能化聚乙二醇(SCM-PEG-MAL,MW=5kD)来自于NANOCS Inc(New York,NY)。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-半胱氨酸(RGDC)肽购于GenScript Corp.(Piscataway,NJ)。CD接枝的分枝状聚乙烯亚胺(CD-PEI)和Ad接枝的聚乙二醇(Ad-PEG)如上述方法制备。2nm Au胶体的合成基于Brust-Schiffrin两相法(Brust等,J.Chem.Soc.Chem.Comm.,801页,1994)。磷酸盐缓冲液(PBS)、Dulbecco′s Modified Eagle Medium(DMEM)、Earl′s Modified Eagle′sMedium(EMEM)生长培养基、青霉素/链霉素和细胞标记剂Vybrant DiD和DiO细胞标记溶液购于Invitrogen(Carlsbad,CA)。依据产品说明(Invitrogen),PBS(pH 7.2±0.05)中含有磷酸二氢钾(I=1.5mM)、氯化钠(I=155mM)和磷酸氢二钠(I=2.7mM)。U87成胶质细胞瘤细胞系与MCF7乳腺癌细胞系购于美国典型培养物保藏中心。胎牛血清(FBS)购于Lonza Walkerrsville Inc(Walkerrsville,MD)。4孔Lab-TekTM培养室平板购于Thermo Fisher Scientific。
用Bruker Avance 400光谱仪记录在氘化溶剂中的1H NMR光谱。使用Applied Biosystems Voyager DE-STR MALDI-TOF质谱仪(Framingham,MA)获取质谱数据。在Zetasizer纳米仪(MalvernInstruments Ltd.,UK)测量Au-SNP的ζ电位。透射电镜(TEM)图像在以120kV加速电压操作的Philips CM 120电子显微镜上测量。细胞成像在带有CCD摄像头、X-Cite 120汞灯、自动级式和两种荧光通道滤镜(W1(GFP)和W2(Cy5)的Nikon TE2000S倒置荧光显微镜(Photomatrix,Cascade II)上进行。
HS-PEG-RGD的合成
向1mL SCM-PEG-MAL(50.0mg,10.0μmol,1.0当量)的PBS(pH7.2)溶液中加入含有RGDC(22.5mg,50.0μmol,5.0当量)的PBS缓冲溶液(10mL)制成反应混合物。反应混合物在室温下搅拌2小时。反应完成后,向反应残留物中加入2-氨基乙硫醇(3.9mg,50.0μmol,5.0当量)。混合物在室温下再搅拌2小时。然后将溶液在Slide-A-Lyzer透析盒(MWCO,2kD)中用水透析过夜,冻干后以62%产率产生白色粉末状HS-PEG-RGD(31.0mg,5.4μmol)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.03-8.84(br,RGD上的质子),3.42-3.54(br,PEG和氨基乙硫醇上的质子)。MS(MALDI-TOF,正离子模式,DHB):SCM-PEG-MAL中观察到的Mn值为5373.49,基于SCM-PEG-MAL的HS-PEG-RGD的Mn计算值为5785.01(M+H)+;实测值:5785.29。
HS-PEG-Ad的合成
向1mL金刚烷-1-硫醇(8.4mg,50.0μmol,5.0当量)的CH2Cl2溶液中缓慢加入SCM-PEG-MAL(50.0mg,10.0μmol,1.0当量)。反应混合物在室温下搅拌1小时。反应结束后,真空除去溶剂,并向反应残留物中加入含有2-氨基乙硫醇(3.9mg,50.0μmol,5.0当量)的PBS溶液(10mL)。混合物在室温下再搅拌2小时,然后过滤除去不溶的金刚烷-1-硫醇。溶液随后用Slide-A-Lyzer透析盒(MWCO,2kD)在水中透析过夜,冻干后以71%产率产生白色粉末状HS-PEG-Ad(35.5mg,6.5μmol)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.13-8.72(br,RGD上的质子),3.43-3.64(br,PEG上的质子),1.53-1.20(br,Ad上的质子)。MS(MALDI-TOF,正离子模式,DHB):SCM-PEG-MAL中观察到的Mn值为5373.49,基于SCM-PEG-MAL的HS-PEG-Ad的Mn计算值为5503.60(M+H)+;实测值:5503.76。
Ad接枝的2-nm Au胶体的合成
依据Brust-Schiffrin两相法以硫代乙二醇为加帽配体制备2-nm Au胶体(Brust等,J Chem.Soc.Chem.Comm.,p.801,1994)。采用配体交换反应从2-nm Au胶体产生Ad接枝的2-nm Au胶体(Ingram等,J.Am.Chem.Soc,vol.119,9175页,1997;Kim等,J Am.Chem.Soc,vol.131,1360页,2009)。将30mg 2-nm Au胶体与10mg溶于CH2Cl2中的Ad-PEG-HS混合。溶液在室温下搅拌24小时。通过离心蒸发器除去溶剂,然后用乙醚清洗聚集物。最后,得到Ad接枝的2-nm Au胶体。
RGD接枝的2-nm Au胶体的合成
为在2-nm Au胶体上掺入靶标配体RGD-PEG-HS,进行如上所述类似的配体交换反应以获得RGD接枝的2-nm Au胶体。
Au-SNP的合成
向700μLPBS缓冲液中不同浓度(0.145、0.29、0.57、1.43、2.87、5.73mg/ml)的CD-PEI中缓慢加入10μL Ad接枝的2-nm Au胶体(3.2mg/L)。然后向混合物中缓慢加入700μL含Ad-PEG(6.3mg)的PBS缓冲液以获得40-118nm(40±5、59±6、78±5、99±7、118±23nm)不同尺寸的一系列Au-SNP,如图26所示。
原位配体交换以获得RGD-Au-SNP
为合成RGD-Au-SNP,靶向配体即精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽的便捷掺入可简单地通过所得Au-SNP的原位RGD配体交换来实现,以产生具有5mol%配体覆盖率的RGD-Au-SNP。
透射电子显微术
Au-SNP的形态和尺寸可在Philips CM 120电子显微镜(TEM)上检验,以120kV加速电压操作。TEM样品通过将2μL Au-SNP溶液滴落包被在碳包覆铜网上来制备。45秒后以滤纸除去过量的液滴。图26显示了一系列40-118nm(40±5、59±6、78±5、99±7、118±23nm)尺寸范围的Au-SNP。注意它们的尺寸分布是通过对每种尺寸测量超过200个Au-SNP得到的。TEM图像显示Au-SNP呈现球形,具有窄尺寸分布(图27B)。图27B显示了单个Au-SNP的典型高倍放大TEM图像,从中可清楚看到单个2-nm Au胶体。
ζ电位
用Zetasizer纳米仪(Malvern Instruments,Malvern,Worcestershire,UK)通过光子相关光谱学来确定Au-SNP的ζ电位。测量在25℃下以90°检测角进行测量,随后用Zetasizer软件包的累积分析将原始数据与ζ电位相关联。ζ电位为至少3次测量值的平均。通过多价Ad/CD识别相互作用,CD-PEI中的铵基使Au-SNP带有正电荷。随着Au-SNP尺寸的增加,电荷从10.5mV增加至17mV(10.5±0.44、12.5±0.25、16.2±0.74、16.3±0.76、17±0.96mV),如图28所示。
稳定性
由于Au-SNP是通过超分子组装制备的,在不同环境变量(温度和pH)时对Au-SNP的动态稳定性进行表征,以118nm Au-SNP为例。众所周知,动态光散射(DLS)测定的总体聚合物尺寸比TEM测量值大很多,尤其是无机纳米颗粒(Shenhar等,Adv.Mater.,vol.17,657页,2005)。这种情况下,采用TEM测量的Au-SNP尺寸分布来监测7-100℃温度范围(图27D)和3-10 pH值范围(图27E)的PBS中Au-SNP的尺寸变化。结果表明118nm Au-SNP在7-40℃温度范围(图27D)和5-10 pH值范围(图27E)的PBS中稳定,说明Au-SNP可在生理条件下使用。在更高温度(图29C中>50℃)下,通过TEM观察到更宽范围的Au-SNP尺寸分布。当温度上升到100℃时,118nm Au-SNP可完全解聚成2nm Au胶体。118nm Au-SNP的热解聚可归因于Ad/CD超分子相互作用在温度升高时变弱(Rekharsky等,Chem Rev,vol.98,1875页,1998)。
Au-SNP在不同温度下的稳定性
为理解Au-SNP的热稳定性,将40和118nm Au-SNP溶液置于水浴中20分钟。该研究在7-100℃的不同温度范围内进行。然后通过TEM测定Au-SNP的尺寸变化并绘制成图(图29A)。图29B为25℃下测定的118nm Au-SNP的TEM柱状图。该柱状图显示了118nm Au-SNP的尺寸分布。图29C中更高温度(50℃)时,Au-SNP开始解聚成平均尺寸为40nm的碎片。100℃时,118nm Au-SNP完全解聚,仅观察到约2nm的Au胶体(图29D)。结果表明Au-SNP在7-40℃温度范围内表现出良好的热稳定性。
Au-SNP在不同pH值下的稳定性
为理解Au-SNP在生理条件下的特性及其为进一步实验提供合理pH范围的能力,向0.9-10.1范围的不同pH缓冲溶液中加入40和118nmAu-SNP贮存液来进行Au-SNP的pH依赖性稳定性测试。所用不同的pH缓冲溶液如下:100mM HCl-KCl缓冲液(pH 0-2.0)、100mM甘氨酸-HCl缓冲液(pH 2.2-3.6)、100mM CH3COOH-CH3COONa缓冲液(pH3.7-5.6)、100mM Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(pH 5.8-8.0)、100mMTris-HCl缓冲液(pH 7.0-9.0)和100mM Na2CO3-NaHCO3缓冲液(pH9.2-10.8)。通常,将100μL Au-SNP的PBS贮存液(pH=7.2)注射到900μL不同pH的缓冲溶液中。将所得溶液混合并平衡10分钟。用pH计测定最终pH值。然后通过TEM测定不同pH值时Au-SNP溶液的尺寸变化。注意曲线(图27E)中的每个数据点是通过测量超过200个Au-SNP获得的。结果表明Au-SNP在5-10pH范围内稳定。
光热能力
细胞培养
将U87成胶质细胞瘤细胞系(2×105细胞/孔)和MCF7乳腺癌细胞系(2×105细胞/孔)以4孔Lab-TekTM培养室平板分别培养在含在10%胎牛血清(FBS)和1%青霉素/链霉素的DMEM以及含10%胎牛血清(FBS)和1%青霉素/链霉素的EMEM中。细胞培养物维持在37℃,5%CO2的湿润条件。为帮助视觉区分两种不同的细胞类型,U87和MCF7细胞依据建议的试验方案分别用绿色和红色荧光染料(DiO和DiD细胞标记溶液,Invitrogen)标记。接种24小时后,用PBS清洗细胞一次,分别加入颗粒溶液(包括RGD接枝的2-nm Au胶体、118nm Au-SNP和118nmRGD-Au-SNP)。孵育20分钟后,用PBS清洗细胞三次以除去过量的溶液,并在孵育2小时后加入其各自的培养基。就细胞混合实验而言,在类似条件下处理U87细胞和MCF7细胞的1∶1细胞混合物。
脉冲激光照射
方案S8阐述了用于微泡研究的激光系统设置。激光源为以532nm波长和6ns脉冲时长工作的光量开关控制双倍频率的Nd:YAG激光(Continuum,Minilite I)。激光束为线性偏振光,脉冲能量可通过包含半波片和偏振分束器的可变衰减器调节。用能热电光能检测器(Newport,1918-C)测量脉冲能量。将脉冲激光束导入倒置显微镜(Zeiss,AxioObserver)的外荧光端口,并通过物镜(40×,0.6NA)微弱聚焦。最终在样品平面上的激光点直径为1mm。光路中放置一个全息漫射器(Edmund Optics,NT55-848)以减少干扰效应并使激光强度谱平滑。
用时间分辨成像系统进行成像空化微泡
为捕获脉冲激光诱发的存在时间极短的空化微泡(通常寿命<1μs),利用时间分辨成像系统。这包括高速的增强型CCD摄像头(PrincetonInstrument,PI-MAXII),可提供短至500ps的曝光时间。通过摄像机控制单元设置接受激光触发信号与摄像机快门打开之间的可编程延迟。在偏振分束器后,一支激光束被发出穿过荧光染料细胞(Exciton,LDS 698)。被激发的荧光脉冲(波长以约698nm为中心)耦合进入多模光纤(Thorlabs,BFL37-600),然后透过显微镜聚光器照亮样品,同步开启摄像机快门。捕获的气泡影像与激发激光脉冲之间的纳秒级时间延迟可通过控制光纤延迟线长度来完成。
讨论
为测试Au-SNP用作光热剂的可行性,使用118nm Au-SNP作为模型系统。广泛公认癌症治疗所用纳米颗粒的直径应当在10-120nm的大致范围内(Davis等,Nature Rev.Drug Discov.,vol.7,771-782页,2008)。为比较起见,采用2nmAu胶体作为对照。首先,进行UV-Vis光谱学测量以研究118nm Au-SNP和2nm Au胶体的光物理性质(图31A)。考虑到Au-SNP和Au胶体(500-530nm范围内)的特征性表面等离子体共振吸收(Khlebtsov等,Nanotechnology,vol.17,5167页,2006),选择532nm绿色脉冲激光来检验光热效应。其次,进行激光诱发微泡产生的研究以监测各个Au-SNP的局部累积热。检测了532nm脉冲激光在6ns脉冲时长下的广泛能量密度范围(3-265mJ/cm2)。用激光对Au-SNP和Au胶体的PBS悬液(归一化的Au浓度为4.67mg/mL)以不同的能量进行照射。对118nm Au-SNP,其32mJ/cm2的激光阈值足以在激光照射时产生微泡(图31B)。相比之下,2nm Au胶体甚至在最大激光测试能量(265mJ/cm2,图31C)时也未观察到微泡。再一次,118nm Au-SNP中光热效应的显著增强可归因于Au-SNP中的热集合效应(Richardson等,NanoLett,vol.9,1139页,2009)。个体Au-SNP上爆炸性蒸气泡的形成需要提高局部温度以超过液体培养基的临界温度(对水而言为374℃)(Kotaidis等,Appl Phys Lett,vol.87,2005)。微泡一旦形成,局部累积的热量可促进Au-SNP热解聚成小碎片,与图27D中观察到的相似。为监测激光诱发的Au-SNP解聚,采用脉冲激光(脉冲时长为6ns)以1Hz重复率照射Au-SNP。通过时间分辨成像,设置在激光脉冲到达后70ns捕获到微泡的形成。在几次激光脉冲照射后观察到激光诱发微泡的剧烈减少,表明溶液中大部分Au-SNP已热解聚成小碎片,其光热性能变弱(Huang等,Lasers Med Sci,vol.23,217页,2008;Khlebtsov等,Nanotechnology,vol.17,5167页,2006)。随后的光热处理研究中,采用120mJ/cm2的固定激光功率以确定118nm Au-SNP中的微泡形成。
细胞靶向
通过掺入靶向配体,基于Au纳米结构的光热剂可用于某些癌细胞类型的靶向性光热处理(Lapotko等,Laser Surg Med,vol.38,631页,2006;Huang等,Langmuir,vol.24,11860页,2008;Pitsillides等,Biophys J,vol.84,4023页,2003;Wang等,Angew Chem Int Ed Engl,vol.48,2759页,2009)。本研究中,采用动态配体交换(向1.0mL 118nm Au-SNP溶液(4.67mg/mL)中加入0.21mg Ad-PEG-RGD)以产生可识别带有膜αvβ3整联蛋白受体的肿瘤细胞的RGD-Au-SNP(Liu等,Nat Nanotech,vol.2,47页,2007)。118nm RGD-Au-SNP与对照(即RGD接枝的2-nm Au胶体和非靶向性118-nm Au-SNP)一起用于在含有αvβ3阳性U87成胶质细胞瘤细胞和αvβ3阴性MCF7乳腺癌细胞的4孔培养室平板上进行靶向性光热处理。为帮助视觉区分两种不同的细胞类型,U87和MCF7细胞依据建议的实验方案分别用绿色和红色荧光染料(DiO和DiD细胞标记溶液,Invitrogen)标记。与三种试剂孵育20分钟后更换培养基(以除去残余试剂),培养室中的细胞暴露于光束直径为1mm(以光掩膜测定)的脉冲激光(6ns,120mJ/cm2)照射。照射过的细胞在培养室内(5%CO2,37℃)保持2小时,因微孔形成而受损的细胞将从基板上脱落。使用倒置荧光显微镜(Nikon TE2000)检查激光照射区域的细胞。如图32A所示,在RGD-Au-SNP处理的U87细胞中观察到细胞脱落。相比之下,RGD-Au-SNP处理的MCF7细胞(图32B)和两种非靶标Au-SNP处理的细胞中观察到的细胞脱落可忽略不计。这些结果表明:(i)RGD肽赋予RGD-Au-SNP以靶标特异性,使得光热处理αvβ3阳性的U87细胞成为可能,和(ii)非靶向性Au-SNP表现出对癌症细胞无明显效应,因为其表面接枝的PEG链((Harris,Poly(ethylene glycol)Chemistry:Biotechnical and Biomedical Applications,Plenum Press,New York,1992)能够降低与细胞的非特异性结合。此外,在Au胶体处理的U87细胞中观察到的细胞脱落检测不到(图32C),证实了之前2nm Au胶体在给定脉冲照射时观察到的微小光热效应。
通过在含有αvβ3阳性细胞U87和阴性细胞MCF7的细胞混合物中测定αvβ3阳性细胞的靶向性消耗,来检验RGD-Au-SNP对靶标特异性光热处理的选择性。用RGD-Au-SNP(4.67mg/ml)处理U87细胞和MCF7细胞的1∶1细胞混合物(图33A)。除去游离RGD-Au-SNP后,用脉冲激光照射细胞混合物。在激光照射区域,U87细胞被消除,剩余的MCF7细胞能够在基板上继续培养(图33A右侧)。显而易见,激光印迹外侧区域中,阳性和阴性细胞均依然存在。这些结果表明,RGD-Au-SNP的光热处理对靶标细胞具有高选择性。除上文提及的RGD-Au-SNP的特异靶向效应,脉冲激光的使用也在ns间隔的确定位置产生有效的光热效应,允许以空间限制模式定位细胞损伤。不同于连续波长照射,常常观察到大面积的细胞损伤,这是在相对长的光照时间中从靶标细胞到周围培养基的不首先条件下热扩散的结果(O′Neal等,Cancer Lett,vol.209,171页,2004)。
应当注意的是,细胞损伤机制和与爆炸性微泡形成相关的机械性破坏有关,这与提出的基于Au纳米颗粒(Lapotko等,Laser Surg Med,vol.38,631页,2006;Hleb等,Nanomed,vol.3,647页,2008;Wu等,OpticsExpress,2009,发表中)或碳纳米管(Kang等,Small,vol.5,p.1292,2009)光热剂机制类似,但与其他光热剂中观察到的加热损伤机制(Huang等,Lasers Med Sci,vol.23,217页,2008;Gobin等,Nano Lett,vol.7,1929页,2007;Pitsillides等,Biophys J,vol.84,4023页,2003;Huang等,J AmChem Soc,vol.128,2115页,2006)有着巨大的不同。为使靶标细胞中微泡诱发的机械性损伤(Hleb等,Nanomed,vol.3,647页,2008)显现,进行时间分辨成像以监测RGD-Au-SNP接枝的细胞如何应答于恰好在激光照射后的微泡形成。为确保少量的RGD-Au-SNP接枝在细胞上,αvβ3阳性的U87细胞用118nm RGD-Au-SNP以稀释浓度(0.93mg/ml)处理。图33B显示了RGD-Au-SNP处理的U87细胞在6ns脉冲激光(120mJ/cm2)照射下的时间依赖性响应。照射后,观察到细胞突出的快速收缩,这是微泡导致的局部机械性损伤的结果。
总之,利用超分子自组装方法从2nm Au胶体合成尺寸可控的Au-SNP已得到成功证实。所得Au-SNP表现出增强的光热效应,并可在掺入靶标特异性配体(即RGD)后用于展示癌细胞亚群的靶向性光热处理。预计(i)此类超分子组装方法能够应用于装配其他“小”无机纳米颗粒(如超顺磁氧化物纳米颗粒)(Lee等,Angew Chem Int Ed Engl,vol.45,8160页,2006),在材料科学和生物医学中有更广泛的应用;(ii)多种功能性构建块和治疗性载荷(如DNA、蛋白质和药物)能够被包装进Au-SNP中,且激光诱发的Au-SNP解聚能够用作可控的释放机制;和(iii)双光子激光(Starkey等,Clin Cancer Res,,vol.14,p.6564,2008)能够应用于克服组织透过性限制。
结论
目前认为,基于纳米颗粒的癌症治疗剂的直径应当在10-100nm范围内。下限是基于肾小球毛细血管壁筛选系数的测量值,因为估计肾的首过清除的阈值为10nm(Venturoli等,Am.J.Physiol,vol.288,F605-F613页,2005)。尺寸的上限现在尚未明确定义。已知肿瘤的脉管系统对于大分子是渗漏性的。小鼠模型中的肿瘤淋巴系统操作性很差,且从血管中渗出的大分子累积——此现象被称为“增强的透过和滞留(enhancedpermeability and retention,EPR)效应”(Matsumura等,Cancer Res.,vol.6,6387-6392页,1986)。许多证据表明,该现象在人体内同样适用。已有证据显示,大约数百纳米(nm)尺寸的实体能够从血管中渗出并在肿瘤中累积。不过,大体积的大分子或纳米颗粒在胞外空间中的扩散性有限(Dreher等,J.Natl Cancer Inst.,vol.98,335-344页,2006)。动物模型实验表明,小于150nm的中性或带少量负电荷的实体能够移动通过肿瘤组织(Nomura等,Pharm Res.,vol.15,128-132页,1998)。此外,最近的数据表明,在全身给药后,50-100nm尺寸范围内带有少量正电荷的纳米颗粒能够穿透大肿瘤(Hu-Lieskovan等,Cancer Res.,vol.65,8984-8992页,2005)。因此,良好设计的10-100nm尺寸范围内表面带有少量正电荷或少量负电荷的颗粒在给药至循环系统时应该能到达并进入弥散性肿瘤。如果该尺寸范围正确,则这些颗粒将受限于已有的正常脉管系统(要求小于1-2nm)。不过,它们还是可以进入肝脏,因为这是大至100-150nm直径的实体所能做到的。
纳米颗粒表面特性
与更大颗粒相比,纳米颗粒具有高的面积-体积比,因此控制其表面的正确结合物对于其在人体内的行为是至关重要的(Chen等,JNeurosurg,vol.103,311-319页,2005)。纳米颗粒在体内的最终命运可通过纳米颗粒与其局部环境的相互作用来确定,其取决于尺寸和表面特性的组合。立体稳定(例如借助其表面的聚乙二醇(PEG)聚合物),且表面电荷稍带正电或稍带负电的纳米颗粒通常其自身-自身以及自身-非自身相互作用极低。此外,血管内表面和细胞表面也含有许多带负电荷的组分,会排斥带负电荷的纳米颗粒。随着表面电荷增多(正或负),巨噬细胞清除增加,可导致更好地被网状内皮系统清除。因此,通过立体稳定和控制表面电荷使非特异性相互作用尽可能小,这有助于防止纳米颗粒在非预期位置损失。不过,现在还不能完全消除非特异性相互作用,因此总有颗粒损失;关键是使这些相互作用尽可能小。如果纳米颗粒损失能够避免,则预计如果没有基于热力学考虑的尺寸限制,哺乳动物体内的纳米颗粒分布将是均一的。不过,在体内有许多限制尺寸的部位,将产生不均一性。例如,脑被血脑屏障保护,其入口具有苛刻的尺寸和表面特性限制。通过了解到达体内特定位点的尺寸和表面特性要求,可实现纳米颗粒在这些位点的定位。
带有靶向配体的纳米颗粒
引入提供了特异性纳米颗粒-细胞表面相互作的靶向配体可在纳米颗粒递送特异性的控制中起关键作用。例如,纳米颗粒如果在其表面含有诸如肽、蛋白质或抗体等部分,则可靶向癌细胞。这些部分可与癌细胞表面受体蛋白如转铁蛋白受体(已知其在许多不同的癌细胞上会增多)相互作用(Gatter等,J.Clin.Pathol.,vol.36,539-545页,1983)。这些靶向配体使得纳米颗粒能够首先与细胞表面受体结合并通过受体介导的胞吞作用进入细胞。比较非靶向性与靶向性纳米颗粒(基于脂质(Kirpotin等,Cancer Res.,vol.66,6732-6740页,2006)或基于聚合物(Bartlett等,Proc.Natl Acad Sci USA,vol.104,15549-15554页,2007))的近期工作显示,靶向性配体的主要作用是增强癌细胞的细胞摄入,而不是提高在肿瘤中的累积。
癌症纳米颗粒治疗剂的独特特征
通过控制尺寸和表面特性,可以调节纳米颗粒以提供或长或短的循环时间。它们还能够被定向于靶标器官内特定的细胞类型(例如,肝脏中的肝细胞和肝巨噬细胞)(Popielarski等,Bioconjug Chem.,vol.16,1071-1080页,2005)。尽管其他类型的癌症治疗剂如分子缀合物(例如抗体-药物缀合物)也能够满足这些最基本的规格时,但靶向性纳米颗粒具有至少五个使其区别于其他癌症治疗模式的特征。首先,纳米颗粒能够携带大装载量的药物实体并保护其免于降解。例如,70nm纳米颗粒能够包含约2,000个小分子干扰RNA(siRNA)分子(Bartlett等,Bioconjug Chem.,vol.18,456-468页,2007),而抗体缀合物仅携带少于10个(Song等,Nature Biotech.,vol.23,709-717页,2005)。其他药物类型如小分子或肽药物也能够达到这样的高装载量。此外,纳米颗粒的载荷位于微粒内部,其类型和数量不会影响纳米颗粒的药物代谢动力学特性和生物分布。这与分子缀合物的情况(其中与靶向配体缀合的治疗配体(如抗体)的类型和数量显著修饰缀合物的整体特性)不同。其次,纳米颗粒足够大,可包含多个靶向配体,允许与细胞表面受体的多价结合(Hong,Chem Biol.,vol.14,107-115页,2007)。纳米颗粒有两个参数用于调谐与靶标细胞的结合:靶向部分的亲和力和靶向部分的密度。使用低亲和性配体的排列时,多价效应可导致高效率的亲和力(Hong,Chem Biol.,vol.14,107-115页,2007;Montet等,J Med.Chem,vol.49,6087-6093页,2006;Carlson等,ACSChem.Biol,vol.2,119-127页,2007)。从而,可用作靶向剂的分子范围可得到极大扩展,因为许多不足以用于分子缀合物的低亲和力配体现在可附着在纳米颗粒上以通过与细胞表面受体的多价结合产生更高的亲和力。第三,纳米颗粒足够大,可容纳多种药物分子类型。许多治疗性干预可同时以可控方式应用于纳米颗粒。如第一点中提及的,纳米颗粒的药物代谢动力学特性不会因治疗数量改变,这也适用于纳米颗粒中结合多种治疗类型时。第四,药物分子从纳米颗粒中释放的动力学可被调谐以匹配其作用机制。例如,拓扑异构酶I抑制剂(如基于喜树碱的化学治疗剂)是该酶的可逆结合物。因此,基于喜树碱的药物在拓扑异构酶I上的作用机制表明了因延长药物暴露时间而产生的增强药效(Pommier,Curr.Med.Chem.Anticancer Agents,vol.4,429-434页,2004),使得从纳米颗粒中缓慢释放成为最理想的。对siRNA,细胞周期时间极大地影响基因抑制动力学(Bartlett等,Nucl.Acid Res.,vol.34,322-333页,2006;Bartlett等,Biotech.Bioeng.,vol.97,909-921页,2007),对其在癌症中的用途而言,可能不需要治疗性药剂的缓慢释放。第五,纳米颗粒可具有绕过与细胞表面蛋白泵(例如糖蛋白P)相关的多药物抗性机制的潜力,因其通过内吞作用进入细胞。总之,通过纳米颗粒设计实现的这些特征的可控组合看来可使抗癌药物的副作用最小化,同时增强效力,并且已经出现了临床结果表明这一前景正开始实现。
纳米颗粒用作抗癌剂
携带有化学治疗小分子药物的脂质体(~100nm和更大)已从九十年代中期开始被批准用于癌症治疗,主要用于药物增溶以使其生物分布与游离药物相比适于肿瘤的更高摄取(Zamboni,Clin.Cancer Res,vol.11,8230-8234页,2005)。不过,脂质体不提供对药物释放时间的控制,大多数情况下达不到药物分子的有效细胞内递送(Zamboni,Clin.Cancer Res,vol.11,8230-8234页,2005),因此限制了其在多药物抗性癌症中的应用潜力。一个实例为Doxil(ortho biotech),是一种含有细胞毒素药物阿霉素的PEG-脂质体。Doxil最初被批准用于AIDS相关的卡波西氏肉瘤的治疗,现在被批准用于卵巢癌和多发性骨髓瘤的治疗。该药剂像纳米颗粒一样在体内循环,具有比游离阿霉素长~100倍的半衰期。它在临床中的主要优势为降低了阿霉素的心脏毒性(Rahman等,Int.J.Nanomedicine,vol.2,567-583页,2007;Batist,Cardiovasc.Toxicol,vol.7,72-74页,2007)。不过,此类纳米尺度系统还显示可表现出其不想要的属性。例如,虽然Doxil已表现出与游离阿霉素相比具有降低的心脏毒性,但它还具有在单独使用时未观察到的皮肤毒性(Uziely,J.Clin.Oncol,vol.13,1777-1785页,1995)。更新的纳米颗粒系统定义为更高程度的多功能性(掺入诸如缓释和/或靶向配体的特征),具有增强的特征,例如与最初批准的产品相比其毒性降低而不出现其他毒性。
无靶向配体的纳米颗粒
将几种基于纳米颗粒的治疗方法(例如,脂质体、聚合物胶束和基于聚合物的纳米颗粒)与其携带的药物分子进行比较。在每种情况下——例如,阿霉素与携带阿霉素的纳米颗粒SP1049C、NK911和Doxil相比——纳米颗粒均改变了药物分子的药物代谢动力学特性。清除率是易于从临床试验中获取的药物代谢动力学常用参数,是治疗方法之间循环时间差异的更好指标。使用诸如Doxil、XYoTAX(CT-2103)和IT-101的纳米颗粒获得了极大降低的清除率。与仅使用游离药物相比,更长的纳米颗粒循环时间能够提高肿瘤摄入(Boddy,Clin.Cancer Res.,vol.11,7834-7840页,2005)。此外,聚合物胶束(小于100nm)已显示出比更大的脂质体更易于在肿瘤中累积(Sutton等,Pharm.Res.,vol.24,1029-1046页,2007)。因此,小心控制其尺寸对纳米颗粒治疗的药物代谢动力学、生物分布、肿瘤累积和肿瘤渗透非常重要。一些现在进行临床测试的纳米颗粒还具有控制药物释放的机制,如下文对IT-101的讨论。这些方法论基于颗粒与药物之间的化学键断裂,所述断裂可通过水解,通过定位于细胞内和细胞外的酶(例如溶菌酶和酯酶),或是通过仅定位于细胞内的酶(如组织蛋白酶)。
有靶向配体的纳米颗粒
纳米颗粒利用被动靶向性到达肿瘤。即,认为肿瘤的渗漏性脉管系统允许纳米颗粒渗出,而正常的脉管系统则不会(该特性与纳米颗粒相比于药物分子其生物分布的改变有关)。最终,通过纳米颗粒上靶向配体的内含而形成的主动靶向预计可提供最有效的治疗。很少有配体靶向治疗获得批准或临床使用。PK2(FCE28069)是一种HPMA-聚合物-Gly-Phe-leu-Gly-阿霉素缀合物(还包含糖类半乳糖胺)是第一种到达临床阶段的靶向配体纳米颗粒。该基于半乳糖的配体用于靶向表达于肝细胞上的脱唾液酸糖蛋白(ASGPR),希望其在原代肝癌细胞上能保持高表达水平。现在,临床中仅有的靶向性纳米颗粒有:MbP-426,其含有包裹在脂质体中的细胞毒性铂基质药物奥沙利铂;SGT-53,是含有编码肿瘤抑制因子p53的质粒的脂质体;和CAIAA-01,一种聚合物-siRNA复合物。CAIAA-01是一种靶向性纳米颗粒,其具有每个靶向配体的高药物(siRNA)装载量、已证明的与癌细胞表面的多价结合以及主动药物(siRNA)释放机制(在细胞内定位识别后因pH值下降到6.0以下(发生在内吞作用途径中)而被触发)(Heidel等,Proc.Natl Acad.Sci.USA,vol.104,5715-5721页,2007)。如上所述,将非靶向性与靶标性纳米颗粒进行比较的近期工作表明,靶向性配体的主要作用是增强癌细胞的摄取并尽可能减少其在正常组织中的累积。该行为表明,纳米颗粒的胶体特性将决定其生物分布,而靶向性配体用于增加靶肿瘤的细胞内摄取。如果该行为被证实为普遍情况,则纳米颗粒上的靶向配体亲和力和表面密度将决定细胞摄取。
超分子纳米颗粒
不同于能够产生/断裂共价键的常规化学合成,将两个基本概念(自组装和分子识别)组合在一起的超分子化学合成提供了从分子构建块制备纳米结构材料的强大而便捷的工具(Meyer等,Chem.Soc.Rev.,vol.36,1705页,2007;Hwang等,Angew.Chem.,vol.119,214页,2007;Hwang等,Angew.Chem.Int.Ed,vol.46,210页,2007;Ludden等,Chem.Soc.Rev.,vol.35,1122页,2006;Park等,Nature,vol.451,553页,2008;Stoddart等,Proc.Natl.Acad.Sci USA,vol.99,4797页,2002;Liu等,Angew.Chem.,vol.116,2744页,2004;Liu等,Angew.Chem.Int.Ed,vol.43,2690页,2004)。事实上,自组装的概念已广泛用于制备有机纳米颗粒。例如,通过磷脂自组装制备的带有双层膜(Li等,Advanced Drug Delivery Reviews,vol.60,1000-1017页,2008)的脂质体和纳米级载体(Torchilin,Nat.Rev.Drug Discov.,vol.4,145页,2005)可用作药物和基因递送的强大纳米载体。两亲性模块水溶性共聚物的自组装形成可用于药物递送和分子成像的纳米颗粒(Sun,Advanced Materials,vol.19,3157页,2007;Ferreira等,Cell stem cell,vol.3,136-146页,2008;Bull等,Nano Letters,vol.5,1-4页,2005;Bertin,等,Journal of the American Chemical Society,vol.128,4168-4169页,2006)。不过,分子识别的概念似乎仍未被认识到可应用于产生有机纳米颗粒和所得纳米颗粒的独特特性。
β-环糊精(CD)是最常使用的超分子构建块之一(Wenz等,ChemicalReviews,vol.106,782-817页,2006)。CD分子以亲水性/生物相容性外壁和疏水性内部结合口袋为特征。CD的外壁赋予基于CD的超分子结构以期望的亲水性和生物相容性,从而使其多种生物医药应用成为可能(Li等,Advanced Drug Delivery Reviews,vol.60,1000-1017页,2008)。具有适宜尺寸和疏水性的客体分子(即金刚烷(Ad)或其衍生物)可通过其在水溶液中的疏水相互作用而包括在CD的内部结合口袋中,允许得到一种制备功能性超分子材料的便捷、灵活且模块化的合成方法(Ludden等,Chemical Society Reviews,vol.35,pp.1122-1134,2006)。含有CD的阳离子聚合物已被用作高效递送siRNA的载体。通过CD/Ad识别,Ad功能化的PEG链可接枝在纳米颗粒上,以使得体内的生物相容性的长全身循环成为可能(Bartlett等,Proc Natl Acad Sci USA,vol.104,15549-15554页,2007)。
尽管通过某些具体实施方案对本发明进行了描述和说明,但本领域技术人员会认识到,可在不背离本发明构思和范围的前提下对程序和方案进行多种改变、变更、改良、替代、删除或添加。因此本发明旨在由如下权利要求的范围来定义,这些权利要求应合理地以广义理解。
Claims (29)
1.一种超分子结构,其包含:
多个结构组件,其适于为所述超分子结构至少提供一些机械结构;
多个结合组件,其各自具有适于与所述多个结构组件相结合的多个结合区域;和
多个终止组件,其各自适于与所述多个结合组件之一的结合区域相结合,
其中所述多个结构组件各自包含与所述结合区域相结合的多个结合元件,
其中,所述多个结构组件和所述多个结合组件在接触时发生自组装而成所述超分子结构,并且
其中,在所述多个终止组件相对于所述多个结合组件的所述多个结合区域以足够量存在时,所述多个终止组件用于占据所述多个结合组件的结合区域,以终止进一步的结合,由此形成离散颗粒。
2.根据权利要求1的超分子结构,其中所述多个终止组件各自具有与所述结合区域之一相结合的单个结合元件。
3.根据权利要求1的超分子结构,其中所述结合区域与所述终止组件或结构组件结合而形成分子识别对。
4.根据权利要求3的超分子结构,其中所述分子识别对选自抗体-抗原、蛋白质-底物、蛋白质-抑制剂、蛋白质-蛋白质、互补寡核苷酸对和包合物。
5.根据权利要求4的超分子结构,其中所述分子识别对是互补寡核苷酸对。
6.根据权利要求4的超分子结构,其中所述分子识别对是包合物。
7.根据权利要求6的超分子结构,其中所述包合物是金刚烷胺-β-环糊精或重氮苯-α-环糊精。
8.根据权利要求1-7中任一项的超分子结构,其中所述结构组件、结合组件和终止组件中至少一种还包含功能元件。
9.根据权利要求8的超分子结构,其中所述功能元件为靶向配体或细胞通透配体。
10.根据权利要求9的超分子结构,其中所述功能元件为选自抗体、寡核苷酸、多肽和小分子的靶向配体。
11.根据权利要求9的超分子结构,其中所述功能元件为细胞通透配体。
12.根据权利要求8的超分子结构,其包含两个或更多个功能元件。
13.根据权利要求1的超分子结构,其包含两个或更多个不同的终止组件。
14.根据权利要求1的超分子结构,其还包含载荷。
15.根据权利要求14的超分子结构,其中所述载荷为治疗性化合物、siRNA、肽、寡核苷酸或质粒。
16.根据权利要求14的超分子结构,其中所述载荷为治疗性化合物或质粒。
17.根据权利要求1的超分子结构,其中所述多个结构组件包含至少一个无机或有机芯核。
18.根据权利要求17的超分子结构,其中所述多个结构组件为无机芯核,其包含金纳米颗粒、磁性纳米颗粒、量子点、二氧化硅纳米颗粒或半导体氧化物中的至少一种。
19.根据权利要求17的超分子结构,其中所述多个结构组件为有机芯核,其包含聚合物、胶束、脂质体或囊泡中的至少一种。
20.根据权利要求19的超分子结构,其中所述聚合物是树枝状聚合物。
21.根据权利要求1的超分子结构,其中所述多个结构组件包含树枝状聚合物、分枝状聚乙烯亚胺、直链聚乙烯亚胺、多聚赖氨酸、聚丙交酯、聚丙交酯-乙交酯共聚物、聚酐、聚-ε-己内酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚N-异丙基丙烯酰胺或多肽中的至少一种。
22.根据权利要求21的超分子结构,其中所述多个结构组件包含树枝状聚合物。
23.根据权利要求1的超分子结构,其中所述多个结合组件通过疏水相互作用、生物分子相互作用、氢键相互作用、π-π相互作用、静电相互作用、偶极-偶极相互作用或范德华力中的至少一种来提供结合。
24.根据权利要求23的超分子结构,其中所述生物分子相互作用包括DNA杂交、链霉亲和素-生物素相互作用、酶-底物相互作用、抗体-抗原相互作用或蛋白-蛋白相互作用中的至少一种。
25.根据权利要求1的超分子结构,其中所述多个终止组件包括聚乙二醇、金刚烷衍生物、靶标配体、肽、抗体或蛋白质中的至少一种。
26.将基因递送进细胞的方法,包括使所述细胞与带有质粒载荷的权利要求1-25中任一项所述超分子结构相接触。
27.带有治疗性化合物作为载荷的权利要求1-25中任一项所述超分子结构在制备用于递送治疗性化合物的药物组合物中的用途。
28.生产根据权利要求1所述的超分子结构的方法,包括:
制备结构组件和结合组件的悬液,和
向所述悬液中加入终止组件,
其中结构组件、结合组件与终止组件的量的比例根据所述超分子结构的预定尺寸来选择,和
其中所述结构组件、结合组件和终止组件自组装成基本具有所述预定尺寸的超分子结构。
29.根据权利要求28的生产所述超分子结构的方法,其中所述超分子结构的所述预定尺寸至少为30nm并小于500nm。
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