CN102766191B - 一种简单的磁颗粒功能化修饰方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种简单的磁颗粒功能化修饰方法，首先利用聚醚酰亚胺将磁纳米或者微米颗粒表面的羧基官能团氨基化，随后将一端氨基甲酸叔丁酯（Boc）基团保护而另外一端为N-羟基琥珀酰亚胺的PEG高分子偶联到氨基化的磁颗粒上，其次将蛋白的伯胺利用蛋白修饰试剂N-琥珀酰亚胺-S-乙酰基硫代乙酸酯或N-琥珀酰亚胺-3-乙酰硫代丙酸酯修饰为巯基，最后将Boc保护基团脱除，并与巯基化的蛋白反应，从而将蛋白修饰到磁纳米或者微米颗粒上。本发明步骤简单，操作简便，价格相对便宜，可以实现蛋白等的分离纯化，临床分子诊断，单分子磁镊技术研究蛋白分子间相互作用等的目标。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学领域，具体地说，涉及的是一种简单的磁颗粒功能化修饰方法。
背景技术
磁纳米和微米颗粒是一种在生物医学领域中有着重大应用价值的新型材料。磁颗粒的表面性质对其实际应用有着极其重要的影响。总体而言，磁颗粒通过表面功能化修饰起到如下三个方面的作用：（1）控制磁颗粒的尺寸和形貌；（2）赋予磁颗粒合适的表面官能团和胶体稳定性；（3）进行磁颗粒的生物学功能化。
在磁颗粒生物学功能化方面，针对不同的生物分子，如寡聚核苷酸、蛋白质（含抗原、抗体、酶）、多肽等，不同的修饰方法已经被用来对磁颗粒表面进行功能化修饰。比如，Fengqin Hu等人(Adv.Mat.2006.18，2553-2556)利用蛋白质修饰试剂N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)将癌靶区抗体上的氨基和Fe3O4磁纳米颗粒表面的羧基相连接，从而构建了靶向到癌部位的磁纳米颗粒。但是这种连接方法反应活性较低，连接到磁颗粒表面的生物分子较少。Hao Shang等人(J Am.Chem.Soc.2007.129，6640-6646)将Fe3O4磁微米颗粒表面的羧基氨基化，将蛋白质的伯胺通过N-琥珀酰亚胺-S-乙酰基硫代乙酸酯转化成巯基，随后利用N-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇-乙烯砜，将巯基化的蛋白质与氨基化的磁微米颗粒连接起来。但是这种连接方法中所用的N-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇-乙烯砜价格昂贵。
因此，有必要寻找一种简单的磁颗粒功能化修饰方法，能够具有高的反应活性，并且，反应中所用的试剂便宜，最后，有必要在双功能化的聚乙二醇分子中加入分子量小的单功能化聚乙二醇分子，从而在长的双功能化的聚乙二醇分子将蛋白质连接到磁颗粒上后，既能给与蛋白质一定的自由度，又能保证磁颗粒的生物相容性和降低非特异性相互作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简单的磁颗粒功能化修饰方法，即用于表面羧基化的磁颗粒表面功能化修饰蛋白质的方法，该方法步骤简单，操作简便，价格相对便宜，可以实现蛋白等的分离纯化，临床分子诊断，单分子磁镊技术研究蛋白分子间相互作用等的目标。
本发明的技术解决方案是：
本发明所述简单的磁颗粒功能化修饰方法，首先利用聚醚酰亚胺（PEI）将磁纳米或者微米颗粒表面的羧基官能团氨基化；随后将一端氨基甲酸叔丁酯（Boc）基团保护而另外一端为N-羟基琥珀酰亚胺的聚乙二醇（PEG）高分子偶联到氨基化的磁颗粒上；其次将蛋白的伯胺利用蛋白修饰试剂N-琥珀酰亚胺-S-乙酰基硫代乙酸酯（SATA）或者N-琥珀酰亚胺-3-乙酰硫代丙酸酯（SATP）修饰为巯基；最后将Boc保护基团脱除，并与巯基化的蛋白反应，从而将蛋白修饰到磁纳米或者微米颗粒上。
进一步的，本发明所述方法具体操作包括以下步骤：
1）磁颗粒表面氨基化：取表面羧基化磁颗粒溶液，通过磁铁吸引在反应器壁上，移液枪取走液体，加入碳酸盐缓冲液，超声振动分散磁颗粒，重复上述清洗过程两次，随后聚醚酰亚胺（PEI）的碳酸盐缓冲液，反应一段时间，利用碳酸盐缓冲液，清洗磁颗粒。
2）磁颗粒表面聚乙二醇化：将步骤1）得到的磁颗粒，加入氨基甲酸叔丁酯-聚乙二醇（分子量为3000）-N-羟基琥珀酰亚胺（Boc-PEG-3000-NHS）和甲氧基-聚乙二醇（分子量为2000）-N-羟基琥珀酰亚胺（mPEG-2000-NHS）混合碳酸盐缓冲液中，反应一段时间，利用超纯水溶液，清洗磁颗粒。从而将磁颗粒表面聚乙二醇化，长链双功能化PEG（Boc-PEG-3000-NHS）和短链单功能化PEG（mPEG-2000-NHS）的混合使用可以在保证在利用长链双功能化PEG来连接蛋白分子的同时，也利用长短链PEG分子的差别来保证给与所连接蛋白一定的空间自由度。
3）磁颗粒表面Boc官能团脱保护：将步骤2）得到的磁颗粒，加入适量的三氟乙酸，超声振荡，反应一段时间。利用磷酸盐缓冲液，清洗磁颗粒。
4）磁颗粒表面马来酰亚胺活化：将步骤3）得到的磁颗粒，加入蛋白交联剂4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯（SMCC）或者4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐（Sulfo-SMCC）的二甲基甲酰胺溶液中，反应一段时间。利用磷酸盐缓冲液，清洗磁颗粒。
5）蛋白质交联剂修饰引入受保护的巯基：在蛋白溶液中加入蛋白修饰试剂N-琥珀酰亚胺-S-乙酰基硫代乙酸酯（SATA）或者N-琥珀酰亚胺-3-乙酰硫代丙酸酯（SATP），并反应一段时间。
6）蛋白质巯基化：将步骤5）得到的蛋白质溶液，加入脱乙酰缓冲液，反应一段时间，随后利用脱盐柱脱去蛋白溶液中的盐。
7）磁颗粒表面功能化修饰蛋白质：将步骤4）得到的磁颗粒，加入步骤6）中处理得到的蛋白溶液，反应一段时间，利用磷酸盐缓冲液，清洗磁颗粒。4摄氏度保存备用。
本发明选用磁颗粒为表面羧基化修饰的纳米或者微米颗粒。
步骤1）中所用碳酸盐缓冲液为pH条件为8.2的0.05mol/L碳酸钠水溶液，所用聚醚酰亚胺的碳酸盐缓冲液浓度为2-10%，反应时间为1-3h。
步骤2）中所用的聚乙二醇混合液中Boc-PEG-3000-NHS摩尔百分比率为5%-20%，总PEG浓度为1-40mM，反应时间为1-3h。
步骤3）中与三氟乙酸反应时间为5-10min。
步骤4）中所用的交联剂SMCC先溶解于二甲基甲酰胺或者二甲基亚砜，或者Sulfo-SMCC首先溶解于超纯水中，随后再将SMCC或者Sulfo-SMCC溶液加入到PBS缓冲体系中，浓度为0.1-2mg/mL，反应时间为15-45min。
步骤5）中蛋白修饰试剂SATA（SATP）先溶解于二甲基甲酰胺或者二甲基亚砜，随后再加入到蛋白溶液中，其与蛋白的摩尔比率范围为10:1到250:1，反应时间为0.5-3h。
步骤6）中脱乙酰缓冲液为含有0.5M羟胺、25mM乙二胺四乙酸EDTA的PBS缓冲混合溶液，pH7.2-7.5。反应时间为1-3h。
步骤7）中蛋白浓度为1-40μg/mL，反应时间为0.5-3h。
本发明提供了上述用于表面羧基化的磁颗粒表面功能化修饰蛋白质的方法，该方法步骤简单，操作简便，价格相对便宜，可以实现蛋白等的分离纯化，临床分子诊断，单分子磁镊技术研究蛋白分子间相互作用等的目标。
附图说明
图1为本发明中磁颗粒表面功能化修饰蛋白质的示意图
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
1）磁颗粒表面氨基化：取1mL表面羧基化的磁颗粒溶液，通过磁铁吸引在1.5mL离心管壁上，移液枪取走液体，加入0.05mol/L碳酸盐缓冲液（pH8.2），超声振动分散磁颗粒，重复上述清洗过程两次，随后加入5%聚醚酰亚胺的碳酸盐缓冲液，反应2h。利用碳酸盐缓冲液清洗磁颗粒三次，去除过量的聚醚酰亚胺。
2）磁颗粒表面聚乙二醇化：将步骤1）得到的磁颗粒，加入1mL的氨基甲酸叔丁酯-聚乙二醇（分子量为3000）-N-羟基琥珀酰亚胺（Boc-PEG-3000-NHS）和甲氧基-聚乙二醇（分子量为2000）-N-羟基琥珀酰亚胺（mPEG-2000-NHS）混合碳酸盐缓冲液（总PEG浓度为40mM，Boc-PEG-3000-NHS与mPEG-2000-NHS摩尔比为1:4）中，反应2h。利用超纯水清洗磁颗粒三次，去除过量的聚乙二醇分子。
3）磁颗粒表面Boc官能团脱保护：将步骤2）得到的磁颗粒，加入1mL三氟乙酸，超声振荡，反应5min。利用磷酸盐缓冲液清洗磁颗粒三次，去除过量的三氟乙酸。
4）磁颗粒表面马来酰亚胺活化：将步骤3）得到的磁颗粒，加入1mL0.1mg/mL的蛋白交联剂4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯（SMCC）磷酸盐缓冲液，反应30min。利用磷酸盐缓冲液，清洗磁颗粒三次，去除过量的SMCC。
5）蛋白质交联剂修饰引入受保护的巯基：在单克隆抗羊IgG溶液中加入蛋白修饰试剂N-琥珀酰亚胺-S-乙酰基硫代乙酸酯（SATA）的二甲基甲酰胺溶液，SATA与蛋白的摩尔比率范围为25:1，并反应30min。
6）蛋白质巯基化：将步骤5）得到的蛋白质溶液，加入脱乙酰缓冲液（0.5M羟胺，25mM乙二胺四乙酸（EDTA），PBS缓冲体系，pH7.2-7.5）（脱乙酰缓冲液与蛋白溶液体积比为1:10），反应2h。随后利用脱盐柱脱去蛋白溶液中的盐，得到伯胺巯基活化的蛋白质。
7）磁颗粒表面功能化修饰蛋白质：将步骤4）得到的磁颗粒，加入1mL2μg/mL的步骤6）得到的伯胺巯基活化的蛋白质，反应2h。利用磷酸盐缓冲液清洗磁颗粒三次，最后加入1mL磷酸盐缓冲液，4摄氏度保存备用。
本发明采用的磁颗粒可以是表面羧基官能团修饰的直径为纳米级或者微米级的磁颗粒。
实施例2
1）磁颗粒表面氨基化：取1mL表面羧基化的磁颗粒溶液，通过磁铁吸引在1.5mL离心管壁上，移液枪取走液体，加入0.05mol/L碳酸盐缓冲液（pH8.2），超声振动分散磁颗粒，重复上述清洗过程两次，随后加入5%聚醚酰亚胺的碳酸盐缓冲液，反应1h。利用碳酸盐缓冲液清洗磁颗粒三次，去除过量的聚醚酰亚胺。
2）磁颗粒表面聚乙二醇化：将步骤1）得到的磁颗粒，加入1mL的氨基甲酸叔丁酯-聚乙二醇（分子量为3000）-N-羟基琥珀酰亚胺（Boc-PEG-3000-NHS）和甲氧基-聚乙二醇（分子量为2000）-N-羟基琥珀酰亚胺（mPEG-2000-NHS）混合碳酸盐缓冲液（总PEG浓度为20mM，Boc-PEG-3000-NHS与mPEG-2000-NHS摩尔比为1:9）中，反应2h。利用超纯水清洗磁颗粒三次，去除过量的聚乙二醇分子。
3）磁颗粒表面Boc官能团脱保护：将步骤2）得到的磁颗粒，加入1mL三氟乙酸，超声振荡，反应5min。利用磷酸盐缓冲液清洗磁颗粒三次，去除过量的三氟乙酸。
4）磁颗粒表面马来酰亚胺活化：将步骤3）得到的磁颗粒，加入1mL0.2mg/mL的蛋白交联剂4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯（SMCC）磷酸盐缓冲液，反应30min。利用磷酸盐缓冲液，清洗磁颗粒三次，去除过量的SMCC。
5）蛋白质交联剂修饰引入受保护的巯基：在多克隆羊IgG蛋白溶液中加入蛋白修饰试剂N-琥珀酰亚胺-S-乙酰基硫代乙酸酯（SATA）的二甲基甲酰胺溶液，SATA与蛋白的摩尔比率范围为50:1，并反应30min。
6）蛋白质巯基化：将步骤5）得到的蛋白质溶液，加入脱乙酰缓冲液（0.5M羟胺，25mM乙二胺四乙酸（EDTA），PBS缓冲体系，pH7.2-7.5）（脱乙酰缓冲液与蛋白溶液体积比为1:10），反应2h。随后利用脱盐柱脱去蛋白溶液中的盐，得到伯胺巯基活化的蛋白质。
7）磁颗粒表面功能化修饰蛋白质：将步骤4）得到的磁颗粒，加入1mL10μg/mL的步骤6）得到的伯胺巯基活化的蛋白质，反应2h。利用磷酸盐缓冲液清洗磁颗粒三次，最后加入1mL磷酸盐缓冲液，4摄氏度保存备用。
实施例3
1）磁颗粒表面氨基化：取1mL表面羧基化的磁颗粒溶液，通过磁铁吸引在1.5mL离心管壁上，移液枪取走液体，加入0.05mol/L碳酸盐缓冲液（pH8.2），超声振动分散磁颗粒，重复上述清洗过程两次，随后加入5%聚醚酰亚胺的碳酸盐缓冲液，反应2h。利用碳酸盐缓冲液清洗磁颗粒三次，去除过量的聚醚酰亚胺。
2）磁颗粒表面聚乙二醇化：将步骤1）得到的磁颗粒，加入1mL的氨基甲酸叔丁酯-聚乙二醇（分子量为3000）-N-羟基琥珀酰亚胺（Boc-PEG-3000-NHS）和甲氧基-聚乙二醇（分子量为2000）-N-羟基琥珀酰亚胺（mPEG-2000-NHS）混合碳酸盐缓冲液（总PEG浓度为10mM，Boc-PEG-3000-NHS与mPEG-2000-NHS摩尔比为1:4）中，反应2h。利用超纯水清洗磁颗粒三次，去除过量的聚乙二醇分子。
3）磁颗粒表面Boc官能团脱保护：将步骤2）得到的磁颗粒，加入1mL三氟乙酸，超声振荡，反应5min。利用磷酸盐缓冲液清洗磁颗粒三次，去除过量的三氟乙酸。
4）磁颗粒表面马来酰亚胺活化：将步骤3）得到的磁颗粒，加入1mL0.2mg/mL的蛋白交联剂4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐（Sulfo-SMCC）磷酸盐缓冲液，反应30min。利用磷酸盐缓冲液，清洗磁颗粒三次，去除过量的Sulfo-SMCC。
5）蛋白质交联剂修饰引入受保护的巯基：在单克隆抗羊IgG蛋白溶液中加入蛋白修饰试剂N-琥珀酰亚胺-S-乙酰基硫代乙酸酯（SATA）的二甲基亚砜溶液，SATA与蛋白的摩尔比率范围为25:1，并反应30min。
6）蛋白质巯基化：将步骤5）得到的蛋白质溶液，加入脱乙酰缓冲液（0.5M羟胺，25mM乙二胺四乙酸（EDTA），PBS缓冲体系，pH7.2-7.5），脱乙酰缓冲液与蛋白溶液体积比为1:10，反应1.5h。随后利用脱盐柱脱去蛋白溶液中的盐，得到伯胺巯基活化的蛋白质。
7）磁颗粒表面功能化修饰蛋白质：将步骤4）得到的磁颗粒，加入1mL5μg/mL的步骤6）得到的伯胺巯基活化的蛋白质，反应2h。利用磷酸盐缓冲液清洗磁颗粒三次，最后加入1mL磷酸盐缓冲液，4摄氏度保存备用。
实施例4
1）磁颗粒表面氨基化：取1mL表面羧基化的磁颗粒溶液，通过磁铁吸引在1.5mL离心管壁上，移液枪取走液体，加入合适体积的0.05mol/L碳酸盐缓冲液（pH8.2），超声振动分散磁颗粒，重复上述清洗过程两次，随后加入5%聚醚酰亚胺的碳酸盐缓冲液，反应2h。利用碳酸盐缓冲液清洗磁颗粒三次，去除过量的聚醚酰亚胺。
2）磁颗粒表面聚乙二醇化：步骤1）得到的磁颗粒，加入1mL的氨基甲酸叔丁酯-聚乙二醇（分子量为3000）-N-羟基琥珀酰亚胺（Boc-PEG-3000-NHS）和甲氧基-聚乙二醇（分子量为2000）-N-羟基琥珀酰亚胺（mPEG-2000-NHS）混合碳酸盐缓冲液（总PEG浓度为30mM，Boc-PEG-3000-NHS与mPEG-2000-NHS摩尔比为1:9）中，反应1h。利用超纯水清洗磁颗粒三次，去除过量的聚乙二醇分子。
3）磁颗粒表面Boc官能团脱保护：步骤2）得到的磁颗粒，加入1mL三氟乙酸，超声振荡，反应5min。利用磷酸盐缓冲液清洗磁颗粒三次，去除过量的三氟乙酸。
4）磁颗粒表面马来酰亚胺活化：步骤3）得到的磁颗粒，加入1mL0.2mg/mL的蛋白交联剂4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯（SMCC）磷酸盐缓冲液，反应30min。利用磷酸盐缓冲液，清洗磁颗粒三次，去除过量的SMCC。
5）蛋白质交联剂修饰引入受保护的巯基：在多克隆羊IgG蛋白溶液中加入蛋白修饰试剂N-琥珀酰亚胺-3-乙酰硫代丙酸酯（SATP）的二甲基甲酰胺溶液，SATP与蛋白的摩尔比率范围为25:1，并反应45min。
6）蛋白质巯基化：将步骤5）得到的蛋白质溶液，加入脱乙酰缓冲液（0.5M羟胺，25mM乙二胺四乙酸，PBS缓冲体系，pH7.2-7.5），脱乙酰缓冲液与蛋白溶液体积比为1:10，反应1h。随后利用脱盐柱脱去蛋白溶液中的盐，得到伯胺巯基活化的蛋白质。
7）磁颗粒表面功能化修饰蛋白质：将步骤4）得到的磁颗粒，加入1mL5μg/mL的步骤6）得到的伯胺巯基活化的蛋白质，反应1h。利用磷酸盐缓冲液清洗磁颗粒三次，最后加入1mL磷酸盐缓冲液，4摄氏度保存备用。
实施例5
1）磁颗粒表面氨基化：取1mL表面羧基化的磁颗粒溶液，通过磁铁吸引在1.5mL离心管壁上，移液枪取走液体，加入合适体积的0.05mol/L碳酸盐缓冲液（pH8.2），超声振动分散磁颗粒，重复上述清洗过程两次，随后加入5%聚醚酰亚胺的碳酸盐缓冲液，反应1.5h。利用碳酸盐缓冲液清洗磁颗粒三次，去除过量的聚醚酰亚胺。
2）磁颗粒表面聚乙二醇化：将步骤1）得到的磁颗粒，加入1mL的氨基甲酸叔丁酯-聚乙二醇（分子量为3000）-N-羟基琥珀酰亚胺（Boc-PEG-3000-NHS）和甲氧基-聚乙二醇（分子量为2000）-N-羟基琥珀酰亚胺（mPEG-2000-NHS）混合碳酸盐缓冲液（总PEG浓度为25mM，Boc-PEG-3000-NHS与mPEG-2000-NHS摩尔比为1:7）中，反应1h。利用超纯水清洗磁颗粒三次，去除过量的聚乙二醇分子。
3）磁颗粒表面Boc官能团脱保护：将步骤2）得到的磁颗粒，加入1mL三氟乙酸，超声振荡，反应5min。利用磷酸盐缓冲液清洗磁颗粒三次，去除过量的三氟乙酸。
4）磁颗粒表面马来酰亚胺活化：将步骤3）得到的磁颗粒，加入1mL0.2mg/mL的蛋白交联剂4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯（SMCC）磷酸盐缓冲液，反应30min。利用磷酸盐缓冲液，清洗磁颗粒三次，去除过量的SMCC。
5）蛋白质交联剂修饰引入受保护的巯基：在单克隆抗羊IgG蛋白溶液中加入蛋白修饰试剂N-琥珀酰亚胺-3-乙酰硫代丙酸酯（SATP）的二甲基甲酰胺溶液，SATP与蛋白的摩尔比率范围为25:1，并反应30min。
6）蛋白质巯基化：将步骤5）得到的蛋白质溶液，加入脱乙酰缓冲液（0.5M羟胺，25mM乙二胺四乙酸，PBS缓冲体系，pH7.2-7.5），脱乙酰缓冲液与蛋白溶液体积比为1:10，反应2h。随后利用脱盐柱脱去蛋白溶液中的盐，得到伯胺巯基活化的蛋白质。
7）磁颗粒表面功能化修饰蛋白质：将步骤4）得到的磁颗粒，加入1mL5μg/mL的步骤6）得到的伯胺巯基活化的蛋白质，反应1.5h。利用磷酸盐缓冲液清洗磁颗粒三次，最后加入1mL磷酸盐缓冲液，4摄氏度保存备用。
上述实施例中的磁颗粒可以是表面羧基官能团修饰的直径为纳米级或者微米级的磁颗粒，只要符合该要求，就可以实现本发明的目的。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
Claims (1)
1.一种简单的磁颗粒功能化修饰方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
1）磁颗粒表面氨基化：取表面羧基化磁颗粒溶液，通过磁铁吸引在反应器壁上，移液枪取走液体，加入碳酸盐缓冲液，超声振动分散磁颗粒，重复上述清洗过程两次，随后加入聚醚酰亚胺PEI的碳酸盐缓冲液，反应一段时间，利用碳酸盐缓冲液，清洗磁颗粒；所用碳酸盐缓冲液为pH条件为8.2的0.05mol/L碳酸钠水溶液，所用聚醚酰亚胺的碳酸盐缓冲液浓度为2-10%，反应时间为1-3h；
2）磁颗粒表面聚乙二醇化：将步骤1）得到的磁颗粒，加入氨基甲酸叔丁酯-聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺和甲氧基-聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺混合碳酸盐缓冲液中，反应一段时间，利用超纯水溶液，清洗磁颗粒；所用的聚乙二醇混合液中氨基甲酸叔丁酯-聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺摩尔百分比率为5%-20%，总PEG浓度为1-40mM，反应时间为1-3h；所述氨基甲酸叔丁酯-聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺中聚乙二醇分子量为3000；所述甲氧基-聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺中聚乙二醇分子量为2000；
3）磁颗粒表面Boc官能团脱保护：将步骤2）得到的磁颗粒，加入三氟乙酸，超声振荡，反应一段时间，利用磷酸盐缓冲液，清洗磁颗粒；所述磁颗粒与三氟乙酸反应时间为5-10min；
4）磁颗粒表面马来酰亚胺活化：将步骤3）得到的磁颗粒，加入蛋白交联剂4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯SMCC或者4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐Sulfo-SMCC的二甲基甲酰胺溶液中，反应一段时间，利用磷酸盐缓冲液，清洗磁颗粒；所用的交联剂SMCC先溶解于二甲基甲酰胺或者二甲基亚砜，或者Sulfo-SMCC首先溶解于超纯水中，随后再将SMCC或者Sulfo-SMCC溶液加入到PBS缓冲体系中，浓度为0.1-2mg/mL，反应时间为15-45min；
5）蛋白质交联剂修饰引入受保护的巯基：在蛋白溶液中加入蛋白修饰试剂N-琥珀酰亚胺-S-乙酰基硫代乙酸酯SATA或者N-琥珀酰亚胺-3-乙酰硫代丙酸酯SATP，并反应一段时间；所述蛋白修饰试剂SATA或SATP先溶解于二甲基甲酰胺或者二甲基亚砜，随后再加入到蛋白溶液中，其与蛋白的摩尔比率范围为10:1到250:1，反应时间为0.5-3h；
6）蛋白质巯基化：步骤5）得到的蛋白质溶液，加入脱乙酰缓冲液，反应一段时间，随后利用脱盐柱脱去蛋白溶液中的盐；所述脱乙酰缓冲液为含有0.5M羟胺、25mM乙二胺四乙酸EDTA的PBS缓冲混合溶液，pH7.2-7.5；
7）磁颗粒表面功能化修饰蛋白质：将步骤4）得到的磁颗粒，加入步骤6）中处理得到的蛋白溶液，反应一段时间，利用磷酸盐缓冲液，清洗磁颗粒，4摄氏度保存备用；所述蛋白溶液浓度为1-40μg/mL，反应时间为0.5-3h。
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