KR20190083723A - 시료의 농축 및 정제를 위한 전처리 시스템 - Google Patents

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성균관대학교산학협력단
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Abstract

본 발명은 시료의 농축 및 정제를 위한 전처리 시스템에 관한 것으로, 보다 상세하게는 기시료 저장 카트리지; 상기 시료 저장 카트리지와 연결되는 핀치-솔레노이드 밸브시스템; 상기 밸브시스템에 연결되는 하부모듈; 상기 하부모듈의 상부에 위치하는 상부모듈; 상기 하부모듈에 장착되는 미세유체 칩; 및 상기 미세유체 칩과 연결되는 튜빙연동펌프를 포함하는, 시료의 농축 및 정제를 위한 전처리 시스템을 제공한다. 이에 따라, 본 발명은 핵산 증폭 기법으로 검출되기 어려운 낮은 농도의 병원체 시료를 전처리 농축을 통해 검출 가능한 농도로 만들어 줌과 동시에 시료에 들어있는 분자진단 저해요소들을 제거하며, 농축된 병원체에서 핵산을 정제 후 추출하는 과정이 완전 자동화되어 비숙련자들도 쉽게 사용할 수 있어 편리성 및 재현성을 증가된 전처리 시스템을 제공할 수 있다.

Description

시료의 농축 및 정제를 위한 전처리 시스템{PRETREATMENT SYSTEM FOR CONCENTRATION AND PURIFICATION OF SAMPLES}
본 발명은 시료의 농축 및 정제를 위한 전처리 시스템 등에 관한 것이다.
현재 병원에서는 낮은 농도의 병원체를 핵산 증폭과 같은 분자진단 기법으로 검출하기 위해서, 전처리 과정으로 12시간 이상의 시간동안 배양을 진행한다. 그 후 배양을 진행한 시료를 원심분리기를 통해 병원체를 농축하여 사용한다. 이러한 방법은 시간이 오래 걸리며 검출하려고 하는 시료 안에 분자진단 저해요소가 존재하여 분자진단 기법의 민감도에 영향을 미친다. 또한 이러한 전처리 과정은 연구원들의 수작업으로 이루어지며 연구자의 숙련도에 영향을 받게 되며, 고위험성 병원체에 노출로 인한 연구원들의 감염 문제를 발생시킬 수 있다.
병원체 농축기술 경우 최근 자성나노입자의 표면에 항체를 결합시킨 후 특정세균과 반응시키는 방법인 Immunomagnetic separation (IMS) 기법을 이용하여 이를 대체할 수 있으나, 10 mL 의 많은 시료에 적용시킬 경우 영구 자석에 의한 입자의 포집 효율이 떨어지며, 복잡한 실험 과정으로 인해 많은 시간이 소요된다.
핵산 정제 방법은 일반적으로 원심분리기를 이용한 기술이 있다. 이 과정은 원심분리기를 이용해 세균을 농축하는 과정 및 washing 과정 등의 반복해서 완충용액을 바꾸어 주면서 원심분리를 진행해 주어야하는 단점이 있다. 이를 대체하는 기술로 자성 실리카 입자를 이용한 정제 기술이 있으나, 이 기술 역시 튜브 안에서 반복적으로 완충용액을 바꾸어주면서 진행해야하는 복잡한 방법으로 이루어져 있다.
Qiagen, Cephied, abbott, BD 등의 분자진단 선발주자 기업에서 시료 내 병원체로부터 직접적으로 유전자를 추출하는 상용 kit를 개발해내고 있지만 병원체 농축과 핵산 정제 및 추출이 동시에 가능한 시스템은 제시된 바 없다.
한편, 마이크로 플루이딕 채널(Microfluidic channel)과 같이 화학물질이나, 혈액 또는 생체분자 등의 액체 시료를 원하는 방향으로 빠르게 전달하려는 연구가 진행됨에 따라(국내 공개특허 제2007-0005153호), 이러한 채널들은 극소량의 샘플 및 시료만을 가지고도 집약적으로 설계된 칩 내에서 화학물질 검출, 반응 검사, 신약 개발, 세포배양, 생체 기관 모사, 또는 실험 등을 수행할 수 있다. 최근에는 분석에 필요한 시료의 양을 극소화시켜 한 방울의 액체만 가지고도 분석이 가능한 개방형 플루이딕 채널(Open fluidic channel)에 대한 연구 또한 진행되고 있다. 상기와 같은 마이크로 플루이딕 채널(Micro fluidic channel)에서는 유체의 흐름을 제어하는 것이 중요하며, 예를 들어 전기나 3차원 구조를 이용하여 유체의 흐름을 제어한다.
본 발명자들은 시료 내 존재하는 낮은 농도의 병원체를 신속하게 농축하고, 농축된 병원체로부터 순수한 핵산 정제 및 추출이 동시에 가능한 미세유체 칩 및 칩 내의 시료전처리 과정을 자동화하기 위한 시스템을 개발하고자 예의 연구한 결과, 시료저장 카트리지, 펌프, 밸브, 히터, 영구자석, 진동모터의 조립 및 자동제어를 통한 전처리용 시스템을 개발함으로써, 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명의 목적은 시료의 농축 및 정제를 위한 전처리 시스템을 제공하는 데 있다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 시료 저장 카트리지; 상기 시료 저장 카트리지와 연결되는 핀치-솔레노이드 밸브시스템; 상기 밸브시스템에 연결되는 하부모듈; 상기 하부모듈의 상부에 위치하는 상부모듈; 상기 하부모듈에 장착되는 미세유체 칩; 및 상기 미세유체 칩과 연결되는 튜빙연동펌프를 포함하는, 시료의 농축 및 정제를 위한 전처리 시스템을 제공한다.
본 발명의 일구현예로서, 상기 시료 저장 카트리지는 시료, 용해 완충액, 용출 완충액 및 세척 완충액을 저장하고 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 하부모듈은 영구자석 및 전동모터가 구비된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또다른 구현예로서, 상기 상부모듈은 히터 및 미세유체 칩의 필름 밸브를 작동시키는 필름 밸브 액츄에이터가 구비된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또다른 구현예로서, 상기 미세유체 칩은 기판; 상기 기판 상에 형성되는 시료 주입구; 시료의 이동 경로를 형성하는 채널; 상기 채널에 연결된 정제 챔버; 상기 정제 챔버에서 제거된 불순물이 빠져나가는 불순물 제거 출구; 상기 채널에 공기가 주입되는 공기 주입구; 및 상기 정제 챔버에서 정제된 시료가 빠져나가는 정제 핵산 출구를 구비한 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또다른 구현예로서, 상기 정제 챔버의 양말단에는 필름밸브가 구비된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또다른 구현예로서, 상기 정제 챔버의 하부에 영구자석이 구비된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또다른 구현예로서, 상기 미세유체 칩은 진동모터를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 미세유체 칩을 이용한 전처리 시스템은, 분자진단 기법에 이용될 순수한 핵산을 분리하기 위한 시료의 전처리 과정(세균 농축, 불순물 분리, 핵산 정제 및 추출)을 1시간 이내 수행할 수 있고, 각각 독립적으로 진행되는 과정을 하나의 미세유체 칩 안에서 연속적으로 수행할 수 있으며, 하나의 반응 공간에서 농축과 핵산 정제가 동시에 이루어지기 때문에 시료 손실이 적어 민감도적으로 우수한 장점이 있다.
또한 미세유체 칩 내의 시료전처리 과정의 자동화를 위해 튜빙 펌프, 핀치 밸브, 히터, 영구자석 등의 모듈 조립으로 이루어진 자동시스템을 개발하여 비숙련자들도 쉽게 사용할 수 있어 편리성 및 재현성을 증가시켰다.
도 1은 본 발명의 미세유체 칩의 도면을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에서 제조한 미세유체 칩과 각 구성 요소를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 미세유체 칩의 분해도를 나타낸 도면이다.
도 4a는 본 발명의 미세유체 칩의 상/하부프레임 및 메인기판을 나타낸 도면이다.
도 4b는 본 발명의 미세유체 칩의 하부 프레임과 메인기판을 결합하는 것을 나타낸 도면이다.
도 4c는 본 발명의 미세유체 칩을 조립한 사진을 나타낸 것이다.
도 5a는 본 발명의 시료 전처리 자동화 시스템의 구성을 나타낸 도면이다.
도 5b는 본 발명의 미세유체 칩이 시스템의 디바이스 스테이지에 장착되는 것을 보여주는 도면이다.
도 6a는 본 발명의 실시예에서 제작한 시스템을 나타낸 것으로, 상부모듈 및 하부모듈을 포함하는 것을 보여주는 도면이다.
도 6b는 본 발명의 실시예에서 제작한 시스템의 내부 구조 사진을 나타낸 도면이다.
도 6c는 본 발명의 실시예에서 제작한 시스템의 상부모듈 및 하부모듈을 보다 상세하게 나타낸 도면이다.
도 7a는 본 발명의 실시예에서 제작한 시스템의 상면을 나타낸 도면이다.
도 7b는 본 발명의 실시예에서 제작한 시스템의 우측면을 나타낸 도면이다.
도 8은 본 발명의 시료의 농축 및 정제를 위한 전처리 자동화 시스템의 모식도를 나타낸 도면이다.
도 9는 본 발명의 시료의 농축 및 정제를 위한 전처리 방법의 과정을 나타낸 도면이다.
도 10은 본 발명의 전처리 방법을 거치지 않은 원시료 및 본 발명의 전처리 방법을 거친 시료를 대상으로 PCR(핵산증폭)을 수행한 후 증폭 산물의 젤 전기영동 결과를 나타낸 도면이다.
도 11은 본 발명의 전처리 방법을 거치지 않은 원시료 및 본 발명의 전처리 방법을 거친 시료를 대상으로 정량적 핵산 증폭 기술(quantitative PCR)을 수행한 후 형광 세기를 확인하여 그 결과를 나타낸 도면이다.
본 발명자들은 핵산 증폭 기법으로 검출되기 어려운 낮은 농도의 병원체 시료를 전처리 농축을 통해 검출 가능한 농도로 만들어 줌과 동시에 시료에 들어있는 분자진단 저해요소들을 제거하며, 농축된 병원체에서 핵산을 정제 후 추출하는 과정이 동시에 가능한 미세유체 칩 및 시료의 농축 및 정제 과정이 자동화된 전처리 시스템을 개발하고자 연구한 결과, 시료저장 카트리지, 펌프, 밸브, 히터, 영구자석, 진동모터의 조립 및 자동제어를 통한 전처리용 시스템을 이용할 경우, 분자진단이 가능한 수준의 시료의 농축 및 정제가 자동화 시스템 의해 수행될 수 있다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은, 시료 저장 카트리지; 상기 시료 저장 카트리지와 연결되는 핀치-솔레노이드 밸브시스템; 상기 밸브시스템에 연결되는 하부모듈; 상기 하부모듈의 상부에 위치하는 상부모듈; 상기 하부모듈에 장착되는 미세유체 칩; 및 상기 미세유체 칩과 연결되는 튜빙연동펌프를 포함하는, 시료의 농축 및 정제를 위한 전처리 시스템을 제공한다.
또한 본 발명은 기판; 상기 기판 상에 형성되는 시료 주입구; 시료의 이동 경로를 형성하는 채널; 상기 채널에 연결된 정제 챔버; 상기 정제 챔버에서 제거된 불순물이 빠져나가는 불순물 제거 출구; 상기 채널에 공기가 주입되는 공기 주입구; 및 상기 정제 챔버에서 정제된 시료가 빠져나가는 정제 시료 출구를 포함하는, 미세유체 칩을 제공한다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서는 상기 미세유체 칩을 포함하는 시스템을 통해서 시료의 농축 및 정제를 위한 전처리를 수행하였으며, 이에 본 발명은 하기 단계를 포함하는 시료의 농축 및 정제를 위한 전처리 방법을 제공할 수 있다:
병원체 및 표면에 항원이 결합된 자성나노입자를 혼합하여 시료를 제조하는 단계(S1);
상기 S1 단계의 시료를 자성 입자가 충진 된 미세유체 칩에 주입구를 통해 주입하여 시료를 농축한 후, 불순물 제거 출구를 통해 남은 유체를 제거하는 단계(S2);
상기 S2단계에서 남은 유체를 제거한 후, 용해 및 결합 완충액을 주입하여 볼텍싱(vortexing)하고, 세척 완충액을 주입하여 불순물 제거 출구를 통해 남은 유체를 제거하는 단계(S3);
상기 S3단계에서 남은 유체를 제거한 후, 용출 완충액을 주입하고, 챔버를 50 내지 80℃로 가열하며 볼텍싱하는 단계(S4); 및
상기 S4 단계의 볼텍싱이 완료되면, 시료 주입구 및 불순물 제거 출구를 차단하고, 공기 주입구 및 정제 핵산 출구를 개방하여 농축 및 정제된 시료를 추출해내는 단계(S5).
이하, 도면을 참고하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
[미세유체 칩]
본 발명의 미세유체 칩은 상술한 것과 같이 기판; 상기 기판 상에 형성되는 시료 주입구; 시료의 이동 경로를 형성하는 채널; 상기 채널에 연결된 정제 챔버; 상기 정제 챔버에서 제거된 불순물이 빠져나가는 불순물 제거 출구; 상기 채널에 공기가 주입되는 공기 주입구; 및 상기 정제 챔버에서 정제된 시료가 빠져나가는 정제 시료 출구를 포함하는 것으로, 시료의 농축 및 정제 용도로 이용되는 미세유체 칩이다. 본 발명의 미세유체 칩의 도면은 도 1에 나타내었다.
도 2 하단에서 확인할 수 있는 것과 같이, 본 발명은 기판에 고정을 위한 Align홀, 진동모터 접촉을 위한 홈이 형성될 수 있으며, 상기 기판을 포함한 미세유체 칩은 플라스틱 필름 소재가 이용되는 것으로, 도 3에 나타낸 것과 같이 Polyethylene terephthalate (PET), Polyvinyl chloride (PVC), Polyimide (PI)의 얇은 플라스틱 필름을 이용하여 필요한 형상을 cutting하여 적층구조로 제작되는 것이다.
상기 기판은 아크릴 재질의 상, 하판 케이스를 조립하여 완성될 수 있는 것으로. 본 발명의 미세유체 칩은 4개의 미세채널, 1개의 병원체 농축-핵산 정제 챔버, 4개의 주입구와 2개의 채널 밸브 그리고 시스템 스테이지 고정을 위한 6개의 hole 부분과 믹서 및 세균 용해를 위한 진동을 전달하기 위한 진동모터와의 접촉부분인 1개 hole 구조 그리고 케이스 조립을 위한 8개의 작은 hole로 구성되어있다. 2개의 입구와 2개의 출구는 각각 시료주입구, 공기주입구, 불순물출구, 정제 핵산 출구로 이루어지고, 각 미세 채널은 폭 0.5 내지 3 mm, 높이 50 내지 200 μm일 수 있으며, 농축-핵산 정제 챔버는 중앙의 큰 직사각형(높이 500 내지 1000 μm, 길이, 5 내지 20 mm, 폭 1 내지 10 mm)과 양 옆에 사다리꼴 형태(높이 500 내지 1000 μm, 짧은 길이 0.1 내지 2 mm, 큰 길이 2.5 내지 5 mm, 두 변 사이 길이 1 내지 3 mm)와 직사각형이 합쳐진 형상일 수 있으며 총 허용 가능한 시료의 용량은 20 내지 100 μL의 부피일 수 있다.
상기 정제 챔버의 양 말단에는 필름 밸브가 구비된다. 상기 필름 밸브는 챔버에 들어온 시료가 채널을 통해 새로운 시료가 인입되거나 밖으로 배출되는 것을 조절할 수 있도록 구비된 것으로, 상기 필름 밸브는 챔버에 들어온 시료가 농축되고 정제되는 과정에서 잠겨질 수 있는 것이다.
상기 정제 챔버의 하부에는 영구자석이 구비되는 것으로, 상기 정제 챔버의 하부에 영구자석이 구비됨으로써, 자성 나노입자의 항체에 결합된 병원체를 포함하는 시료를 농축할 때 상기 자성 나노입자와 영구자석 사이의 자성으로 인해 효율적인 농축을 수행할 수 있는 것이다.
상기 미세유체 칩은 시료의 주입 전에, 주입구를 통해 자성 실리카 입자가 충진 될 수 있고, 진동모터를 구비하여 시료의 혼합을 도울 수 있다.
[시료]
본 발명에서 사용하는 시료는, 병원체 및 표면에 항체가 결합된 자성나노입자를 포함하는 것으로, 자성 나노입자의 표면에 항체를 결합시켜 면역자성나노입자를 합성한 후, 병원체를 혼합하여, 병원체가 면역자성나노입자의 항체와 결합하도록 하는 것이다.
상기 병원체의 종류는 바이러스, 세균, 진균 등일 수 있고, 본 발명의 실시예와 같이 대장균일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
[시료 전처리 자동화 시스템]
본 발명의 미세유체 칩은 시료 전처리 자동화 시스템에 장착되어, 시료의 농축 및 정제를 수행할 수 있는 것으로, 본 발명의 시스템은 시료 저장 카트리지; 상기 시료 저장 카트리지와 연결되는 핀치-솔레노이드 밸브시스템; 상기 밸브시스템에 연결되는 하부모듈; 상기 하부모듈의 상부에 위치하는 상부모듈; 상기 하부모듈에 장착되는 미세유체 칩; 및 상기 미세유체 칩과 연결되는 튜빙연동펌프를 포함할 수 있다.
- 시료 저장 카트리지
본 발명의 시료 저장 카트리지는, 시료(Sample), 용해 완충액(lysis buffer), 용출 완충액(elution buffer), 세척 완충액(washing buffer) 등이 저장될 수 있는 카트리지 형태의 시료 저장 부분으로, 시스템 기구물에 탈 부착 가능한 형태이다.
상기 시료 저장 카트리지는 핀치-솔레노이드 밸브 시스템에 연결된다.
- 핀치-솔레노이드 밸브시스템
상기 시료 저장 카트리지와 연결되는 핀치-솔레노이드 밸브 시스템은 솔레노이드 플런지 압박에 의해 유체 시료의 흐름을 제어할 수 있는 것으로, 미세유체 칩이 장착되는 하부모듈과 연결될 수 있다.
- 하부모듈
상기 하부모듈은 상기 밸브시스템과 연결된 것으로, 영구자석 및 전동모터가 구비되어, 미세유체 칩을 시스템에 고정하는 역할과, 미세유체 칩 내 챔버의 시료를 농축하고 mixing하는 역할을 수행할 수 있다.
상기 영구자석의 1축 구동을 통해 농축 및 정제기술을 자동화할 수 있다.
-상부모듈
상기 상부 모듈은 상기 하부모듈의 상부에 위치하는 것으로, 하부모듈에 장착된 미세유체 칩에 주입된 자성 실리카 입자에서 핵산이 잘 분리될 수 있도록 히터가 구비된다. 상기 히터의 양 말단에는 필름 밸브의 개폐를 조절할 수 있는 필름 밸브 액츄에이터가 구비된다.
- 튜빙연동펌프
본 발명에서 하부 모델에 장착된 미세유체 칩에는 튜빙연동펌프가 설치되는 것이며, 상기 펌프에 의해 유체 시료 및 완충액 등의 자동 수송을 가능하게 할 수 있다. 상기 튜빙연동펌프는 0.1 내지 2.5 mL/min으로 유체의 흐름을 제어 가능하다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1. 농축-정제용 미세유체 칩의 제조]
농축-정제용 미세유체 칩을 도 3에 따라 제조하였다. 도 3에 나타낸 것과 같이, 폴리에틸렌 소재의 하판 및 상판 사이에 폴리이미드 소재의 채널형성용 기판을 적층해준 후, PVC 소재의 주입구 부분과 출구 부분을 형성하였고, 그 위에 챔버의 양말단에 필름밸브(챔버-밸브)를 형성하고 챔버 덮개를 적층하여 메인 디바이스 부분을 제조하였다. 이후 메인 디바이스를 상부프레임 및 하부프레임으로 하우징해주었다.
상기 상부프레임 및 하부프레임의 형태는 도 4a에 나타낸 것 같이, 상부프레임에는 시료저장 카트리지의 튜빙 펌프와 연결되는 튜빙 연결부가 형성되었고, 하부프레임에는 정제 챔버 부분이 고정될 수 있도록 오목하게 홈을 형성하였고, 상부프레임 및 하부프레임에 핵산정제 시스템에 고정될 수 있는 Align홀과 진동모터 연결구멍을 형성해주었다.
이후 도 4b에 나타낸 것과 같이 하부프레임에 메인 디바이스를 적층한 후 상부 프레임을 적층하여 조립해주었다. 상기 조립된 미세유체 칩은 도 4c에 나타낸 것과 같다.
본 실시예 1에서는 Polyethylene terephthalate (PET), Polyvinyl chloride (PVC), Polyimide (PI)의 얇은 플라스틱 필름을 이용하여 필요한 형상을 cutting하여 적층구조로 제작하였고, 아크릴 재질의 상, 하판 케이스를 조립한 것을 이용하였다. 상기 미세 유체칩은 4개의 미세채널, 1개의 병원체 농축-핵산 정제 챔버, 4개의 주입구와 2개의 채널 밸브, 시스템 스테이지 고정을 위한 6개의 hole 부분, 믹서 및 세균 용해를 위한 진동을 전달하기 위한 진동모터와의 접촉부분인 1개 hole 구조 그리고 케이스 조립을 위한 8개의 작은 hole로 구성되어있다. 2개의 입구와 2개의 출구는 각각 시료주입구, 공기주입구, 불순물출구, 정제 핵산 출구로 이루어지며, 각 미세 채널은 폭 1 mm, 높이 100 μm이며, 농축-핵산 정제 챔버는 중앙의 큰 직사각형(높이 800 μm, 길이, 13.3 mm, 폭 3 mm)과 양 옆에 사다리꼴 형태(높이 800 μm, 짧은 길이 1 mm, 큰 길이 3 mm, 두 변 사이 길이 2 mm)와 직사각형이 합쳐진 형상이며 40 μL의 부피로 설계하여 제작된 것이다.
[실시예 2. 시료 전처리 자동화 시스템의 구성]
본 실시예에서는 실시예 1에서 제작한 미세유체 칩이 연결되는 시료 전처리 자동화 시스템을 제작하였다. 본 발명에서 사용하는 시스템의 구성은 도 5에 나타내었는데, 도 5a에 나타낸 것과 같이 크게 시료가 저장되는 시료 저장 카트리지, 핀치-솔레노이드 밸브시스템, 디바이스 스테이지 및 히터, 튜빙연동펌프로 이루어지는 것이다. 도 5b에 나타낸 것과 같이 미세유체 칩을 디바이스 스테이지 부분에 올려 고정해주었다. 상기 시스템을 케이싱한 외부 사진을 도 6a에 나타내었다. 도 6a에 나타낸 것과 같이 상부모듈과 하부모듈을 포함하고 있으며 상기 상부 모듈은 디바이스 스테이지 및 히터를 포함하고, 하부모듈은 진동모터와 영구자석을 포함하도록 제작하였다, 시스템의 내부 구조는 도 6b에 나타낸 것과 같이, 상부모듈 및 하부모듈이 형성된 케이스의 안쪽에 핀치-솔레노이드 밸브와 상기 밸브와 연결되는 시스템 파워서플라이를 포함하도록 하였고, 샘플의 이송 및 유체를 제어할 수 있는 튜빙펌프를 구비하였으며, 상기 시스템의 구동 시 발생하는 열을 식힐 수 있도록 했다. 상기 상부모듈과 하부모듈은 도 6c에 더 상세하게 나타내었다.
구동되는 시스템의 상면을 도 7a에 나타내었으며, 도 7a와 같이 시료 저장부를 시스템 좌측에 위치시켜 시료가 담긴 시린지를 거치할 수 있도록 하였고, 핀치-솔레노이드 밸브를 통해 채널에서 유체의 흐름을 조절할 수 있도록 하였다. 상기 튜빙펌프에는 유체 이송 공기 주입 튜브를 연결시켜 유체 시료를 미세유체 칩에 전달하거나 버퍼 용액 등을 자동 수송할 수 있도록 하였다. 또한 시스템의 우측면을 도 7b에 나타내었고, 제작된 시스템의 모식도는 도 8에 나타내었다.
[실시예 3. 시료 전처리]
실시예 1에서 제작된 미세유체 칩을 실시예 2의 시스템에 고정하여 챔버 부분 하단에 영구자석이 위치하도록 하였다. 상기 미세유체 칩은 z-section 방향으로 1축 제어로 이동이 가능하다. 칩의 주입구는 튜빙과 연결되며 모든 시료는 튜빙 펌프와, 핀치-솔레노이드 밸브, 필름 밸브에 의해 제어해주었다. 핵산 정제에 필요한 65℃의 온도유지를 위해서 챔버 상단부에 위치한 히터를 작동시켜 주었고, 시스템 하우징 부분과 탈부착이 가능한 4개의 부분으로 구성되는 시료저장 카트리지에는 병원체-면역자성나노입자 혼합시료, lysis-binding buffer, washing buffer, elution buffer를 채워주었다.
시료 전처리 과정은 도 9에 나타내었다. 병원체 농축, 불순물 제거를 위한 washing, 핵산 정제 및 추출 과정으로 진행되는 것으로, 먼저 자성나노입자의 표면에 항체를 결합시킨 면역자성나노입자를 합성 후 병원체가 들어있는 시료와 혼합하였고, 이 때 시료의 병원체는 자성나노입자 표면의 항체와 결합하는 것이다. 본 실시예에서 병원체는 대장균 O157:H7 균주를 사용하였다.
이 후 챔버에 핵산과 결합이 가능한 자성실리카 비드를 충진 시킨 후 병원체 농축 과정을 진행하였다. 상기 병원체-면역자성나노입자가 들어있는 시료를 시료저장 카트리지에서 튜빙 펌프를 이용하여 2 mL/분의 유량으로 주입시켰고, 영구자석의 자기장에 의해 농축과정을 진행해주었다. 최종적으로 20 μL 시료 내에 병원체-면역자성나노입자가 존재하도록 하였다.
다음으로 50 μL의 lysis-binding buffer를 챔버로 주입한 후 필름 밸브로 막아주었고, 5분 동안 진동모터를 이용하여 병원체로부터 핵산 추출이 원활하게 되도록 하였다. 핵산은 추출됨과 동시에 lysis-binding buffer의 cation bridge로 인해 챔버 내 충진 된 자성실리카입자와 결합되었고, washing을 통해 챔버 내 lysis-binding buffer를 모두 제거한 후, 40 μL의 RNase free water (elution buffer)를 주입하였다.
이 후 히터로 65℃로 10분 동안 챔버를 가열해준 후, 핵산을 자성실리카입자에서 분리시켜주었다. 이후 40 μL 내의 농축된 병원체의 핵산 샘플을 수득하였다.
상기 수득된 샘플에 대하여, 대장균 O157:H7 균주의 농축 전의 원시료와 병원체 농축 및 핵산 정제 후 미세유체 칩에서 얻어진 시료(농축-핵산 정제액)를 핵산 증폭 기법 (PCR) 을 거쳐 젤 전기영동을 통해 비교하여 도 10에 나타내었다(M : DNA 100 bp marker, 103-1 : 103-1 CFU/mL 농도의 대장균 O157:H7 시료).
그 결과 도 10에서 확인할 수 있는 것과 같이, 핵산 증폭 기술을 이용해 검출이 불가능한 102-1 CFU/mL 농도에서 온칩 세균 농축 및 핵산 정제 후 검출되는 것을 확인할 수 있다.
또한, 대장균 O157:H7 균주의 농축 전의 원시료와 병원체 농축 및 핵산 정제 시스템에서 얻어진 시료(농축-정제액)를 정량적 핵산 증폭 기술(quantitative PCR)을 이용하여 농축 및 정제 효과를 확인한 결과를 도 11에 나타내었다. 도 11에서 확인할 수 있는 것과 같이, 농축-정제 과정을 거친 시료에서 더 높은 형광세기가 관찰되어, 농축-정제 과정을 통해 병원체의 농축이 효율적으로 이루어진 것을 알 수 있었다.
또한 상기 원시료 및 상기 농축-정제를 거친 시료의 핵산 증폭 시작점(Cq value)을 분석한 결과, 하기 표 1에 나타낸 것과 같이 원시료에 비하여 현저히 낮은 수준의 Cq value를 보여, 본 발명의 농축 및 정제 방법이 우수한 핵산정제 효과를 보인다는 것을 확인하였다.
농도 (CFU/mL) 원시료 (Cq) 농축-정제액(Cq)
103 30.82 24.02
102 35.22 27.74
10 42.53 28.97
1 - 30.70
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (9)

  1. 시료 저장 카트리지; 상기 시료 저장 카트리지와 연결되는 핀치-솔레노이드 밸브시스템; 상기 밸브시스템에 연결되는 하부모듈; 상기 하부모듈의 상부에 위치하는 상부모듈; 상기 하부모듈에 장착되는 미세유체 칩; 및 상기 미세유체 칩과 연결되는 튜빙연동펌프를 포함하는, 시료의 농축 및 정제를 위한 전처리 시스템.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 시료는 병원체; 및 표면에 항체가 결합된 자성나노입자를 포함하는 것을 특징으로 하는, 시료의 농축 및 정제를 위한 전처리 시스템.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 시료 저장 카트리지는 시료, 용해 완충액, 용출 완충액 및 세척 완충액을 저장하고 있는 것을 특징으로 하는, 시료의 농축 및 정제를 위한 전처리 시스템.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 하부모듈은 영구자석 및 전동모터가 구비된 것을 특징으로 하는, 시료의 농축 및 정제를 위한 전처리 시스템.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 상부모듈은 히터 및 미세유체 칩의 필름 밸브를 작동시키는 필름 밸브 액츄에이터가 구비된 것을 특징으로 하는, 시료의 농축 및 정제를 위한 전처리 시스템.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 미세유체 칩은 기판; 상기 기판 상에 형성되는 시료 주입구; 시료의 이동 경로를 형성하는 채널; 상기 채널에 연결된 정제 챔버; 상기 정제 챔버에서 제거된 불순물이 빠져나가는 불순물 제거 출구; 상기 채널에 공기가 주입되는 공기 주입구; 및 상기 정제 챔버에서 정제된 시료가 빠져나가는 정제 핵산 출구를 구비한 것을 특징으로 하는, 시료의 농축 및 정제를 위한 전처리 시스템.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 정제 챔버의 양말단에는 필름밸브가 구비된 것을 특징으로 하는, 시료의 농축 및 정제를 위한 전처리 시스템.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 정제 챔버의 하부에 영구자석이 구비된 것을 특징으로 하는, 시료의 농축 및 정제를 위한 전처리 시스템.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 미세유체 칩은 진동모터를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 시료의 농축 및 정제를 위한 전처리 시스템.
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