CN100375756C - 分离与富集蛋白质的分子印迹树脂和制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分离与富集蛋白质的分子印迹树脂和制备方法，以克隆蛋白质为模板用辅助识别的限长聚合物链(识别分子)合成蛋白质印迹聚合物，具体地用于天然微量蛋白质的分离、富集。该分子印迹树脂可用于天然细胞提取物中目标蛋白质的分离、富集。本发明成球在有机相中进行，印迹在水相中进行，避免了对模板蛋白质的破坏，实用性强。以克隆蛋白质为模板的方法克服了天然微量蛋白质的印迹模板难以得到的瓶颈。使用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳并以硝酸银染色检测吸附蛋白及其洗涤过程，这种检测方法灵敏度高，定量容易，直观准确。

Description

分离与富集蛋白质的分子印迹树脂和制备方法

技术领域

本发明涉及分子印迹树脂的合成及其应用，特别是一种分子印迹树脂和制备方法及其分离与富集天然微量蛋白质的应用，以克隆蛋白质为模板用辅助识别的限长聚合物链(识别分子)合成蛋白质印迹聚合物，具体地用于天然微量蛋白质的分离、富集。

背景技术

分子印迹技术是聚合物通过“记忆”印迹分子的立体空间而具有的分子水平上的专一性识别能力。由于蛋白质结构的特殊性及生物活性的要求，近年来印迹蛋白质成为分子印迹领域研究热点。利用非共价作用是印迹蛋白质最简单方法。常用的弱分子间作用力有：氢键、静电力、电荷转移、疏水作用以及范德华力等。

印迹蛋白质的方法主要有包埋法、表面印迹法、抗原决定基的方法。早期采用最多的聚合方法是包埋法，印迹的蛋白质通过蛋白酶的降解去除，印迹聚合物可以重新吸附印迹分子。Hjérten等(Hjérten J，Liao J L，Nakazato Ketal.，Chromatography，1997，44：227-234)采用该法，以丙烯酰胺为单体合成了低交联度的凝胶，对血红蛋白、生长激素、红细胞色素、肌红蛋白和核糖核酸酶等进行了印迹。洗脱印迹分子后得到了具有良好选择性的分子印迹聚合物，不同的印迹分子能被相应的凝胶所吸附。

表面印迹法制得的介质使印迹识别位点处在颗粒的表面(或表层)，克服了包埋法印迹分子利用率低、印迹分子洗脱困难、介质内部扩散阻力大、介质形态不规则等缺点。从蛋白质的结构和特性来看，表面印迹法更适合印迹蛋白质分子。其优点是可利用粒子的机械稳定性及调节粒子本身性能的适应不同的印迹需要。表面印迹法印迹蛋白质的载体有硅胶粒子、云母、聚合物微球等。硅胶作载体的优点是在聚合过程中硅胶表面的修饰基团通过价键距离控制，只有相应底物有强烈识别作用，可大大降低非特异吸附对选择性的影响。但用聚合方法制备的微球作载体(YeL，Cormack PAG，Mosbach K.AnalChimActa.2001，435：187～196)可通过对初始聚合阶段工艺条件的控制，得到尺寸均一，有良好机械性能的聚合物颗粒，不用粉碎和筛分，能保证得到的印迹聚合物的物理和化学性能。表面印迹法一般是在微球上进行印迹或涂层印迹聚合物，或是将蛋白质首先吸附到云母上(Shi H，Tsai W B，Ferrari S，Ratner B D.，Nature，1999，398：593-597)，然后将一薄层的二糖分子包被在吸附的蛋白质上，糖层与蛋白质通过氢键结合。接着在糖分子表面聚合上一层光滑的荧光聚合物薄层。最后除去云母并溶解掉印迹蛋白质，即生成了具有蛋白质形状空穴的聚二糖表面印迹聚合物。Sergey等(BossiA，Piletsky SA，PiletskaE V.et al.Anal.Chem.，2001，73：5281～5286)提出表面接枝印迹方法是在聚苯乙烯树脂表面涂一薄层稳定的可键合的物质，该物质在蛋白质分子存在下可聚合。

抗原决定基的方法根据抗原和抗体仅仅是通过一小部分即抗原决定基来相互作用的原理而建立的一种方法，所谓的抗原决定基是由三到六个氨基酸残基组成的表面区域(Rachkov A，MinouraN.Biochi et Biophy Acta，2001，1544：255～266)。如果使用代表蛋白质或多肽结构的小部分裸露片段的短肽作为模板，就会产生与该短肽相匹配的空间大孔，从而分子印迹聚合物就会识别含有该短肽部分的整个蛋白质分子。抗原决定基方法的缺点是不仅可以识别模板分子，还可以识别其他的具有与模板分子相同序列的氨基酸和蛋白质。

从上述情况来看，目前印迹蛋白质方法单一，单体聚合发生在有机溶剂中，用以印迹的蛋白质种类少且均为常见的、在生物体内含量很大或很容易得到的蛋白质，这限制了蛋白质印迹聚合物的应用的实际意义。因此开发印迹蛋白质的新方法，尤其是用以吸附、富集天然微量蛋白质的分子印迹聚合物是迫切需要解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提出一种分离与富集蛋白质的分子印迹树脂和制备方法，即它是将一段带有随机分布功能基团的识别分子引入识别体系，该识别分子与作为模板的克隆蛋白质先进行自组装，然后组装体与自由单体丙烯酰胺共同以聚丙烯酸甲酯大孔树脂为载体在水相中进行交联聚合。本发明成球在有机相中进行，印迹在水相中进行，避免了对模板蛋白质的破坏，实用性强。以克隆蛋白质为模板的方法克服了天然微量蛋白质的印迹模板难以得到的瓶颈。使用免疫印迹的方法检测吸附蛋白及其洗涤过程，这种检测方法能够在天然细胞提取物的复杂的蛋白质混合体系中特异性地检测出目标蛋白质的含量且灵敏度高，直观准确，目标蛋白质在总蛋白质中的含量提高了300倍以上。。

本发明提供的分子印迹树脂的孔径为20nm，小球直径为0.2mm，按以下步骤制备：

1)以丙烯酸丁酯为单体，在引发剂、催化剂和配位剂存在下，通过原子转移自由基聚合反应合成聚合度为30的链聚合物，水解后与烯丙基氯进行部分取代反应，取代后的侧基由于带有双键，可以被引发聚合从而锚定到也带有悬挂双键的大孔微球表面，故称为锚定基团，通过氯含量测试实验证实，有20％的羧基未发生取代反应，这些未取代的羧基可以和蛋白质表面的带正电荷的基团作用，所以称为识别基团；

2)以克隆蛋白质为模板与识别分子在水溶液中进行组装，用丙烯酸甲酯聚合而成的大孔微球对识别分子/模板蛋白质组装体进行吸附，接着在体系中加入丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺，在引发剂过二硫酸胺作用下，组装体中识别分子锚定基团侧链的双键和微球表面的双键进行交联共聚，把辅助识别聚合物链固定到载体小球上；

3)用高离子强度的缓冲溶液洗脱蛋白质和未聚合的识别分子，彻底去除残留蛋白质，用聚丙烯酰胺凝胶电泳/硝酸银染色的方法检测是否有残留的蛋白质，得到分子印迹树脂。

所述的识别分子是聚合度为30的低分子量聚丙烯酸进行部分取代反应的产物，该聚合物链上具有随机分布的识别基团与锚定基团，其中识别基团含量20％，锚定基团含量80％。

所述的克隆蛋白质是克隆的猪亲环素18蛋白质。

一种制备分子印迹树脂的方法包括以下步骤：

1)在120℃，α-氯代苯乙烷为引发剂，氯化亚铜为催化剂，联二吡啶为配位剂，丙烯酸丁酯聚合反应8～10h，然后70℃在5％的NaOH溶液中水解6h，制得聚丙烯酸，聚合度在30左右；α-氯代苯乙烷、氯化亚铜、联二吡啶的摩尔比为1∶1∶3；

2)在室温，充分搅拌下缓慢滴加烯丙基氯，烯丙基氯与聚丙烯酸摩尔比为24∶1，产物通过溴加成一紫外分光光度法测定其双键含量，滴加稀HCl溶液调节pH值使溶液为酸性，产生絮状沉淀，离心分离后，制得功能基化后的聚丙烯酸，即为识别分子。

3)将识别分子10mg与克隆的猪亲环素18蛋白质400μg混合，在4℃进行自组装12h～15h，然后向溶液中加入1g丙烯酸酯大孔微球树脂载体，吸附2h后加入38.8mg丙烯酰胺、1.2mg N，N-亚甲基双丙烯酰胺、1.28mg过二硫酸铵，常温下通氮除氧1h，然后加入0.65mg N，N，N′，N′-四甲基二乙胺溶液，交联聚合反应2h，用2M氯化钾溶液洗涤树脂球至电泳检测无条带，得到分子印迹树脂。

步骤1)所述的丙烯酸丁酯与α—氯代苯乙烷的质量比为28∶1。

步骤2)所述的烯丙基氯与聚丙烯酸摩尔比为24∶1，即聚合度为30的聚丙烯酸链上有80％的羧基发生反应，其余20％的羧基未发生反应。

所述的分子印迹树脂在分离、富集天然蛋白质上的应用。

所述的分子印迹树脂制成的用于蛋白质分离的试剂盒，包括识别分子、丙烯酰胺单体及引发体系和丙烯酸甲酯大孔树脂。

本发明提供的所述的分子印迹树脂应用于蛋白质分离的方法包括下述步骤：

(1)4℃下，将计量的分子印迹树脂直接放入猪白细胞提取物中，吸附15h；

(2)吸附蛋白后的树脂依次用10mM Tris-HCl(pH 7.5)缓冲液洗10次，每次1mL，再用1mL含10mM Tris-HCl(pH 7.5)和300mM氯化钾的缓冲溶液洗涤树脂，得到洗涤液；

(3)应用Bradford法检测氯化钾缓冲溶液的洗涤液，得出总蛋白含量；再取200μL洗涤液，用三氯乙酸/脱氧胆酸纳(TCA/DOC)方法沉淀蛋白，蛋白液制样后恒流走十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，用猪亲环素18的抗体对其做免疫印迹检测吸附蛋白中亲环素1 8的含量，从而得出在所吸附蛋白质中亲环素1 8与总蛋白质含量的比值。

本发明可做成试剂盒，即包括：识别分子、丙烯酰胺单体及引发体系和丙烯酸甲酯大孔树脂。

本发明得到的分子印迹树脂在天然的细胞提取物中，能够极大地富集目标蛋白质，目标蛋白质在总蛋白质中的含量提高了300倍以上。

本发明不同于其他印迹蛋白质的方法有两点，其一是引入了用以辅助识别的识别分子，本发明中的识别分子是具有多识别位点的，且这些识别位点是随机分布的，这种方法克服了通常由单纯的单体制备的识别体系识别位点单一、结构紧密蛋白质不易洗脱的弊端。同时这种方法使得成球与印迹可以分步进行，成球在有机相中进行，印迹在水相中进行，避免了对模板蛋白质的破坏，实用性强。其二是本发明使用克隆的蛋白质作为模板，克服了印迹天然微量蛋白质时模板无法得到的瓶颈，而这一点正是蛋白质印迹技术无法取得更多的应用价值的主要困难之一。

附图说明

图1：分子印迹树脂的对目标蛋白质吸附效果的测定。

图2：分子印迹树脂再生性的测定。

具体实施方式

实施例1.

α-氯代苯乙烷为引发剂0.3004g，氯化亚铜为催化剂0.2135g，联二吡啶为配位剂1.0000g，与丙烯酸丁酯4.1051g一同加入封管中，即α-氯代苯乙烷、氯化亚铜、联二吡啶的摩尔比为1∶1∶3。丙烯酸丁酯与α-氯代苯乙烷的质量比为28∶1。封管经过反复通氮气、抽真空后，于120℃反应8h，所得产物加入100mL 10％的氢氧化钠溶液在70℃水解6h，溶液完全澄清后，降至室温，充分搅拌下缓慢滴加烯丙基氯，烯丙基氯与聚丙烯酸摩尔比为24∶1，产物通过溴加成一紫外分光光度法测定其双键含量，结果证实，聚合度为30的聚丙烯酸链上有80％的羧基带有双键，其余20％的羧基未发生反应不带有双键，滴加稀HCl溶液调节pH值使溶液为酸性，产生絮状沉淀，离心分离后，制得功能基化后的聚丙烯酸，聚合度在30左右，即为识别分子。

取识别分子1g，溶于100 mL10 mM Tris-HCl(pH 7.8)缓冲液中，分装贮存。取上述溶液1mL，加入1mL含有400μg克隆猪亲环素18的蛋白质溶液，于4℃旋转12h，然后向溶液中加入1g丙烯酸酯树脂载体(大孔微球)吸附2h，接着加入38.8mg丙烯酰胺、1.2mgN，N-亚甲基双丙烯酰胺、1.28mg过二硫酸铵，常温下通氮除氧1h，然后加入0.65mgN，N，N′，N′-四甲基二乙胺溶液，交联聚合反应2h，用2mol.L^-1氯化钾溶液洗涤树脂球至电泳检测无条带，得到分子印迹树脂。

4℃下，将上述分子印迹树脂与1mL猪白细胞提取物混合，吸附15h；吸附蛋白后的树脂依次用10 mM Tris-HCl(pH 7.5)缓冲液洗10次，每次1mL，再用1mL含10mM Tris-HCl(pH 7.5)的300 mM氯化钾溶液洗涤树脂，得到洗涤液；应用Bradford法检测氯化钾溶液的洗涤液以及猪白细胞提取物溶液，得出总蛋白含量；再取200μL洗涤液，用三氯乙酸/脱氧胆酸纳(TCA/DOC)方法沉淀蛋白，蛋白液制样后恒流走十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，用猪亲环素18的抗体对其做免疫印迹检测吸附蛋白中亲环素18的含量，从而得出在所吸附蛋白质中亲环素18与总蛋白质含量的比值，同样的方法亦可测得猪白细胞提取物溶液中亲环素18的含量。结果如图1所示，在0.08μL猪白细胞提取物中总共含蛋白质0.1μg，在其中检测不到亲环素18(第一泳道)；在20μL猪白细胞提取物中总共含蛋白质26μg，其中有6ng亲环素18(第二泳道)；而在200μL的洗涤液总共含有蛋白质0.1μg，其中有7ng亲环素18(第三泳道)，所以在1mL猪白细胞提取物中亲环素18在总蛋白质中所占比例为300 ng/1.3mg(即0.023％)，而在1mL洗脱液中亲环素18在总蛋白质中所占比例为35ng/0.5μg(即7％)，目标蛋白质在总蛋白质中的含量提高了300倍。

溴加成一紫外分光光度法测定双键含量：

1.配制溶液

取86mL48％的氢溴酸(密度1.49)、32mL水和882mL冰乙酸，充分混合制成“对照溶液”。取500mL对照溶液，加入3.25mL溴，配得“三溴溶液”。

2.以对照溶液为参比，在410nm处测量三溴溶液的吸光度值，稳定后加入100μL识别分子溶液，稳定1分钟后测量其吸光度值。

3.根据吸光度变化，换算可知溴的减少量，从而得到识别分子溶液中双键的含量。

克隆蛋白质猪亲环素18的制备方法：

1.目的基因的克隆

本实验采用猪肝脏mRNA为模板进行反转录PCR(RT-PCR)，并将PCR产物与质粒载体pGEX-5X1进行限制性内切酶修饰，待连接后转化入大肠杆菌DH5α中并进行质粒鉴定。

(1)在200mL的薄壁PCR管中，按下列顺序依次加入所需各组分进行PCR反应；

(2)称取0.75g琼脂糖，加入50mL 1×TAE，混匀后加热至沸腾，取出后待稍冷时加入2μL溴化乙锭(EB)溶液(10 mg/mL)，将胶液倒入电泳槽的胶台上，并插入梳子；从100μL的反应体系中，取出16μL样品，加4μL5×加样缓冲液；将20μL样品全部加入电泳胶的齿孔中，倒入1×TAE直至没过胶面，在80V下进行电泳，结束后于紫外灯下观察结果。

(3)在PCR产物中加入1/10体积的NaAc溶液(3 M，pH 5.2)，混匀后加入2.5倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀20 min；于4℃、12,000 rpm离心15min；弃去上清，用1mL70％乙醇洗涤；再次于4℃、12,000 rpm离心15 min；弃去上清，真空干燥沉淀30min，DNA量多时在管壁上呈无色透明的膜状物；加1.4μL灭菌水，使之溶解，然后按照下列配比向管中依次加入两种限制性内切酶，建立酶切体系；取2μL浓度为450ng/mL的pGEX-5X1质粒，也加入同样的两种限制性内切酶，建立酶切体系。

(5)在20μL酶切产物中加5μL 5×加样缓冲液，混匀、离心。灌制浓度为1.5％的琼脂糖凝胶，上样，80V下进行电泳。等染料前沿走至胶的一半时，在紫外灯下观察，迅速将目的条带切下；将凝胶块放入充满1×TAE电泳缓冲液的透析袋内一侧，放入电泳槽使凝胶一侧靠近负极，80V电泳，使DNA在电场的作用下从凝胶迁移到缓冲液中。电泳1h后，加反向电压100V，反洗脱60sec；将透析袋中的液体吸入一灭菌的1.5mL离心管中(约500μL)，加等体积的三合一酚，剧烈振荡10sec，室温离心15 sec，将上层含DNA的水相转入另一新管中；加入等体积的氯仿，剧烈振荡10 sec，离心15 sec，将上层含DNA的水相转入另一新管中；加入1/10体积的NaAC(3M，pH 5.2)溶液，稍振荡后加入2.5倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀20min；于4℃、12,000rpm离心15min；弃去上清，加入1mL70％无水乙醇，洗涤沉淀；再次于4℃、12,000rpm离心15min；弃去上清，真空干燥DNA沉淀30 min；将干燥的沉淀溶于实验所需量的水中；pGEX-5X1质粒的酶切产物也做相同处理；取待插入的DNA和质粒DNA，建立连接体系。

(6)挑取E.Coli.DH5α原菌的单克隆菌落于2mLLB培养基中，37℃过夜培养；次日将菌液1∶100稀释到50mL新鲜的LB培养基中，37℃继续振荡培养至菌液的OD600值为0.3(约4-6小时)；将50mL菌液分装至两个灭菌的离心管中，在冰上放置10min，于4℃、4,000 rpm离心10min；弃上清用10mL冰预冷的10mM NaCl重悬细菌沉淀；于4℃、4,000rpm离心10min；弃上清，用10mL冰预冷的50 mMCaC12重悬细菌并冰上放置20min；于4℃、4,000 rpm离心10min；弃上清，加1mL冰预冷的50mMCaC12重悬细胞，即为感受态细胞。可将制得的感受态细胞以200mL(含15％甘油)分装，-80℃冻存；

(7)取200μL感受态细胞，加5μL连接产物，轻旋混匀；同时另取200μL感受态细胞，完全不加DNA作为负对照，于冰上放置1hr；42℃水浴加热90 sec后迅速转移至冰水中冷却1～2min；每管补加800 mL的LB培养基，37℃温育45 min使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素标记基因；取含目的DNA的菌液200μL涂于AMP(50μg/mL)固体培养基平皿上，剩余800μL涂于另一平皿上，而不加DNA的菌液取500μL涂于一平皿上作为对照；将平皿置于无菌洁净工作台中至液体完全被吸收，然后倒置平皿，于恒温培养箱中37℃培养12～16 hr。

(8)挑取平板上某一单克隆，加入液体LB培养基2mL，过夜培养。将菌液在一新的平板上画线过夜培养后贮存于4℃。其余菌液取10μL Glutathione SepharoseTM4B珠子混合后电泳进行小样蛋白检测。

2.目的蛋白的诱导表达及提纯

(1)挑取单菌落于20mL LB/AMP(50μg/mL)培养基中，37℃过夜培养。

(2)次日按1∶100稀释到2L新鲜的LB/AMP(50μg/mL)培养基中，37℃继续培养至OD600值为0.4～0.6(约7～8 h)。

(3)达到确定的OD600值后，将培养温度调至20℃，继续培养30 min。

(4)加IPTG至终浓度为0.1mM，20℃诱导1～2h。

(5)将培养物于4℃、5,000 rpm离心15 min，弃上清并倒置数分钟使残留液体流尽，用少量冰预冷的MTPBS洗涤细胞1～2次，离心去除洗涤液。

(6)用相当于1/50～1/100培养体积的MTPBS重悬细胞，加PMSF至终浓度为0.1mM并挑加少量溶菌酶，于液氮及37℃水浴中反复冻融3次以破碎细胞。

(7)挑加DNase，反复颠倒几次，以解离双链DNA，使细菌裂解液的粘度明显降低。

(8)按1∶100(v/v)的比例加入Triton X-100，4℃旋转混合30min，以促进蛋白溶解性。

(9)4℃，10,000 rpm离心10min  (可适当加大离心转速和时间，这有利于细胞的破碎)。

(10)收集上清，沉淀和上清分别取样待做电泳检测。

(11)上清中加入预溶胀过的亲和层析珠Glutathione SepharoseTM 4B 100～200μL(珠体积)，4℃旋转结合40～60min。

(12)自然沉降或稍做离心，去上清，珠子用预冷的MTPBS洗涤3～4次。

(13)珠子用预冷的50mM Tris·Cl(pH 8.0)平衡1～2次。

(14)将珠子小心地转移至1.5 mL离心管中，定容后取样作蛋白含量测定。

(15)珠子用凝血因子Xa的缓冲液洗涤3～4次。

(16)根据电泳图估算珠子上融合蛋白的含量，加入50μL(0.5u/μL)凝血因子Xa和450μL凝血因子Xa缓冲液，4℃酶切1 6 h。

(17)将珠子稍离心，上清转移至一干净离心管中；再离心，上清转移至另一干净管中；再一次离心，上清即为所要的蛋白溶液。这样反复离心是为了彻底除去蛋白溶液中残留的珠子。

(18)在珠子中加入500 μL凝血因子Xa缓冲液，温和振荡洗涤珠子。如步骤3取上清。

(19)洗涤珠子6次，得到六个蛋白样品。从每个样品中各取出10μL加10μL 2×SDS样品缓冲液，电泳检测切下的目的蛋白含量。

三氯乙酸/脱氧胆酸纳(TCA/DOC)沉淀蛋白质方法

材料：  5％脱氧胆酸钠溶液

30％三氯乙酸溶液

3.2M氢氧化钠溶液

4.十二烷基磺酸钠(1×SDS)样品缓冲液组成：

Tris·Cl(pH 6.8)    50 mM

DTT(二硫苏糖醇)     100 mM

SDS                 2％

溴酚蓝              0.1％

甘油                10％

步骤：1.向1mL上述各蛋白液中加入10μL5％脱氧胆酸钠溶液后混匀，然后加480μL30％三氯乙酸，混匀后于4℃放置2h或冰浴中放置30min。

2.4℃、10,000 rpm离心 25min，去上清。

3.10,000rpm离心25min，去尽残留液体。

4.沉积物中加入50μL一倍样品液重悬，如果呈黄色或有沉淀，则加1～2μL2M氢氧化钠溶液将颜色调至蓝色并使之完全溶解。

5.99℃煮沸5min，3000rpm离心 10s后即可直接上样走电泳。

作为对照，我们还做了无模板蛋白质的印迹(即识别分子不与克隆蛋白质自组装而直接交联聚合锚定到大孔微球表面)和无识别分子的印迹(即克隆蛋白质不与识别分子自组装而直接被大孔微球吸附，然后引发聚合)，结果如图一中第四、第五泳道所示，无明显的富集效果。

图1：分子印迹树脂的对目标蛋白质吸附效果的测定。其中A图为十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳并以硝酸银染色的电泳结果；B图为用猪亲环素18的抗体对相同样品做免疫印迹得到的结果；第一泳道样品为0.08μL猪白细胞提取物；第二泳道样品为20μL猪白细胞提取物；第三泳道样品为200μL分子印迹树脂洗涤液。实施例2.

上例中使用过的分子印迹树脂用2mol.L-1氯化钾溶液洗涤树脂球至电泳检测无条带。加1mL猪白细胞提取物，用同样的方法吸附、洗脱和检测，然后再重复一次。结果两次再生重复使用的吸附效果如图2所示，与第一次吸附效果基本无差别。

图2：分子印迹树脂再生性的测定。第一泳道样品为200μL分子印迹树脂洗涤液；第二泳道样品为200μL分子印迹树脂再生后重复使用的洗涤液；第三泳道样品为200μL分子印迹树脂又一次再生后重复使用的洗涤液。

Claims (9)

1.一种分子印迹树脂，其特征在于，它的孔径为20nm，小球直径为0.2mm，按以下步骤制备：

1)以丙烯酸丁酯为单体，在引发剂、催化剂和配位剂存在下，通过原子转移自由基聚合反应合成聚合度为30的链聚合物，水解后与烯丙基氯进行部分取代反应，取代后的侧基作为锚定基团，未取代的羧基作为识别基团从而得到识别分子；

2)以克隆蛋白质为模板与识别分子在水溶液中进行组装，用丙烯酸甲酯聚合而成的大孔微球对识别分子/模板蛋白质组装体进行吸附，接着在体系中加入丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺，在引发剂过二硫酸胺作用下，组装体中识别分子锚定基团侧链的双键和微球表面的双键进行交联共聚，把辅助识别聚合物链固定到载体小球上；

3)用高离子强度的缓冲溶液洗脱蛋白质和未聚合的识别分子，彻底去除残留蛋白质，用聚丙烯酰胺凝胶电泳/硝酸银染色的方法检测是否有残留的蛋白质，得到分子印迹树脂。

2.根据权利要求1所述的分子印迹树脂，其特征在于，所述的识别分子是聚合度为30的低分子量聚丙烯酸进行部分取代反应的产物，该聚合物链上具有随机分布的识别基团与锚定基团，其中识别基团含量20％，锚定基团含量80％。

3.根据权利要求1所述的分子印迹树脂，其特征还在于，所述的克隆蛋白质是克隆的猪亲环素18蛋白质。

4.一种制备权利要求1所述的分子印迹树脂的方法，其特征在于它包括以下步骤：

1)在120℃，α-氯代苯乙烷为引发剂，氯化亚铜为催化剂，联二吡啶为配位剂，丙烯酸丁酯聚合反应8～10h，然后70℃下在含5％的NaOH溶液中水解6h，制得聚丙烯酸，聚合度30；α-氯代苯乙烷、氯化亚铜、联二吡啶的摩尔比为1∶1∶3；

2)在室温，充分搅拌下缓慢滴加烯丙基氯，烯丙基氯与聚丙烯酸摩尔比为24∶1，产物通过溴加成-紫外分光光度法测定其双键含量，滴加稀HCl溶液调节pH值使溶液为酸性，产生絮状沉淀，离心分离后，制得功能基化后的聚丙烯酸，即为识别分子。

3)将识别分子10mg与克隆的猪亲环素18蛋白质400μg混合，在4℃进行自组装12h～15h，然后向溶液中加入1g丙烯酸酯大孔微球树脂载体，吸附2h后加入38.8mg丙烯酰胺、1.2mg N，N-亚甲基双丙烯酰胺、1.28mg过二硫酸铵，常温下通氮除氧1h，然后加入0.65mg N，N，N′，N′-四甲基二乙胺溶液，交联聚合反应2h，用2M氯化钾溶液洗涤树脂球至电泳检测无条带，得到分子印迹树脂。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤1)所述的丙烯酸丁酯与α-氯代苯乙烷的质量比为28∶1。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤2)所述的烯丙基氯与聚丙烯酸摩尔比为24∶1，即聚合度为30的聚丙烯酸链上有80％的羧基发生反应，其余20％的羧基未发生反应。

7.权利要求1所述的分子印迹树脂在分离与富集天然蛋白质上的应用。

8.权利要求1所述的分子印迹树脂制成的用于蛋白质分离的试剂盒，包括识别分子、丙烯酰胺单体及引发体系和丙烯酸甲酯大孔树脂。

9.一种权利要求1所述的分子印迹树脂应用于蛋白质分离的方法，其特征在于包括下述步骤：

(1)4℃下，将计量的分子印迹树脂直接放入猪白细胞提取物中，吸附15h；

(2)吸附蛋白后的树脂依次用10mM pH 7.5的Tris-HCl缓冲液洗10次，每次1mL，再用1mL含10mM pH 7.5的Tris-HCl和300mM氯化钾的缓冲溶液洗涤树脂，得到洗涤液；

(3)应用Bradford法检测氯化钾缓冲溶液的洗涤液，得出总蛋白含量；再取200μL洗涤液，用三氯乙酸/脱氧胆酸纳方法沉淀蛋白，蛋白液制样后恒流走十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，用猪亲环素18的抗体对其做免疫印迹检测吸附蛋白中亲环素18的含量，从而得出在所吸附蛋白质中亲环素18与总蛋白质含量的比值。

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