CN113403302B - 一种提纯低载量病原体中核酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种提纯低载量病原体中核酸的方法，包括：步骤1，将病原体溶液进行裂解，之后导入微流控芯片中；步骤2，将特异性磁珠颗粒导入微流控芯片中，形成芯片内磁珠塞；步骤3，裂解的病原体溶液与特异性磁珠颗粒结合；步骤4，采用洗涤液对结合后的磁珠‑核酸进行多次洗涤，去除磁珠周围的样本杂质；步骤5，对结合后的磁珠‑核酸进行洗脱工作，收集洗脱液，在洗脱液中进行磁珠‑核酸解吸附过程，去除磁珠并纯化核酸样本液，收集洗脱液，得到纯化后的核酸样本。本发明将提纯核酸所需的磁珠移植于微流控芯片中，通过外围机械结构实现低载量病原体样本自动化核酸处理纯化，提高核酸提取效率，稳定性好，且能够避免交叉污染。

Description

一种提纯低载量病原体中核酸的方法

技术领域

本发明涉及体外检测技术领域，具体涉及一种提纯低载量病原体中核酸的方法。

背景技术

长期以来，病原体引起的传染性疾病，极易威胁人类健康、造成社会恐慌，引发传染病的常见病原体主要包括病毒、细菌、真菌和寄生虫，其中，病毒是导致传染性疾病的重要因素之一，由于病毒具有变异概率高、溯源难度大、感染动物种类多、传染途径多(如接触传播、空气传播等)等特点，因此极易导致疾病蔓延，进而发展成为传染性疾病甚至突发性疫情。

面对病原体跨物种传染、跨地域传播造成的突发性疫情，在管控和治疗过程中，均需要先进行及时准确的诊断，因此，可靠而有效的诊断方法是防治疫情传播的重要手段，目前，对病原体分型检测主要使用核酸检测和抗体检测，其中，核酸检测具有优异的灵敏度和较强的特异性，是目前传染病检测的金标准。

采用核酸检测时，对病原体进行核酸提纯主要通过Trizol法、离心柱法、磁珠法等来实现，上述方法需要人工操作相应的试剂来完成，提纯流程复杂、时间长、核酸提取效率较低且稳定性较差，同时，对于一些病原体含量较少的应用场景，通过上述方法提取后，难以获得有效检测量的核酸样本，为了高效稳定的提取核酸原液，已有多款自动核酸提取仪面市，它们对核酸的提纯原理通常基于磁棒法和旋转离心法。

申请号为201810404724.0的发明专利公开了一种磁棒式自动核酸提取方法，其通过将表面吸附有核酸的磁珠吸附在磁棒上，通过机械移动磁棒使其参与不同的反应过程，同时电机带动磁棒进行上下高频往复震动对试剂液体进行快速混匀和搅拌，来完成裂解、吸附、洗涤和洗脱等复杂的核酸提取过程，但上述高频往复震动的混合式核酸提取方法易产生液体飞溅，存在样品交叉污染的风险；同时，高频往复震动会对核酸产生强烈的震荡，存在破坏DNA链、RNA链完整度的风险。

申请号为201710435931.8的发明专利公开了一种旋转式自动核酸提取装置及其控制方法，其采用旋转方式进行样本及所需提取试剂的混匀，通过高速旋转实现搅拌、磁吸、加热等功能，同时配合垂直和/或水平方向运动，实现裂解、吸附、洗涤和洗脱等核酸提取全流程。尽管该发明降低了提取样本之间的交叉污染率，但该装置由多个传动齿轮和电机交错排布而成，结构较复杂，设备故障率较高。

因此，目前的核酸提取存在核酸提取效率低、稳定性差、样本之间交叉污染等问题。

发明内容

本发明旨在提供一种用于提纯低载量病原体中核酸的方法，实现了快速、自动化核酸处理纯化，提高了样本采集的稳定性。

为了实现上述目的，本发明提供了一种提纯低载量病原体中核酸的方法，包括：步骤1，将病原体溶液进行裂解，之后导入微流控芯片中；步骤2，将特异性磁珠颗粒导入微流控芯片中并固定，形成芯片内磁珠塞；步骤3，裂解的病原体溶液与特异性磁珠颗粒结合；步骤4，采用洗涤液对结合后的磁珠-核酸进行多次洗涤，去除磁珠周围的样本杂质；步骤5，对结合后的磁珠-核酸进行洗脱工作，收集洗脱液，在所述洗脱液中进行磁珠-核酸解吸附过程，去除磁珠并纯化核酸样本液，收集洗脱液，得到纯化后的核酸样本。

根据本发明，在所述步骤1中，将病原体溶液置于液体存储器的复合样本存储器中，进行裂解，之后导入微流控芯片中。优选地，将参与病原体裂解所需的裂解混合液与样本原液按照一定比例依次通入复合样本储存器中，关闭第二开关部件以防止未经充分反应的复合样本进入微流控芯片。

优选地，所述裂解混合液与样本原液按照3:1-5:1的体积比例混合。

优选地，所述病原体样本裂解过程中通过外接振荡器、施加热源辅助加热复合样本储存器的方式促进病原体样本裂解。

根据本发明，采用间断抽取模式将存储在液体存储器中相应的反应液抽入到所述微流控芯片的溶液输入腔中，所述间断抽取模式为在两类反应液之间抽取一段气体，形成“液体A-气体-液体B”的气液供给模式。

根据本发明，所述步骤2包括：步骤2-1，液体分配器通过机械选通磁性粒子储存器对应通道，打开试剂给液支通道上第一开关部件，在给液驱动器作用下，将充分混匀的磁珠液经第一开关部件输入微流控芯片溶液输入腔；

步骤2-2，关闭第二开关部件，防止磁珠液回流至与第二开关部件相连接的复合样本储存器中，所述磁珠液在给液驱动器的控制下，给富集纯化腔供给磁珠颗粒。优选所述磁珠液在给液驱动器的控制下，以低于300μL/min流速给富集纯化腔供给磁珠颗粒。

步骤2-3，在富集纯化腔外围的第一磁铁、第二磁铁控制下，磁珠颗粒停留于富集纯化腔中形成磁珠塞。

步骤2-4，在采集控制器的控制下，微流控芯片的出口选通废液收集支通道，经过外围磁场富集后，剩余磁珠废液经废液收集支通道进入废液采集器。

根据本发明，所述步骤3包括：步骤3-1，打开试剂给液支通道第二开关部件，在给液驱动器作用下，将充分裂解的复合样本经第二开关部件输入微流控芯片的溶液输入腔；步骤3-2，关闭第一开关部件，防止复合样本液回流至与第一开关部件相连接的液体分配器中，复合样本液经给液驱动器驱动流经气泡捕获机构后进入富集纯化腔；步骤3-3，所述富集纯化腔外围的第一磁铁、第二磁铁在磁铁驱动器控制下发生匀速转动，在外围不断变化的磁场作用下，静态磁珠塞开始在富集纯化腔中产生规律运动，形成动态磁珠塞。优选此过程中所述复合样本液的流速控制在150μL/min以内。步骤3-4，所述微流控芯片出口选通废液收集支通道，使经过核酸-磁珠结合后的剩余废液，经废液收集支通道进入废液采集器。

根据本发明，所述步骤4包括：步骤4-1，所述液体分配器选通洗涤液储存器对应通道，打开试剂给液支通道的第一开关部件，在给液驱动器作用下，将洗涤液经第一开关部件输入微流控芯片的溶液输入腔；步骤4-2，关闭第二开关部件，防止洗涤液回流至与第二开关部件相连接的复合样本储存器中，洗涤液经所述给液驱动器驱动依次流经气泡捕获机构、富集纯化腔，与腔内核酸-磁珠复合体接触，实现病原体裂解带来的杂质成分洗涤作用。步骤4-3，微流控芯片的出口选通废液收集支通道，使经过洗涤后含有蛋白、高盐离子等杂质成分的废液经废液收集支通道进入废液采集器。

优选地，所述洗涤过程对核酸-磁珠复合体进行固定，将第一磁铁和第二磁铁固定在所述富集纯化腔的上方和下方，形成静态磁珠塞进行洗涤操作。更优选地，通过磁铁驱动器控制上方的第一磁铁和下方的第二磁铁发生匀速转动，形成动态磁珠塞使整个洗涤过程更为充分。

根据本发明，所述步骤5包括：步骤5-1，液体分配器选通洗脱液储存器对应通道，在给液驱动器作用下，洗脱液依次流经微流控芯片的溶液输入腔、气泡捕获机构、富集纯化腔，与腔内纯化后的核酸-磁珠复合体接触，利用硅羟基纳米磁珠在不同溶液盐分及pH值的变化调控下与核酸分子进行特异性解吸附过程，实现对纯化后的核酸样本洗脱富集工作。

步骤5-2，在采集控制器的控制下，微流控芯片出口连接富集样本采集主通道，使经过核酸洗脱富集后，洗脱液经富集样本采集主通道进入富集样本采集器。优选地，所述磁场产生模块包括设置在富集纯化腔的微流控芯片通道上表面的第一磁铁和设置在富集纯化腔的微流控芯片通道下表面的第二磁铁。优选地，所述洗脱过程中第一磁铁和第二磁铁固定在富集纯化腔的上方和下方，形成静态磁珠塞进行洗脱操作。优选地，通过磁铁驱动器控制第一磁铁和第二磁铁发生匀速转动，形成动态磁珠塞使整个洗脱过程更为充分。

优选地，所述第一磁铁的下表面和富集纯化腔的微流控芯片通道上表面的距离H1，与第二磁铁的上表面和富集纯化腔的微流控芯片通道下表面的距离H2相等。优选地，所述第一磁铁及第二磁铁宽度为所述富集纯化腔的微流控芯片通道的宽度W的4～5倍。

优选地，还包括采用冲洗液对系统管路进行自清洁的过程。优选地，所述液体存储器中的反应液为冲洗液、反应样本溶液、洗涤溶液、裂解溶液、洗脱溶液或其他类型溶液。优选地，所述冲洗液、洗涤溶液、洗脱溶液涉及无酶纯水、乙醇、异丙醇、磁性粒子溶液、高盐类溶液。优选地，所述反应样本为纯化或未纯化的唾液、尿液、精液、细胞溶液、蛋白溶液、核酸溶液、细菌菌液、病毒溶液。

优选地，所述磁珠为超顺磁磁珠，所述磁珠表面包裹有高分子化合物，所述高分子化合物为聚苯乙烯化合物、聚氟乙烯或聚纤维化合物，所述高分子化合物表面修饰有功能配体基团，所述功能配体基团包括氨基、羧基、硅基、链霉素、亲和素、醛基或巯基。更优选地，所述配体基团上还修饰有抗体、DNA片段和/或RNA片段。最优选地，所述磁珠表面修饰有聚纤维化合物，所述聚纤维化合物表面修饰有硅羟基。

本发明还公开了一种用于提纯低载量病原体中核酸的装置，包括微流控芯片，气液供给机构、液体分配机构、磁场产生机构、采集机构以及设置在所述微流控芯片外围的驱动控制器。所述气液供给机构包括给液驱动器、独立设置的复合样本储存器以及独立设置的若干液体存储器，在所述给液驱动器的控制下将液体存储器中的反应气/液通过液体分配机构按一定流速输送至微流控芯片；或在给液驱动器的控制下将复合样本储存器中的复合样本液直接输送至微流控芯片中；所述磁场产生机构配置为产生磁场以对微流控芯片中的磁性物质与核酸样本混匀、固定或分离；所述采集机构入口与微流控芯片出口相连通，配置为进行气体或/和液体的输出。

根据本发明，所述微流控芯片上设置有进样口、出样口、和若干功能腔，若干所述功能腔通过流道相连通，每个进样口分别对应连通一个进气/液口，所述进气/液口用于将气体/液体导入相应的功能腔或流道，不同功能腔之间通过流道进行气体/液体的流通。

优选地，所述微流控芯片上设置有与所述功能腔连通的气泡捕获机构，所述气泡捕获机构是由一组直径大于流道宽度的圆形腔室构成，可以设置在进液口与功能腔之间的流道上。

根据本发明，所述液体分配机构包括液体分配器和用于控制所述液体分配器的分配控制器；所述液体分配器为多接口且具有电磁阀选通功能的通路。

根据本发明，所述液体存储器包括复合样本存储器、以及独立设置且分别与所述液体分配器连通的冲洗液存储器、磁性粒子存储器、洗涤液存储器和洗脱液存储器；所述冲洗液存储器、磁性粒子存储器、洗涤液存储器和洗脱液存储器分别在所述给液驱动器的控制下将所存储的反应液输送到液体分配器中，并在分配控制器的控制下实现相应反应液向溶液输入腔的单向流通；所述复合样本存储器的出口与溶液输入腔的另一入口连通，并在所述给液驱动器的控制下将所存储的复合样本溶液直接输送至溶液输入腔中。

根据本发明，所述微流控芯片上设置有依次连通的溶液输入腔、气泡捕获机构和富集纯化腔，所述溶液输入腔的入口分别与复合样本存储器的出口和液体分配器的出口连通；所述富集纯化腔的出口与所述采集机构连通。

根据本发明，所述采集机构包括富集样本采集器、废液采集器和采集控制器，在所述采集控制器的控制下将富集纯化腔中富集纯化后的核酸溶液导入富集样本采集器，将磁珠废液、样本废液、洗涤废液、及系统管路的冲洗废液依次导入所述废液采集器。

根据本发明，所述磁场产生机构布设在微流控芯片上需要对磁性物质进行混合、固定或分离的位置，优选布设在富集纯化腔上方和下方。优选地，所述磁场产生机构包括磁铁驱动器和两组磁铁，两组所述磁铁对称地分布于所述富集纯化腔上方和下方。

根据本发明，所述流道包含直线结构和曲线结构。优选地，所述流道为微流道或毛细流道。优选地，同一流道不同位置的宽度相同或不同。

本发明的有益效果：

1)本发明提供了一种低载量病原体中核酸的提纯方法，该核酸提纯方法通过微流控芯片的模块功能组合以及外围的功能化模块，使微流控芯片具有优异的综合处理功能以及良好的控制能力，提高了低载量病原体中核酸的提取效率，解决现有技术中核酸与超顺磁性纳米磁珠结合、洗脱效率低，稳定性差，提纯试剂消耗量大，成本高，样本之间交叉污染等弊端，有效提高了低载量病原体样本自动化核酸处理纯化的能力。

2)本发明将提纯核酸所需的磁珠移植于微流控芯片中，同时，通过外围机械结构实现低载量病原体样本自动化核酸处理纯化，提高核酸提取效率，稳定性较好，且能够避免交叉污染。

3)本发明利用磁珠在不同环境(溶液盐分及pH值的变化调控)下与核酸分子进行特异性吸附与解吸附过程，实现快速、自动化核酸处理纯化功能，提高了样本采集的稳定性。

4)本发明将核酸与磁珠的结合、杂质洗涤、核酸洗脱过程集成于一个微流控芯片上，一方面通过微型流道减少了对核酸提取过程中使用试剂的损耗，另一方面全封闭式提取过程避免了样本之间交叉污染等问题，并通过在微流控芯片内设置气泡捕获机构，能够捕获流道中的气泡，进而避免因气泡而影响核酸与磁珠的结合、洗涤和洗脱，进而有效提高了低载量病原体中核酸释放及提取效率。

附图说明

图1是本发明实施例中用于提纯低载量病原体中核酸的装置的结构示意图。

图2是本发明实施例中富集纯化腔内磁性粒子与核酸结合的流程示意图。

图3是上、下磁铁匀速运动至某一状态时，微流控通道中形成动态磁珠塞的状态。

附图标记：1-微流控芯片，11-溶液输入腔，12-气泡捕获机构，13-富集纯化腔，2-气液供给机构，21-给液驱动器，22-液体存储器，221-冲洗液存储器，222-磁性粒子存储器，223-洗脱液存储器，224-洗涤液存储器，225-复合样本存储器，3-液体分配机构，31-液体分配器，32-分配控制器，4-磁场产生机构，41-磁铁驱动器，42，43-磁铁，5-采集机构，51-富集样本采集器，52-废液采集器，53-采集控制器。

具体实施方式

下文将结合附图和具体实施例对本发明的结构和应用做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

参见图1所示，本发明提供了一种用于提纯低载量病原体核酸的装置，包括微流控芯片1、气液供给机构2、液体分配机构3、磁场产生机构4、采集机构5以及设置在所述微流控芯片1外围的驱动控制器。

气液供给机构2作为气、液两相物质驱动的动力源，提供三类反应试剂和复合病原体样本进入微流控芯片1参与反应的驱动力，以及冲洗液进行系统管路自清洁的驱动力。气液供给机构2包括给液驱动器21、独立设置的复合样本储存器225以及独立设置的若干液体存储器22，在给液驱动器21的控制下将液体存储器22中的反应气/液通过液体分配机构3按一定流速输送至微流控芯片1；或在给液驱动器21的控制下将复合样本储存器225中的复合样本液直接输送至所述微流控芯片1中。磁场产生机构4配置为产生磁场以对微流控芯片1中的磁性物质与核酸样本混匀、固定或分离。采集机构5入口与微流控芯片1出口相连通，配置为进行气体或/和液体的输出。

其中，液体存储器22中可存储液体溶液或固体粉末，液体存储器22的数量可以根据实际情况进行拓展或缩减。

本发明将病原体溶液置于复合样本存储器225中进行裂解，后导入微流控芯片1中；将提纯核酸所需的磁性颗粒移植或导入微流控芯片1中，同时，通过外围机械结构实现低载量病原体样本自动化核酸处理纯化，提高核酸提取效率，稳定性较好，且能够避免交叉污染。

根据本发明，微流控芯片1上设置有进样口、出样口、和若干功能腔，若干功能腔通过流道相连通，每个进样口分别对应连通一个进气/液口，所述进气/液口用于将气体/液体导入相应的功能腔或流道，不同功能腔之间通过流道进行气体/液体的流通。功能腔的数量和大小根据实际需要设置，可以为加样、反应、过滤、检测、混合等功能腔中的一种或几种。功能腔和流道可以通过在芯片材料上进行光刻、数控、热压、注塑等方法制备得到。

优选地，微流控芯片1上还设置有与功能腔连通的气泡捕获机构12，本发明通过在微流控芯片1内设置气泡捕获机构12，能够捕获流道中的气泡，进而避免因气泡而影响核酸与磁珠的结合、洗涤和洗脱，进而有效提高了低载量病原体中核酸释放及提取效率。气泡捕获机构12的位置根据实际需要进行设置，可以在不同功能腔之间的流道上，也可以在流道与功能腔的相交之处，或者在进液口与功能腔的相交之处。

如图1所示，液体分配机构3包括液体分配器31和用于控制液体分配器31的分配控制器32；液体分配器31为多接口且具有电磁阀选同功能的通路。

液体存储器22包括复合样本存储器225、以及独立设置且分别与液体分配器31连通的冲洗液存储器221、磁性粒子存储器222、洗涤液存储器223和洗脱液存储器224，其中，冲洗液存储器221、磁性粒子存储器222、洗涤液存储器223和洗脱液存储器224分别在给液驱动器21的控制下将所存储的反应液输送到液体分配器31中，并在分配控制器32的控制下实现相应反应液向溶液输入腔11的单向流通。复合样本存储器225的出口与溶液输入腔11的另一入口连通，并在给液驱动器21的控制下将所存储的复合样本溶液直接输送至溶液输入腔11中。

如图1所示，在本发明的一个具体实施例中，微流控芯片1上设置有依次连通的溶液输入腔11、气泡捕获机构12和富集纯化腔13，其中，溶液输入腔11具有两个独立的入口，分别与复合样本存储器225的出口和液体分配器31的出口连通，用于病原体样本与相应反应试剂进入微流控芯片1。富集纯化腔13的出口与采集机构5连通。其中，采集机构5可以为微流控芯片1的一部分，或者独立于微流控芯片1之外。

如图1所示，采集机构5包括富集样本采集器51、废液采集器52和采集控制器53，在采集控制器53的控制下将富集纯化腔13中富集纯化后的核酸溶液导入富集样本采集器51，将磁珠废液、样本废液、洗涤废液、及系统管路的冲洗废液依次导入废液采集器52。

磁场产生机构4布设在微流控芯片1上需要对磁性物质进行混合、固定或分离的位置，优选布设在富集纯化腔13上方和下方。优选地，磁场产生机构4包括磁铁驱动器41和两组磁铁42、43，两组磁铁42、43对称地分布于所述富集纯化腔13上方和下方。

其中，所述微流控芯片1还连接有芯片夹持装置，该夹持装置包括溶液输入腔11与液体分配器31、溶液输入腔11与复合样本存储器225之间的接口，芯片富集纯化腔13与采集控制器53之间的接口。

在本发明中，流道包含直线结构和曲线结构。优选地，所述流道为微流道或毛细流道。

本发明装置中的通道结构是以主通道、反应体系供给支通道和废液收集支通道三类通道形式实现的，具体为连接溶液输入腔11、气泡捕获机构12和富集纯化腔13的主通道；反应体系供给支通道包含两类介质供给支通道，具体为：一类由溶液输入腔11与四种反应试剂的试剂给液支通道组成，其中包含冲洗液存储器221、磁性粒子存储器222、洗涤液存储器223和洗脱液存储器224依次与液体分配器31中对应阀口连接的4路相互独立的反应试剂支通道，以及液体分配器31与溶液输入腔11连接的复用反应试剂传输支通道。另一类由溶液输入腔11与复合样本储存器225连接的独立供给复合病原体给液支通道；废液收集支通道由废液采集器52与采集控制器53之间的支通道组成，用于输运反应产生的磁珠废液、样本废液、洗涤废液以及冲洗系统产生的冲洗废液。

根据本发明的另一个方面，还提供了一种利用上述提纯低载量病原体核酸的装置来提纯低载量病原体中核酸的方法，包括：

步骤1，将病原体溶液置于复合样本存储器225中进行裂解，后导入微流控芯片1中；步骤2，将特异性磁珠颗粒导入微流控芯片1中并固定，形成芯片内磁珠塞；步骤3，裂解的病原体溶液与特异性磁珠颗粒结合；步骤4，对结合后的磁珠-核酸进行多次洗涤；步骤5，对结合后的磁珠-核酸进行洗脱工作，在洗脱液中进行磁珠-核酸解吸附过程，去除磁珠并纯化核酸样本液，收集洗脱液，得到纯化后的核酸样本。

本发明将核酸与磁珠的结合、杂质洗涤、核酸洗脱过程集成于一个微流控芯片上，一方面通过微型流道减少了对核酸提取过程中使用试剂的损耗，另一方面全封闭式提取过程避免了样本之间交叉污染等问题。同时利用免疫磁珠在不同环境(溶液盐分及pH值的变化调控)下与核酸分子进行特异性吸附与解吸附过程，实现快速、自动化核酸处理纯化功能，提高了样本采集的稳定性。

在本发明一个优选实施例中，采用间断抽取模式将存储在液体存储器22中相应的反应液抽入到微流控芯片1的溶液输入腔11中，所述间断抽取模式为在两类反应液之间抽取一段气体，形成“液体A-气体-液体B”的气液供给模式。

以100μL病原体样本为例，采用本发明的方法进行低载量病原体中核酸提纯：

步骤1包括：将参与病原体裂解所需的裂解混合液与样本原液按照一定体积比例(例如按照3:1-5:1)依次通入复合样本储存器225，关闭第二开关部件102防止未经充分反应的复合样本进入微流控芯片1。其中，上述病原体样本裂解过程中可通过外接振荡器、施加热源辅助加热复合样本储存器225的方式来促进病原体样本裂解。

步骤2包括：步骤2-1，液体分配器31通过机械选通磁性粒子储存器222对应通道，打开试剂给液支通道上第一开关部件101，在给液驱动器21作用下，将充分混匀的磁珠液经第一开关部件101输入微流控芯片溶液输入腔11。

步骤2-2，关闭第二开关部件102，防止磁珠液回流至与第二开关部件102相连接的复合样本储存器225中，磁珠液在给液驱动器21的控制下，以低于300μL/min流速给富集纯化腔13供给磁珠颗粒。

步骤2-3，如图2-3所示，在富集纯化腔13外围的第一磁铁42、第二磁铁43控制下，磁珠颗粒停留于富集纯化腔13中形成磁珠塞。

步骤2-4，在采集控制器53的控制下，微流控芯片1的出口选通废液收集支通道，经过外围磁场富集后，剩余磁珠废液经废液收集支通道进入废液采集器52。

步骤3包括：打开试剂给液支通道第二开关部件102，在给液驱动器21作用下，将充分裂解的复合样本经第二开关部件102输入微流控芯片1的溶液输入腔11；关闭第一开关部件101防止复合样本液回流至与第一开关部件101相连接的液体分配器31中，复合样本液经给液驱动器21驱动流经气泡捕获机构12后进入富集纯化腔13。如图2-3所示，富集纯化腔13外围的磁铁42、磁铁43在磁铁驱动器41控制下发生匀速转动，在外围不断变化的磁场作用下，静态磁珠塞开始在富集纯化腔13中产生规律运动，形成动态磁珠塞。此过程中复合样本液流速需控制在150μL/min以内。所述微流控芯片出口选通废液收集支通道，使经过核酸-磁珠结合后的剩余废液，经废液收集支通道进入废液采集器52。

其中，所述核酸-磁珠的结合除了可以在微流控芯片1上完成，也可以在复合样本储存器225中实现，使过程伴随病原体样本在裂解液作用下碎裂，释放出的核酸随即被复合样本储存器225中的磁珠结合，待样本完全裂解，释放的核酸分子也与磁珠颗粒表面发生键能连接。

上述过程中，步骤1病原体样本裂解将与步骤3中核酸-磁珠结合同时发生，即步骤1与步骤3合并，在复合样本储存器225中产生的核酸-磁珠复合体经上述过程完成步骤2，在微流控芯片富集纯化腔13中形成核酸-磁珠复合体塞。

步骤4包括：液体分配器31选通洗涤液储存器223对应通道，打开试剂给液支通道第一开关部件101，在给液驱动器21作用下，将洗涤液经第一开关部件101输入微流控芯片1的溶液输入腔11。关闭第二开关部件102，防止洗涤液回流至与第二开关部件102相连接的复合样本储存器225中，洗涤液经给液驱动器21驱动依次流经气泡捕获机构12、富集纯化腔13，与腔内核酸-磁珠复合体接触，实现病原体裂解带来的杂质成分洗涤作用。微流控芯片1的出口选通废液收集支通道，使经过洗涤后含有蛋白、高盐离子等杂质成分的废液经废液收集支通道进入废液采集器52。

其中洗涤过程需要对核酸-磁珠复合体进行固定，优选将第一磁铁42和第二磁铁43固定在富集纯化腔13的上方和下方，形成静态磁珠塞进行洗涤操作。更优选地，通过磁铁驱动器41控制上方的第一磁铁42和下方的第二磁铁43发生匀速转动，形成动态磁珠塞使整个洗涤过程更为充分。

其中，所述洗涤过程可涉及一种洗涤液，也可依次通入多种成分不同的洗涤试剂，使核酸-磁珠环境中原有的蛋白质、高盐离子、酚、EDTA等杂质成分有效洗涤纯化。

步骤5包括：液体分配器31选通洗脱液储存器224对应通道，在给液驱动器21作用下，洗脱液依次流经微流控芯片1的溶液输入腔11、气泡捕获机构12、富集纯化腔13，与腔内纯化后的核酸-磁珠复合体接触，利用硅羟基纳米磁珠在不同环境(溶液盐分及pH值的变化调控)下与核酸分子进行特异性解吸附过程，实现对纯化后的核酸样本洗脱富集工作。在采集控制器53的控制下，微流控芯片出口连接富集样本采集主通道，使经过核酸洗脱富集后，洗脱液经富集样本采集主通道进入富集样本采集器51。

其中，所述洗脱过程需要对核酸-磁珠复合体进行固定，优选将第一磁铁42和第二磁铁43固定在富集纯化腔13的上方和下方，形成静态磁珠塞进行洗脱操作。优选地，通过磁铁驱动器41控制上磁铁42和下磁铁43发生匀速转动，形成动态磁珠塞使整个洗脱过程更为充分。所述富集样本富集浓度与洗脱液用量相关，当洗脱液量小于病原体样本输入液量时，核酸富集液浓度高，当洗脱液量远大于病原体样本输入液量时，核酸富集液浓度越低。

其中，所述磁场产生模块中的磁铁部件包括设置在富集纯化腔13的微流控芯片通道上表面的第一磁铁42和设置在富集纯化腔13的微流控芯片通道下表面的第二磁铁43。所述第一磁铁42的下表面和所述富集纯化腔13的微流控芯片通道上表面的距离H1，与第二磁铁43的上表面和富集纯化腔13的微流控芯片通道下表面的距离H2相等。

优选地，所述第一磁铁42及第二磁铁43宽度为富集纯化腔13的微流控芯片通道的宽度W的4～5倍。

所述第一磁铁42和第二磁铁43固定在富集纯化腔13的上方和下方，此时腔内微流控通道中形成静态磁珠塞，对应液体流速需低于300μL/min；第一磁铁42和第二磁铁43以稳定转速在富集纯化腔13的上方和下方匀速运动，此时腔内微流控通道中形成规律运动的动态磁珠塞，对应液体流速需低于150μL/min。

优选地，所述步骤1之前以及步骤5之后还包括采用冲洗液对系统管路进行自清洁的过程。

优选地，所述液体存储器22中的反应液为冲洗液、反应样本溶液、洗涤溶液、裂解溶液、洗脱溶液或其他类型溶液。

优选地，所述冲洗液、洗涤溶液、洗脱溶液涉及无酶纯水、乙醇、异丙醇、磁性粒子溶液、高盐类溶液。

优选地，所述反应样本为纯化或未纯化的唾液、尿液、精液、细胞溶液、蛋白溶液、核酸溶液、细菌菌液、病毒溶液。

优选地，所述磁性粒子溶液通过对磁珠表面进行靶向修饰获得。

优选地，所述磁珠为超顺磁磁珠，所述磁珠表面包裹有高分子化合物，所述高分子化合物为聚苯乙烯化合物、聚氟乙烯或聚纤维化合物，所述高分子化合物表面修饰有功能配体基团，所述功能配体基团包括氨基、羧基、硅基、链霉素、亲和素、醛基或巯基。更优选地，所述配体基团上还修饰有抗体、DNA片段和/或RNA片段。最优选地，所述磁珠表面修饰有聚纤维化合物，所述聚纤维化合物表面修饰有硅羟基。

以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (24)

1.一种提纯低载量病原体中核酸的方法，其特征在于，包括：

步骤1，将病原体溶液进行裂解，之后导入微流控芯片(1)中；

步骤2，将特异性磁珠颗粒导入微流控芯片(1)中，形成芯片内磁珠塞；

步骤3，裂解的病原体溶液与特异性磁珠颗粒结合；

步骤4，采用洗涤液对结合后的磁珠-核酸进行多次洗涤，去除磁珠周围的样本杂质；

步骤5，对结合后的磁珠-核酸进行洗脱工作，收集洗脱液，在所述洗脱液中进行磁珠-核酸解吸附过程，去除磁珠并纯化核酸样本液，收集洗脱液，得到纯化后的核酸样本；

将病原体溶液置于液体存储器(22)的复合样本存储器(225)中，进行裂解，之后导入微流控芯片(1)中；

采用间断抽取模式将存储在液体存储器(22)中相应的反应液抽入到所述微流控芯片(1)的溶液输入腔(11)中，所述间断抽取模式为在两类反应液之间抽取一段气体，形成“液体A-气体-液体B”的气液供给模式。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将参与病原体裂解所需的裂解混合液与样本原液按照一定比例依次通入复合样本储存器(225)中，关闭第二开关部件(102)防止未经充分反应的复合样本进入微流控芯片(1)。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述裂解混合液与样本原液按照3:1-5:1的体积比混合。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述病原体样本裂解过程中通过外接振荡器、施加热源辅助加热复合样本储存器(225)的方式促进病原体样本裂解。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2包括：

步骤2-1，液体分配器(31)通过机械选通磁性粒子储存器(222)对应通道，打开试剂给液支通道上第一开关部件(101)，在给液驱动器(21)作用下，将充分混匀的磁珠液经第一开关部件(101)输入微流控芯片溶液输入腔(11)；

步骤2-2，关闭第二开关部件(102)，防止磁珠液回流至与第二开关部件(102)相连接的复合样本储存器(225)中，所述磁珠液在给液驱动器(21)的控制下，给富集纯化腔(13)供给磁珠颗粒；

步骤2-3，在富集纯化腔(13)外围的第一磁铁(42)、第二磁铁(43)控制下，磁珠颗粒停留于富集纯化腔(13)中形成磁珠塞；

步骤2-4，在采集控制器(53)的控制下，微流控芯片(1)的出口选通废液收集支通道，经过外围磁场富集后，剩余磁珠废液经废液收集支通道进入废液采集器(52)。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述磁珠液在给液驱动器(21)的控制下，以低于300μL/min流速给富集纯化腔(13)供给磁珠颗粒。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3包括：

步骤3-1，打开试剂给液支通道的第二开关部件(102)，在给液驱动器(21)作用下，将充分裂解的复合样本经第二开关部件(102)输入微流控芯片(1)的溶液输入腔(11)；

步骤3-2，关闭第一开关部件(101)，防止复合样本液回流至与第一开关部件(101)相连接的液体分配器(31)中，复合样本液经给液驱动器(21)驱动流经气泡捕获机构(12)后进入富集纯化腔(13)；

步骤3-3，所述富集纯化腔(13)外围的第一磁铁(42)、第二磁铁(43)在磁铁驱动器(41)控制下发生匀速转动，在外围不断变化的磁场作用下，静态磁珠塞开始在所述富集纯化腔(13)中产生规律运动，形成动态磁珠塞；

步骤3-4，所述微流控芯片出口选通废液收集支通道，使经过核酸-磁珠结合后的剩余废液，经废液收集支通道进入废液采集器(52)。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤3-3中复合样本液的流速控制在150μL/min以内。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4包括：

步骤4-1，所述液体分配器(31)选通洗涤液储存器(223)对应通道，打开试剂给液支通道的第一开关部件(101)，在给液驱动器(21)作用下，将洗涤液经第一开关部件(101)输入微流控芯片(1)的溶液输入腔(11)；

步骤4-2，关闭第二开关部件(102)，防止洗涤液回流至与第二开关部件(102)相连接的复合样本储存器(225)中，洗涤液经所述给液驱动器(21)驱动依次流经气泡捕获机构(12)、富集纯化腔(13)，与腔内核酸-磁珠复合体接触，实现病原体裂解带来的杂质成分洗涤作用；

步骤4-3，微流控芯片(1)的出口选通废液收集支通道，使经过洗涤后含有蛋白、高盐离子等杂质成分的废液经废液收集支通道进入废液采集器(52)。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述洗涤过程对核酸-磁珠复合体进行固定，将第一磁铁(42)和第二磁铁(43)固定在所述富集纯化腔(13)的上方和下方，形成静态磁珠塞进行洗涤操作。

11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，通过磁铁驱动器(41)控制上方的第一磁铁(42)和下方的第二磁铁(43)发生匀速转动，形成动态磁珠塞使整个洗涤过程更为充分。

12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤5包括：

步骤5-1，液体分配器(31)选通洗脱液储存器(224)对应通道，在给液驱动器(21)作用下，洗脱液依次流经微流控芯片(1)的溶液输入腔(11)、气泡捕获机构(12)、富集纯化腔(13)，与腔内纯化后的核酸-磁珠复合体接触，利用硅羟基纳米磁珠在不同溶液盐分及pH值的变化调控下与核酸分子进行特异性解吸附过程，实现对纯化后的核酸样本洗脱富集工作；

步骤5-2，在采集控制器(53)的控制下，微流控芯片出口连接富集样本采集主通道，使经过核酸洗脱富集后，洗脱液经富集样本采集主通道进入富集样本采集器(51)。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述磁场产生模块包括设置在富集纯化腔(13)的微流控芯片通道上表面的第一磁铁(42)和设置在富集纯化腔(13)的微流控芯片通道下表面的第二磁铁(43)。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述洗脱过程将第一磁铁(42)和第二磁铁(43)固定在富集纯化腔(13)的上方和下方，形成静态磁珠塞进行洗脱操作。

15.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，通过磁铁驱动器(41)控制第一磁铁(42)和第二磁铁(43)发生匀速转动，形成动态磁珠塞使整个洗脱过程更为充分。

16.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述第一磁铁(42)的下表面和所述富集纯化腔(13)的微流控芯片通道上表面的距离H1，与第二磁铁(43)的上表面和富集纯化腔(13)的微流控芯片通道下表面的距离H2相等。

17.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述第一磁铁(42)及第二磁铁(43)宽度为所述富集纯化腔(13)的微流控芯片通道的宽度W的4～5倍。

18.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液体存储器(22)中的反应液为冲洗液、反应样本溶液、洗涤溶液、裂解溶液、洗脱溶液或其他类型溶液。

19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述冲洗液、洗涤溶液、洗脱溶液为无酶纯水、乙醇、异丙醇、磁性粒子溶液和高盐类溶液中的一种或多种。

20.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述反应样本溶液为纯化或未纯化的唾液、尿液、精液、细胞溶液、蛋白溶液、核酸溶液、细菌菌液或病毒溶液。

21.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述磁性粒子溶液通过对磁珠表面进行靶向修饰获得。

22.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磁珠为超顺磁磁珠，所述磁珠表面包裹有高分子化合物，所述高分子化合物为聚苯乙烯化合物、聚氟乙烯或聚纤维化合物，所述高分子化合物表面修饰有功能配体基团，所述功能配体基团包括氨基、羧基、硅基、链霉素、亲和素、醛基或巯基。

23.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述配体基团上还修饰有抗体、DNA片段和/或RNA片段。

24.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述磁珠表面修饰有聚纤维化合物，所述聚纤维化合物表面修饰有硅羟基。

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