CN103232613B - 双亲性寡肽对聚甲基丙烯酸甲酯微流控芯片表面改性方法 - Google Patents
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Abstract
一种双亲性寡肽对聚甲基丙烯酸甲酯微流控芯片表面改性方法，以双亲性寡肽作为动态修饰剂，再用修饰剂对聚甲基丙烯酸甲酯微流控芯片进行修饰，使其具有亲水性和抗生物污染性。本发明操作简单，微流控芯片的微通道不易堵塞，经修饰的微流控芯片对生物样品氨基酸、多肽和蛋白质的分离效果好，提高了聚甲基丙烯酸甲酯微流控芯片的分析性能，拓展了其在生化分析中的应用。
Description
技术领域
本发明属于微流控芯片电泳分离技术应用领域，具体涉及一种用双亲性寡肽修饰剂表面修饰聚甲基丙烯酸甲酯微流控芯片，实现对蛋白质和多肽等分析物的高效分离分析。
背景技术
自从20世纪90年代初瑞士的Manz等提出微全分析系统的概念以来，微流控芯片的技术得到了快速的发展。因成本低、品种多、光学性能各异及加工工艺多样，多种有机聚合物包括热塑性的聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酯和弹性的聚二甲基硅氧烷等已广泛用于微流控芯片的制备。其中，聚甲基丙烯酸甲酯是目前较为常用的一种微流控芯片基体材料，但因其表面的高疏水性、生物兼容性差和对分析物的吸附严重，导致微流控芯片功能低下或失效，如芯片电泳分离效率下降、峰高降低甚至不出峰等，极大地限制了聚甲基丙烯酸甲酯微流控芯片的应用前景。因此，表面改性是决定聚甲基丙烯酸甲酯微流控芯片发展与前途的关键课题之一。
目前微流控芯片的表面改性方法主要有化学键合涂层和物理吸附涂层二种方法。化学键合涂层法主要源于玻璃表面的改性，其核心是利用玻璃及石英表面的硅羟基通过化学反应将纤维素、聚丙烯酰胺或苯基甲基硅烷等高分子聚合物化学键合到毛细管壁，形成稳定的化学键合涂层，多用于DNA和蛋白质的尺寸分离。但化学键合涂层的制备步骤繁琐，反应条件苛刻且涂层寿命短，基本不适用于低成本塑料微流控芯片的表面改性。物理吸附是利用表面活性分子在固/液界面的自发吸附现象，在固体表面形成物理吸附涂层，从而克服样品分子在芯片通道表面的非特异性吸附，实现高效重现的芯片电泳分离即所谓的动态涂层修饰法，是目前聚甲基丙烯酸甲酯芯片最为常用的一种表面修饰方法，其操作十分简单，只需向电泳缓冲液中加入少量的表面改性物质，如表面活性剂或水溶性高分子聚合物，并让缓冲液和芯片通道管壁平衡即可，具有操作简便，涂层再生容易等优点，但涂层结合强度较化学键合法差。常用的表面修饰材料包括小分子的表面活性剂，如十二烷基磺酸钠、十二烷基-β-D-麦芽糖苷和高分子水溶性聚合物（如甲基纤维素、羟乙基纤维素和聚乙二醇）等。现存的表面修饰材料无论是小分子的表面活性剂还是高分子水溶性聚合物均在较高浓度时才能有效地抑制荧光染料、DNA和多寡糖链等样品分子非特异性吸附的作用，取得较好的表面改性效果和高效重现的分离，但上述表面改性材料因涂层的结合强度较低，均无法有效地抑制蛋白质的非特异性吸附，峰低、峰宽和不出峰的现象常见，无法实现蛋白质等高效快速分离分析。此外，高浓度的高分子聚合物及表面活性剂可显著地增加缓冲液的粘度或离子强度，导致微流体操控如缓冲液的填充、冲洗及进样等困难、焦耳热增加、装置效率下降、蛋白质和酶的变性失活及限制微流控芯片-质谱在线联用等诸多问题。
因此，设计和发展新型表面改性材料与方法，是克服蛋白质在微流控芯片表面吸附问题的关键所在，以实现蛋白质等生物分子的高效分离分析，推动聚甲基丙烯酸甲酯微流控芯片等低成本塑料微流控芯片在蛋白质组学等生命科学领域中的广泛应用，促进高集成高通量及微流控芯片-质谱在线连用等技术的发展。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服上述微流控芯片表面改性方法存在的问题，提供一种操作简单、通道不易堵塞的双亲性寡肽对聚甲基丙烯酸甲酯微流控芯片表面改性方法。
解决上述技术问题所采用的技术方案由下述步骤组成：
1、配制双亲性寡肽修饰剂
将双亲性寡肽溶解于pH值为9.4的20mmol/L硼砂缓冲溶液中，配制成0.1～1mg/mL的双亲性寡肽修饰剂，放入-20℃冰箱中备用。
上述的双亲性寡肽由西安吉诺泰生物科技有限公司提供，其序列为：AC-AEAEARAKAEAEARAK-NH2，结构式如下：
2、甲基丙烯酸甲酯微流控芯片的预处理
将聚甲基丙烯酸甲酯微流控芯片依次用0.1～1mol/L的NaOH水溶液、去离子水、pH值为9.4的20mmol/L硼砂缓冲溶液冲洗3～5次。
3、聚甲基丙烯酸甲酯微流控芯片的表面修饰
将步骤1配制的双亲性寡肽修饰剂注入步骤2预处理后的聚甲基丙烯酸甲酯微流控芯片的微通道中，充满，得到双亲性寡肽表面修饰的聚甲基丙烯酸甲酯微流控芯片。
本发明的配制双亲性寡肽修饰剂步骤1中，将双亲性寡肽解于pH值为9.4的20mmol/L硼砂缓冲溶液中，最佳配制成1mg/mL的双亲性寡肽修饰剂，放入-20℃冰箱中备用。
本发明方法操作简单，通道不易堵塞；经本方法修饰的微流控芯片对氨基酸、多肽和蛋白质的分离效果好，提高了柱效，本方法适用于对微流控芯片的通道进行动态修饰，拓展了聚甲基丙烯酸甲酯微流控芯片在电泳中的应用。
附图说明
图1是聚甲基丙烯酸甲酯微流控芯片的结构示意图，图中1是样品池，2是样品废液池、3是缓冲液池、4是缓冲废液池、5是微通道。
图2是未修饰的聚甲基丙烯酸甲酯微流控芯片分离苯丙氨酸和精氨酸的电泳谱图。
图3是实施例1、2、3得到的双亲性寡肽表面修饰的聚甲基丙烯酸甲酯微流控芯片分离苯丙氨酸和精氨酸的电泳谱图。
图4是实施例1得到的双亲性寡肽修饰的聚甲基丙烯酸甲酯微流控芯片分离核糖核酸酶A、β-乳球蛋白和胰凝乳蛋白酶原A的电泳谱图。
图5是实施例1得到的双亲性寡肽修饰的聚甲基丙烯酸甲酯微流控芯片分离多肽AE16-II和AR16-II的电泳谱图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。
实施例1
1、配制双亲性寡肽修饰剂
将1mg双亲性寡肽加入1mL pH值为9.4的20mmol/L硼砂缓冲溶液中，振荡使其完全溶解，得到1mg/mL的双亲性寡肽修饰剂，放入-20℃冰箱中备用。
上述的双亲性寡肽由西安吉诺泰生物科技有限公司提供，其序列为：AC-AEAEARAKAEAEARAK-NH2，结构式如下：
2、聚甲基丙烯酸甲酯微流控芯片的预处理
如图1所示，先将聚甲基丙烯酸甲酯微流控芯片用0.1mol/L的NaOH水溶液冲洗3次，然后依次用去离子水和pH值为9.4的20mmol/L硼砂缓冲溶液分别冲洗3～5次。
3、聚甲基丙烯酸甲酯微流控芯片的表面修饰
如图1所示，用移液器吸取10μL步骤1配制的双亲性寡肽修饰剂加入步骤2预处理后的聚甲基丙烯酸甲酯微流控芯片的缓冲废液池4中，然后用注射器压入微通道5中，使双亲性寡肽修饰剂充满微通道5，得到双亲性寡肽表面修饰的聚甲基丙烯酸甲酯微流控芯片。
实施例2
在实施例1的配制双亲性寡肽修饰剂步骤1中，将1mg双亲性寡肽加入10mLpH值为9.4的20mmol/L硼砂缓冲溶液中，振荡使其完全溶解，得到0.1mg/mL的双亲性寡肽修饰剂，然后用放入-20°C冰箱中备用。其他步骤与实施例1相同，得到双亲性寡肽表面修饰的聚甲基丙烯酸甲酯微流控芯片。
实施例3
在实施例1的配制双亲性寡肽修饰剂步骤1中，将1mg双亲性寡肽加入2mL pH值为9.4的20mmol/L硼砂缓冲溶液中，振荡使其完全溶解，得到0.5mg/mL的双亲性寡肽修饰剂，然后用放入-20℃冰箱中备用。其他步骤与实施例1相同，得到双亲性寡肽表面修饰的聚甲基丙烯酸甲酯微流控芯片。
实施例4
在实施例1～3的甲基丙烯酸甲酯微流控芯片的预处理步骤2中，先将聚甲基丙烯酸甲酯微流控芯片用1mol/L的NaOH水溶液冲洗3～5次，然后依次用去离子水和pH值为9.4的20mmol/L硼砂缓冲溶液分别冲洗3～5次。其他步骤与相应实施例相同，得到双亲性寡肽表面修饰的聚甲基丙烯酸甲酯微流控芯片。
为了证明本发明的有益效果，发明人采用实施例1～3得到的双亲性寡肽表面修饰的聚甲基丙烯酸甲酯微流控芯片进行了各种试验，具体试验情况如下：
1、分离氨基酸
以苯丙氨酸和精氨酸为样品，分别在未修饰的聚甲基丙烯酸甲酯微流控芯片以及实施例1、2、3得到的双亲性寡肽表面修饰的聚甲基丙烯酸甲酯微流控芯片中进行电泳分析，具体方法如下：
将7.8mg异硫氰酸荧光素溶于4mL丙酮中，配制成异硫氰酸荧光素的丙酮溶液；将1μL2×10-3mol/L的氨基酸水溶液加入1μL异硫氰酸荧光素的丙酮溶液中，再加入8μL pH值为10的20mmol/L硼砂缓冲液，暗室放置过夜，用蒸馏水稀释至氨基酸的浓度为2×10-6mol/L，配制成待测样品。如图1所示，分别向未修饰的聚甲基丙烯酸甲酯微流控芯片以及实施例1、2、3得到的双亲性寡肽修饰的聚甲基丙烯酸甲酯微流控芯片的样品废液池2、缓冲液池3、缓冲废液池4加入双亲性寡肽修饰剂，样品池1中加入待测样品，进行电泳分析，具体的电泳进样及分离的电压条件如表1所示，分析结果见图2和3。
表1电泳分析的电压条件
由图2可见，未获得两种氨基酸的峰信号，重复进样和分离几十次，仍得不到两种氨基酸的峰信号，说明未修饰的聚甲基丙烯酸甲酯微流控芯片通道表面严重吸附氨基酸样品。由图3可见，以实施例1得到的双亲性寡肽修饰的聚甲基丙烯酸甲酯微流控芯片分离苯丙氨酸和精氨酸，两种氨基酸的理论塔板数分别为2.47×105/m和2.5×105/m，RSD分别为1.9%和1.7%；以实施例2得到的双亲性寡肽修饰的聚甲基丙烯酸甲酯微流控芯片分离苯丙氨酸和精氨酸，氨基酸的分离时间较长；以实施例3得到的双亲性寡肽修饰的聚甲基丙烯酸甲酯微流控芯片分离苯丙氨酸和精氨酸，两种氨基酸的迁移时间分别为32.41秒和47.68秒、理论塔板数分别为1.19×105/m和1.27×105/m、RSD分别为2.3%和2.1%。兼顾重现性和分离效率，由实验结果可见实施例1得到的双亲性寡肽修饰的聚甲基丙烯酸甲酯微流控芯片分离苯丙氨酸和精氨酸的效果最好。
2、分离蛋白质
以乳球蛋白、核糖核酸酶A和胰凝乳蛋白酶原A为样品，在实施例1得到的双亲性寡肽表面修饰的聚甲基丙烯酸甲酯微流控芯片中进行电泳分析，具体方法如下：
将7.8mg异硫氰酸荧光素溶于4mL丙酮中，配制成异硫氰酸荧光素的丙酮溶液；将20μL1mg/mL的蛋白质水溶液加入20μL异硫氰酸荧光素的丙酮溶液中，再加入160μL pH值为10的20mmol/L硼砂缓冲液，用葡聚糖凝胶G-50过滤，配制成待测样品，放入冰箱中-20℃保存。按照试验1的方法进行电泳分析，分析结果见图4，图中1是乳球蛋白的信号峰，2是异硫氰酸荧光素的信号峰，3是核糖核酸酶A的信号峰，4是胰凝乳蛋白酶原A的信号峰。
由图4可见，蛋白质峰形较好，无明显的拖尾，说明双亲性寡肽表面修饰的聚甲基丙烯酸甲酯微流控芯片能够分离乳球蛋白、核糖核酸酶A和胰凝乳蛋白酶原A，异硫氰酸荧光素标记三种蛋白质在双亲性寡肽表面修饰的聚甲基丙烯酸甲酯微流控芯片上无明显的吸附。
3、分离多肽
以多肽AE16-II和AR16-II为样品，在实施例1得到的双亲性寡肽表面修饰的聚甲基丙烯酸甲酯微流控芯片中进行电泳分析，具体方法如下：
多肽AE16-II的序列为AC-AEAEAEAEAEAEAEAE-NH2，AR16-II的序列为AC-ARARARARARARARAR-NH2，均由西安吉诺泰生物科技有限公司提供。按照试验1的方法配制待测样品并进行电泳分析，分析结果见图5，图中1是AE16-II的信号峰，2是异硫氰酸荧光素的信号峰，3是AR16-II的信号峰。
由图5可见，多肽的峰形较好，无明显的拖尾，说明双亲性寡肽表面修饰的聚甲基丙烯酸甲酯微流控芯片能够分离多肽AE16-II和AR16-II，异硫氰酸荧光素标记两种多肽在双亲性寡肽表面修饰的聚甲基丙烯酸甲酯微流控芯片上无明显的吸附。
Claims (2)
1.一种双亲性寡肽对聚甲基丙烯酸甲酯微流控芯片表面改性方法，其特征在于它由下述步骤组成：
（1）配制双亲性寡肽修饰剂
将双亲性寡肽溶解于pH值为9.4的20mmol/L硼砂缓冲溶液中，配制成0.1～1mg/mL的双亲性寡肽修饰剂，放入-20℃冰箱中备用；
上述的双亲性寡肽的序列为：AC-AEAEARAKAEAEARAK-NH2；
（2）甲基丙烯酸甲酯微流控芯片的预处理
将聚甲基丙烯酸甲酯微流控芯片依次用0.1～1mol/L的NaOH水溶液、去离子水、pH值为9.4的20mmol/L硼砂缓冲溶液冲洗3～5次；
（3）聚甲基丙烯酸甲酯微流控芯片的表面修饰
将步骤（1）配制的双亲性寡肽修饰剂注入步骤（2）预处理后的聚甲基丙烯酸甲酯微流控芯片的微通道中，充满，得到双亲性寡肽表面修饰的聚甲基丙烯酸甲酯微流控芯片。
2.根据权利要求1所述的双亲性寡肽对聚甲基丙烯酸甲酯微流控芯片表面改性方法，其特征在于：在配制双亲性寡肽修饰剂步骤（1）中，将双亲性寡肽溶解于pH值为9.4的20mmol/L硼砂缓冲溶液中，配制成1mg/mL的双亲性寡肽修饰剂，放入-20℃冰箱中备用。
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