CN114164102A - 一种用于核酸提纯的微流控芯片及核酸提纯方法 - Google Patents

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CN114164102A CN202111383403.5A CN202111383403A CN114164102A CN 114164102 A CN114164102 A CN 114164102A CN 202111383403 A CN202111383403 A CN 202111383403A CN 114164102 A CN114164102 A CN 114164102A
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Abstract

本发明公开了一种用于核酸提纯的微流控芯片及核酸提纯方法，微流控芯片包括接口层、功能层和密封层，按照自下而上的顺序将所述接口层、所述功能层和所述密封层封装于一体形成所述微流控芯片；所述接口层上形成有第一入口、第二入口和排出口；通过所述第一入口接入反应物，通过所述第二入口接入样本；所述功能层上形成有气泡捕获模块、核酸富集纯化模块和微流道，通过控制自所述第一入口和所述第二入口流经所述气泡捕获模块和所述核酸富集纯化模块的反应试剂及样本的种类和顺序来实现核酸提纯中结合捕获、洗涤、洗脱以及核酸回收。本发明简化核酸提纯操作、降低提纯过程中试剂消耗量并能避免提纯过程中交叉污染。

Description

一种用于核酸提纯的微流控芯片及核酸提纯方法
技术领域
本发明涉及医学、生物检测技术领域，特别涉及一种用于核酸提纯的微流控芯片及核酸提纯方法。
背景技术
微流控芯片是一种以在微米尺度空间范围内，利用微纳米加工技术在芯片上形成微型管道网络，以可控流体作为主要操作载体，将各类生物、化学等实验室基本功能微缩到一个几平方厘米的芯片上来实现。伴随微流控及相关技术的发展，芯片以其可以将多种单元技术在微小可控平台上灵活组合和规模集成成为现今发展的最大优势。近年来，组织生物学、分子生物学涉及的器官芯片、免疫蛋白反应、核酸扩增反应、细胞裂解等重要生化过程成为研究热点。随着相关产业的发展，微流控芯片的应用领域从实验室逐步扩展到生产生活的方方面面，用于提纯低载量病原体中核酸的微流控芯片是现今日常防疫的重要应用领域。
常用的病原体核酸提取纯化技术包含Trizol法、离心柱法、磁珠法等方法，这些基于人工提取核酸的方法都面临提取流程复杂、时间长、核酸提取效率较低且稳定性差等问题。为解决这些问题，对微流控芯片结构设计做了很多尝试，但这些微流控芯片均只能实现核酸提取过程中的部分功能，且没有考虑临床应用的实际需求，很难产业化。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种将核酸提纯过程中涉及的结合捕获、洗涤、洗脱、收集功能集成于一体的微流控芯片。本发明的另一目的在于提供一种简化核酸提纯操作、降低提纯过程中试剂消耗量并避免提纯过程中交叉污染的基于上述微流控芯片的核酸提纯方法。
为实现上述目的，本发明第一方面提供一种用于核酸提纯的微流控芯片，包括接口层、功能层和密封层，按照自下而上的顺序将所述接口层、所述功能层和所述密封层封装于一体形成所述微流控芯片；其中，
所述接口层上形成有第一入口、第二入口和排出口；通过所述第一入口接入反应物，通过所述第二入口接入样本；
所述功能层上形成有气泡捕获模块、核酸富集纯化模块和微流道，所述第一入口和所述第二入口分别通过微流道与所述气泡捕获模块的输入端连接，所述气泡捕获模块的输出端通过微流道与所述核酸富集纯化模块的输入端连接，所述核酸富集纯化模块的输出端通过微流道与所述排出口连接；通过控制自所述第一入口和所述第二入口流经所述气泡捕获模块和所述核酸富集纯化模块的反应试剂及样本的种类和顺序来实现核酸提纯中结合捕获、洗涤、洗脱以及核酸回收。
进一步，所述第一入口、所述第二入口和所述排出口处分别设置有夹固结构，所述夹固结构用于夹固所述第一入口、所述第二入口和所述排出口连接的外置管路，以使外置管路与所述第一入口、所述第二入口和所述排出口紧密连接。
进一步，所述功能层与所述接口层相接的密封面以及所述功能层与所述密封层相接的密封面上涂覆设置有弹性层。
进一步，所述第一入口接入的反应物包括特异性粒子溶液、洗涤液或洗脱液。
本发明的第二方面提供一种基于微流控芯片的核酸提纯方法，利用如第一方面所述的微流控芯片，所述核酸提纯方法包括：
1)将特异性粒子溶液从所述第一入口通入所述微流控芯片，经所述气泡捕获模块和所述核酸富集纯化模块处理后在所述核酸富集纯化模块中形成磁珠塞；
2)将样本液从所述第二入口通入所述微流控芯片，经所述气泡捕获模块处理后将样本液中的核酸分子与所述磁珠塞结合形成核酸-磁珠复合体；
3)将洗涤液从所述第一入口通入所述微流控芯片，经所述气泡捕获模块处理后通过洗涤液冲洗核酸-磁珠复合体表面及附近的杂质；
4)将洗脱液从所述第一入口通入所述微流控芯片，经所述气泡捕获模块处理后通过洗脱液从核酸-磁珠复合体中将核酸样本解吸附，使核酸样本随洗脱液从排出口排出微流控芯片。
进一步，将特异性粒子溶液从所述第一入口通入所述微流控芯片，经所述气泡捕获模块和所述核酸富集纯化模块处理后在所述核酸富集纯化模块中形成特异性磁珠塞包括：
封闭所述第二入口，将特异性粒子溶液从所述第一入口通入所述微流控芯片进入气泡捕获模块；
经所述气泡捕获模块对溶液中气泡进行捕获处理后进入核酸富集纯化模块；
通过所述核酸富集纯化模块周围的磁场将特异性粒子溶液中的磁性粒子固定形成磁珠塞。
进一步，将样本液从所述第二入口通入所述微流控芯片，经所述气泡捕获模块处理后将样本液中的核酸分子与所述磁珠塞结合形成核酸-磁珠复合体包括：
封闭所述第一入口，将样本液从所述第二入口通入所述微流控芯片进入气泡捕获模块；
经所述气泡捕获模块对溶液中气泡进行捕获处理后进入核酸富集纯化模块；
通过所述核酸富集纯化模块周围的磁场将样本溶液中的核酸分子与所述磁珠塞键能连接形成核酸-磁珠复合体。
进一步，将洗脱液从所述第一入口通入所述微流控芯片，经所述气泡捕获模块处理后通过洗脱液从核酸-磁珠复合体中将核酸样本解吸附包括：
封闭所述第二入口，将洗脱液从所述第一入口通入所述微流控芯片进入气泡捕获模块；
经所述气泡捕获模块对溶液中气泡进行捕获处理后进入核酸富集纯化模块；
通过洗脱液与核酸-磁珠复合体接触后，将核酸样本从核酸-磁珠复合体中解吸附。
进一步，特异性粒子溶液从所述第一入口接入的流速控制在50μL/min-300μL/min，样本液从所述第二入口接入的流速控制在50μL/min-150μL/min，洗涤液从所述第一入口接入的流速控制在50μL/min-150μL/min，洗脱液从所述第一入口接入的流速控制在10μL/min-50μL/min。
进一步，所述核酸富集纯化模块周围通过磁性装置施加有匀速运动磁场。
本发明的微流控芯片通过三层结构封装形成，下层形成包括反应物和样本的接入口与排出口的接口层，中层形成气泡捕获和核酸富集纯化以及微流道的功能层，上层封装层将功能层密封。各层结构实现不同的功能，通过三层结构的微流控芯片可以实现核酸提纯中结合捕获、洗涤、洗脱以及核酸回收，同时可以保证微流控芯片的小型化。通过控制流入微流控芯片的反应试剂及样本的种类和顺序来实现核酸提纯，简化核酸提纯操作、降低提纯过程中试剂消耗量并能避免提纯过程中交叉污染。
应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本发明。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一实施例用于核酸提纯的微流控芯片各层结构的截面示意图；
图2为本发明一实施例用于核酸提纯的微流控芯片整体结构的截面示意图；
图3为本发明一实施例微流控芯片中接入层接口与功能层连接的示意图；
图4为本发明一实施例微流控芯片的核酸提纯方法的流程图；
图5为五组DNA样本经微流控芯片提纯后的纯化效率曲线图。
具体实施方式
现在将参考附图更全面地描述示例实施方式。然而，示例实施方式能够以多种形式实施，且不应被理解为限于在此阐述的范例；相反，提供这些实施方式使得本发明将更加全面和完整，并将示例实施方式的构思全面地传达给本领域的技术人员。
此外，所描述的特征、结构或特性可以以任何合适的方式结合在一个或更多实施例中。在下面的描述中，提供许多具体细节从而给出对本发明的实施例的充分理解。然而，本领域技术人员将意识到，可以实践本发明的技术方案而没有特定细节中的一个或更多，或者可以采用其它的方法、组元、装置、步骤等。在其它情况下，不详细示出或描述公知方法、装置、实现或者操作以避免模糊本发明的各方面。
附图中所示的流程图仅是示例性说明，不是必须包括所有的内容和操作/步骤，也不是必须按所描述的顺序执行。例如，有的操作/步骤还可以分解，而有的操作/步骤可以合并或部分合并，因此实际执行的顺序有可能根据实际情况改变。
如图1和2所示，本发明第一方面提供一种用于核酸提纯的微流控芯片，包括接口层1、功能层2和密封层3，按照自下而上的顺序将所述接口层1、所述功能层2和所述密封层3封装于一体形成微流控芯片。接口层1、功能层2和密封层3之间可选用热压、激光焊接、贴膜等方式可逆封装。接口层1、功能层2和密封层3所采用的材料包含但不限于PDMS、PMMA、COC、玻璃、硅。考虑到材料需具有较好的生物兼容性，耐酸、碱、醇类等试剂腐蚀，对生物分子的吸附能力弱，成本低，兼容于大批量加工、键合、集成等生产手段，因此本芯片优先选用透明高分子共聚物硬质材料，例如COC等。
所述接口层1上形成有第一入口101、第二入口102和排出口103；通过所述第一入口101接入反应物，通过所述第二入口102接入样本。第一入口101和第二入口102可以接入液相、气相的反应试剂或者样本。例如，反应试剂可以为特异性粒子溶液、洗涤液、洗脱液，样本可以为携带有病毒、细菌等不同种类病原体的溶液。
所述功能层2上形成有气泡捕获模块201、核酸富集纯化模块202和微流道21，所述第一入口101和所述第二入口102分别通过微流道21与所述气泡捕获模块201的输入端连接，所述气泡捕获模块201的输出端通过微流道21与所述核酸富集纯化模块202的输入端连接，所述核酸富集纯化模块202的输出端通过微流道21与所述排出口103连接；通过控制自所述第一入口101和所述第二入口102流经所述气泡捕获模块201和所述核酸富集纯化模块202的反应试剂及样本的种类和顺序来实现核酸提纯中结合捕获、洗涤、洗脱以及核酸回收。
密封层3可以为密封功能层2中微流道所需的盖板。
在本发明一实施例中，如图3所示，微流道21包括第一分支211、第二分支212、第三分支213、第四分支214和第五分支215，第一入口101与第一分支211连接，第二入口102与第二分支212连接，第一分支211和第二分支212汇集后经第三分支213与气泡捕获模块201输入端连接，气泡捕获模块201的输出端与第四分支214一端连接，第四分支214另一端与核酸富集纯化模块202的输入端连接，核酸富集纯化模块202的输出端与第五分支215的一端连接，第五分支215的另一端与排出口103连接。从第一入口101接入的反应物可通过微流道21依次经过气泡捕获模块201和核酸富集纯化模块202处理后从排出口103排出。从第二入口102接入的样本可通过微流道21依次经过气泡捕获模块201和核酸富集纯化模块202处理后从排出口103排出。
在本发明一实施例中，气泡捕获模块201可以为一组直径大于微流道21宽度的圆形腔室，用来捕获样本、试剂等液体中的小气泡，避免因气泡进入后续核酸富集纯化模块202，影响核酸、洗涤液、洗脱液与特异性磁珠塞的充分接触。需要说明的是，气泡捕获模块201的腔室形状优选为弧形结构，但并不局限为圆形，也可以为椭圆形等其他弧形结构的腔室。
在本发明一实施例中，核酸富集纯化模块202可以由一个长15～20mm，宽度W为流道宽度3～4倍，高0.2～0.3mm的长方形腔室构成。在核酸富集纯化模块202中实现磁珠塞的形成、核酸-磁珠结合、杂质冲洗、核酸-磁珠洗脱多项功能。需要说明的是，核酸富集纯化模块202的尺寸并不局限于此，其可以根据实际情况及需要做相应调整。
在本发明一实施例中，为了保证密封性能，位于中层的功能层2的上、下表面可粘覆0.05-0.5mm弹性层。为减少芯片对生物分子(如DNA、RNA、蛋白质)的粘附现象，可对芯片表面进行teflon或其他表面疏水处理。
在本发明一实施例中，所述第一入口101、所述第二入口102和所述排出口103处分别设置有夹固结构104，所述夹固结构104用于夹固所述第一入口101、所述第二入口102和所述排出口103连接的外置管路，以使外置管路与所述第一入口101、所述第二入口102和所述排出口103紧密连接，防止溶液从微流控芯片接口处泄漏。
如图4所示，本发明的基于微流控芯片的核酸提纯方法，利用如第一方面所述的微流控芯片，所述核酸提纯方法包括如下步骤：
步骤S400：将特异性粒子溶液从所述第一入口通入所述微流控芯片，经所述气泡捕获模块和所述核酸富集纯化模块处理后在所述核酸富集纯化模块中形成磁珠塞。
步骤S410：将样本液从所述第二入口通入所述微流控芯片，经所述气泡捕获模块处理后将样本液中的核酸分子与所述磁珠塞结合形成核酸-磁珠复合体；
步骤S420：将洗涤液从所述第一入口通入所述微流控芯片，经所述气泡捕获模块处理后通过洗涤液冲洗核酸-磁珠复合体表面及附近的杂质；
步骤S430：将洗脱液从所述第一入口通入所述微流控芯片，经所述气泡捕获模块处理后通过洗脱液从核酸-磁珠复合体中将核酸样本解吸附，使核酸样本随洗脱液从排出口排出微流控芯片。
步骤S400具体包括以下步骤：
1)封闭所述第二入口102，第一入口101和排出口103为开放状态，将特异性粒子溶液从所述第一入口101通入所述微流控芯片，由于第二入口102为封闭状态，第二分支212流阻大，溶液由第一分支211进入气泡捕获模块201；
2)经所述气泡捕获模块201对溶液中气泡进行捕获处理后进入核酸富集纯化模块202；
3)通过所述核酸富集纯化模块202周围的磁场将特异性粒子溶液中的磁性粒子固定于核酸富集纯化模块202中形成磁珠塞；
4)剩余溶液通过排出口103排出。
在本发明一实施例中，特异性粒子溶液从所述第一入口接入的流速控制在50μL/min-300μL/min范围内，该范围可以保证磁性粒子高效捕获并稳定分布在磁场区域内，同时保持流路效率。
步骤S410具体包括如下步骤：
1)封闭所述第一入口101，第二入口102和排出口103为开放状态，将样本液从所述第二入口102通入所述微流控芯片，由于第一分支211为封闭状态，第一分支211流阻大，样本液由第二分支212进入气泡捕获模块201；
2)经所述气泡捕获模块201对溶液中气泡进行捕获处理后进入核酸富集纯化模块202；
3)通过所述核酸富集纯化模块202周围的匀速运动磁场使原有静态磁珠塞形成动态磁珠塞，样本液中释放的核酸与动态磁珠塞充分接触，产生键能连接形成核酸-磁珠复合体；
4)剩余液体通过排出口103排出。
在本发明一实施例中，样本液从所述第二入口102接入的流速控制在50μL/min-150μL/min范围内，该范围可以保证核酸分子与磁性粒子充分稳定的结合捕获。
步骤S420具体包括如下步骤：封闭所述第二入口102，第一入口101和排出口103为开放状态。将多种洗涤液依次从第一入口101接入微流控芯片，由于第二入口102为封闭状态，第二分支212流阻大，洗涤液由第一分支211经气泡捕获模块201拦截溶液中存在的小气泡后进入核酸富集纯化模块202，该区域的匀速运动磁场使磁珠塞保持运动状态，洗涤液冲洗附着在磁珠塞表面及附近的杂质，经过洗涤后含有蛋白质、高盐离子等杂质成分的废液经排出口103排出芯片。
在本发明一实施例中，洗涤液从所述第一入口101接入的流速控制在50μL/min-150μL/min范围内，以保证洗涤液与核酸-磁珠复合物充分稳定的接触洗涤。
步骤S430具体包括以下步骤：
1)封闭所述第二入口102，第一入口101和排出口103为开放状态。将洗脱液从所述第一入口101通入所述微流控芯片，由于第二入口102为封闭状态，第二分支212流阻大，洗脱液由第一分支211进入气泡捕获模块201；
2)经所述气泡捕获模块201对溶液中气泡进行捕获处理后进入核酸富集纯化模块202；
3)通过洗脱液与核酸-磁珠复合体接触后，利用硅羟基纳米磁珠在不同环境(溶液盐分及PH值的变化调控)下与核酸分子进行特异性解吸附作用，将核酸样本从核酸-磁珠复合体中解吸附；
4)经过洗脱液对磁珠表面的核酸样本解吸附作用，使富集的核酸样本溶于洗脱液中，最终将含有核酸的洗脱液经排出口103导出芯片，进行收集。该富集液后续可用于目的核酸片段恒温、变温扩增，实时荧光定量检测、跑胶等技术对目标核酸模板进行检测甄别。图5为五组低浓度DNA样本经上述提纯方法提纯核酸后的纯化效率曲率，从图中可以看出通过上述方法提纯核酸的提纯效率均高于75％。
在本发明一实施例中，洗脱液从所述第一入口101接入的流速控制在10μL/min-50μL/min范围内，以保证洗脱液与核酸-磁珠复合物充分稳定的接触洗脱。
本发明一实施例中，所述核酸富集纯化模块202周围可以通过芯片外围的磁性装置施加固定磁场和匀速运动磁场。
在本发明一实施例中，通过芯片外围的给液驱动器作为动力源，提供试剂及样本等液相进入芯片参与反应的驱动力，并可以通过调节参数控制液相流速。
在本发明一实施例中，特异性粒子溶液为不同粒径的磁性颗粒表面包裹氧化硅形成的超顺磁性硅羟基纳米磁珠。洗涤液包括但不限于：Tris-HCL、氯化钠、EDTA缓冲液等高盐类溶液和或50-80％无水乙醇溶液。洗脱液包括但不限于与无核酸酶相关的去离子水。
本领域技术人员在考虑说明书及实践这里公开的发明后，将容易想到本发明的其它实施方案。本申请旨在涵盖本发明的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本发明的一般性原理并包括本发明未公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本发明的真正范围和精神由下面的权利要求指出。
应当理解的是，本发明并不局限于上面已经描述并在附图中示出的精确结构，并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。本发明的范围仅由所附的权利要求来限制。

Claims (10)

1.一种用于核酸提纯的微流控芯片，其特征在于，包括接口层、功能层和密封层，按照自下而上的顺序将所述接口层、所述功能层和所述密封层封装于一体形成所述微流控芯片；其中，
所述接口层上形成有第一入口、第二入口和排出口；通过所述第一入口接入反应物，通过所述第二入口接入样本；
所述功能层上形成有气泡捕获模块、核酸富集纯化模块和微流道，所述第一入口和所述第二入口分别通过微流道与所述气泡捕获模块的输入端连接，所述气泡捕获模块的输出端通过微流道与所述核酸富集纯化模块的输入端连接，所述核酸富集纯化模块的输出端通过微流道与所述排出口连接；通过控制自所述第一入口和所述第二入口流经所述气泡捕获模块和所述核酸富集纯化模块的反应试剂及样本的种类和顺序来实现核酸提纯中结合捕获、洗涤、洗脱以及核酸回收。
2.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述第一入口、所述第二入口和所述排出口处分别设置有夹固结构，所述夹固结构用于夹固所述第一入口、所述第二入口和所述排出口连接的外置管路，以使外置管路与所述第一入口、所述第二入口和所述排出口紧密连接。
3.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述功能层与所述接口层相接的密封面以及所述功能层与所述密封层相接的密封面上涂覆设置有弹性层。
4.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述第一入口接入的反应物包括特异性粒子溶液、洗涤液或洗脱液。
5.一种基于微流控芯片的核酸提纯方法，其特征在于，利用如权利要求1所述的微流控芯片，所述核酸提纯方法包括：
1)将特异性粒子溶液从所述第一入口通入所述微流控芯片，经所述气泡捕获模块和所述核酸富集纯化模块处理后在所述核酸富集纯化模块中形成磁珠塞；
2)将样本液从所述第二入口通入所述微流控芯片，经所述气泡捕获模块处理后将样本液中的核酸分子与所述磁珠塞结合形成核酸-磁珠复合体；
3)将洗涤液从所述第一入口通入所述微流控芯片，经所述气泡捕获模块处理后通过洗涤液冲洗核酸-磁珠复合体表面及附近的杂质；
4)将洗脱液从所述第一入口通入所述微流控芯片，经所述气泡捕获模块处理后通过洗脱液从核酸-磁珠复合体中将核酸样本解吸附，使核酸样本随洗脱液从排出口排出微流控芯片。
6.如权利要求5所述的核酸提纯方法，其特征在于，将特异性粒子溶液从所述第一入口通入所述微流控芯片，经所述气泡捕获模块和所述核酸富集纯化模块处理后在所述核酸富集纯化模块中形成特异性磁珠塞包括：
封闭所述第二入口，将特异性粒子溶液从所述第一入口通入所述微流控芯片进入气泡捕获模块；
经所述气泡捕获模块对溶液中气泡进行捕获处理后进入核酸富集纯化模块；
通过所述核酸富集纯化模块周围的磁场将特异性粒子溶液中的磁性粒子固定形成磁珠塞。
7.如权利要求5所述的核酸提纯方法，其特征在于，将样本液从所述第二入口通入所述微流控芯片，经所述气泡捕获模块处理后将样本液中的核酸分子与所述磁珠塞结合形成核酸-磁珠复合体包括：
封闭所述第一入口，将样本液从所述第二入口通入所述微流控芯片进入气泡捕获模块；
经所述气泡捕获模块对溶液中气泡进行捕获处理后进入核酸富集纯化模块；
通过所述核酸富集纯化模块周围的磁场将样本溶液中的核酸分子与所述磁珠塞键能连接形成核酸-磁珠复合体。
8.如权利要求5所述的核酸提纯方法，其特征在于，将洗脱液从所述第一入口通入所述微流控芯片，经所述气泡捕获模块处理后通过洗脱液从核酸-磁珠复合体中将核酸样本解吸附包括：
封闭所述第二入口，将洗脱液从所述第一入口通入所述微流控芯片进入气泡捕获模块；
经所述气泡捕获模块对溶液中气泡进行捕获处理后进入核酸富集纯化模块；
通过洗脱液与核酸-磁珠复合体接触后，将核酸样本从核酸-磁珠复合体中解吸附。
9.如权利要求5所述的核酸提纯方法，其特征在于，特异性粒子溶液从所述第一入口接入的流速控制在50μL/min-300μL/min，样本液从所述第二入口接入的流速控制在50μL/min-150μL/min，洗涤液从所述第一入口接入的流速控制在50μL/min-150μL/min，洗脱液从所述第一入口接入的流速控制在10μL/min-50μL/min。
10.如权利要求6或7所述的核酸提纯方法，其特征在于，所述核酸富集纯化模块周围通过磁性装置施加有匀速运动磁场。
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CN115445677A (zh) * 2022-08-23 2022-12-09 深圳市第二人民医院(深圳市转化医学研究院) 一种与maldi-tof-ms分析联用的微流控芯片

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