JP2001506587A

JP2001506587A - 安定微粒子および超音波コントラスト剤としてのその使用

Info

Publication number: JP2001506587A
Application number: JP51866898A
Authority: JP
Inventors: ロールマン，ロルフ; リーゴレック，ブレント
Original assignee: モレキュラーバイオシステムズ，インコーポレイテッド; ロールマン，ロルフ; リーゴレック，ブレント
Priority date: 1996-10-17
Filing date: 1997-10-17
Publication date: 2001-05-22
Also published as: CA2268763A1; EP0932419A2; WO1998016257A2; US6083484A; US6193953B1; WO1998016257A3

Abstract

(57)【要約】組織または器官の超音波画像を向上させるのに有用な微粒子は、生体適合性の皮革化されたタンパク質のシェルによってカプセル化された液体および／または気体コア材料からなる。これらの安定化された微粒子は、超音波イメージング剤として有用であり、インビボイメージングのための官能基化微粒子のさらなる製造にさらに有用である。特に、抗体または他のリガンドなどの標的化分子は、安定化された微粒子の強化外面に付着して標的特異性を微粒子に与え得る。標的化分子はまた、外面に親水性を提供し得、それによって微粒子の再循環時間を増加させる。標的化分子は、微粒子の外面に直接付着され得るか、またはそれ自身が親水性であり得る二官能性スペーサアームを介して付着され得る。標的特異的微粒子は、静脈注射され、標的部位に蓄積することができ、標的組織または器官の超音波画像を向上させるのに使用される。

Description

【発明の詳細な説明】安定微粒子および超音波コントラスト剤としてのその使用関連出願に対するクロスリファレンス本出願は、１９９６年１０月１７日に提出された米国特許シリアル番号第０８／７35,594号の一部継続出願であり、その明細書の全文は本明細書に援用する。技術分野本発明は、超音波コントラスト剤の分野に関する。より詳細には、本発明は、超音波コントラスト剤として使用できる安定化微粒子の生産に関する。超音波コントラスト剤は、微粒子形成に続いて「皮革化された(tanned)」外部表面を有するタンパク質の(protenaceous)材料のシェルによってカプセル化された気体および／または液体の微粒子の懸濁液からなることを更に特徴とし得る。背景技術診断上の超音波イメージングは、音エネルギーの波長が目的の領域に焦点を合わされ、そのイメージを生成するように反射されるという原理に基づく。超音波トランスデューサはイメージされるべき領域の上に横たわる身体表面上に置かれ、音波の形態の超音波エネルギーがその領域に向けられる。超音波エネルギーが身体を通過する際、エネルギーの速度および体組織の音響効果ならびにエネルギーが衝突する物質が、超音波エネルギーの吸収、散乱、伝達、および反射の度合いを決定する。次いで、トランスデューサは反射された超音波エネルギーの量および特徴を検出し、そのデータをイメージへと翻訳する。超音波が１つの物質から別の物質へ移動する際、ある程度の反射が界面に存在する。反射の程度は界面を規定する物質の音響効果に関する。これらの音響効果が異なる場合（液体−固体、または液体−気体界面など）、反射の程度が増強する。この理由から、気体を含むコントラスト剤は、超音波を反射するのに特に効率的である。よって、このようなコントラスト剤は、衝突される物質の反射率の度合いを増強し、超音波イメージの鮮明度を高める。 OphirおよびParkerは、２種類の気体含有イメージング剤を説明している：（１）遊離気泡；および（２）カプセル化された気泡(Ultrasound in Medicine and Biology 15(4):319-333(1989))であり、後者は、前者を用いる際に遭遇する不安定性および毒性の問題を克服する試みで開発された。以後「マイクロスフィア(microsphere)」と呼ぶカプセル化気泡は、タンパク質または他の生体適合性材料のシェルによって包囲された気体のマイクロバブル(microbubble)で構成される。このようなイメージング剤の１つは、空気で充填したアルブミンマイ go,California)である。マイクロスフィアは、本明細書で「微粒子」と呼ばれるイメージング剤のより広い分類の一部であり、シェルによってカプセル化された気体および／または液体の導管をくり抜くことを意図する。一般に、タンパク質のシェルで覆われたマイクロスフィアの形態の特定の気体の微粒子は、同一の気体の遊離気泡と比較すると改善されたインビボ安定性を示す。しかし、タンパク質のシェルで覆われたマイクロスフィアのほとんどは、コントラスト剤としての有用性を成すインビボ半減期が未だに比較的短い。このインビボにおける不安定性は、マイクロスフィアからの気体の迅速な拡散による圧力下でタンパク質のシェルが圧壊するまたは分解することに起因すると考えられた。よって、界面活性剤でタンパク質シェルをコーティングしたり(Giddy，WO 9 2/05806)、タンパク質反応性アルデヒドでタンパク質を結合したり(Feinsteinらによる米国特許番号第4,718,433号および第4,774,958号)、共有結合的にタンパク質シェルを架橋したり(HolmesらによるWO 92/17213)、およびタンパク質シェルをイオン的に架橋したり(KlavenessらによるWO 95/23615)するなど、最近の労力はインビボ圧力安定性を増加することによってタンパク質シェルを改善することを中心としている。空気で充填されたマイクロスフィアがインビボにおける注入および循環の間に遭遇するような１５０ｍｍＨｇの圧力変化に供されたときにエコー発生性を迅速に失うことを示す（N.deJongらによるUltrasound Med．Biol．19:279-288，199 3.）ことから、マイクロスフィアを安定させる努力は空気以外の気体を使用することも含む。米国特許第5,413,774号は、マイクロスフィアの圧力抵抗は、Ｓ_gas ／√ＭＷ_gas≦０．００３１を有する気体の少なくとも一部を用いる事によって改善され得ることを示す。ここで、Ｓ_gasは気体の水溶性であり、ＭＷ_gasは気体の平均分子量である。１９９５年１２月１日に発行されたＰＣＴ出願WO95/01187は、カプセル化された気体が完全に水溶性気体である、熱不溶化された膜発生性(filmogenic)タンパク質によってカプセル化された気体の圧力安定性マイクロスフィアを記載している。具体的に述べられた気体の一部は、ペルフルオロアルカンＣＦ₄、Ｃ₂Ｆ₆、Ｃ₃Ｆ₈、およびＣ₄Ｆ₁₀である。これらのマイクロスフィアは、タンパク質の水溶液および不溶性気体の混合物を、酸素のない状態で超音波または機械キャビテーションに供し、混合物を雰囲気から閉鎖された超音波処理器／ミルで超音波処理またはミリングすることによって形成される。カプセル化された気体はマイクロスフィアの安定性を決定する重要な要因ではあり得るが、微粒子シェルの組成および可撓性も同等に重要である。インビボ安定性に対する影響に加えて、シェルの組成は、形成後の更なる処理、すなわち「ポストプロセシング」に耐える微粒子の能力に大きく影響する。これは、殺菌およびパッケージングなど所定の製造手順および追加の化学的操作を含み得る。例えば、形成の後に、微粒子に抗体などの標的化部分を付加するために必要な化学的工程を実施することが所望であり得る。治療学的または治療上の薬剤を特定の組織または臓器に標的化(target)させ、このような薬剤の有効性を高めることが当該技術で周知である。抗体は細胞傷害性薬剤または検出可能標識を癌に標的化させるために広範囲に用いられている。たとえば、様々な癌の種類に対して放射標識された抗体を利用する放射免疫検出法は、癌性組織の検出およびイメージに利用されている。同様に、リシンなどの毒素は、癌に特異的な抗体に結合され、癌特異的抗毒素を生成する。また、抗体はリポソームおよびアルブミン粒子などの粒子材料に結合される。この件について、米国特許番号第5,216,130号はデキストランスペーサアームを介してIgGに結合されたTc-99m標識アルブミンマイクロスフィアを記載している。抗体に加えて、特定の細胞型上のレセプタに特異的である別のリガンドがこのような細胞に対して薬剤を標的化させるために用いられる。例えば、肝細胞が、オリゴ糖連鎖がβ連結されたガラクトースまたはＮ−アセチルガラクトサミン末端を有する糖タンパク質に対する形質膜レセプタを所有することが公知である(A shwell，GらによるAdv．Enzymol．44:99(1974)およびAnn．Rev．Biochem．51 53 1(1982))。表面がガラクトシル化またはアラビノガラクタンでコーティングされたリポソームおよび磁気粒子は、肝細胞特異性を与える。このような磁気粒子は、肝臓をイメージングするためのＭＲＩ剤として有用であることが示されている (Josephson，LらによるMag．Res．Imag．8:637-646(1990))。アシアログリコプロテインもまた、遺伝子を肝細胞に標的化させるために遺伝子と接合される(PCT /US 92/03639)。イメージング剤として用いられる気体および／または液体で充填された微粒子に抗体などの機能成分を付着することが前に記載されてきたが（例えば、ＰＣＴ出願WO 95/01187を参照）、このようなタンパク質のシェルで覆われた微粒子は、インビボイメージング剤として用いるためにいままで首尾良く製造されていない。これは、このような付着を形成するために必要な物理的および化学的条件に耐えることの不可能な微粒子シェルの脆弱性に一部起因する。さらに、このような努力は、再循環する能力に欠けるシェルに終わっている。よって、本発明の目的は、皮革化タンパク質シェルを有する非毒性微粒子を提供することである。このような安定化されたタンパク質のシェルで覆われた微粒子は、毛細血管系を介して移動可能な可撓性シェルを有するインビボイメージング剤として有用であり、機能的微粒子の生産の中間体として機能し得る。本発明の更なる目的は、これらの安定性微粒子の形成のためのプロセス、およびこれらの安定性微粒子を利用して機能成分を付着された微粒子の形成のためのプロセスを提供する事である。本発明の開示本発明は、金属塩溶液を用いて皮革化されたシェルを有する安定化マイクロスフィアを提供する。特に、本発明は、気体および／または液体コアおよび安定化シェルを含む生体適合性マイクロスフィアを生成するプロセスのために提供する。シェルは、頑丈であるが可撓性であることによって、インビボおよびインビトロ安定性を大いに高め、化学的および物理的後処理に耐える能力を増加し、熱殺菌に耐える性能を可能にすることを特徴とする。プロセスは、金属塩溶液を用いた皮革化方法でタンパク質の微粒子調製物に実施される。好適な金属は、クロム、ジルコニウム、チタン、およびアルミニウムである。所与の時間にわたって望ましい皮革化の量を達成するためにはプロセスパラメータは変化し得る。皮革化度は、金属塩の濃度、期間、および反応温度に依存する。金属塩溶液の好ましい濃度は、概して、１〜３０ｍＭであり、約１６０℃までの温度で数分から数時間以上の範囲である。皮革化されたマイクロスフィアは、シェルを親水性化(hydrophilize)および／または成分を付着させるために更に処理され得る。親水性官能基部分は、例えば、多糖体、ＰＥＧ、およびペプチドを含み得る。標的化部分は、皮革化された微粒子シェルに付着され得る。標的化部分は、肝臓の肝細胞、特定の癌、および別の組織および／または臓器を含む血管内または血管外標的に対する特別な親和性を有し得る。これらの標的化剤は、静脈内、直腸内、または膣内を含む任意の適切な方法で投与され得る。標的化部分のいくつかは、治療上の標的化ツール、および治療的送達ビヒクルとしての二重目的を果たし得る。二官能性スペーサアームもまた、シェルの外部表面および標的化部分に付着するために利用され得る。得られる微粒子調製物は、非毒性であり、毛細血管系を介して移動することが可能である。向上した安定性は、特定の部位に蓄積しイメージングおよび潜在的な治療的送達を改善させる能力をもたらす。更に、微粒子の長寿命は臓器灌流研究を実施する能力を援助する。図面の簡単な説明図１は、様々なマイクロスフィア調製物のインビトロ安定性を示す。図２は、活性化ＰＥＧの一般式を表す。図３は、皮革化された微粒子の表面に、官能基部分を付着させるための、様々な付着プロトコールのフロー図を示す。発明の実施のための最適な様態本発明の安定化微粒子は、外面が皮革化されたタンパク質性のシェル(shell) を有することを、特徴とする。これは、金属塩を用いて、表面に露出したアミノ酸のイオン化されたカルボキシル基と架橋リガンドとの間に、多核配位錯体(pol ynuclear coordination complex)を形成することを指している。皮革化法は皮革産業において広範に使用されているが、インビボ剤製造におけるその用途は今まで発見されていなかった。この方法を既存の微粒子調製物に用いると、インビボ寿命が増大し、殻部の弾性を維持しながら過酷な熱および化学的後処理反応に耐えることのできる、生体適合性の超音波イメージング剤が得られる。皮革化された微粒子は非毒性である。例えば、分離されたマイクロスフィアの誘導結合プラズマ発光分光法(ICP)に基づいて、典型的な皮革化微粒子調製物は、マイクロスフィア懸濁液のmL当たり約４５μgの結合した３価クロームを含むと見積もられる。金属含有量は可変であり、皮革化処理のパラメータに依存する。マイクロスフィアが代謝される際、結合したクロームは血流中に放出される。血液はクロームに高い結合能力を有しており、クロームは血清タンパク質に結合する。クロームは必須ミネラルであるため、米国食品栄養委員会(U.S．Food and Nutrition Board)は、安全かつ十分な、１日当たりにつき食品を介して50〜200 μgのクロームを摂取することを奨励している。クロームは通常腎臓を通して急速に排泄され、排泄の一部は胆管系を介してなされる。これらの安定化微粒子は、超音波イメージング剤として有用であり、さらには官能基化微粒子の製造において有用である。「官能基化微粒子」とは、外面に付着した官能基部分を有することによって特徴付けられる。「官能基部分」とは、インビボにおける微粒子の生物学的相互作用を変化または増進させる役割を果たす、化学的部分または置換基を意図している。インビボにおける再循環時間を増大するために、親水性官能基を付着することにより安定化微粒子を官能基化してもよい。このような微粒子を本明細書において「親水性微粒子」と呼ぶ。あるいは、皮革化された微粒子を官能基化することにより、特定の組織または器官に対して特異的にされ得、この場合官能基部分は標的化部分である。このような微粒子を本明細書において「標的特異的微粒子」と呼ぶ。好ましくは、安定化微粒子は、同じまたは異なる官能基化部分を付着することで親水性且つ標的特異的にすることにより、官能基化される。本発明の微粒子は、シェルに封入されたコア材料を有する。コア中の材料の性質（すなわち気体および／または液体）およびシェルの剛性に依存して、微粒子は概して球形であってもよく、あるいは、不規則な非球形形状を有していてもよい。インビボでの超音波コントラスト剤としての使用のために、微粒子はまた、非毒性、エコー反射性、および小さな血管を通るのに適した大きさおよび可撓性でなければならない。一般に、微粒子は0.1μから10μの平均直径を有する。脈管内標的に対して特異的である標的特異的微粒子は好ましくは、平均直径が＞１μ であり、より好ましくは２〜５μである。脈管外標的に対して特異的である場合は、好ましくは平均直径＜１μである。コア微粒子コア材料は、「気体および／または液体」であり、これは、気体、液体、気体混合物、液体混合物、または気体（単数または複数）と液体（単数または複数）との混合物を包含することを意図している。適切なコア材料は薬理学的に受容可能すなわち生体適合性であり、毒性が最低限であることも必要である。そのような適切なコア材料の例は当該分野において周知である。例えば、インビボイメージング剤として気体の微細気泡を使用することを開示する、米国特許第5, 409,668号を参照のこと。これらのうち任意のものが、本発明におけるコア材料として用いられ得る。一般に、適切なコア材料は、３つのカテゴリーに分類され得る。すなわち、１）空気、二酸化炭素、窒素、酸素、一酸化二窒素、ヘリウムまたはアルゴンなどの水溶性気体；２）６フッ化硫黄またはペルフルオロプロパンなどのペルフルオロアルカンなどの水不溶性気体（標準的な条件下において水の１mL当たりにつき0.01mL未満の溶解性を有する）；および３）ペルフルオロペンタンまたはその他のハロゲン化炭化水素などの、生理学的温度未満の温度においては液体である化学物質である。特に好ましいのは、気体−液体混合物である。例えば、空気またはペルフルオロプロパンなどの低沸点（気体状）ペルフルオロ炭素と、ペルフルオロヘプタンなどの高沸点（液体）ペルフルオロ炭素との混合物である。これらの気体−液体混合物は、マイクロスフィアのシェル内に疎水性障壁を提供し、これは、マイクロスフィアと周囲の水性環境と間での気体交換の速度を減少させる。例えば、同時係属中の米国特許出願第08/660,480号を参照せよ。シェル微粒子の外面はタンパク質性の殻で規定されているため、「タンパク質殻微粒子」と呼ぶ。タンパク質性の殼を形成する材料は、天然に生じる膜形成性(filmo genic)タンパク質、組換えDNAを包含する方法によって形成されたタンパク質、および化学合成されたタンパク質および、アミノ酸ポリマーの両方を包含し、これらを本明細書において「タンパク質」と総称する。適切なタンパク質は「膜形成性」でなければならない。つまり、タンパク質が不溶化された際にコア周辺にシェルまたは膜を形成する能力を有する、可溶性タンパク質を意図している。天然に生じるタンパク質の例としては、ガンマグロブリン（ヒト）、アポートランスフェリン（ヒト）、β−ラクトグロブリン、ウレアーゼ、リゾチーム、およびアルブミンが含まれる。ヒト血清アルブミンは、好ましいシェル材料である。本発明において有用な化学合成されたアミノ酸ポリマーは、オプションとして、同じまたは異なるアミノ酸鎖中に疎水性アミノ酸と親水性アミノ酸との両方が組み合わさった、ブロックまたはランダムコポリマーの形態であり得る。安定化微粒子は、外面が皮革化されたタンパク質性シェルを有することをさらに特徴とする。「皮革化」とは、硫酸クロム(III)カリウムなどの金属塩を使用して、表面に露出したアミノ酸のイオン化されたカルボキシル基と、ヒドロキソル(hydroxol)基、オキソ基、およびスルファト基などの架橋リガンドとの間に、多核配位錯体を形成することを指す。微粒子を皮革化するための他の塩、例えばジルコニウム、チタニウム、およびアルミニウムの硫酸塩なども用いられ得る。従って、適切なシェル材料はまた、微粒子の表面上に遊離カルボキシル基を示し、そのような配位錯体を形成する能力を有さなければならない。皮革化されたマイクロスフィアは、より強く且つ可撓性のシェルという、素晴らしい性質を示す。シェルの増大した強度のため、一旦体内中に導入されると、より長く耐え残ることが可能になる。シェルの可撓性性質は、毛細管系の通過を可能にする。さらに、皮革化されたシェルは、過酷な後処理熱および化学反応を可能にする性質を付与する。このことにより、マイクロスフィア調製物が、さらなる寿命および／または標的化能力を生むように、さらに改変され得る。さらに、これらの熱安定性マイクロスフィアを劣化を起こすことなくオートクレーブ中において約120℃で滅菌し得ることが、考えられる。金属安定化を前もって行わない場合、マイクロスフィアは７５℃を越える温度において不可逆的に損傷を受ける。タンパク質のシェルを有する微粒子の製造タンパク質のシェルを有する微粒子は、任意の公知の方法によって作製され得る。例えば、同時係属中の米国出願第08/662,983号またはPCT第WO 95/01187号に記載されるように、熱不溶化タンパク質の水溶液と気体または液体蒸気との混合 olecular Biosystems，Inc.、San Diego、CA）などの任意の適切な市販のタンパク質性微粒子調製物を用い得る。皮革化処理従来の微粒子のシェルは、シェルを酸性金属塩溶液で皮革化することにより、安定化および強化される。好ましくは、金属塩は、皮革の皮革化処理に典型的に用いられるものである。最も好ましいのはクロームである。皮革化法は皮革産業において広範に使用されている。例えば、Elvers，B．ら、Ullmann's Encyclope dia of Industrial Chemistry、第５版、A15:268-274（VCH Publishers、New Yo rk、1990）を参照のこと。しかし、タンパク質性のインビボ調製物の安定化における金属塩の使用は、この処理の新規な用途である。処理期間は、使用される温度に依存して、ほんの数分間から、数時間以上であってもよい。処理は、処理は、室温または処理を速めるために昇温（例えば85〜 160℃）で行われてもよい。シェル材料の分裂(disruption)を避けるために、手順は、チャンバのヘッドスペース中で発達した圧力が、微粒子のシェル内の増大した圧力とバランスを釣り合うような、閉じた系の中で行われる。処理は、タンパク質シェルが凝集(clump)してしまわないように常に撹拌しながら行われる。撹拌は、処置されたマイクロスフィアが冷めるまで続けられる。回収のためのマイクロスフィアの分離を速めるために、低速遠心分離を用いてもよい。微粒子を回収し、緩衝液をオプションとして含有してもよい水溶液（例えば水または食塩水）を用いて繰り返し洗浄する。水溶液はさらに、マイクロスフィアのコア材料中に存在するものと同じ気体および／または液体で飽和されてもよい。得られる金属含有量は、ICPまたはその他の適切な方法で決定される。温度、金属濃度、および皮革化処理期間に依存して、皮革化されたシェルの金属含有量は変化し得る。当業者であれば、所望の特定のアプリケーションに必要とされる皮革化の程度を決定し得る。例えば、標的特異的な微粒子は、器官灌流研究に用いられる微粒子に比べて、より高度の皮革化を必要とするであろう。得られる結合した金属含有量は、マイクロスフィア懸濁液の約0.1〜100μg/mである。これらの最終含有量は、約１〜30mMの金属塩溶液の初期濃度を用いることによって得られ得る。再循環皮革化マイクロスフィアは、インビトロおよびインビボの両方において、その増大した安定性および寿命によって区別され得る。表１および表２は、それぞれさらに実施例１０および１１において説明される、シェルの皮革化有りまたは無しで様々なマイクロスフィア調製物を用いた、インビトロおよびインビボ実験を示している。これらの実験の結果を検討することにより、当業者は、インビトロおよびインビボの両方における金属処理の実質的な安定化効果を理解することができる。さらにこれらの結果は、疎水性コアとともに用いられた際における、クローム処理されたシェルの相加効果を示している。１連続的な超音波処理システムによって作製されたマイクロスフィア（別途記載がある場合を除く）。２機械的キャビテーションによって作製されたマイクロスフィア。３括弧内の数字は、気体のバブリング中において疎水性化合物が維持された槽温度である。肝臓のクップファー細胞によるファゴサイトーシス(phagocytosis)を介した細網内皮系（「RES」）による取り込みは、粒子状物質(particulate matter)が循環し続ける期間の長さを短縮する。特に標的特異性微粒子(target-specific mic roparticles)は、微粒子が目指す標的に蓄積される機会を有するように、循環中安定でなければならない。超音波コントラスト剤としての微粒子の効率は、シェルを皮革化し、且つＲＥＳによる識別(recognition)を防止する粒子表面に官能基を加えることによって循環時間を増加することにより向上され得る。リポソームまたはコロイド状粒子等の粒子状物質が、粒子表面上の負電荷の立体遮蔽(steric shielding)によりＲＥＳに対して不可視にされ得ることが示されている(Lasic,D.D．ら、Biochim．Biophys．Acta 1070:187−192(1991))。このような遮蔽が、粒子状物質がＲＥＳによる従来のリポソーム除去の原因であると考えられるオプソニン、プラズマタンパク質と相互作用するのを妨げる。微粒子の遮蔽が親水性官能基部分を用いることにより達成され、「親水性微粒子」を形成し得る。これにより微粒子は、静脈内投与に続く延長された期間の間、循環し続けることができる。好適な親水性官能基部分は、多糖類、ポリエチレングリコール(PEG)およびペプチドを含むが、これらに限らない。標的特異性微粒子は標的に到達し且つ蓄積されるのに充分な時間、循環し続ける必要があるために、微粒子の外表面は好適には中性または親水性である。標的部分自体が親水性であるかまたは標的化部分が親水性スペーサーアームによって取り付けられる場合、分離親水性部分または親水基で微粒子外表面を必ずしも更に親水性化しなくてもよい。標的化部分がそれ自体親水性でない場合、標的化部分および親水性分子が独立して微粒子の外表面に付加され、微粒子を標的特異性および親水性の両方にし得る。親水基を微粒子の表面に付加するのに使用される典型的な化学反応は、有機溶媒、ならびに温度、ｐＨ、およびイオン強度の極限、ならびに反応チャンバ内での機械的混合の厳しさ(rigor)への曝露の間に、粒子が気体／液体のコアを保持できることを要求する。これらの理由から、皮革化微粒子の安定性が向上することにより、表面親水基を追加するための基材として提供されるのに、非皮革化微粒子よりもはるかに適していることが理解され得る。非皮革化微粒子は、所望の反応条件の非常に限られた部分にだけ耐え得る。官能基部分の付加官能部分は、多岐に亘る公知の化学反応のいずれかを用いて、安定化タンパク質の殻を持つ微粒子(stabilized protein-shelled microparticle)に付加され得る。例えば、スクシンイミジルエステル基は、アミノ基と反応した場合にアミド結合を形成する。他の例を表３に示す。任意の方法の選択(preference)は、標的化部分の性質（溶解度、他の反応基の存在等）および特定の付加部位によって決定される。選択された方法が官能基部分をほとんど妨害しないまたは破壊しないこと、つまりこれは標的化部分が標的組織／器官と共に複合体を形成する能力を喪失することを意味するが、このこともまた重要である。標的化部分を、結合剤またはスペーサーアームによって、安定化された微粒子の外表面に付加することもまた可能である（例えば、米国特許第5,225,182号参照）。スペーサーアームは更に二官能性であり得る。本明細書中では、「二官能性」という用語は２つの異なる端部を有する分子を指し、それぞれが結合反応において使用される異なる官能基を有し、一方の端部は微粒子の外表面上の官能基に付加するのに使用され、他方の端部は標的化部分の官能基に付加するのに使用される。標的化部分の官能基は保護基によって保護され得、標的化部分の脱保護および付加が続く。スペーサーアームは生体適合可能(biocompatible)で、且つ、標的化分子に立体的に自由な結合部位を提供せねばならない。スペーサーアームはまた、親水化剤(hydrophilizing agent)としても機能し得る、または微粒子外表面の親水性が上記の別の分子によって提供され得る。好適には、スペーサーアームの長さは２０Åよりも長い。更に、スペーサーアームは、結像剤(imaging agent)の調製に含まれる化学的操作による切断に対して耐性を有さねばならず、且つ、微粒子の注入中および循環中に発生する剪断力に対する耐性も有さねばならない。好適な二官能性スペーサーアームは、ポリエチレングリコール、デキストラン、修飾デンプン、キトサン、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、ポリビニールアルコール、およびポリアクリル酸、またはこれらの分子のいずれかの誘導体を含むが、これらに限定されない。PEGはスペーサーアームとして最も好適である。皮革化微粒子に関する他の方法皮革化タンパク質性微粒子の外表面上には更に数多くの反応基が存在する。それらは主にカルボキシル基およびアミノ基からなる。必要であるなら、安定化された微粒子は、水溶性カルボジイミドの存在下で、スペルミン、ポリリジン、またはポリアリルアミン等のポリアミンで、６から８のｐＨ範囲で６時間から２４時間かけて前処理され、ポリアミンの共有性付加によってシェル表面のアミン濃度を増大する。同様の条件下で、クエン酸、ポリグルタミン酸、またはポリアクリル酸等のポリカルボキシル酸もまた、シェル表面上のカルボキシル密度を増大させる目的で、微粒子上の遊離のεアミノと反応し得る。いずれの場合においても、簡単な洗浄および遠心分離によって、異なる表面特性を有する微粒子が提供される。リガンドを微粒子表面に結合するために、カルボキシル基（例えば水溶性カルボジイミド）を活性化させ、そしてリガンドをポリエチレングリコール（PEG）のアミン誘導体等の求核試薬と反応させて安定したアミド結合を得るか、またはリシンの遊離εアミノ基と反応し得る活性PEG誘導体（集合的に「PEG化」(PEGyl ation)と呼ぶ）を用いる。考え得る選択される反応性PEG誘導体は多数ある（図２参照）。端部の１つがスクシンイミジルエステル(succinimidyl ester)等の活性エステル基またはスクシンイミジルカルバマートエステル(succinimidyl carb amate ester)であるPEG誘導体が好適であり、どちらもアミノ分解を経て、それぞれ安定したアミド結合またはウレタン結合を提供する。別の好適な選択肢は、トレシルエステル(tresyl ester)またはエポキシド等のアルキル化する特性を有するPEG誘導体を用いることである。これらの薬剤は、PEGylation処理の間、微粒子表面上の一級アミンを二級アミンに変換することによって、微粒子の正味表面電荷を保護するという利点を有する。図２は、異なる活性端部を有するPEG誘導体の構造を示す。ＹおよびＺの任意の組み合わせが、標的特異性を有するまたは有さないPEG化微粒子の製造に有用である。単官能PEG(Z=1or2)が、中性で親水性の層で微粒子を取り囲むのに使用される。このような粒子はRESによって検知されにくく、且つ循環時間が長い。標的特異的なリガンドを付加するこのアプローチは、例えば血清アルブミン由来の微粒子等の、実質的に遊離のチオール基を欠いたタンパク質に特に適合させられる(tailored)。アルブミンに含まれる３５個あるシステイン基のうちの３４個がジスルフィド架橋によって互いに結合されるので、血清アルブミン由来の微粒子はその表面上に実質的に遊離のチオール基を有さない。しかし、遊離のアミン官能基は多数存在する。従って、本発明者らの好適なアプローチの１つは、Ｙがアミン選択性である活性エステルまたはアルキル化部分(alkylating moiety) であり、且つＺがチオール選択性基であるヘテロ官能PEGを選択することである（図２：Z=3，4，5または6)。これらのヘテロ官能PEGのいくつかが市販されている(Shearwater Polymers，Inc.，Huntsville，AL)。他のヘテロ官能PEGも、当業者が公知の方法を用いて容易に合成され得る。他の付加方法前述の、皮革化微粒子に官能基部分を付加する方法は、多くの応用に適しているが、特別な結合技術を用いることが望まれる状況がある。例えば、結合効率を最大化しコストを最小化する技術、または２つ以上の異なる官能基部分の簡便な結合を可能にする技術を用いて官能基部分を付加することが望まれる場合がある。上で述べたように、皮革化された微粒子の外表面上の利用可能なアミノ基に官能基部分を付加することが可能である。活性エステルを含む官能基部分をこれらのアミノ基に付加することの１つの欠点は、結合処理中に活性エステルが加水分解されやすいことであり、このことが原因で、結合効率が制限される。更に、ポリエチレングリコール−ペプチド複合体等の比較的官能基部分の大きな活性エステルは、立体障害のために、表面露出アミノ基と反応可能でなくてもよい。従って、皮革化された微粒子の表面に付加する他の方法を利用することによって結合効率が向上され得る。図３に示すように、クロム処理の後、（図３の上部に示す）得られた皮革化微粒子は、表面露出クロム、ジスルフィド基およびアミノ基を含む。表面露出クロム、ジスルフィド基およびアミノ基は、以下に説明する様々な化学反応から得ることができる。媒染染料皮革化処理の結果、微粒子の外部表面にクロムがまた存在する。この表面に露出されたクロムは、「金属固着」（ｍｅｔａｌ−ｆｉｘａｔｉｏｎ）機構を通して、標的特異的リガンドなど官能部分が付着される新しい（ｄｅｎｏｖｏ）サイトとして使用され得る。本発明の皮革化された微粒子にそのような付着を行うために、本願発明者は、通常繊維産業と関わりのある複合体化機構を使用し得ることを発見した。クロム染料は、長い間羊毛染色産業において使用されてきた。クロム染料は、繊維に良好な一般的な色固着特性を提供する。いわゆる「媒染染料」はクロム染料の１つのサブグループであり、クロム処理された後の繊維に適用される。複合体の形成は、通常電子ドナーの関与下での酸性の媒体において、染色処理の間に発生する。複合体の中心原子であるクロムは、染料と繊維との間を連結するものとして機能する。これにより強力な結合が生じ、織物に適用された場合に得られる、卓越した、色固着に反映される。染料は、最適な官能基を含む必要がある。続いて、ＣＯＯＨ内のＨまたはＯＨ基の置換によって、そして−（Ｃ＝Ｏ）−、−ＮＨ₂などからの孤立電子対を介して、Ｃｒ³⁺の結合が発生する。この原理は、クロム処理されたタンパク質の微粒子に、媒染特性、すなわちクロムをキレート化する能力を有する末端基を介して、クロムに複合体化された官能部分を付着するために適用され得る。そのような末端基は、例えば、サリチル酸またはアリザリン系化合物であり得る。実質的には、そのような特性を有する任意の化合物が使用され得、当業者には周知である。しかし、クロム−キレート複合体の安定性が、タンパク質−クロム複合体の安定性より大きくないことが重要で、そうでなければ、反応の間にクロムが微粒子表面から剥離されてしまう。この付着の方法を使用することで、本明細書中に記載される任意の官能部分、特に標的化部分やポリマー（合成親水性ポリマー、多糖、タンパク質など）との安定した結合を形成することが可能となる。そのような安定した結合は、長い有効期間が望ましい特性とされる商業的な使用にむけて、微粒子を調製するために所望される。図３の反応１に、前記付着の方法についての代表的な実施態様が示される。図示されるように、ＰＥＧの付着により、皮革化された微粒子は親水性にされ、したがってインビボでＲＥＳによって検出されにくくなる。同時に、ペグ標的化部分（「ＰＥＧ−Ｔ」）複合体を使用することで、微粒子は標的特異的にされ得る。標的化部分を付着されたアミノ誘導体化ポリエチレングリコール（アミノ−ＰＥＧ−Ｔ）は、５−クロロスルホ−サリチル酸と反応され、安定したスルホンアミド結合（Ｒ₂−ＰＥＧ）を形成し得る。次いで、得られたＰＥＧ誘導体は、図３の反応１に示されるように皮革化された微粒子の表面上にクロムを有する、安定した金属複合体を形成し得る、サリチル酸基（Ｒ₂）を含むこととなる。例えば、付着は、高い温度、通常９５℃で、オートクレーブにおいて撹拌されて達成され得る。チオール結合官能基の付着サイトとして、皮革化された微粒子の表面上の既存のジスルフィド基を利用することも可能である。図３の反応２に示されるように、２−メルカプトエタノールやジチオスレイトールなどの一般的な還元剤を使用することで、ジスルフィド結合は還元される。好ましい還元剤は、トリス（２−カルボキシエチル）ホスゲン（ＴＣＥＰ）である。還元処理の間、クロム処理された微粒子は安定している。過剰の還元剤が除去され、得られた微粒子は、酸素の存在しない状態において洗浄される。得られたチオール基は、アルケンまたはアルキン基のヒドロアルキルチオ付加に関与し得る。例えば、ビニルスルホンまたはマレイミド基（Ｒ₁）は、ｐＨ７の非常に緩やかな条件における、スルフヒドリルとの反応に対して、非常に選択的であることが公知である。水中における、より大きな加水分解安定性のため、マレイミドよりビニルスルホンが好ましい。付着条件において加水分解の影響を受けやすい、活性エステル変性ＰＥＧと比較して、そのような安定性は明確な利点を有する。それにより、非常に安定なチオエーテル結合を介して、ビニルスルホン誘導体化ＰＥＧペプチド結合体（Ｒ₁−ＰＥＧ−Ｔ）が微粒子の表面に効率的に付着され得る（図３の反応２）。付着工程が完了した後、未反応のチオール基が酸化され、緩やかな酸化条件のもとでジスルフィド結合を形成する。ビニルスルホン基は、ハイドロアミノ付加を経るという更なる利点を有する。したがって、ビニルスルホン基は、アミン基とｐＨ９−１１でゆっくり反応する（図３の反応３）。これにより、Ｒ₁−ＰＥＧ−Ｔはチオール基に付着するのみでなく、ある程度において、アミノ基へも付着する。これは、一方は中性のｐＨにおいて反応し、チオール基に付着する部分、他方はより高いｐＨにおいて反応し、アミノ基に付着する部分といった、２つの異なるビニルスルホン活性化官能部分の結合を可能にする。また、アミノ基を予めチオール化することで、更なるチオール基を微粒子の表面に導入し得る。図３の反応４に示されるように、イミノチオラン（「Ｔｒａｕｔ試薬」、「Ｉ」）などのチオール化剤に微粒子をさらすことで、チオール基が導入され得る。続いて、微粒子表面の既存のジスルフィド結合は、図示されるように、酸性条件下、ＴＣＥＰ（「Ｈ」）により還元される。次に、図３の反応５に示されるように、チオールに変換されたアミノ基、および還元により形成された既存のチオール基の双方に、Ｒ₁−ＰＥＧ−Ｔが付着され得る。ビニルスルホン−ＰＥＧ誘導体は当業者によって容易に作製され得、例えば、適切な末端を有するＰＥＧ誘導体に、ビニルスルフォニルプロピオン酸を付着することで作製され得る。市販のビニルスルホニルＰＥＧおよびマレイミドＰＥＧがＳｈｅａｒｗａｔｅｒＰｏｌｙｍｅｒｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬから入手可能である。標的特異性本発明の安定化された微粒子は、「標的特異性」とするために更に官能化され得る。本発明の安定化された微粒子は、それらの増強された強度が熱安定性および厳しい化学後処理を可能にし、また標的に到達し、蓄積するのに必要とされるインビボでの長寿を微粒子が有することを確実にするため、標的特異性な微粒子の製造のために特に最適である。静脈投与された標的特異的微粒子がこの目的を達成するために、循環系において遭遇する物理的な力に対抗し、生理学的条件況において、化学的、生物学的安定性を示す必要がある。標的組織／器官の超音波画像の所望の増強のために、インビボで、標的特異的微粒子が十分な時間持続される場合、その微粒子は「安定」していると見なされる。標的特異的微粒子は、標的の細胞の種類、組織、または器官に対して優先的な親和性を有することで更に特徴づけられ、標的特異的微粒子は標的との複合体の形成を行い得、それにより、必然的に、循環系内に留まらずに標的の組織／器官の中、または付近に蓄積される傾向の増進を生じさせる。標的内またはその付近での蓄積の速度、および程度は、背景の反射率、すなわち「ノイズ」から区別するために十分な超音波の反射率、すなわち「信号」を提供するに足りるものでなければならない。「標的組織」または「標的器官」とは、細胞表面または細胞外のマトリクス材料に局在化されたタンパク質、炭水化物、糖タンパク質、または糖脂質などの特定の標的特異的置換基の存在によって、非標的組織／器官から同定され、差別化され得る、体内の任意の構造または部位である。標的として最適であるためには、これらの標的特異的置換基が特定の標的部分によって選択的に識別され得る必要がある。標的組織／器官は、血管系の内皮壁内に含まれ得（血管内標的）、または血管内皮に限定された領域の外に位置し得る（血管外標的）。適切な血管内標的は、アテローム硬化型プラーク、血栓、および塞栓などの心血管損傷を含むが、それに限定されない。適切な血管内標的の例として、米国特許第５、３６４、６１２号を参照されたい。適切な血管外標的は、肝臓、腎臓胃腸管系路、生殖器官、泌尿器系、乳房、肺、およびリンパ腫、黒色腫、神経膠腫、肉腫、および神経芽腫など、それらのガンを含むが、それに限定されない。特定の標的組織または器官のイメージングのために本発明の標的特異的微粒子が有用であるためには、標的が、循環系を介して、微粒子によってアクセス可能でなければならない。これは、シェルが、毛細血管系内の動作を可能にするような、可撓的性質を維持することを必要とする。現在の医療超音波技術を使用して最も容易に結像可能な寸法範囲（一般的に、１−１０μ）内の微粒子は、血管内の空間に残留する傾向があるので、血管内の標的が望ましい。例えば肝臓および肺臓の毛細血管内皮中における洞様毛細血管の接合部を介して、より小さい（＜１μ）微粒子によってアクセス可能な血管外標的は、静脈投与された微粒子が、意図される標的に到達するために、十分に血管化されなければならない。したがって、固形の腫瘍などの、血管化が不十分になされた、より密な特定の組織は、微粒子によって、比較的アクセスがされ得ない。しかし、血管透過性は血管拡張剤、腫瘍壊死因子、および他の血管作用性の剤によって増進され得ることが周知である。この増進された透過性が、微粒子の、増強された管外遊出に変換される場合、標的化微粒子は、標的の腫瘍細胞へのより良いアクセスを有し、それらと結合する。さらに、他の種類の固形腫瘍は、微粒子によるそれらへのアクセスの容易性を実際には増進させるような、不完全に組織化された脆弱な血管系を有する。標的化部分標的特異的微粒子および標的組織／器官の間の複合体形成は、標的化部分を皮革化処理された微粒子殻の外側表面に付着させることによって達成される。標的組織／器官の標的特異的置換基と安定な鉗体を形成し得る標的化部分を選択する。標的化部分の選択は、錯体を形成する相手となる標的特異的置換基の性質に必然的に依存する。例えば、膵臓β細胞を標的化する場合にはソマトスタチンが使用でき、脳の領域を標的化する場合にはエンドルフィンが使用でき、脂肪細胞を標的化する場合にはインシュリンが使用できる。標的化部分は、特定の細胞表面レセプターに結合するリガンド、または特定の細胞型に親和性を有する抗体等の任意の組織／器官特異的リガンドであり得る。適切なリガンドには、オリゴ糖、多糖、ペプチド、タンパク質、糖ペプチド、糖タンパク質または糖脂質が含まれるが、これらに限定はされない。例えば、肝臓に対して微粒子を標的化するには、肝細胞特異的リガンドが使用され得る。哺乳類肝細胞は、そのオリゴ糖鎖がβ連結ガラクトースまたはＮアセチルガラクトサミン末端を持つ糖タンパク質と相互作用するアシアロ糖タンパク質レセプターをその形質膜上に有する(Ashwell，G．ら、Advantage．Enzymology 41:99(1974)。リポソーム等の粒子の表面にガラクトースが結合している場合、それらの粒子が肝細胞特異的になることが分かっている。アメリカカラマツ（Larix occidental is）から得られる水溶性の炭水化物であるアラビノガラクタンが、肝細胞のアシアロ糖タンパク質レセプターと相互作用することも報告されている(Beuth，J.ら、Cancer Res．Cin．Oncol．113:51-55(1987)。この原理は、アラビノガラクタンでコーティングされた酸化鉄粒子からの肝細胞特異的ＭＲ剤の製造に応用されている(Josephson，L．ら、Magn．Res．Imag．8:637-646(1990)。安定化気体および／または液体充填マイクロスフィアは、アラビノガラクタン層（平均粒径０．１〜１μｍ）でコーティングすると親水性となって肝臓のクッパー細胞に対して不可視となり、同時に肝細胞特異的にもなる。これらの粒子をほとんど液体パーフルオロペンタンで充填することにより、マイクロスフィアは、肝臓のＳ状接合部(sigmoidal junctures)を通過するのに十分に小さくなる。超音波エネルギーを印加することにより、この液体化学物質は体温（〜３７℃）で揮発し、そして、診断的超音波（０．５〜５μｍ）で後方散乱を生じるような範囲の大きさの気体マイクロバブル(gas microbubbles)を生じる。当業者には、様々な他の標的化部分／標的特異的置換基の組み合わせが明白であろう。特定の組織／器官に特異的な抗体もまた、適切な標的化部分として機能し得る。このような抗体はポリクローナルであり得るが、好適には単一特異的であり、より好適にはモノクローナルである。「抗体」とは、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して標的に特異的に結合することができる免疫グロブリン分子である。本願において、この用語は、インタクトな抗体だけでなく、そのフラグメント、その変異体、融合タンパク質、ヒト化抗体、および、必要な特異性を持つ抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の他のあらゆる修飾された立体配置をも包含する。ある抗体が、少なくとも１つの抗原認識部位を介して、所期の標的に対して、別の物質と比べてより頻繁に、より急速にまたはより長時間結合するとき、その抗体を「特異的」であるという。ある抗体が、他の非標的細胞型または抗原と比べてより頻繁に、特定の標的置換基付近に微粒子を搬送(conveys)または保持(re tains)するとき、その抗体はその微粒子を「特異的に送達する」ことができる。適切な抗体は、任意の特定の標的組織または器官に対して特異的な抗原に対する抗体であり得る。例えば、血小板特異的抗体についてはWangら(Nucl．Med．Bi ol 18(3):275-280(1981))、フィブリノーゲンおよびフィブリン特異的抗体についてはBiniら(Arteriosclerosis 9(1):109-121(1989))、フィブリン特異的抗体についてはKnightら(Nucl．Med．Comm．9:823-829(1988))、癌特異的抗体についてはMilenicら（Cancer Res．51:6363-6371(1991)）、腫瘍特異的抗体についてはGoldenbergら（J．Nuclear Med．33(5):803-814(1992)）を参照。標的化部分は、少なくとも２つの異なる実質的に単一特異的な抗体またはそのフラグメントを持つ免疫反応性のマルチ特異的(multispecific)な複合体を含むマルチ特異的な抗体接合体でも構成され得る。好適には、この複合体は、ある種の白血球に特異的に結合する抗体または抗体フラグメント、および白血球、フィブリン、ミオシンまたは血小板等の細胞内標的に関連する抗原に特異的に結合する抗体を含む。このような標的化ツールは、米国特許第5,364,612号に記載されており、アテローム硬化性プラーク(atherosclerotic plaques)等の心臓血管病巣(cardiovascular leslons)、血栓形成または塞栓等の血管血餅(vascular clot s)、および心筋梗塞等の器官梗塞(organ infarcts)を標的化する際に特に有用である。マイクロスフィア抗体複合体が、聴覚式診断剤(acoustic diagnostic age nt)として、および治療的送達剤(therapeutic delivery agent)として両方に使用され得ることも想起されている。上記の標的化部分に加えて、Bioorganic and Medician Chemistry，3(4):337- 360(1995)に記載のようなＲＧＤペプチドを付着させることも可能である。安定化または機能化微粒子の超音波造影剤としての使用法本発明の微粒子は、無菌水性注射可能キャリア(sterile，aqueous，injectabl e carrier)中に懸濁した形態で使用される。このようなキャリアは、薬学処方の分野において周知である。懸濁液中の微粒子濃度は、懸濁媒体１ｍＬ当たり、通常１ｘ１０⁷〜１ｘ１０¹⁰の範囲、より通常１ｘ１０⁸〜１ｘ１０⁹の範囲内である。生理食塩水溶液は好適なキャリアである。無論、微粒子を、上記よりもより濃縮またはより希釈された懸濁液中で保存して、後に注射用に再処方することも可能である。そのような使用法の場合、上記懸濁液を、体重１ｋｇ当たり約０．０５〜０．５ｃｃで末梢血管に注射するか、あるいは、低濃度で持続点滴(continuously in fused)する。他のあらゆる適切な投与経路が許容可能であり、膣内および直腸投与も含まれ得る。標的部位にイメージング剤を蓄積させた後、イメージング対象の組織／器官に超音波エネルギーを印加し、反射エネルギーを収集し、任意の超音波イメージング機器を用いて、これを画像に変換する。これらの様式には、基本的（Ｂモード）イメージング、ドップラーイメージング、３次元イメージング、および高調波(harmonic)イメージングが含まれる。安定化または機能化微粒子のその他の使用法本明細書では、好適な実施形態である超音波イメージングにおける上記微粒子の使用に主に焦点を絞ったが、このような微粒子が、ＭＲＩおよびＣＴイメージング、ならびに治療的用途においても有用であることも理解される。これらの他の使用法では、適切な微粒子コアを含むことが必要になり得る。例えば、そのコア内に、磁気的に等価なフッ索を十分に含む微粒子はＭＲＩに使用でき、そのコア内に、Ｉ¹²⁵等の放射性核種を十分に含む微粒子はＣＴに使用でき、治療的薬剤を十分に含む微粒子は治療的用途に使用できる。本願において使用される用語「十分」は、所望の診断的または治療的効果を得るために必要な量を指す。実施例実施例１：液体充填微粒子の調製２”ガウリンコロイドミル装置(Gaulin colloid mill apparatus)を、ステンレス鋼気体流入ラインおよびステンレス鋼液体流入ラインと接続(plumbed)した。流入タンパク質溶液を温めて、液体パーフルオロペンタンを蒸気に変換するために、両方のラインを熱交換機に取り付けた。ミルからの流出口は、ステンレス鋼冷却器(chiller)に接続した。液体パーフルオロペンタンが蒸発し、気体としてミル内に導入されるように、ヒーターの上流側に取り付けたシリンジポンプ（ Harvard Apparatus Co.）を用いて、パーフルオロペンタンを気体流入ライン内に送達した。１％ヒトアルブミン溶液（Ｕ．Ｓ．Ｐ．）を６０℃に加熱し、３００ｍｌ／分でミル内にポンピングした。キャリアガスとして使用される空気を、ガスラインを通して０、４０または８０ｍｌ／分でポンピングし、液体パーフルオロ−ｎ− ペンタンを、シリンジポンプを介して、３．５ｍｌ／分でガスライン内に導入した。パーフルオロ−ｎ−ペンタンまたは空気／パーフルオロ−ｎ−ペンタン混合物を、インラインの(in-line)熱交換機で９０℃に加熱した。ミルは、２０，０００ｒｐｍ、０．０１５インチのギャップ、温度約７６．５℃で作動させた。冷却器は、ミリングされた(milled)生成物を１０〜２０℃に冷却した。冷却器から発生した微粒子の懸濁液を、ガラス瓶に収集した。４℃で数時間放置すると、懸濁液は、瓶の底の微粒子層と、中間透明液体層と、泡の上層とに分離した。微粒子および透明液体を瓶から排水して４℃で閉じたガラスバイアル中に保管した。実施例２：気体充填微粒子の調製Ａ）連続超音波処理系(Continuous Sonication System) 米国特許第4,957,656号に記載の方法を使用して、パーフルオロプロパンおよび六フッ化硫黄微粒子を以下のように調製した。ヒト血清アルブミンを無菌生理食塩水で希釈して１％ｗ／ｖ溶液とした。この溶液を、初発変性(incipient denaturation)、約７６℃、まで加熱した。系を外部の雰囲気から閉鎖し、空気の代わりに、パーフルオロペンタンまたは六フッ化硫黄気体を液体内に導入した。約１００ｍｌ液体／分における超音波処理器ホーン(sonicator horn)を越えて、気体／アルブミン混合物（１：１ｖ／ｖ）を流して連続的に生成物を製造した。超音波処理チャンバから出てくる生成物を、熱交換機に通すことによって冷却し、微粒子の大量液体懸濁液(bulk liquid suspens ion)として収集した。取扱いおよび保管条件は、手動で製造したマイクロスフィアの場合と同様であった。Ｂ）機械的キャビテーション(Mechanical Cavitation) １％ヒト血清アルブミンおよび気体の混合物をミリングすることによって、閉鎖系内で、パーフルオロプロパンまたは六フッ化硫黄気体を含有するアルブミンマイクロスフィアをも製造した。所与のミルの機械的キャビテーションによってマイクロスフィア形成を可能にするのに十分な温度にまで加熱したアルブミン溶液を気体と１：１（ｖ：ｖ）で混合し、コロイドミル内に導入した。液体流速は、ミルの容量または大きさに依存し、典型的には１００〜５００ｍｌ／分であった。ミルからの流出物を、熱交換系を通すことによって冷却し、得られたアルブミンマイクロスフィア懸濁液を大量に収集した。他のプロセスと同様に、この生成物をガラスバイアル内に充填した。実施例３：疎水性バリアを有するガス充填粒子の調製キャリアガス（空気、ペルフルオロプロパン）を、同時係属中の米国特許出願Ｎｏ．０８／６６０，４８０に記載されるように、ペルフルオロヘキサンなどの疎水性化合物を用い、フリットのガス分散チューブを介して、一定温度の浴中に維持されたこの疎水性化合物に通して泡立てることによって飽和させた。温度は、必要な蒸気分圧を維持するために適切なレベルに調節された。キャビテーションチャンバへ続くガスラインの温度を、チャンバへ到達する前にガス−蒸気混合物から疎水性化合物が凝縮することを防ぐために浴温度以上に維持した。ガス／疎水性化合物の比は、ガスバブラーの下流でガス試料を採取し、ガスクロマトグラフィーで分析することによって決定された。ガス−蒸気混合物は、実施例２に記載されるような連続超音波処理システムにおいて微粒子を作成するために使用した。実施例４：微粒子のクロム処理ヒト血清アルブミンの生理食塩水溶液とペルフルオロプロパン充填マイクロスフィアとの懸濁液を含むバイアルを、すべてのマイクロスフィアが上部に浮くまで室温に静置させ、濃密な層を形成させた。その後の操作の間、マイクロスフィアは、ペルフルオロプロパン（ＰＦＰ）の環境中に維持した。透明な底部層は、シリンジを介して除去し、そして（ＰＦＰで脱気および飽和された）５．６ｍＭ硫酸クロム（ＩＩＩ）カリウム溶液の溶液によって置換した。混合物を撹拌しながら油浴中において９５℃で１０分間加熱した。懸濁液を撹拌しながら室温へ冷却させた。一晩静置した後、クロムを含む下層をシリンジで除去した。残りのマイクロスフィアをＰＦＰ飽和生理食塩水中に再懸濁させることによって完全に洗浄した。洗浄物を除去する際に、マイクロスフィアは、室温のＰＦＰ雰囲気下でＰＦＰ飽和生理食塩水中に保存された。クールター計数器測定は、初期粒子濃度として１．３９×１０⁹／ｍＬ（平均の大きさが４．８６μｍ）を示し、クロム処理されたマイクロスフィアの最終濃度は、１．１５×１０⁹／ｍＬ（平均の大きさが４．６５μｍ）であった。マイクロスフィア懸濁液の結合クロム含量は、ＩＣＰによって測定されたように４５μｇ／ｍＬであった。実施例５：微粒子とモノ官能性ＰＥＧとの反応Ａ）安定化されたマイクロスフィアのアミノ化クロムで処理された空気／ペルフルオロヘプタン充填マイクロスフィアの懸濁液、（０．２Ｍ３−（Ｎ−モルホリノ）−プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝液（ｐＨ７．６、２ｍＬ空気−およびペルフルオロヘプタン−飽和）中のポリリジン（２５ｍｇ、３６００ダルトン、ＨＢｒ塩）および１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド−ＨＣｌ（２０ｍｇ）の溶液中に約５×１０⁹）。粒子を、穏やかな撹拌によって懸濁液中に室温で５時間維持した。アミノ化されたマイクロスフィアを、断続的な遠心分離および混入物の除去をしながら生理食塩水で繰り返し洗浄した。Ｂ）マイクロスフィアのＰＥＧ化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）実施例５Ａに上述されたアミノ化マイクロスフィアをメトキシ−ＰＥＧ −エポキシド（６０ｍｇ，分子量５０００、ＳｈｅａｒｗａｔｅｒＰｏｌｙｍｅｒｓ社、図２参照：Ｙ＝５、Ｚ＝１）を含む０．２ＭＮ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジンＮ’−３−プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）緩衝液、ｐＨ８．０（２ｍＬ、空気およびペルフルオロヘプタンで飽和された）に懸濁した。粒子は、室温で５０時間懸濁液中に穏やかな撹拌によって維持された。最終的に、生理食塩水で洗浄し、そして懸濁液中に保存した。実施例６：微粒子とヘテロ官能性ＰＥＧとの反応安定化ガス充填マイクロスフィア（約２×１０⁹粒子）、例えば実施例５Ａで上述されたもの、を０．２Ｍペルフルオロヘプタン／空気−飽和ＥＰＰＳ緩衝液（１ｍｌ；ｐＨ８）に懸濁し、そして穏やかに撹拌しながら３０ｍｇのヘテロ官能性ＰＥＧ（図２に述べられるように、Ｙ＝２およびｍ＝２、またはＺ＝５およびｎ＝１２０）と４時間反応させた。ＰＥＧ誘導体は、そのリジン活性スクシンイミジルプロピオネート末端を介して粒子表面に付着する。さらに粒子を、さらに疎水性表面層を増加させるために、モノ官能性ＰＥＧ（例えば、（図２に述べられるように）Ｙ＝２かつＺ＝１かつｎ＝２５〜５０）でＰＥＧ化し得る。得られた、スルフヒドリル選択的末端を有するマイクロスフィアは、任意のチオール含有リガンドに対する汎用アクセプタとして働く。必要ならば、付着され得る前に、標的化分子は、チオール化されなければならない。抗体およびそのフラグメントの他に、ペプチドおよびオリゴ糖などの、他の標的特異的分子がまた使用され得る。ＰＥＧ末端の異なる組合せが図２に述べられ、そして当業者によって公知の方法を使用することによって簡単に合成され得る。実施例７：標的化リガンドの微粒子への付着実施例６に上述されるＰＥＧ化されたマイクロスフィアを、標的特異的Ｆａｂ’分子と伴にペルフルオロヘプタン／窒素−飽和緩衝液（ｐＨ７）中でインキュベートする。Ｆａｂ’は、遊離スルフヒドリルを介してマイクロスフィア上のチオール選択的ＰＥＧ末端と反応する。チオール化された抗体およびＦ（ａｂ’）₂フラグメントは、同様のやり方で付着される。チオール化は、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート、無水Ｓ−アセチルコハク酸を用いて、または２−イミノチオラン（ｉｍｉｎｏｔｈｉｏｌａｎｅ）を用いて行われ得る。実施例８：スターＰＥＧ化安定化マイクロスフィアをまた、ヒドロゲルの形態のスターＰＥＧ分子でコーティングする。スターＰＥＧは、架橋されたジビニルベンゼンのコアからエチレンオキシドを重合することによって生成された複数の腕を有する（ｍｕｌｔｉ−ａｒｍｅｄ）分子である。スターＰＥＧ分子は、代表的には、トレシル（ｔｒｅｓｙｌ）クロライドで活性化される。トレシル化されたスターＰＥＧは、市販される（ＳｈｅａｒｗａｔｅｒＰｏｌｙｍｅｒｓ社、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）。マイクロスフィアを水性緩衝液（ｐＨ１０）中でトレシル化スターＰＥＧで処理する。スター分子は、共有結合し、マイクロスフィア上に濃密な層を形成する。結合は、マイクロスフィア上のアミノ基とスター分子の腕上のトレシレート末端との間の反応から得られる。さらに、反応時間を制限することによって（１時間以下）、マイクロスフィアは、反応していないトレシル基のためになお活性である単層のスターＰＥＧ分子で共有結合的にコーティングされる。コーティングされたマイクロスフィアを繰り返し洗浄し、次に抗体またはそのＦａｂ’フラグメント（ｐＨ８．５〜１０．０）などの標的化リガンドと反応させる。リガンドは、そのアミノ基およびチオール基を介してスターＰＥＧ化マイクロスフィアに共有結合される。この結果は、インビボの寿命が延長された標的特異的マイクロスフィア調製物である。実施例９：アラビノガラクタンのマイクロスフィアへの共有結合精製されたアラビノガラクタン（２３，０００ダルトン；ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ社）を、当業者によってなされ得るように、塩基の存在下でブロモ酢酸でカルボキシメチル化する。得られたカルボキシメチル化アラビノガラクタンを、例えばクロム処理されたペルフルオロヘプタン／空気充填マイクロスフィアの表面へ、タンパク質のリジン基を介して、適切な緩衝液（ｐＨ７．５）中の１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドなどの水溶性カルボジイミドの作用によって、結合体化させる。最終的に、マイクロスフィアをペルフルオロヘプタンで飽和された生理食塩水でしっかりと洗浄し、そして懸濁液として保存する。実施例１０：インビトロ超音波安定性判定１リットルのプラスチックビーカーにおいて、８００ｍＬの絶えず撹拌した生理食塩水溶液を３７℃で空気で飽和した。その後、マイクロスフィア懸濁液のアリコートを、最終濃度が１ｍＬ当たり約１×１０⁴個のマイクロスフィアになるように加えた。エコー発生性をＨＰＳｏｎｏｓ１００超音波機械および５ＭＨｚトランスデューサを用いて試験した。試験は、パワー設定３０％および深度８ｃｍフィールドで、連続的または断続的超音波処理で行われた。断続的超音波処理測定は、一定の時間間隔（それぞれ約１０秒）で、連続して撹拌されるマイクロスフィア懸濁液で行われた。イメージは、ビデオテープ上に記録し、そしてその後Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ（ＭｅｄｉａＣｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ）ソフトウェアプログラムを使用して評価した。２００×８０ピクセルの長方形におけるグレイスケール強度を時間の関数としてプロットした。結果は、図１に示す。「連続的安定性」測定は、マイクロスフィアが超音波フイールドにおいてどれくらい持ちこたえるかを反映し、他方「断続的安定性」測定は、空気飽和環境における循環中の物理的安定性の指標を与える。マイクロスフィアは、グレイスケールがバックグラウンドを１５％より大きく超えて維持された場合に「安定」と考えられた。実施例１１：インビボ研究クロム処理された空気充填マイクロスフィアを、右および左心室の増強について、およびまた心筋潅流について評価した。試験剤は、室温（２２℃）で維持し、麻酔下のニュージーランド白ラビット（体重３．５Ｋｇ）の大腿静脈へ（１８Ｇ針を介して）注射する前に再懸濁した。空気充填マイクロスフィア懸濁Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）をコントロールとして利用した。超音波イメージングを、ＨＰＳｏｎｏｓ１５００器械に取り付けられた５ＭＨｚトランスデューサを用いて行い、そしてビデオテープ上に記録した。剤は、不透明化および潅流増強の両方を提供した。ＬＶ、ＲＶ、および心筋の増強の持続時間を音響デンシトメトリーによって評価した。超音波コントラスト剤の当業者にとって明らかな、本発明を実施するための上述のモードの改変は、以下の請求項の範囲内にあると意図される。本明細書中において引用されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、各このような刊行物、特許、または特許出願が具体的におよび個別に示されるが如くに、援用として参照される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人ゴレック，ブレントリーアメリカ合衆国カリフォルニア 92122, サンディエゴ，マハイラアベニュー 4034，アパートメントシー (72)発明者ロールマン，ロルフアメリカ合衆国カリフォルニア 92037, ラホヤ，リンダローザアベニュー 5531 (72)発明者ゴレック，ブレントリーアメリカ合衆国カリフォルニア 92122, サンディエゴ，マハイラアベニュー 4034，アパートメントシー

Claims

【特許請求の範囲】１．安定化した微粒子の懸濁液を含む、超音波コントラスト剤として用いられる組成物であって、該微粒子は、（ａ）気体および／または液体を含むコア材料、および（ｂ）該コア材料を被包する皮革化（ｔａｎｎｅｄ）タンパク質を含むシェル、を含む組成物。２．前記タンパク質がアルブミンである、請求項１に記載の組成物。３．前記コア材料が気体である、請求項１に記載の組成物。４．前記気体が空気である、請求項３に記載の組成物。５．前記気体がペルフルオロアルカンである、請求項３に記載の組成物。６．前記コア材料が液体である、請求項１に記載の組成物。７．前記液体がハロゲン化炭化水素である、請求項６に記載の組成物。８．前記ハロゲン化炭化水素がペルフルオロペンタンである、請求項７に記載の組成物。９．前記コア材料が、第１の気体と第２の気体との混合物である、請求項１に記載の組成物。１０．前記第１の気体がペルフルオロプロパンであり、前記第２の気体がペルフルオロペンタンである、請求項９に記載の組成物。１１．前記コアが、気体と液体との混合物である、請求項１に記載の組成物。１２．前記気体が空気であり、前記液体がペルフルオロヘプタンである、請求項１１に記載の組成物。１３．前記気体が空気であり、前記液体がＣ５〜Ｃ１０過フッ化化合物からなる群より選択される、請求項１１に記載の組成物。１４．前記タンパク質が、クロム、ジルコニウム、チタンおよびアルミニウムからなる群より選択される金属塩を用いて皮革化されている、請求項１に記載の組成物。１５．安定化した微粒子の懸濁液を含む、超音波コントラスト剤として用いられる組成物であって、（ａ）気体および／または液体を含むコア材料、（ｂ）該コア材料を被包する皮革化タンパク質を含む外表面を有するシェル、および（ｃ）該外表面に付着する親水性官能基部分、を含む組成物。１６．前記親水性官能基部分が、多糖、ＰＥＧおよびペプチドからなる群より選択される、請求項１５に記載の組成物。１７．前記親水性官能基部分がＰＥＧである、請求項１５に記載の組成物。１８．前記親水性官能基部分がスターＰＥＧ（ｓｔａｒＰＥＧ）である、請求項１７に記載の組成物。１９．前記親水性官能基部分が、多糖および糖ペプチドからなる群より選択される化学物質である、請求項１５に記載の組成物。２０．前記タンパク質がアルブミンである、請求項１５に記載の組成物。２１．前記コア材料が気体である、請求項１５に記載の組成物。２２．前記気体が空気である、請求項２１に記載の組成物。２３．前記気体がペルフルオロアルカンである、請求項２１に記載の組成物。２４．前記コア材料が液体である、請求項１５に記載の組成物。２５．前記液体がハロゲン化炭化水素である、請求項２４に記載の組成物。２６．前記ハロゲン化炭化水素がぺルフルオロペンタンである、請求項２５に記載の組成物。２７．前記コア材料が、第１の気体と第２の気体との混合物である、請求項１５に記載の組成物。２８．前記第１の気体がペルフルオロプロパンであり、前記第２の気体がペルフルオロペンタンである、請求項１５に記載の組成物。２９．前記コアが、気体と液体との混合物である、請求項１５に記載の組成物。３０．前記気体が空気であり、前記液体がペルフルオロヘプタンである、請求項２９に記載の組成物。３１．前記気体が空気であり、前記液体がＣ５〜Ｃ１０過フッ化化合物からなる群より選択される、請求項２９に記載の組成物。３２．前記タンパク質が、クロム、ジルコニウム、チタンおよびアルミニウムからなる群より選択される金属塩を用いて皮革化されている、請求項１５に記載の組成物。３３．安定化した標的特異的微粒子の懸濁液を含む、超音波コントラスト剤として用いられる組成物であって、該微粒子は、（ａ）気体および／または液体を含むコア材料、（ｂ）該コア材料を被包する皮革化タンパク質を含む外表面を有するシェル、および（ｃ）該外表面に付着する標的部分、を含む組成物。３４．前記シェルの前記外表面が親水性である、請求項３３に記載の組成物。３５．前記タンパク質がアルブミンである、請求項３３に記載の組成物。３６．前記コア材料が気体である、請求項３３に記載の組成物。３７．前記気体が空気である、請求項３６に記載の組成物。３８．前記気体がペルフルオロアルカンである、請求項３６に記載の組成物。３９．前記コア材料が液体である、請求項３３に記載の組成物。４０．前記液体がハロゲン化炭化水素である、請求項３９に記載の組成物。４１．前記ハロゲン化炭化水素がペルフルオロペンタンである、請求項４０に記載の組成物。４２．前記コア材料が、第１の気体と第２の気体との混合物である、請求項３３に記載の組成物。４３．前記第１の気体がペルフルオロプロパンであり、前記第２の気体がペルフルオロペンタンである、請求項４２に記載の組成物。４４．前記コアが、気体と液体との混合物である、請求項３３に記載の組成物。４５．前記気体が空気であり、前記液体がペルフルオロヘプタンである、請求項４４に記載の組成物。４６．前記気体が空気であり、前記液体がＣ５〜Ｃ１０過フッ化化合物からなる群より選択される、請求項４５に記載の組成物。４７．前記標的部分が、血管内標的に対して特異的親和力を有する、請求項３３に記載の組成物。４８．前記標的部分が、血管外標的に対して特異的親和力を有する、請求項３３に記載の組成物。４９．前記標的部分が、ペプチド、糖ペプチド、炭水化物、および糖脂質からなる群より選択される、請求項３３に記載の組成物。５０．前記標的部分が、肝細胞に対して特異的親和力を有する、請求項３３に記載の組成物。５１．前記標的部分が癌細胞に対して特異的親和力を有し、該標的部分が抗体である、請求項３３に記載の組成物。５２．前記標的部分が前記血管内標的に関連する少なくとも２つの抗原に対して特異的親和力を有する多特異的（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体である、請求項４７に記載の組成物。５３．前記標的部分が抗体であり、前記コア材料が治療剤である、請求項３３に記載の組成物。５４．前記微粒子が、クロム、ジルコニウム、チタン、およびアルミニウムからなる群より選択される金属塩を用いて皮革化されている、請求項３３に記載の組成物。５５．安定化した標的特異的微粒子の懸濁液を含む、超音波コントラスト剤として用いられる組成物であって、該微粒子が、（ａ）気体および／または液体を含むコア材料、（ｂ）該コア材料を被包する皮革化タンパク質を含む外表面を有するシェル、（ｃ）該外表面に付着する標的部分、および（ｄ）第１の端部と第２の端部とを有する二官能スペーサアーム、を含み、該第１の端部が該外表面に付着し、該第２の端部が該標的部分に付着している、組成物。５６．前記シェルの前記外表面が親水性である、請求項５５に記載の組成物。５７．前記二官能スペーサアームが親水性である、請求項５５に記載の組成物。５８．前記スペーサアームがポリエチレングリコールである、請求項５７に記載の組成物。５９．前記スペーサアームがスターＰＥＧである、請求項５８に記載の組成物。６０．前記タンパク質がアルブミンである、請求項５５に記載の組成物。６１．前記コア材料が気体である、請求項５５に記載の組成物。６２．前記気体が空気である、請求項６１に記載の組成物。６３．前記気体がペルフルオロアルカンである、請求項６１に記載の組成物。６４．前記コア材料が液体である、請求項５５に記載の組成物。６５．前記液体がハロゲン化炭化水素である、請求項６４に記載の組成物。６６．前記ハロゲン化炭化水素がペルフルオロペンタンである、請求項６５に記載の組成物。６７．前記コア材料が、第１の気体と第２の気体との混合物である、請求項５５に記載の組成物。６８．前記第１の気体がペルフルオロプロパンであり、前記第２の気体がペルフルオロペンタンである、請求項６７に記載の組成物。６９．前記コアが、気体と液体との混合物である、請求項５５に記載の組成物。７０．前記気体が空気であり、前記液体がペルフルオロヘプタンである、請求項６９に記載の組成物。７１．前記気体が空気であり、前記液体がＣ５〜Ｃ１０過フッ化化合物からなる群より選択される、請求項６９に記載の組成物。７２．前記標的部分が、血管内標的に対して特異的親和力を有する、請求項５５に記載の組成物。７３．前記標的部分が、血管外標的に対して特異的親和力を有する、請求項５５に記載の組成物。７４．前記標的部分が肝細胞に対して特異的親和力を有する、請求項５５に記載の組成物。７５．前記標的部分が癌細胞に対して特異的親和力を有し、該標的部分が抗体である、請求項５５に記載の組成物。７６．前記標的部分が前記血管内標的に関連する少なくとも２つの抗原に対して特異的親和力を有する多特異的抗体である、請求項６３に記載の組成物。７７．前記標的部分が抗体であり、前記コア材料が治療剤である、請求項５５に記載の組成物。７８．前記微粒子が、クロム、ジルコニウム、チタン、およびアルミニウムからなる群より選択される金属塩を用いて皮革化されている、請求項５５に記載の組成物。７９．標的特異的微粒子の製造で使用される組成物であって、（ａ）気体および／または液体を含むコア材料と、（ｂ）該コア材料をカプセル化する、皮革化タンパク質を含む外表面を有するシェルと、（ｃ）第１端部と第２端部とを有する親水性スペーサアームであって、該第１端部は該外表面に取り付けられ、該第２端部は、標的部分と共有結合を形成し得る官能基を有する、親水性スペーサアームと、を含む組成物。８０．前記タンパク質はアルブミンである、請求項７９に記載の組成物。８１．前記コア材料は気体である、請求項７９に記載の組成物。８２．前記気体は空気である、請求項８１に記載の組成物。８３．前記気体はペルフルオロアルカンである、請求項８１に記載の組成物。８４．前記コア材料は液体である、請求項７９に記載の組成物。８５．前記液体はハロゲン化炭化水素である、請求項８４に記載の組成物。８６．前記ハロゲン化炭化水素はペルフルオロペンタンである、請求項８５に記載の組成物。８７．前記コア材料は第１の気体と第２の気体との混合物である、請求項７９に記載の組成物。８８．前記第１の気体はペルフルオロプロパンであり、前記第２の気体はペルフルオロペンタンである、請求項８７に記載の組成物。８９．前記コアは気体と液体との混合物である、請求項７９に記載の組成物。９０．前記気体は空気であり、前記液体はペルフルオロヘプタンである、請求項８９に記載の組成物。９１．前記気体は空気であり、前記液体は、Ｃ５〜Ｃ１０の過フッ化化合物よりなる群から選択される、請求項８９に記載の組成物。９２．前記微粒子は、クロム、ジルコニウム、チタン、およびアルミニウムよりなる群から選択される金属塩を用いて皮革化されている、請求項７９に記載の組成物。９３．安定した微粒子の懸濁物を含む超音波コントラスト剤として使用される組成物であって、該微粒子は、（ａ）気体および／または液体を含むコア材料と、（ｂ）該コア材料をカプセル化するタンパク質を含むシェルと、を含み、該タンパク質はさらに、カルボキシル基と架橋リガンドとの間の多核配位錯体を含む、組成物。９４．前記架橋リガンドは、ヒドロキソル、オキソ、および硫黄よりなる群から選択される、請求項９３に記載の組成物。９５．前記タンパク質はアルブミンである、請求項９３に記載の組成物。９６．前記コア材料は気体である、請求項９３に記載の組成物。９７．前記気体は空気である、請求項９６に記載の組成物。９８．前記気体はペルフルオロアルカンである、請求項９６に記載の組成物。９９．前記コア材料は液体である、請求項９３に記載の組成物。１００．前記液体はハロゲン化炭化水素である、請求項９９に記載の組成物。１０１．前記ハロゲン化炭化水素はペルフルオロペンタンである、請求項１００に記載の組成物。１０２．前記コア材料は第１の気体と第２の気体との混合物である、請求項９３に記載の組成物。１０３．前記第１の気体はペルフルオロプロパンであり、前記第２の気体はペルフルオロペンタンである、請求項１０２に記載の組成物。１０４．前記コアは気体と液体との混合物である、請求項９３に記載の組成物。１０５．前記気体はペルフルオロプロパンであり、前記液体はペルフルオロヘプタンである、請求項１０４に記載の組成物。１０６．前記気体は空気であり、前記液体は、Ｃ５〜Ｃ１０の過フッ化化合物よりなる群から選択される、請求項１０４に記載の組成物。１０７．前記微粒子は、クロム、ジルコニウム、チタン、およびアルミニウムよりなる群から選択される金属塩を用いて皮革化されている、請求項９３に記載の組成物。１０８．標的特異的微粒子の製造で使用される組成物であって、（ａ）気体および／または液体を含むコア材料と、（ｂ）該コア材料をカプセル化する、タンパク質を含む外表面を有するシェルと、（ｃ）第１端部と第２端部とを有する親水性スペーサアームであって、該第１端部は該外表面に取り付けられ、該第２端部は、標的部分と共有結合を形成し得る官能基を有する、親水性スペーサアームと、（ｄ）該親水性スペーサアームの該第２端部に取り付けられる該標的部分と、を含む組成物。１０９．前記二機能性スペーサアームは親水性である、請求項１０８に記載の組成物。１１０．前記スペーサアームはＰＥＧである、請求項１０９に記載の組成物。１１１．前記スペーサアームはスターＰＥＧである、請求項１１０に記載の組成物。１１２．前記タンパク質はアルブミンである、請求項１０８に記載の組成物。１１３．前記コア材料は気体である、請求項１０８に記載の組成物。１１４．前記気体は空気である、請求項１１３に記載の組成物。１１５．前記気体はペルフルオロアルカンである、請求項１１３に記載の組成物。１１６．前記コア材料は液体である、請求項１０８に記載の組成物。１１７．前記液体はハロゲン化炭化水素である、請求項１１６に記載の組成物。１１８．前記ハロゲン化炭化水素はペルフルオロペンタンである、請求項１１７に記載の組成物。１１９．前記コア材料は第１の気体と第２の気体との混合物である、請求項１０８に記載の組成物。１２０．前記第１の気体はペルフルオロプロパンであり、前記第２の気体はペルフルオロペンタンである、請求項１１９に記載の組成物。１２１．前記コアは気体と液体との混合物である、請求項１０８に記載の組成物。１２２．前記気体は空気であり、前記液体はペルフルオロヘプタンである、請求項１２１に記載の組成物。１２３．前記気体は空気であり、前記液体は、Ｃ５〜Ｃ１０の過フッ化化合物よりなる群から選択される、請求項１２１に記載の組成物。１２４．前記標的部分は、血管内標的に対して特異的な親和性を有する、請求項１０８に記載の組成物。１２５．前記標的部分は、血管外標的に対して特異的な親和性を有する、請求項１０８に記載の組成物。１２６．前記標的部分は、肝細胞に対して特別な親和性を有する、請求項１０８に記載の組成物。１２７．前記標的部分は癌細胞に対して特別な親和性を有し、該標的部分は抗体である、請求項１０８に記載の組成物。１２８．前記標的部分は、前記血管内標的に関連する少なくとも２つの抗原に対して特別なアフィニティを有する多特異的抗体である、請求項１２４に記載の組成物。１２９．前記標的部分は抗体であり、前記コア材料は治療剤である、請求項１０８に記載の組成物。１３０．前記微粒子は、クロム、ジルコニウム、チタン、およびアルミニウムよりなる群から選択される金属塩を用いて皮革化されている、請求項１０８に記載の組成物。１３１．タンパク質のシェルによってカプセル化された気体および／または液体のコア材料を含む微粒子を、適切な条件の下で皮革化剤に曝して、曝されたイオン化可能カルボキシル基と架橋リガンドとの間の多核配位鉗体を形成する工程を包含する、安定微粒子を作製する方法。１３２．前記タンパク質はアルブミンである、請求項１３１に記載の方法。１３３．前記コア材料は気体である、請求項１３１に記載の方法。１３４．前記気体は空気である、請求項１３３に記載の方法。１３５．前記気体はペルフルオロアルカンである、請求項１３３に記載の方法。１３６．前記コア材料は液体である、請求項１３１に記載の方法。１３７．前記液体はハロゲン化炭化水素である、請求項１３６に記載の方法。１３８．前記ハロゲン化炭化水素はペルフルオロペンタンである、請求項１３７に記載の方法。１３９．前記コア材料は第１の気体と第２の気体との混合物である、請求項１３１に記載の方法。１４０．前記第１の気体はペルフルオロプロパンであり、前記第２の気体はペルフルオロペンタンである、請求項１３９に記載の方法。１４１．前記コアは気体と液体との混合物である、請求項１３１に記載の方法。１４２．前記気体は空気であり、前記液体はペルフルオロヘプタンである、請求項１４１に記載の方法。１４３．前記気体は空気であり、前記液体は、Ｃ５〜Ｃ１０の過フッ化化合物よりなる群から選択される、請求項１４１に記載の方法。１４４．前記皮革化剤はクロム塩溶液である、請求項１３１に記載の方法。１４５．前記クロム溶液の濃度は１〜３０ｍＭである、請求項１４４に記載の方法。１４６．前記クロム溶液の濃度は５．６ｍＭである、請求項１４４に記載の方法。１４７．前記皮革化剤は、ジルコニウム、チタン、およびアルミニウムよりなる群から選択される塩溶液である、請求項１３１に記載の方法。１４８．前記適切な条件は熱滅菌を含む、請求項１３１に記載の方法。１４９．標的特異的超音波コントラスト剤を作製する方法であって、（ａ）皮革化タンパク質のシェルによってカプセル化された気体および／または液体のコア材料を含む微粒子を、第１の端部と第２の端部とを有する親水性スペーサアームと反応させる工程であって、該第１の端部は、該タンパク質と共有結合を形成し得る第１の官能基を有し、該第２の端部は保護基によって保護される第２の官能基を有する、工程と、（ｂ）該第２の官能基から該保護基を除去して非保護生成物を形成する工程と、（ｃ）工程（ｂ）の該非保護生成物を、該第２の官能基と共有結合を形成し得る官能基を有する標的部分と反応させる工程と、を包含する方法。１５０．前記タンパク質はアルブミンである、請求項１４９に記載の方法。１５１．前記コア材料は気体である、請求項１４９に記載の方法。１５２．前記気体は空気である、請求項１５１に記載の方法。１５３．前記気体はペルフルオロアルカンである、請求項１５１に記載の方法。１５４．前記コア材料は液体である、請求項１４９に記載の方法。１５５．前記液体はハロゲン化炭化水素である、請求項１５４に記載の方法。１５６．前記ハロゲン化炭化水素はペルフルオロペンタンである、請求項１５５に記載の方法。１５７．前記コア材料は第１の気体と第２の気体との混合物である、請求項１４９に記載の方法。１５８．前記第１の気体はペルフルオロプロパンであり、前記第２の気体はペルフルオロペンタンである、請求項１５７に記載の方法。１５９．前記コアは気体と液体との混合物である、請求項１４９に記載の方法。１６０．前記気体は空気であり、前記液体はペルフルオロヘプタンである、請求項１５９に記載の方法。１６１．前記気体は空気であり、前記液体は、Ｃ５〜Ｃ１０の過フッ化化合物よりなる群から選択される、請求項１５９に記載の方法。１６２．前記皮革化剤はクロム塩溶液である、請求項１４９に記載の方法。１６３．前記クロム溶液の濃度は１〜３０ｍＭである、請求項１６２に記載の方法。１６４．前記クロム溶液の濃度は５．６ｍＭである、請求項１６２に記載の方法。１６５．前記皮革化剤は、ジルコニウム、チタン、およびアルミニウムよりなる群から選択される塩溶液である、請求項１４９に記載の方法。１６６．前記標的特異的超音波薬剤は熱滅菌されている、請求項１４９に記載の方法。１６７．標的特異的超音波コントラスト剤を調製する方法であって、（ａ）皮革化されたタンパク質のシェルによってカプセル化された気体および／または液体のコア材料を含む微粒子を、第１の端部および第２の端部を有する親水性スペーサアームに反応させる工程であって、該第１の端部は、該タンパク質と共有結合を形成することが可能な第１の官能基を有し、該第２の端部は、チオールを含有する標的化部分と反応することが可能な第２の官能基を有する、工程と、（ｂ）（ａ）の該官能基を、該第２の官能基と共有結合を形成することが可能なチオールを含有する標的化部分に反応させる工程と、を包含する方法。１６８．前記タンパク質がアルブミンである、請求項１６７に記載の方法。１６９．前記コア材料が気体である、請求項１６７に記載の方法。１７０．前記気体が空気である、請求項１６９に記載の方法。１７１．前記気体がペルフルオロアルカンである、請求項１６９に記載の方法。１７２．前記コア材料が液体である、請求項１６９に記載の方法。１７３．前記液体がハロゲン化炭化水素である、請求項１７２に記載の方法。１７４．前記ハロゲン化炭化水素がペルフルオロペンタンである、請求項１７３に記載の方法。１７５．前記コア材料が第１の気体と第２の気体との混合物である、請求項１６７に記載の方法。１７６．前記第１の気体がペルフルオロプロパンであり、前記第２の気体がペルフルオロペンタンである、請求項１７５に記載の方法。１７７．前記コアが気体と液体との混合物である、請求項１６７に記載の方法。１７８．前記気体が空気であり、前記液体がペルフルオロヘプタンである、請求項１７７に記載の方法。１７９．前記気体が空気であり、前記液体がＣ５−Ｃ１０過フッ化化合物からなる群から選択される、請求項１７７に記載の方法。１８０．前記皮革化剤がクロム塩溶液である、請求項１６７に記載の方法。１８１．前記クロム溶液の濃度が１〜３０ｍＭである、請求項１８０に記載の方法。１８２．前記クロム溶液の濃度が５．６ｍＭである、請求項１８０に記載の方法。１８３．前記皮革化剤がジルコニウム、チタニウムおよびアルミニウムからなる群から選択される塩溶液である、請求項１６７に記載の方法。１８４．前記標的特異的超音波剤が加熱滅菌されている、請求項１６７に記載の方法。１８５．標的特異的超音波コントラスト剤を調製する方法であって、（ａ）親水性表面を有するタンパク質の皮革化されたシェルによってカプセル化された気体および／または液体コア材料を含む微粒子を提供する工程と、（ｂ）標的化部分を該表面に付着させる工程と、を包含する方法。１８６．前記タンパク質がアルブミンである、請求項１８５に記載の方法。１８７．前記コア材料が気体である、請求項１８５に記載の方法。１８８．前記気体が空気である、請求項１８７に記載の方法。１８９．前記気体がペルフルオロアルカンである、請求項１８７に記載の方法。１９０．前記コア材料が液体である、請求項１８５に記載の方法。１９１．前記液体がハロゲン化炭化水素である、請求項１９０に記載の方法。１９２．前記ハロゲン化炭化水素がペルフルオロペンタンである、請求項１９１に記載の方法。１９３．前記コア材料が第１の気体と第２の気体との混合物である、請求項１８５に記載の方法。１９４．前記第１の気体がペルフルオロプロパンであり、前記第２の気体がペルフルオロペンタンである、請求項１９３に記載の方法。１９５．前記コアが気体と液体との混合物である、請求項１８５に記載の方法。１９６．前記気体が空気であり、前記液体がペルフルオロヘプタンである、請求項１９５に記載の方法。１９７．前記気体が空気であり、前記液体がＣ５−Ｃ１０過フッ化化合物からなる群から選択される、請求項１９５に記載の方法。１９８．前記皮革化剤がクロム塩溶液である、請求項１８５に記載の方法。１９９．前記クロム溶液の濃度が１〜３０ｍＭである、請求項１９８に記載の方法。２００．前記クロム溶液の濃度が５．６ｍＭである、請求項１９８に記載の方法。２０１．前記皮革化剤がジルコニウム、チタニウムおよびアルミニウムからなる群から選択される塩溶液である、請求項１８５に記載の方法。２０２．前記標的特異的超音波剤が加熱滅菌されている、請求項１８５に記載の方法。２０３．標的特異的超音波コントラスト剤を調製する方法であって、（ａ）皮革化されたタンパク質のシェルによってカプセル化された気体および／または液体コア材料を含む微粒子の外面を親水性にする工程と、（ｂ）標的化部分を該親水性にされた表面に結合させる工程と、を包含する方法。２０４．前記タンパク質がアルブミンである、請求項２０３に記載の方法。２０５．前記コア材料が気体である、請求項２０３に記載の方法。２０６．前記気体が空気である、請求項２０５に記載の方法。２０７．前記気体がペルフルオロアルカンである、請求項２０５に記載の方法。２０８．前記コア材料が液体である、請求項２０３に記載の方法。２０９．前記液体がハロゲン化炭化水素である、請求項２０８に記載の方法。２１０．前記ハロゲン化炭化水素がペルフルオロペンタンである、請求項２０９に記載の方法。２１１．前記コア材料が第１の気体と第２の気体との混合物である、請求項２０３に記載の方法。２１２．前記第１の気体がペルフルオロプロパンであり、前記第２の気体がペルフルオロペンタンである、請求項２１１に記載の方法。２１３．前記コアが気体と液体との混合物である、請求項２０３に記載の方法。２１４．前記気体が空気であり、前記液体がペルフルオロヘプタンである、請求項２１３に記載の方法。２１５．前記気体が空気であり、前記液体がＣ５−Ｃ１０過フッ化化合物からなる群から選択される、請求項２１３に記載の方法。２１６．前記皮革化剤がクロム塩溶液である、請求項２０３に記載の方法。２１７．前記クロム溶液の濃度が１〜３０ｍＭである、請求項２１６に記載の方法。２１８．前記クロム溶液の濃度が５．６ｍＭである、請求項２１６に記載の方法。２１９．前記皮革化剤がジルコニウム、チタニウムおよびアルミニウムからなる群から選択される塩溶液である、請求項２０３に記載の方法。２２０．前記標的特異的超音波剤が加熱滅菌されている、請求項２０３に記載の方法。２２１．前記工程（ａ）がＰＥＧ化である、請求項２０３に記載の方法。２２２．前記ＰＥＧ化がスターＰＥＧを用いて実施される、請求項２２１に記載の方法。２２３．前記ＰＥＧ化がアミノ化を含む、請求項２２１に記載の方法。２２４．前記標的化部分が抗体であり、前記コア材料が治療剤である、請求項２０３に記載の方法。２２５．超音波画像内の患者の組織または器官のコントラストを向上させる方法であって、（ａ）請求項１、１５、３３、５５、７９、９３または１０８に記載の微粒子を患者に投与する工程と、（ｂ）該微粒子が該組織または器官内または付近で蓄積するのを待つ工程と、（ｃ）超音波エネルギーを該組織または器官を含む領域に適用する工程と、（ｄ）該領域から反射される超音波エネルギーを検出する工程と、（ｅ）該反射されたエネルギーを画像に変換する工程と、を包含する方法。２２６．組織または器官の不透明化が検出される、請求項２２５に記載の方法。２２７．組織または器官の潅流が検出される、請求項２２５に記載の方法。２２８．前記組織または器官が、肝臓、腎臓、胃腸管、再生器官、尿路、胸部、肺、リンパ腫、黒色腫、グリオーム、肉腫および神経芽細胞腫からなる群から選択される、請求項２２５に記載の方法。２２９．前記超音波エネルギーが、基本波、ドップラー波、３次元波、および高調波からなる群から選択されるモードに変換される、請求項２２５に記載の方法。２３０．官能部分を安定化された微粒子に付着させる方法であって、該微粒子が気体、液体または気体と液体との混合物のコア材料を含み、該コア材料がタンパク質のシェルによってカプセル化され、該微粒子が金属カチオンで皮革化されており、該方法は、（ａ）該官能部分を誘導体化し、該金属カチオンとの複合体を形成することが可能な金属キレータを含ませる工程と、（ｂ）該微粒子を該誘導体化された官能部分に反応させ、該金属キレータと該カチオンとの間に安定した金属キレートを形成する工程と、を包含する方法。２３１．安定化された微粒子の懸濁液を含む超音波コントラスト剤として使用される組成物であって、該微粒子は、（ａ）気体、液体または気体と液体との混合物のコア材料と、（ｂ）該コア材料をカプセル化するタンパク質を含むシェルであって、該タンパク質が金属カチオンで皮革化されている、シェルと、（ｃ）金属キレータを含むように誘導体化された官能部分であって、該金属キレータが該金属カチオンにキレート化される、官能部分とを含む、組成物。