KR20110030415A - 만능 샘플 제조 시스템 및 집적 분석 시스템에서의 용도 - Google Patents

만능 샘플 제조 시스템 및 집적 분석 시스템에서의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 마이크로칩을 카트리지 및 공압 매니폴드에 상호접촉시키기 위한 장치 및 방법을 제공한다. 카트리지, 마이크로칩 및 공압 매니폴드는 하류 제조 장치, 예컨대 열 조정 장치 및 분리 및 분석 장치와 집적될 수 있다.

Description

만능 샘플 제조 시스템 및 집적 분석 시스템에서의 용도 {UNIVERSAL SAMPLE PREPARATION SYSTEM AND USE IN AN INTEGRATED ANALYSIS SYSTEM}

<교차-참조>

본원은 2008년 1월 22일에 출원된 미국 가출원 제61/022,722호 및 2008년 12월 23일에 출원된 미국 가출원 제61/140,602호를 우선권 주장하며, 상기 가출원들은 그 전문이 본원에 참고로 도입된다.

<정부 지원 연구에 대한 기술>

본 발명의 측면은 미국 국방부에 의해 수여된 프로젝트 번호 W911SR-04-P-0047 및 NIH에 의해 수여된 승인 번호 5R01HG003583 중 하나 이상 하에 미국 정부 지원으로 이루어진 것이다. 미국 정부는 본 발명에 대해 특정 권리를 가질 수 있다.

샘플 제조는 생물학적 분석 시스템에서 아주 흔한 문제점이다. 하류 분석 검정을 믿을 수 있게 수행하기 위해 다양한 원래의 샘플 유형으로부터 충분히 정제된 표적을 제공하는 것에 대한 문제는 보편적이고, 세포 생물학, 게놈학, 프로테오믹스, 메타볼로믹스, 음식 생물학, 분자 진단학, 및 많은 다른 생물학적 및 의학적 검정을 망라한다. 샘플 제조에 대한 많은 발전이 이루어졌으나, 주요 해결책은 샘플을 조작하기 위해 직선 단 또는 다축 팔을 사용하는 로봇 시스템에서 또는 수동으로 사용되는 시약을 개발하는 것이었다.

마이크로유체공학 및 나노유체공학은 소형화된 샘플 부피가 분석을 위해 제조되는 것을 허용한다. 장점은 작동 비용을 감소시키는 시약의 나노규모 소비 및 오퍼레이터 변동을 제거하는 완전 자동화를 포함한다. 마이크로유체 샘플 제조는 현존 또는 미래 검출 방법과 조화될 수 있거나, 완전 집적 시스템의 일부일 수 있다. 본원에서, 샘플 제조 및 분석을 위한 10 mL 초과의 부피를 갖는 완전 부피 샘플 제조를 마이크로리터 및 더 작은 부피로 집적하는 방법 및 기구가 개시되어 있다.

샘플로부터 출발하여, 본 발명은 ELISA, PCR 또는 다른 핵산 증폭 기술에 의한 분석, 단일 분자 검출, 단백질 어레이, 질량 분광법, 및 당업자에게 익히 공지된 다른 분석 방법으로 에어로졸 샘플, 물, 액체, 혈액, 대변, 비내, 협측 및 다른 면봉, 체액, 환경 샘플을 포함하는 매트릭스에서 유기체를 검출하고 분류하는 추가 가공을 위해 구성성분을 농축시키고 예비분리하는데 적용될 수 있다.

마이크로유체 핵산 정제는 핵산 검정을 위한 샘플의 제조에서 수행될 수 있다. DNA 분석의 경우, PCR 증폭이 현재 방법 중 하나이다. 마이크로어레이 DNA, RNA 및 단백질 분석은 또한 샘플을 반응 및 판독을 위해 마이크로어레이에 적용할 수 있기 전에 광범위한 샘플 제조를 필요로 한다.

샘플은 다양한 기질 및 매트릭스에 의해 수득될 수 있다. 매트릭스는 DNA-기재 증폭을 방해하는 억제성 화합물, 예컨대 헴, 인디고, 흄산, 이가 양이온 및 단백질 등을 포함하는 복잡한 혼합물을 함유할 수 있다. 에어로졸은 PCR 증폭을 방해하는 다량의 곰팡이, 금속 및 토양 흄산 및 다른 산을 함유할 수 있다 (절대 표준(gold standard)).

초기 작업은 겨우 3개의 시딩된 유기체가 토양 추출물의 희석된 샘플로부터, 이어서 2개의 16S 리보솜 유전자 단편의 PCR 증폭에 의해 검출될 수 있다는 것을 나타내었다. 만능(universal) 프라이머를 사용하여 16S 및 18S rDNA PCR 증폭을 위해 토양 샘플로부터 DNA를 추출하는데 저융점 아가로스가 사용되어 왔다. 컬럼 포맷의 스펀 분리 겔, 예컨대 세파덱스(Sephadex) 컬럼이 사용될 수 있다. 다단계 정제, 예컨대 세파덱스 컬럼과 조합된 유기 추출이 개발되었다. 비드 비팅은 많은 수의 유기체에 대한 샘플을 제조하는데 있어서 효과적인 방법이고, 액체 질소에서의 분쇄는 적은 수의 유기체를 검출하는데 있어서 효과적인 방법으로 밝혀졌다. 이들 방법은 효과적이면서, 연구 실험실 환경에 가장 적합하였다.

컬럼, 비드 및 표면으로의 고체상 추출이 DNA 분석 전에 DNA를 정제하기 위해 사용될 수 있다. 프로테이나제 K, 이어서 퀴아젠(Qiagen) QIA Amp 실리카-겔 막 컬럼 및 이소코드 스틱스(IsoCode Stix), 함침 막-기재 기술, 이어서 가열, 세척 및 간단한 원심분리를, 완충액, 혈청 및 전혈 중 탄저균(B. anthracis) 스턴 무성 세포 및 완충액 중 포자에 대해 비교하였고, 잘 작동하는 것으로 밝혀졌다.

본 발명의 장치 및 방법을 사용하여 다양한 분리를 수행할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 장치 및 방법을 사용하여 크로마토그래피, 상-기재 또는 자성-기재 분리, 전기영동, 증류, 추출 및 여과를 수행할 수 있다. 예를 들어, 크로마토그래피 또는 전기영동을 위해 마이크로유체 채널 또는 모세관을 사용할 수 있다. 또한, 상-기재 분리 및 자성-기재 분리를 위해 비드, 예컨대 자성 비드를 사용할 수 있다. 비드 또는 본원에 기재된 임의의 다른 표면은 표적에 대한 특이적 또는 비특이적 결합을 나타내는 결합 잔기로 관능화될 수 있다. 결합은 정전기, 반데르 발스 상호작용, 소수성, 친수성, 수소 결합, 이온 상호작용, 뿐만 아니라 부분적 공유결합 상호작용, 예컨대 금과 황 사이에서 나타나는 상호작용을 기초로 할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 장치 및 방법은 면역자기 분리를 사용한다.

면역자기 분리 (IMS)는 상자성 비드 및 자기장을 사용하는 기계론적으로 단순화된 포맷을 사용하여 단일 단계로 표적을 포획하고 농축시키는 강력한 기술이다 (문헌 [Grodzinski P, Liu R, Yang J, Ward MD. Microfluidic system integration in sample preparation microchip-sets-a summary. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2004;4:2615-8], [Peoples MC, Karnes HT. Microfluidic immunoaffinity separations for bioanalysis. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2007 Aug 30] 및 [Stevens KA, Jaykus LA. Bacterial separation and concentration from complex sample matrices: a review. Crit Rev Microbiol. 2004; 30(1):7-24] 참조). IMS는 특이적 표적 항원, 단백질, 독소, 핵산, 세포 및 포자를 포획하고, 농축시키고 이어서 정제하는데 사용될 수 있다. 본래 사용되는 IMS는 항체를 사용하는 것과 관련되나, 본 발명자들은 IMS의 사용을 다른 특이적 친화성 상호작용, 예를 들어 렉틴, DNA-DNA, DNA-RNA, 바이오틴-스트렙타비딘, 및 고체상에 커플링된 다른 친화성 상호작용을 포함하는 것으로 보편화한다. IMS는 특이적 친화성 시약, 전형적으로 항체 또는 DNA를 외부 자기장의 존재하에 오직 자성인 상자성 비드에 결합시킴으로써 작용한다. 비드를 복잡한 샘플, 예컨대 에어로졸, 액체, 체액 또는 음식에 첨가할 수 있다. 친화성 시약 (그 자체가 상자성 비드에 결합됨)으로의 표적의 결합 후, 자기장의 적용에 의해 비드를 포획한다. 결합되지 않은 또는 느슨하게 결합된 물질을 상용성 완충액으로 세척함으로써 제거하며, 이는 본래 샘플 중의 기타 원치않는 물질로부터 표적을 정제한다. 비드는 작고 (nm 내지 um) 높은 수준의 표적에 결합하기 때문에, 자기력에 의해 비드가 농축되는 경우, 비드는 전형적으로 단지 nL-uL 부피의 비드층을 형성하여, 정제와 동시에 표적을 농축시킨다. 정제되고 농축된 표적을 편리하게는 온-비드 도중 수송하거나, 변성하거나, 용해하거나 또는 분석할 수 있거나, 또는 추가 샘플 제조 또는 분석을 위해 비드를 용리시킬 수 있다.

면역자기 분리는 음식, 체액 및 다른 매트릭스 중의 미생물의 검출을 포함하는 많은 적용을 위해 광범위하게 사용된다. 상자성 비드는 용이하게 혼합되고 조작될 수 있고, 마이크로규모 및 마이크로유체 적용으로 개질가능하다. 이 기술은 거시적 규모-대-마이크로규모 경계면에 대한 우수한 해결책을 제공한다: 비드는 샘플을 거시적 규모에서 정제한 후, 마이크로유체 또는 나노유체 플랫폼으로의 도입을 위해 나노규모 (수백 nL)로 농축시키는데 있어서 거의 이상적인 비히클이다. 면역자기 분리는 통상적으로 실시간 PCR, 전기화학발광 및 자기력 식별 전에 상류 정제 단계로서 사용된다.

마이크로칩 상의 유체를 이동시키는 능력은 매우 중요하다. 본 발명은 샘플 포획 및 정제, 마이크로-분리, 마이크로-밸브, 마이크로-펌프 및 마이크로-라우터, 나노유체 제어 및 나노규모 생화학에서의 기술을 기재한다. 기술의 핵심 구성성분은 마이크로-로봇 온-칩 밸브 (Micro-robotic On-chip Valves; MOVe) 기술 (도 1에 나타낸 예) 및 복잡한 작업흐름을 소형화하고 자동화하는 그의 적용이다. 집합적으로, MOVe 밸브, 펌프 및 라우터, 및 이들을 작동시키는 한벌의 기계는 마이크로칩 유체 가공 플랫폼이라고 지칭될 수 있다.

마이크로칩 유체 가공 플랫폼 기술의 핵심은 샘플을 수송하고 가공하고 분석을 가능하게 하는 MOVe 펌프, 밸브 및 라우터이다. 본래 캘리포니아대학교 버클리캠퍼스 (U. C. Berkeley)에 있는 마티스(Mathies) 실험실에서 개발된 이들 신규 외부로 구동되는, 공압식으로-추진되는, 온-칩 밸브, 펌프 및 라우터 (문헌 [Grover, W.H. A. M. Skelley, C. N. Liu, E. T. Lagally, and R. M. Mathies. 2003. Sensors and Actuators B89:315-323]; 리차드 에이. 마티스(Richard A. Mathies) 등의 미국 특허 출원 제20040209354 A1호 (2004년 10월 21일); 이들 모두는 그 전문이 본원에 참고로 도입됨)는 20 nL 내지 10 ㎕의 조작 부피에서 유체 유동을 제어할 수 있다.

MOVe 밸브 및 펌프 (도 1)는 밸브를 개방하고 폐쇄하는 폴리디메틸 실록산 (PDMS) 변형가능한 막 층, 및 막을 변형시키고 밸브를 구동시키는 공압층과 2개의 유리 마이크로유체 층을 조합할 수 있다. 상단 유리 유체 웨이퍼에서 에칭된 마이크로유체 채널은 불연속적이고, "비아 웨이퍼(via wafer)"를 통해 비아로, 및 마이크로유체 채널을 통상적으로 폐쇄된 밸브 자리로 인도한다 (도 1A). 진공이 통상적 규모 진공 공급원 및 압력원에 의해 공압 변위 챔버에 가해지는 경우, 통상적으로 폐쇄된 PDMS 막이 밸브 자리로부터 상승하여, 밸브를 개방시킨다 (도 1B). 도 1의 바닥 패널은 다른 패널과 유사한 규모로 밸브의 상면도를 나타낸다.

마이크로칩 A 상의 입력 구역으로부터 출력 구역으로 유체를 이동시키기 위한 마이크로칩 상의 마이크로펌프를 제조하기 위해 3개의 마이크로밸브가 사용될 수 있다. 유체는 3개 이상의 밸브에 의해 이동된다. 밸브는 변형가능한 구조의 구동에 의해 생성될 수 있다. 몇몇 이행에서는 밸브 자리가 생성되고, 다른 실시양태에서는 밸브 자리가 필요하지 않을 수 있다. 도 2는 상단으로부터 바닥으로 MOVe 장치를 나타낸다: 밸브, 라우터, 믹서, 비드 포획부. 자가-프라이밍 MOVe 펌프 (도 2, 상단)는 3개의 밸브의 작동을 조정함으로써 제조되고, 어느 한 방향으로 유동을 생성할 수 있다. 라우터는 3개 이상의 MOVe 밸브로부터 제조된다 (도 2, 상단 중간 패널). 혼합은 마이크로유체에 대한 성배였다: MOVe 믹서 (도 2, 바닥 중간 패널)는 샘플 및 시약을 신속하게 혼합한다. MOVe 장치는 비드 세트를 펌핑 또는 트래핑하기 위해 자성 비드와 정교하게 작용한다 (도 2, 바닥 패널).

통상적으로 폐쇄된 MOVe 밸브, 펌프 및 라우터는 내구성이 있고, 낮은 비용으로 용이하게 제작되고, 조밀 어레이에서 작동할 수 있고, 낮은 불용 부피를 갖는다. MOVe 밸브, 펌프 및 라우터의 어레이는 마이크로칩 상에서 용이하게 제작된다. 중요하게는, 마이크로칩 상의 모든 MOVe 밸브, 펌프 및 라우터는 PDMS 막의 단일 시트를 사용하여 간단한 제조 공정으로 동시에 제조된다 (마이크로칩 상의 5개의 MOVe 마이크로펌프를 제조하는데 드는 비용으로 500개를 제조할 수 있음). 이 획기적인 기술은 처음으로 마이크로칩 상의 복잡한 마이크로유체 회로 및 나노유체 회로를 제조하는 능력을 제공한다.

마이크로칩의 용도 및 설계에 대해 논의하는 특허 및 출원은 2007년 12월 25일에 허여된 미국 특허 제7,312,611호; 2001년 2월 20일에 허여된 미국 특허 제6,190,616호; 2002년 7월 23일에 허여된 미국 특허 제6,423,536호; 2005년 3월 22일에 허여된 미국 특허 제10,633,171호; 2005년 3월 22일에 허여된 미국 특허 제6,870,185호; 2001년 1월 25일에 출원된 미국 특허 출원 제US 2001-0007641호; 2002년 4월 18일에 출원된 미국 특허 출원 제US 20020110900호; 2005년 9월 15일에 출원된 미국 특허 출원 제20070248958호; 2003년 12월 29일에 출원된 미국 특허 출원 제US 20040209354호; 2003년 12월 29일에 출원된 미국 특허 출원 제US 2006/0073484호; 2005년 5월 25일에 출원된 제US 20050287572호; 2007년 3월 21일에 출원된 미국 특허 출원 제US 20070237686호; 2004년 11월 24일에 출원된 제US 20050224352호; 2005년 9월 15일에 출원된 제US 20070248958호; 2007년 2월 2일에 출원된 제US 20080014576호; 및 2006년 7월 26일에 출원된 미국 특허 출원 제US 20070175756호를 포함하며, 상기 문헌들은 모두 그 전문이 본원에 참고로 도입된다.

<발명의 요약>

한 측면에서, 본 발명은 마이크로유체 마이크로칩 내의 하나 이상의 마이크로유체 채널에 유체적으로 연결된 하나 이상의 포트 천공부를 포함하는 마이크로유체 마이크로칩 (여기서, 상기 채널은 채널을 통한 유체의 이동을 제어하는 하나 이상의 밸브를 포함함); 및 마이크로칩에 맞물리고 챔버를 포함하는 카트리지 (여기서, 상기 챔버는 상기 마이크로유체 마이크로칩의 포트 천공부와 각각 일렬로 정렬된 2개의 챔버 천공부를 포함함)를 포함하는 장치를 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 카트리지는 하나 이상의 샘플 또는 하나의 시약을 수용하도록 개질된다. 다른 실시양태에서, 상기 카트리지는 다른 마이크로칩에 맞물린 다른 카트리지에 유체적으로 연결된다. 다른 실시양태에서, 상기 카트리지는 2개 이상의 챔버를 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 2개 이상의 챔버 중 하나 이상은 이동가능한 자석에 인접한다. 다른 실시양태에서, 상기 2개 이상의 챔버 중 하나 이상은 온도 제어된다. 다른 실시양태에서, 상기 2개 이상의 챔버 중 하나 이상은 필터를 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 하나 이상의 챔버는 5 ㎕ 이상의 유체 부피를 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 하나 이상의 챔버는 10 ㎕ 이상의 유체 부피를 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 카트리지의 유체 부피는 상기 마이크로유체 마이크로칩의 유체 부피의 100 X이다. 다른 실시양태에서, 상기 하나 이상의 챔버 중 하나는 필터를 더 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 장치는 카트리지 또는 마이크로유체 마이크로칩에 자기장을 가하기 위한 자석을 더 포함한다. 다른 실시양태에서, 밸브는 공압식으로 구동된다. 다른 실시양태에서, 상기 카트리지는 상기 하나 이상의 시약 또는 상기 하나 이상의 샘플의 전달을 위한 하나 이상의 압력원에 연결되도록 개질된다. 다른 실시양태에서, 상기 압력원은 카트리지에 양압 또는 음압을 제공한다. 다른 실시양태에서, 상기 하나 이상의 압력원은 공압 솔레노이드에 의해 제어된다. 다른 실시양태에서, 상기 하나 이상의 압력원은 공압 매니폴드이다. 다른 실시양태에서, 마이크로유체 마이크로칩은 유체층, 엘라스토머층 및 공압층을 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 카트리지는 하나 이상의 입력 포트를 더 포함하며, 여기서 상기 하나 이상의 입력 포트는 전달 장치와 맞물리도록 개질되고, 상기 전달 장치는 상기 마이크로유체 마이크로칩의 유체층에 유체적으로 연결되고; 상기 하나 이상의 챔버 중 하나는 상기 마이크로유체 마이크로칩의 유체층에 유체적으로 연결된 폐쇄된 반응 챔버이다. 다른 실시양태에서, 상기 전달 장치는 온도 조절기에 열로 커플링된다. 다른 실시양태에서, 상기 전달 장치는 주사기이다. 다른 실시양태에서, 상기 카트리지는 상기 샘플로부터의 하나 이상의 구성성분을 풍부하게 하도록 설계되고, 하나 이상의 샘플 입력 포트를 포함하며, 여기서 상기 하나 이상의 챔버는 비드를 포함하는 폐쇄된 반응 챔버이고, 상기 비드는 상기 하나 이상의 구성성분에 결합한다. 다른 실시양태에서, 카트리지는 핵산을 증폭시키기 위한 시약을 포함하는 하나 이상의 시약 저장소를 더 포함하며, 여기서 하나 이상의 시약 저장소는 마이크로칩을 통해 챔버에 유체적으로 연결된다. 다른 실시양태에서, 카트리지는 증폭된 핵산에 결합하기 위한 비드를 포함하는 하나 이상의 비드 저장소를 더 포함하며, 여기서 하나 이상의 비드 저장소는 마이크로칩을 통해 챔버에 유체적으로 연결된다. 다른 실시양태에서, 상기 비드는 상자성 비드 또는 유리 비드이다. 다른 실시양태에서, 비드로의 하나 이상의 구성성분의 상기 결합은 가역적이다. 다른 실시양태에서, 상기 비드는 상자성 비드이고, 상기 장치는 상기 폐쇄된 반응 챔버의 벽으로 상기 상자성 비드를 끌어당길 수 있는 이동가능한 자석을 더 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 카트리지는 샘플로부터의 하나 이상의 구성성분을 풍부하게 하도록 설계되고, 여기서 상기 하나 이상의 구성성분은 DNA, RNA, 마이크로RNA, siRNA, 단백질, 지질 또는 다당류이다.

다른 측면에서, 본 발명은 (a) 마이크로유체 마이크로칩 내의 하나 이상의 마이크로유체 채널에 유체적으로 연결된 하나 이상의 포트 천공부를 포함하는 마이크로유체 마이크로칩 (여기서, 상기 채널은 채널을 통한 유체의 이동을 제어하는 하나 이상의 밸브를 포함함); 및 마이크로칩에 맞물리고 챔버를 포함하는 카트리지 (여기서, 상기 챔버는 상기 마이크로유체 마이크로칩의 포트 천공부와 각각 일렬로 정렬된 2개의 챔버 천공부를 포함함)를 포함하는 장치를 제공하는 단계, 및 (b) 상기 챔버 내에서 하나 이상의 효소 반응을 수행하는 단계를 포함하는, 생화학 반응을 수행하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 하나 이상의 효소 반응은 라이게이션, 평활화, 닉(nick) 복구, 변성, 중합, 가수분해, 인산화 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 다른 실시양태에서, 방법은 고체상 입자를 사용하여 상기 효소 반응의 생성물을 분리하는 것을 더 포함한다.

다른 측면에서, 본 발명은 (a) 마이크로유체 마이크로칩 내의 하나 이상의 마이크로유체 채널에 유체적으로 연결된 하나 이상의 포트 천공부를 포함하는 마이크로유체 마이크로칩 (여기서, 상기 채널은 채널을 통한 유체의 이동을 제어하는 하나 이상의 밸브를 포함함); 및 마이크로칩에 맞물리고 챔버를 포함하는 카트리지 (여기서, 상기 챔버는 상기 마이크로유체 마이크로칩의 포트 천공부와 각각 일렬로 정렬된 2개의 챔버 천공부를 포함하고, 상기 카트리지는 하나 이상의 입력 포트를 더 포함하며, 상기 하나 이상의 입력 포트는 전달 장치와 맞물리도록 개질되고, 상기 전달 장치는 상기 마이크로유체 마이크로칩의 유체층에 유체적으로 연결되고; 상기 하나 이상의 챔버 중 하나는 상기 마이크로유체 마이크로칩의 유체층에 유체적으로 연결된 폐쇄된 반응 챔버임)를 포함하는 장치의 입력 포트에 전달 장치를 맞물리게 하는 단계, (b) 풍부화에 대한 상기 하나 이상의 구성성분의 이용율을 증가시키기 위해 상기 샘플을 하나 이상의 시약으로 처리하는 단계, (c) 상기 하나 이상의 구성성분을 상기 카트리지의 상기 하나 이상의 반응 챔버로 전달하는 단계, (d) 상기 하나 이상의 폐쇄된 반응 챔버에서 상기 구성성분을 하나 이상의 입자에 결합시키는 단계, (e) 폐기물을 제거하기 위해 상기 입자 결합된 구성성분을 세척하는 단계, (f) 상기 입자 결합된 구성성분을 용리시키는 단계를 포함하는, 샘플로부터의 하나 이상의 구성성분을 풍부하게 하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 전달은 마이크로유체 마이크로칩의 상기 하나 이상의 밸브를 통해 상기 하나 이상의 구성성분을 상기 하나 이상의 반응 챔버로 펌핑하는 것을 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 결합은 마이크로유체 마이크로칩의 상기 하나 이상의 밸브를 통해 상기 입자를 카트리지 내의 시약 포트로부터 상기 하나 이상의 반응 챔버로 펌핑하는 것을 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 입자는 상자성 비드, 나노입자, 수지 또는 고체상 입자이다. 다른 실시양태에서, 상기 하나 이상의 구성성분은 DNA, RNA, 마이크로RNA, siRNA, 단백질, 지질 또는 다당류이다. 다른 실시양태에서, 단계 (b)는 상기 전달 장치를 열로 조절하는 것을 더 포함한다. 다른 실시양태에서, 단계 (b)는 풍부화에 대한 상기 하나 이상의 구성성분의 이용율을 증가시키기 위해 용해 시약 또는 구성성분 단리 시약을 상기 카트리지 상의 시약 포트로부터 상기 전달 장치로 전달하는 것을 더 포함한다. 다른 실시양태에서, 단계 (d)의 비드는 상자성 비드이다. 다른 실시양태에서, 상기 세척 단계 (e)는 이동가능한 자석에 의해 상기 상자성 비드를 끌어당기는 것을 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 마이크로유체 마이크로칩은 상기 폐기물의 유동을 제2 방향으로 향하게 한다. 다른 실시양태에서, 단계 (c)는 마이크로유체 마이크로칩 내의 공압식으로 구동되는 밸브 또는 외부 압력원을 사용하여 상기 하나 이상의 구성성분을 상기 카트리지의 상기 하나 이상의 폐쇄된 반응 챔버로 전달하는 것을 포함한다. 다른 실시양태에서, 외부 압력원은 마이크로유체 마이크로칩에 양압 또는 음압을 제공한다. 다른 실시양태에서, 상기 샘플 전달 장치는 주사기이다.

다른 측면에서, 본 발명은 (a) (i) 마이크로유체 마이크로칩 내의 마이크로유체 채널에 유체적으로 연결된 포트 천공부를 포함하는 제1 마이크로유체 마이크로칩 (여기서, 상기 채널은 채널을 통한 유체의 이동을 제어하는 하나 이상의 밸브를 포함함); 및 (ii) 마이크로유체 마이크로칩에 맞물리고 하나 이상의 샘플 입력 포트, 하나 이상의 챔버, 출구 포트를 포함하는 카트리지 (여기서, 샘플 입력 포트는 포트 천공부에 연결되고, 상기 하나 이상의 출구 포트 중 하나 이상은 상기 제1 마이크로유체 마이크로칩의 출구 포트 천공부와 일렬로 정렬되고, 상기 하나 이상의 챔버는 상기 제1 마이크로유체 마이크로칩의 유체층에 유체적으로 연결됨)를 포함하는 제1 유체 조작 모듈; (b) 반응 채널 (여기서, 상기 반응 채널은 상기 제1 마이크로칩 내에 함유되지 않음); (c) 온도 조절기 (여기서, 상기 반응 채널은 상기 출구 포트에 유체적으로 연결된 상기 카트리지 상의 포트에 유체적으로 연결되고, 상기 반응 채널의 한 부분 이상은 상기 온도 조절기와 열 접촉함); 및 (d) 마이크로유체 마이크로칩, 카트리지 또는 반응 채널에 자기장을 가하기 위한 자석을 포함하는 장치를 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 자석은 상기 반응 채널에 인접한다. 다른 실시양태에서, 장치는 상기 반응 채널을 통해 상기 제1 마이크로유체 마이크로칩에 유체적으로 연결된 제2 마이크로유체 마이크로칩을 더 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 온도 조절기는 펠티어(Peltier) 장치이다. 다른 실시양태에서, 장치는 상자성 비드를 더 포함한다.

다른 측면에서, 본 발명은 (a) (i) 마이크로유체 마이크로칩 내의 마이크로유체 채널에 유체적으로 연결된 포트 천공부를 포함하는 제1 마이크로유체 마이크로칩 (여기서, 상기 채널은 채널을 통한 유체의 이동을 제어하는 하나 이상의 밸브를 포함함); 및 (ii) 마이크로유체 마이크로칩에 맞물리고 하나 이상의 샘플 입력 포트, 하나 이상의 챔버, 출구 포트를 포함하는 카트리지 (여기서, 샘플 입력 포트는 포트 천공부에 연결되고, 상기 하나 이상의 출구 포트 중 하나 이상은 상기 제1 마이크로유체 마이크로칩의 출구 포트 천공부와 일렬로 정렬되고, 상기 하나 이상의 챔버는 상기 제1 마이크로유체 마이크로칩의 유체층에 유체적으로 연결됨)를 포함하는 제1 유체 조작 모듈; (b) 반응 채널 (여기서, 상기 반응 채널은 상기 제1 마이크로칩 내에 함유되지 않음); (c) 온도 조절기 (여기서, 상기 반응 채널은 상기 출구 포트에 유체적으로 연결된 상기 카트리지 상의 포트에 유체적으로 연결되고, 상기 반응 채널의 한 부분 이상은 상기 온도 조절기와 열 접촉함); 및 (d) 마이크로유체 마이크로칩, 카트리지 또는 반응 채널에 자기장을 가하기 위한 자석을 포함하는 장치에 핵산을 함유하는 샘플을 전달하고; 온도 조절기와 열 접촉하는 반응 채널의 부분을 통해 핵산 및 유효량의 시약을 1회 이상 수송하는 단계; 핵산을 증폭시키는 단계; 및 증폭된 핵산을 분석하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 방법은 온도 조절기를 사용하여 열순환을 수행하는 것을 더 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 시약은 중합효소 연쇄 반응 또는 순환 서열분석을 위한 시약이다.

다른 측면에서, 본 발명은 (a) 유체층, 구동층 및 공압층을 포함하는 제1 마이크로유체 마이크로칩 (여기서, 유체층은 하나 이상의 마이크로유체 채널을 포함하고, 상기 하나 이상의 마이크로유체 채널 중 하나 이상은 출구 천공부를 포함함); (b) 가요성 커넥터의 제1 말단에서 출구 천공부에 유체적으로 연결된 가요성 커넥터; (c) 상기 가요성 커넥터에 유체적으로 연결된 모세관; 및 (d) 제1 전극 및 제2 전극 (여기서, 제1 전극 및 제2 전극은 모세관 통로를 따라 전기장을 생성하도록 배치됨)을 포함하는 장치를 제공한다. 한 실시양태에서, 가요성 커넥터는 수술용 폴리(테트라플루오로에틸렌) 또는 규소 배관(tubing)이다. 다른 실시양태에서, 가요성 커넥터는 탄성 배관이다. 다른 실시양태에서, 가요성 커넥터는 약 1.5 내지 3 mm의 외부 직경 및 약 0.25 내지 0.5 mm의 내부 직경을 갖는다. 다른 실시양태에서, 가요성 커넥터는 또한 가요성 커넥터의 제2 말단에서 제2 마이크로유체 마이크로칩 또는 제1 마이크로유체 마이크로칩에 유체적으로 연결된다. 다른 실시양태에서, 가요성 커넥터는 캐뉼라, 업피트 배관, 마이크로배관 피팅(fitting) 또는 업처치(upchurch) 배관 어댑터에 의해 출구 천공부에 유체적으로 연결된다. 다른 실시양태에서, 모세관은 약 150 내지 500 마이크로미터의 외부 직경 및 약 10 내지 100 마이크로미터의 내부 직경을 갖는다. 다른 실시양태에서, 모세관은 폴리아미드 또는 폴리(테트라플루오로에틸렌) 코팅된다. 다른 실시양태에서, 모세관은 분리 겔을 포함한다. 다른 실시양태에서, 모세관은 약 10 내지 100 cm 길이이다. 다른 실시양태에서, 제1 전극은 포크형 전극이다. 다른 실시양태에서, 상기 포크형 전극은 하나 이상의 전도성 채널 또는 하나 이상의 금속성 도체를 포함한다. 다른 실시양태에서, 제1 전극 및 제2 전극은 약 25 내지 500 V/cm인 전기장을 생성한다.

다른 측면에서, 본 발명은 유체층, 엘라스토머층 및 공압층을 포함하는 마이크로유체 마이크로칩에 조성물을 제공하는 단계; 마이크로유체 마이크로칩에 유체적으로 연결된 가요성 커넥터로 조성물을 전달하는 단계; 조성물을 모세관으로 이동시키기 위해 전기장을 제공하는 단계; 크기 또는 전하를 기준으로 구성성분을 분리하기 위해 조성물에 대해 모세관 전기영동을 수행하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 전기장은 약 25 내지 500 V/cm이다. 다른 실시양태에서, 상기 튜브 내의 상기 조성물은 기체의 제1 및 제2 볼루스(bolus)에 인접하며, 기체의 상기 제1 볼루스는 상기 조성물의 상류에 있고, 기체의 상기 제2 볼루스는 상기 튜브 내의 상기 조성물의 하류에 있다. 다른 실시양태에서, 기체의 상기 제1 및 제2 볼루스는 상기 조성물을 다른 조성물로부터 단리한다. 다른 실시양태에서, 조성물은 핵산, 단백질, 지방산 또는 다당류인 하나 이상의 구성성분을 포함한다. 다른 실시양태에서, 핵산은 마이크로RNA, DNA, RNA 또는 siRNA이다.

다른 측면에서, 본 발명은 (a) 로딩 채널에 유체적으로 연결된 분리 채널; (b) 로딩 채널 및 로딩 채널을 통해 분리 채널에 전기적으로 연결된 2개 이상의 전극을 포함하는 포크형 전극 (여기서, 분리 채널과 로딩 채널 사이의 유체 연결부는 로딩 채널로의 2개의 전극의 전기 연결부 사이에 위치됨); 및 (c) 로딩 채널에 유체적으로 연결된 공압식으로 구동되는 밸브를 포함하는 장치를 제공한다. 한 실시양태에서, 장치는 상기 포크형 전극과 전기 접촉하는 캐뉼라형 전극을 더 포함하며, 상기 캐뉼라형 전극의 내부 직경은 약 0.2 mm 이상이다. 다른 실시양태에서, 상기 캐뉼라형 전극은 상기 분리 채널로의 기체의 주입을 감소시키도록 배치된다. 다른 실시양태에서, 분리 채널은 모세관이며, 여기서 모세관은 가요성 연결부를 사용하여 공압식으로 구동되는 밸브에 유체적으로 연결된다. 다른 실시양태에서, 분리 채널은 마이크로채널이다. 다른 실시양태에서, 분리 채널 및 공압식으로 구동되는 밸브는 마이크로유체 마이크로칩 상에 집적된다. 다른 실시양태에서, 로딩 채널은 로딩 채널 용액을 포함하고, 분리 채널은 분리 채널 용액을 포함하며, 여기서 샘플 용액은 분리 채널 용액보다 더 낮은 전기 전도성을 갖는다. 다른 실시양태에서, 2개 이상의 전극은 분리 채널과 로딩 채널 사이의 유체 연결부의 어느 한 측면 상의 로딩 채널에 유체적으로 연결된 한 말단, 및 베이스 채널에 유체적으로 연결된 다른 말단 상에 있는 2개 이상의 마이크로채널을 포함한다. 다른 실시양태에서, 2개 이상의 전극 각각은 전압원 및 로딩 채널에 전기적으로 연결된 금속성 도체이다.

다른 측면에서, 본 발명은 결합되어 삼원 접합부를 형성하는 제1, 제2 및 제3 마이크로유체 채널을 포함하며, 여기서 제1 마이크로유체 채널은 포크형 전극의 제1 전극에 전기적으로 연결되고, 제2 마이크로유체 채널은 포크형 전극의 제2 전극에 전기적으로 연결되고, 제1, 제2 및 제3 마이크로유체 채널은 각각 공압식으로 구동되는 밸브에 유체적으로 연결된 것인 장치를 제공한다.

다른 측면에서, 본 발명은 (1) 로딩 채널에 유체적으로 연결된 분리 채널; (2) 로딩 채널 및 로딩 채널을 통해 분리 채널에 전기적으로 연결된 2개 이상의 전극을 포함하는 포크형 전극 (여기서, 분리 채널과 로딩 채널 사이의 유체 연결부는 로딩 채널로의 2개의 전극의 전기 연결부 사이에 위치됨); 및 (3) 로딩 채널에 유체적으로 연결된 공압식으로 구동되는 밸브를 포함하는 장치를 제공하는 단계; 분리 채널에 분리 채널 용액을 제공하는 단계; 로딩 채널에 조성물을 전달하는 단계 (여기서, 공압식으로 구동되는 밸브는 로딩 채널로의 조성물의 전달을 제어하는데 사용됨); 포크형 전극을 사용하여 분리 채널을 따라 전기장을 가하는 단계; 크기 또는 전하를 기준으로 구성성분을 분리하기 위해 조성물에 대해 모세관 전기영동을 수행하는 단계를 포함하는 모세관 전기영동을 수행하는 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, 조성물은 분리 채널 용액보다 더 낮은 전기 전도성을 갖는다. 다른 실시양태에서, 조성물은 상기 전기장의 적용에 의해 농축된다.

다른 측면에서, 본 발명은 (a) (1) 제1 밸브를 포함하는 제1 채널; (2) 제1 밸브의 한 측면 상에서 제1 채널과 교차하는 제2 채널; (3) 제1 밸브의 다른 측면 상에서 제1 채널과 교차하는 제3 채널 (여기서, 제2 채널 또는 제3 채널 중 하나 이상은 T-밸브에서 제1 채널과 교차하거나, 또는 제2 채널 또는 제3 채널 중 하나 이상은 제2 밸브를 포함하고, 제2 채널 및 제3 채널은 각각 포트에 연결됨)을 포함하는 마이크로유체 마이크로칩; 및 (b) 유체가 제1 채널로부터 유체 루프로 유동할 수 있도록 포트에 제거가능하게 부착된 유체 루프를 포함하는 마이크로유체 장치를 제공한다.

다른 측면에서, 본 발명은 (a) 하나 이상의 공압식으로 구동되는 밸브를 포함하는 마이크로칩; 및 (b) 마이크로유체 마이크로칩 내의 포트를 통해 하나 이상의 공압식으로 구동되는 밸브에 유체적으로 연결되고, 고정된 부피를 갖고, 제거가능한 샘플 루프를 포함하는 마이크로유체 장치를 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 공압식으로 구동되는 밸브는 마이크로유체 장치 내의 하나 이상의 공압 채널에 의해 구동된다. 다른 실시양태에서, 샘플 루프는 모세관 튜브를 포함한다. 다른 실시양태에서, 샘플 루프는 제1 접합부 및 제2 접합부에서 관통형 마이크로유체 채널에 유체적으로 연결되고, 관통형 마이크로유체 공압식으로 구동되는 밸브는 제1 접합부와 제2 접합부 사이의 관통형 마이크로유체 채널에 위치된다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 접합부는 T-밸브를 포함하며, 여기서 T-밸브의 폐쇄는 관통형 마이크로유체 채널을 통한 유체의 통과를 방지하지 않는다. 다른 실시양태에서, 샘플 루프는 제1 채널 및 제2 채널을 통해 관통형 마이크로유체 채널에 연결되고, 제1 채널 및 제2 채널 중 하나 이상은 샘플 루프 밸브를 포함한다.

다른 측면에서, 본 발명은 원하는 부피를 포함하고 제거가능한 샘플 루프를 갖는 장치를 배치하는 단계; 마이크로유체 장치 상의 하나 이상의 공압식으로 구동되는 밸브를 사용하여 샘플 루프를 고정된 부피의 유체로 충전하는 단계; 마이크로유체 장치로 유체를 전달하는 단계를 포함하는, 마이크로유체 장치로 고정된 부피의 유체를 전달하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 샘플 루프 및 관통형 마이크로유체 채널은 제1 접합부 및 제2 접합부에서 유체적으로 연결되고, 하나 이상의 접합부는 T-밸브를 포함한다. 다른 실시양태에서, 관통형 마이크로유체 채널은 제1 접합부와 제2 접합부 사이에 위치된 관통형 마이크로유체 밸브를 포함한다.

한 측면에서, 본 발명은 (a) 카트리지; (b) 카트리지와 유체적으로 상호접촉된, 하나 이상의 마이크로유체 격막식 밸브를 갖는 마이크로유체 마이크로칩; 및 (c) 마이크로유체 마이크로칩의 표면 상에서 마이크로유체 마이크로칩과 상호접촉된 공압 매니폴드 (여기서, 공압 매니폴드는 마이크로유체 마이크로칩의 표면의 전체 또는 오직 일부를 덮음)를 포함하는 장치를 제공한다. 한 실시양태에서, 장치는 마이크로유체 마이크로칩의 챔버에서 자기장을 생성하도록 배치된 자석을 더 포함한다. 한 실시양태에서, 공압 매니폴드는 자성 구성성분을 위한 환상 공간을 갖는다. 다른 실시양태에서, 마이크로유체 마이크로칩은 유체 채널을 포함하는 유체층, 공압 채널을 포함하는 공압층, 및 그 사이에 샌드위치된 활성화 층을 포함하며, 여기서 카트리지는 개구부를 갖는 챔버를 포함하고, 개구부는 유체 채널에 연결하는 유체층 내의 개구부와 맞물리고, 공압 매니폴드는 공압 채널과 연결하는 마이크로유체 마이크로칩의 공압층 내의 개구부와 맞물린 개구부를 포함한다.

다른 측면에서, 본 발명은 (a) 카트리지; (b) 하나 이상의 마이크로유체 격막식 밸브를 갖고 카트리지와 상호접촉된 마이크로유체 마이크로칩; (c) 마이크로유체 마이크로칩의 표면 상에서 마이크로유체 마이크로칩과 상호접촉된 공압 매니폴드; 및 (d) 카트리지와 열 접촉하는 온도 제어 블록을 포함하는 장치를 제공한다. 한 실시양태에서, 마이크로유체 마이크로칩은 유체 채널을 포함하는 유체층, 공압 채널을 포함하는 공압층, 및 그 사이에 샌드위치된 활성화 층을 포함하며, 여기서 카트리지는 개구부를 갖는 챔버를 포함하고, 개구부는 유체 채널에 연결하는 유체층 내의 개구부와 맞물리고, 공압 매니폴드는 공압 채널과 연결하는 마이크로유체 마이크로칩의 공압층 내의 개구부와 맞물린 개구부를 포함한다.

다른 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 마이크로유체 격막식 밸브를 갖고 카트리지와 상호접촉된 마이크로유체 마이크로칩을 포함하는 장치를 제공하며, 여기서 마이크로유체 마이크로칩은 비드 레일 및 시약 레일을 갖는다.

다른 측면에서, 본 발명은 (a) (i) 카트리지; (ii) 카트리지와 유체적으로 상호접촉된, 하나 이상의 마이크로유체 격막식 밸브를 갖는 마이크로유체 마이크로칩; (iii) 마이크로유체 마이크로칩의 표면 상에서 마이크로유체 마이크로칩과 상호접촉된 공압 매니폴드 (여기서, 공압 매니폴드는 마이크로유체 마이크로칩의 표면의 전체 또는 오직 일부를 덮음); 및 (iv) 마이크로유체 마이크로칩의 챔버에서 자기장을 생성하도록 배치된 자석 (여기서, 공압 매니폴드는 자성 구성성분을 위한 환상 공간은 갖음)을 포함하는 장치를 제공하는 단계; (b) mRNA를 함유하는 샘플 및 시약을 카트리지에 공급하는 단계; (c) 마이크로유체 마이크로칩의 웰에서 샘플 및 시약을 혼합하는 단계; (d) mRNA를 증폭시켜 증폭된 RNA를 형성시키는 단계; (e) 자성 비드를 사용하여 증폭된 RNA를 포획하는 단계; (f) 환상 공간에 자석을 위치시켜, 마이크로유체 마이크로칩의 저장소 내의 자성 비드를 포획하는 단계를 포함하는, mRNA를 증폭시키고 증폭된 RNA를 정제하는 방법을 제공한다.

다른 측면에서, 본 발명은 (a) (i) 카트리지; (ii) 하나 이상의 마이크로유체 격막식 밸브를 갖고 카트리지와 상호접촉된 마이크로유체 마이크로칩; (iii) 마이크로유체 마이크로칩의 표면 상에서 마이크로유체 마이크로칩과 상호접촉된 공압 매니폴드; 및 (iv) 카트리지와 열 접촉하는 온도 제어 블록을 포함하는 장치를 제공하는 단계; (b) mRNA를 함유하는 샘플 및 시약을 카트리지에 공급하는 단계; (c) 마이크로유체 마이크로칩의 웰에서 샘플 및 시약을 혼합하여 혼합물을 형성시키는 단계; (d) 온도 제어 블록을 사용하여 혼합물을 가열하는 단계; (e) mRNA를 증폭시키는 단계를 포함하는, mRNA를 증폭시키는 방법을 제공한다.

다른 측면에서, 본 발명은 (a) 하나 이상의 마이크로유체 격막식 밸브를 갖고 카트리지와 상호접촉된 마이크로유체 마이크로칩을 포함하는 장치 (여기서, 마이크로유체 마이크로칩은 비드 레일 및 시약 레일을 갖음)를 제공하는 단계; (b) 하나 이상의 시약 레일 웰에 시약을 공급하는 단계; (c) 비드 레일 웰에 자성 비드 슬러리를 공급하는 단계; (d) 샘플 웰에 mRNA를 함유하는 샘플을 공급하는 단계; (e) 마이크로유체 마이크로칩의 출력 웰에 샘플 및 시약을 펌핑하여 혼합물을 형성시키는 단계; (f) mRNA를 증폭시켜 증폭된 RNA를 형성시키는 단계; (g) 정제 웰에 자성 비드 슬러리를 펌핑하는 단계; (h) 정제 웰에 증폭된 RNA를 펌핑함으로써 증폭된 RNA와 자성 비드 슬러리를 접촉시키는 단계; (i) 증폭된 RNA를 정제하는 단계를 포함하는, mRNA를 증폭시키고 증폭된 RNA를 정제하는 방법을 제공한다.

다른 측면에서, 본 발명은 (a) 펌핑 밸브, 공급원 웰 및 혼합 웰을 포함하는 마이크로유체 장치 (여기서, 펌핑 밸브, 공급원 웰 및 혼합 웰은 채널에 의해 유체적으로 연결됨)를 제공하고; (b) 채널을 통해 공급원 웰로부터 펌핑 밸브로 제1 방향으로 유체를 펌핑하고; (c) 채널을 통해 펌핑 밸브로부터 혼합 웰로 제2 방향으로 유체를 펌핑하는 것 (여기서, 제2 방향은 제1 방향과 반대임)을 포함하는, 마이크로유체 장치에서 유체를 펌핑하는 방법을 제공한다.

샘플 제조는 생체분석 공정의 도전할만한 영역이다. 한 측면에서, 많은 상이한 샘플 유형으로부터 샘플을 제조하는 방법이 개시되어 있다. 다른 측면에서, 많은 상이한 샘플 유형으로부터 샘플을 제조할 수 있는 기구가 개시되어 있다. 한 실시양태에서, 기구는 개별적으로 또는 카트리지의 집적 부분으로서 제작될 수 있는 마이크로칩 구성성분에서 유체 유동을 향하게 하는 마이크로규모 밸브를 갖는 카트리지를 작동시킨다. 다른 실시양태에서, 기구는 압력-추진된 유동을 사용하여 카트리지로 샘플을 이동시키거나, 또는 카트리지 상의 마이크로밸브에 의해 진공 조절될 수 있다. 다른 실시양태에서, 기구는 마이크로밸브에 의해 향하게 된 유체 유동으로 원하는 분석물질을 정제하기 위해 샘플의 구성성분의 자기 분리를 위해 상자성 비드를 조작할 수 있다.

한 실시양태에서, 기구는 생물학적 또는 화학적 샘플을 가공할 수 있는 만능 샘플 제조 시스템이다. 액체, 면봉, 스와이프(swipe), 고체, 기체 또는 다른 매트릭스 중의 샘플을 카트리지에 로딩할 수 있다. 적절한 시약을 선택하고, 카트리지에 의해 및 마이크로칩 구성성분에 의해 형성되는 회로망을 개방하고 폐쇄하는 마이크로규모 밸브를 사용하여 유체를 향하게 하기 위해, 컴퓨터를 포함할 수 있는 전자기기에 의해 기구를 제어한다. 핵산, 예를 들어 샘플의 DNA, RNA, 마이크로RNA, 단백질, 지질, 다당류, 세포벽, 소분자 및 모든 다른 생물학적 구성성분을 추출하기 위해 샘플을 가공할 수 있다. 유사하게, 또한 화학적 구성성분을 추출하거나 정제하기 위해 샘플을 가공할 수 있다. 예를 들어, DNA를 마이크로비드로 가공할 수 있다.

한 실시양태에서, 카트리지에 영구적으로 부착될 수 있거나 또는 카트리지에 가역적으로 결합될 수 있는 하나 이상의 챔버, 채널, 배관 또는 모세관을 포함하는 카트리지 내의 반응 챔버로 샘플을 이동시킬 수 있다. 카트리지, 기구, 외부 장치 또는 다른 배치에 위치될 수 있는 마이크로펌프에 의해 조절거나 생성된 진공 또는 압력을 사용하여 채널, 배관 또는 모세관에 샘플을 재현가능하게 위치시킬 수 있다.

한 실시양태에서, DNA의 경우, 가공된 샘플은 PCR, 회전환, 분지된 DNA, EXPAR, LAMP 및 당업자에게 익히 공지된 다른 DNA 증폭 방법에 의해 증폭되거나, 또는 질량 분광법 또는 단일 분자 검출 방법에 의해 분석될 수 있다. RNA는 역전사효소 실시간-PCR에 의해 가공될 수 있거나, 또는 샘플은 DNA 마이크로어레이 또는 다른 분석 방법을 위해 제조될 수 있다. 실시간 또는 종점 분석이 기구에 의해 수행될 수 있다. 단백질의 경우, 효소 검정, 샌드위치 면역검정, 항체 침전, 단백질 소화, 단백질 및 펩티드 표지화, 및 다른 통상적으로 사용되는 단백질 분석 방법을 포함하는 검정이 카트리지에서 수행될 수 있다. 유사하게, 표준 방법을 사용하여 기구에서 다른 세포 구성성분 또는 화학물질이 추출되거나 정제될 수 있다. 분자 생물학 방법은 기구에 대해 용이하게 개질된다. 샘플은 단일 카트리지에서 기구 상에서 완전히 분석되거나, 별개의 카트리지로 이동되거나, 또는 모세관 전기영동 시스템 또는 마이크로칩 모세관 전기영동; 다차원 겔 및 모세관 전기영동; 질량 분광법, HPLC에 의한 다차원 질량 분광법, ICP, 라만(Raman) 분광법, 입자, 나노입자 및 비드 기재 검출, 영상화 (형광 포함), IR, 광학 또는 당업자에게 익히 공지된 임의의 다른 분석 시스템을 포함하는 별개의 기계에서 분석되거나 추가로 가공될 수 있다.

한 실시양태에서, 많은 입력 및 샘플 유형으로부터 DNA 샘플을 제조하기 위한 카트리지를 혼입하는 완전한 샘플-투-앤써(sample-to-answer) 기계 및 DNA 단편의 분리를 위한 마이크로칩-기재 모세관 전기영동 장치의 집적은 분석, 예컨대 DNA 서열분석, 단편 크기조절 및 법의학을 위해 사용된다.

<참고문헌 도입>

본 명세서에 언급된 모든 공개 및 특허 출원은 각 개별 공개 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 본원에 참고로 도입된 바와 동일한 정도로 본원에 참고로 도입된다.

본 발명의 신규 특징은 첨부된 청구항에 구체적으로 나열되어 있다. 본 발명의 원리를 이용하는 예시적인 실시양태를 나열한 하기 발명의 상세한 설명 및 하기 첨부된 도면을 참고하여 본 발명의 특징 및 장점을 더 잘 이해할 수 있을 것이다:
도 1은 마이크로규모 온-칩 밸브 (MOVe)의 예를 도시한다.
도 2는 마이크로칩 상의 MOVe 마이크로밸브, 마이크로라우터, MOVe 믹서 및 비드 포획부를 나타낸다.
도 3은 MOVe 마이크로밸브를 갖는 유체 카트리지를 나타낸다.
도 4는 마이크로밸브를 갖는 마이크로유체 마이크로칩으로의 포트를 갖는 유체 카트리지를 나타낸다.
도 5는 카트리지에서 유동을 제어하는 MOVe 밸브를 갖는 마이크로유체 마이크로칩을 나타낸다.
도 6은 반응 챔버에 연결된 카트리지, 및 하류 MOVe 펌프 및 시약을 갖는 검출기를 나타낸다.
도 7은 열 순환할 수 있고 자성 포획부, 핀치 클램프 및 7개의 반응을 동시에 순환시키는 능력을 혼입한 온도 제어 장치를 나타낸다.
도 8은 열 순환할 수 있고 자성 포획부, 핀치 클램프 및 7개의 반응을 동시에 순환시키는 능력을 혼입한 온도 제어 장치를 나타낸다.
도 9는 수동적 테플론 (PTFE) 기재 튜브 반응 챔버에서 수행되는 파워플렉스(PowerPlex)16 STR (단일 직렬 반복) 증폭 반응을 나타낸다.
도 10은 69', 23.5', 10.5' 및 4.5'에서 혈액 25 uL로부터의 DNA의 정제를 나타내고; 수율 (ng)은 막대로 나타낸다.
도 11은 마이크로칩 상의 비드를 포획하기 위해 마이크로밸브를 사용하는 개략도를 나타낸다.
도 12는 MOVe 마이크로밸브를 사용하는 마이크로칩 상의 카트리지로부터의 비드 포획을 나타낸다.
도 13은 MOVe 마이크로밸브를 사용하는 마이크로칩 상의 카트리지로부터의 비드 포획을 나타낸다.
도 14는 MOVe 마이크로밸브를 사용하는 포획 및 반응 마이크로칩을 나타낸다.
도 15는 MOVe 마이크로밸브를 사용하는 포획 및 반응 마이크로칩을 나타낸다.
도 16은 4-카트리지 어셈블리를 나타낸다.
도 17은 마이크로칩 상의 STR 반응의 예를 나타낸다.
도 18은 핵산 및 독소를 제조하기 위한 만능 샘플 제조 작업흐름을 나타낸다.
도 19는 상자성 비드를 사용하는 카트리지에서의 샘플의 정제를 나타낸다.
도 20은 카트리지 내의 MOVe 마이크로밸브를 작동시키기 위한 집적 공압 매니폴드를 나타낸다.
도 21은 컴퓨터 제어된 기구 상에 탑재된 카트리지를 나타낸다.
도 22는 컴퓨터 제어된 기구 상에 탑재된 카트리지를 나타낸다.
도 23은 5개의 추출/단리 또는 다른 장치로 5개의 시약을 분포시킬 수 있는 MOVe 기술을 기초로 하는 시약 분포 매니폴드를 나타낸다.
도 24는 5개의 추출/단리 또는 다른 장치로 5개의 시약을 분포시킬 수 있는 MOVe 기술을 기초로 하는 시약 분포 매니폴드를 나타낸다.
도 25는 샘플 루프 및 MOVe 마이크로밸브를 갖는 분포 매니폴드를 나타낸다.
도 26은 공압 매니폴드를 나타내고, 위 패널은 상단 측면을 나타내고, 아래 패널은 바닥 측면을 나타낸다.
도 27은 면역자기 분리, 이어서 알칼리 용해 및 자성 비드 상의 PEG-촉진 포획에 의한 이. 콜라이(E. coli)의 검출, 및 실시간 PCR에 의한 분석을 나타낸다.
도 28은 게놈 라이브러리 및 다른 적용을 구축하는데 사용될 수 있는 3개의 챔버를 갖는 카트리지의 적용을 나타낸다.
도 29는 카트리지를 사용하여 게놈 라이브러리를 제조하기 위한 작업흐름을 나타낸다.
도 30은 마이크로칩 기재 전기영동을 위한 포크형 주입기를 나타낸다.
도 31은 포크형 주입기에 의한 샘플 적재를 나타낸다.
도 32는 MOVe 마이크로밸브에 커플링된 포크형 주입기를 나타낸다.
도 33은 MOVe 마이크로칩과 커플링된 포크형 캐쏘드(cathode) 주입기를 나타낸다.
도 34는 포크형 주입기를 갖는 마이크로칩의 사진을 나타낸다.
도 35는 포크형 주입기를 갖는 마이크로칩의 사진을 나타낸다.
도 36은 포크형 캐쏘드 주입기로부터 DNA 서열분석 추적으로부터 단일 색상의 전기영동도를 나타낸다.
도 37은 포크형 캐쏘드 주입 시스템에서의 STR 분리를 나타낸다.
도 38은 셔틀 로딩을 위한 MOVe 마이크로유체를 갖는 포크형 캐쏘드를 나타낸다.
도 39는 핵산 단리, 증폭(들), 분리 및 검출을 위한 집적 시스템을 나타낸다.
도 40은 카트리지, 마이크로유체 마이크로칩 및 자석을 갖는 장치를 나타낸다.
도 41은 유체층, 엘라스토머층 및 공압층을 갖는 마이크로유체 마이크로칩을 나타낸다.
도 42는 2개의 물질 층으로 제조된 유체층을 도시한다.
도 43은 단일 물질 층으로 제조된 유체층을 도시한다.
도 44는 mRNA 증폭에 대한 반응식을 도시한다.
도 45는 열 블록 (509), 카트리지 (50), 마이크로유체 마이크로칩 (519) 및 공압 매니폴드 (507)의 확대도를 도시한다.
도 46은 열 블록, 카트리지, 마이크로유체 마이크로칩 및 공압 매니폴드를 조립된 형태로 도시한다.
도 47은 4개의 펌프 세트를 갖는 마이크로유체 마이크로칩의 유체층 및 공압층을 도시한다.
도 48은 마이크로유체 마이크로칩의 유체층과의 상호접촉을 위한 카트리지를 도시한다.
도 49는 카트리지와 상호접촉하는 팁을 보유하기 위한 블록을 도시한다.
도 50은 mRNA 증폭식의 역전사 반응의 결과를 도시한다.
도 51은 열 분포 요소를 갖는 열 블록, 카트리지, 마이크로유체 마이크로칩 및 공압 매니폴드의 확대도를 도시한다.
도 52는 열 분포 요소를 갖는 열 블록, 카트리지, 마이크로유체 마이크로칩 및 공압 매니폴드를 조립된 형태로 도시한다.
도 53은 공압 매니폴드를 도시한다.
도 54는 공압 매니폴드를 도시한다.
도 55는 공압 매니폴드를 도시한다.
도 56은 공압 매니폴드를 도시한다.
도 57은 시약 레일 및 비드 레일을 갖는 마이크로유체 마이크로칩의 유체층 및 공압층을 도시한다 (유체층은 실선으로 나타내고, 공압층은 점선으로 나타냄).
도 58은 시약 레일 및 비드 레일을 갖는 마이크로유체 마이크로칩의 유체층을 도시한다.
도 59는 카트리지 내의 유동을 제어하는 MOVe 밸브를 갖는 마이크로유체 마이크로칩을 나타낸다.
도 60은 포크형 전극을 나타낸다.
도 61은 포크형 전극, 와이어 실행 전극을 갖는 포크형 전극, 및 캐뉼라형 전극을 갖는 포크형 전극을 나타낸다.
도 62는 분리 채널로의 샘플 주입을 나타낸다.
도 63은 주입 배관과 분리 모세관을 맞물리게 하기 위한 장치를 나타낸다.
도 64는 4개의 주입 배관과 분리 모세관을 맞물리게 하기 위한 장치를 나타낸다.
도 65는 울템(Ultem) 핀치 클램프를 갖는 열순환기를 나타낸다.
도 66은 4-채널 병렬 가공 장치의 구성성분 간의 시약의 이동을 나타내는 다이어그램을 나타낸다.
도 67은 4-채널 병렬 시약 전달 장치를 나타낸다: 칩 C 마이크로칩 설계는 왼쪽 위에 나타내고, 유체 매니폴드는 왼쪽 아래에 나타내고, 제작되고 조립된 장치는 오른쪽에 나타낸다.
도 68은 4-채널 샘플 제조 장치 (왼쪽) 및 단일체 공압 매니폴드 상에 탑재된 4-채널 샘플 제조 장치 (오른쪽)를 나타낸다.
도 69는 4-채널 샘플 제조 장치의 MOVe 마이크로칩 설계를 나타낸다: 상단 패널에 나타낸 2개의 양분 채널 사이에 T-접합부를 형성하는 유동-관통 밸브를 갖는 칩 D 마이크로칩 설계는 왼쪽에 나타내고; 유동-관통 밸브를 갖는 칩 D 마이크로칩 설계는 오른쪽 위에 나타내고; 밸브의 중간을 통해 통과하는 오직 1개의 채널을 갖는 인라인 밸브를 갖는 칩 F 마이크로칩 설계는 오른쪽 아래에 나타낸다.
도 70은 4-채널 샘플 제조 장치에서 제조된 DNA 샘플의 아이덴티필러(IdentiFiler) STR 프로파일을 나타내며, 여기서 STR 증폭은 급속 프로토콜 (1.5 시간)을 사용하여 STR 반응 서브시스템 열순환기에서 수행하였다.
도 71은 유체 매니폴드를 갖는 칩 A 마이크로칩과 조합된 4-채널 증폭후 장치를 나타낸다: 칩 A 마이크로칩 설계는 왼쪽에 나타내고, 제작된 마이크로칩은 가운데에 나타내고, 조립된 유체 매니폴드 및 마이크로칩은 오른쪽에 나타낸다.
도 72는 증폭후 장치를 갖는 증폭후 STR 세정 서브시스템을 나타낸다.
도 73는 증폭후 장치에서 사용될 수 있는 칩 E 마이크로칩 설계를 나타낸다.
도 74는 믹서의 다이어그램을 나타낸다.
도 75는 믹서의 다이어그램을 나타낸다.
도 76은 세포를 용해시키기 위해 믹서를 사용한 결과를 나타낸다.
<발명의 상세한 설명>
본 발명은 유체의 이동을 제어하기 위해 밸브, 예컨대 마이크로밸브 (공압식으로 구동되는 밸브 및 마이크로규모 온-칩 밸브를 포함하나 이에 제한되지 않음)를 그의 설계에 혼입한 장치를 포함한다. 이러한 장치는 구성성분의 풍부화, 샘플 제조, 및/또는 샘플 중의 또는 샘플로부터의 하나 이상의 구성성분의 분석을 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 유체 및 분석물질 가공을 위한 장치 및 그의 사용 방법을 제공한다. 본 발명의 장치는 유체 및 분석물질에 대한 다양한 작용을 수행하는데 사용될 수 있다. 이들 작용은 이동, 혼합, 분리, 가열, 냉각 및 분석을 포함할 수 있다. 장치는 다수의 구성성분, 예컨대 카트리지, 마이크로유체 마이크로칩 및 공압 매니폴드를 포함할 수 있다. 도 40은 카트리지 (101), 마이크로유체 마이크로칩 (103) 및 공압 매니폴드 (113)를 갖는 예시적 장치를 나타낸다.
I. 샘플 제조 장치
한 측면에서, 도 16에서 장치 (800), 도 21 및 도 22에서 장치 (1000), 및 도 68에서 장치 (1000)에 나타낸 바와 같은 샘플 제조 장치는 마이크로밸브를 통해 카트리지에서의 유체의 이동을 제어하는 마이크로유체 마이크로칩과 집적된 카트리지, 및 카트리지를 작동시키는 구성성분을 포함한다. 카트리지 및/또는 그의 구획은 자동화 장치에서 1 밀리리터 이상의 입력 샘플을 가공하기에 충분한 크기일 수 있다. 카트리지는 샘플을 가공하여, 마이크로밸브에 의해 조절되는 압력-추진된 유동 또는 진공을 사용하여 이동될 수 있는 구성성분을 출력할 수 있다. 카트리지는 거시적 규모 샘플, 예컨대 혈액, 에어로졸, 액체, 면봉, 체액, 스와이프 및 기타 액체, 고체 및 기체 샘플을 포함하는 전달 장치와의 경계면을 제공할 수 있다. 카트리지는 마이크로규모 샘플 제조 및 분석을 사용하여 거시적 규모 샘플 부피를 가공할 수 있다. 카트리지는 마이크로유체 장치를 사용하여 거시적 규모 또는 큰 부피 샘플의 가공을 허용할 수 있고, 구성성분은 물질의 손실 감소를 허용하는 감소된 공극 부피를 갖는다.
A. 카트리지
카트리지 (또한, 본원에서 유체 매니폴드라고 지칭됨)는 수많은 목적을 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, 카트리지는 대규모 장치 뿐만 아니라 마이크로유체 장치와 상호접촉하도록 크기조절된 포트를 가질 수 있다. 카트리지 또는 유체 매니폴드는 미국 특허 출원 제61/022,722호 (그 전문이 본원에 참고로 도입됨)에 기재되어 있다. 카트리지는 공급원으로부터 물질, 예컨대 샘플, 시약 또는 고체 입자를 수용하고 이를 마이크로유체 마이크로칩에 전달하는데 사용될 수 있다. 물질은 카트리지 및 마이크로유체 마이크로칩의 맞물린 개구부를 통해 카트리지와 마이크로유체 마이크로칩 사이에서 이동될 수 있다. 예를 들어, 피펫을 사용하여 물질을 카트리지로 이동시킬 수 있으며, 다시 물질을 마이크로유체 장치로 전달할 수 있다. 다른 실시양태에서, 배관이 물질을 카트리지로 이동시킬 수 있다. 다른 실시양태에서, 주사기가 물질을 카트리지로 이동시킬 수 있다. 또한, 카트리지는 나노리터, 마이크로리터, 밀리리터 또는 리터의 유체를 보유할 수 있는 부피를 갖는 저장소를 가질 수 있다. 저장소는 홀딩 챔버, 반응 챔버 (예를 들어, 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 챔버), 가열 또는 냉각을 제공하기 위한 챔버 (예를 들어, 열 제어 요소를 함유하거나 열 제어 장치에 열로 연결된 챔버) 또는 분리 챔버 (예를 들어, 상자성 비드 분리, 친화성 포획 매트릭스 및 크로마토그래피)로서 사용될 수 있다. 임의의 유형의 챔버, 예를 들어 미국 특허 공개 제2007/0248958호 (본원에 참고로 도입)에 기재된 챔버가 본원에 기재된 장치에서 사용될 수 있다. 저장소는 카트리지의 내부 및 외부에 온도 제어된 유체의 이동을 위한 유입구 및 유출구를 가짐으로써 가열 또는 냉각을 제공하는데 사용될 수 있으며, 그러므로 마이크로유체 마이크로칩에 온도 제어를 제공할 수 있다. 별법으로, 저장소는 펠티어 요소, 또는 당업자에게 공지된 임의의 다른 가열 또는 냉각 요소 (히트 싱크 또는 열원을 제공함)를 하우징할 수 있다. 카트리지 저장소 또는 챔버는 적어도 약 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 750, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 ㎕ 이상의 부피를 가질 수 있다. 챔버 또는 저장소의 상대적 부피는 마이크로유체 마이크로칩 내의 채널 또는 밸브보다 약 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000, 10000 이상 더 클 수 있다. 마이크로유체 마이크로칩에 맞물릴 수 있는 카트리지의 챔버 및 저장소의 크기는 큰 부피의 샘플, 예컨대 약 1, 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 5000, 10000, 50000 uL 이상의 샘플을 가공할 수 있도록 선택될 수 있으며, 여기서 샘플을 가공하기 위한 유체의 유동은 마이크로유체 마이크로칩 내의 밸브에 의해 제어된다. 이는 다른 유동 제어 장치, 예컨대 피펫 및 대규모 밸브와 비교하여 마이크로유체 마이크로칩 내의 감소된 공극 부피로 인해 샘플 및 시약 손실의 양을 감소시킬 수 있다. 마이크로유체 마이크로칩 내의 공극 부피는 1000, 500, 100, 50, 10, 5, 1, 0.5, 0.1 또는 0.05 ㎕ 미만일 수 있다. 이는 샘플의 가공 도중 샘플 또는 시약 손실의 양이 20, 15, 10, 7, 5, 3, 2, 1, 0.5, 0.05 % 미만이 되게 할 수 있다.
예를 들어, 도 40은 피펫 또는 임의의 다른 대규모 장치로부터 물질을 수용하는데 사용될 수 있는 카트리지의 측면으로 개방된 포트 (115)를 갖는 저장소를 갖는 카트리지 (101)를 나타낸다. 포트는 또한 카트리지를 상류 유체에 연결하는 배관 또는 모세관을 수용하는 피팅으로 개질될 수 있다. 저장소는 마이크로유체 마이크로칩의 유체층 내의 개구부 (105)와 상호접촉하거나, 일렬로 정렬하거나 또는 맞물리는 카트리지 저장소 개구부 (117)를 형성하도록 점차 가늘어질 수 있다.
카트리지는 당업자에게 공지된 임의의 물질로 구축될 수 있다. 예를 들어, 카트리지는 플라스틱, 유리 또는 금속으로 구축될 수 있다. 플라스틱 물질은 당업자에게 공지된 임의의 플라스틱, 예컨대 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 폴리에스테르, 폴리아미드, 폴리(염화비닐), 폴리카르보네이트, 폴리우레탄, 폴리비닐디엔 클로라이드, 시클릭 올레핀 공중합체 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 카트리지는 당업자에게 공지된 임의의 기술, 예컨대 소프트-리소그래피, 하드-리소그래피, 밀링, 엠보싱, 융삭, 드릴링, 에칭, 사출 성형 또는 이들의 임의의 조합을 사용하여 형성될 수 있다.
도 3 및 도 4에 예시된 바와 같이, 카트리지 (1)는 평평한 측면을 갖는 직선 배치를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 카트리지는 굽은, 둥근, 톱니형이거나 또는 돌출부를 포함하는 표면을 포함한다. 한 실시양태에서, 카트리지는 마이크로유체 마이크로칩에 인접한 하나 이상의 실질적으로 평평한 표면을 갖는다. 카트리지는 마이크로칩 내의 포트와 유체적으로 연결되도록 개질된다. 예를 들어, 카트리지의 표면 내의 개구부는 마이크로칩 내의 포트와 일렬로 정렬될 수 있다. 카트리지 및 마이크로칩이 서로 맞물리는 경우, 개구부는 액체가 카트리지로부터 마이크로칩의 포트로 통과하게 하는 유체 연결부를 생성하도록 일렬로 정렬되고, 이는 유체 회로를 형성하는 밸브를 전형적으로 갖는 채널에 연결된다. 카트리지의 다른 실시양태는 도 59에 나타낸다. 도 59는 마이크로칩 및 외부 구성성분, 예컨대 주사기와 맞물리는 다수의 포트를 갖는 카트리지를 나타낸다. 카트리지 내의 구획은 주사기 및 그의 돌출부의 삽입을 허용하도록 형상화될 수 있다. 카트리지는 또한 카트리지의 챔버 또는 마이크로칩의 챔버에서 기체를 환기하기 위한 벤트 포트를 포함할 수 있다. 또한, 도 59는 구동된 자석이 믹스 챔버에 자기장을 가하는데 사용될 수 있는 위치를 나타낸다. 또한, 도 59는 믹스 챔버를 폐쇄하는데 사용될 수 있는 캡을 나타낸다.
한 실시양태에서, 카트리지는 챔버, 포트, 채널 또는 자석을 포함하나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 특징부를 함유한다. 한 실시양태에서, 마이크로밸브, 예컨대 공압식으로 구동되는 밸브가 마이크로유체 카트리지와 조합된다. 몇몇 실시양태에서, 마이크로밸브는 능동적 기계적 마이크로밸브 (예컨대, 자기, 전기, 또는 압전 열 마이크로밸브), 비기계적 마이크로밸브 (예컨대, 쌍안정 전기기계적 상 변화 또는 유변학적 마이크로밸브), 외부 마이크로밸브 (예컨대, 모듈식 또는 공압식), 수동적 기계적 (예컨대, 체크 마이크로밸브 또는 수동적 비기계적 (예컨대, 모세관 마이크로밸브) (문헌 [Oh et al., A review of microvalves, J. Micromech Microeng. 16 (2006) R13-R39], 그 전문이 본원에 참고로 도입됨))이다.
다른 실시양태에서, 공압식으로 구동되는 밸브, 예컨대 MOVe 밸브는 마이크로유체 마이크로칩 (2) 또는 다수의 마이크로유체 마이크로칩에서 기압, 진공 또는 유체의 유동을 조절한다. MOVe 밸브는 마이크로규모 온-칩 밸브, 마이크로유체 온-칩 밸브 또는 마이크로-로봇 온-칩 밸브일 수 있다. 한 실시양태에서, 기압, 진공 또는 유체의 유동은 하나 이상의 가변 압력 펌프, 예컨대 솔레노이드 밸브 또는 솔레노이드 펌프에 의해 조정된다. 한 실시양태에서, 마이크로유체 마이크로칩은 마이크로채널 및/또는 마이크로트렌치를 함유하는 구조이며, 여기서 마이크로채널은 폐쇄 구조이고, 마이크로트렌치는 개방 구조이다. 한 실시양태에서, 마이크로유체 마이크로칩은 평면 구조이다. 관련 실시양태에서, 마이크로유체 장치는 카트리지의 한 측면 상에 군집화된 마이크로밸브를 갖는 마이크로유체 마이크로칩을 포함한다. 한 실시양태 (도 3 및 도 4)에서, 카트리지 (1)는 외부 유체, 공기 또는 진공으로의 하나 이상의 포트 (4, 5, 6, 7, 8, 9)를 포함할 수 있다. 포트의 기능은 폐기물 (4), 시약 진입 (5), 환기 (6), 샘플 입력 (7), 생성물 출력 (8)을 위한 것일 수 있다. 카트리지 (1)는 하나 이상의 샘플 입력 또는 반응 챔버 (7) 및 (3)를 함유할 수 있다.
카트리지 내의 단일 챔버, 예컨대 반응 챔버는 1개 이상 또는 적어도 1, 2 또는 3개의 마이크로칩으로의 유체 연결부를 가질 수 있다. 예를 들어, 반응 챔버 (3)는 챔버의 기저에 있는 마이크로칩 관통 연결부 (120)로의 유체 연결부, 및 챔버의 상단에 위치된 통로를 통해 챔버 (3)에 연결된 마이크로칩 관통 포트 (9)로의 다른 유체 연결부를 가질 수 있다. 챔버 (3)의 상단, 포트 (9), 및 챔버 (3)와 포트 (9) 사이의 통로는 외부 환경으로부터 폐쇄되어, 챔버 (3)가 가득찼을 때 챔버 (3) 내의 유체가 반드시 포트 (9)로 펌핑되도록 할 수 있으며 그 반대도 가능하다. 이러한 챔버 또는 챔버 및 포트의 조합은 폐쇄 챔버라고 지칭될 수 있다. 유체 연결부의 위치는 반드시 챔버의 기저 및 상단에 있을 필요는 없으나, 챔버의 기저 및 상단에 있는 유체 연결부는 챔버에서 기체의 트래핑을 감소시킨다. 별법으로, 반응 챔버 (3)는 카트리지 내에 있을 수 있는 상단 위치에서 서로 유체적으로 연결된 2개의 챔버의 조합으로 보여질 수 있고, 각 챔버는 또한 기저 위치에 개구부를 갖는다. 기저 위치에 있는 개구부 (또한 챔버 천공부라고 함)는 마이크로칩 상의 포트 천공부에 유체적으로 연결될 수 있다. 2개의 유체 연결부는 유체가 마이크로유체 마이크로칩을 통해 챔버의 내부 및 외부를 향하게 할 수 있다.
다른 실시양태에서, 장치는 하나 이상의 표면 또는 구조 상에 비선형 방식으로 위치된 하나 이상의 공압식으로 구동되는 밸브, 예컨대 MOVe 밸브를 포함하는 카트리지를 포함한다. 카트리지는 카트리지의 기저 이외의 위치에, 카트리지 내에 위치된 하나 이상의 공압식으로 구동되는 밸브를 포함할 수 있다.
카트리지의 기능적 요소는 포트, 채널, 챔버, 필터, 자석 또는 벤트를 포함할 수 있으며, 챔버는 집합적으로 기능적 요소라고 지칭될 수 있다. 한 실시양태 (도 4)에서, 기능적 요소는 접합부 (100, 120, 140, 160 및 230)에서 마이크로밸브를 함유하는 마이크로유체 마이크로칩에 연결한다. 기능적 요소는 플러쉬 연결부 또는 피팅에 의해 포트에 삽입된 배관 또는 모세관과 연결할 수 있다. 한 실시양태에서, 플러쉬 연결부는 마이크로유체 마이크로칩의 천공부와 직접 일렬로 정렬된 카트리지의 포트를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 카트리지 및 마이크로유체 마이크로칩은 집적 모듈을 형성한다. 다른 실시양태에서, 카트리지 및 마이크로유체 마이크로칩은 사용 전에 함께 부착되는 2개의 별개의 조각이다.
카트리지는 하나 이상의 챔버, 샘플 입력 포트, 시약 포트, 출구 포트, 폐기물 포트 및 자석을 포함할 수 있다. 자석은 자석에 의해 생성된 자기력이 상기 챔버 내의 상자성 입자를 챔버의 벽으로 끌어당길 수 있도록 챔버에 인접하게 위치될 수 있다. 한 실시양태에서, 상자성 입자는 자성 반응성이 부여된 비드 또는 세포 (예를 들어, 질산나트륨으로 처리된 헤모글로빈을 포함하는 세포)이다. 자석은 전자석 또는 영구 자석, 예컨대 희토류 금속 자석일 수 있다.
한 실시양태 (도 4)에서, 연결부 또는 포트 (4, 5, 6, 7, 8 및 9)는 각각 카트리지 내의 채널 (14, 15, 16, 17, 18 및 19)로 인도한다. 포트 (4, 5, 6, 7 및 8)는 커넥터 또는 배관을 함몰부, 예컨대 연결부 (7)에서 보여진 함몰부에 믿을 수 있게 부착하는 함몰부를 나타낸다. (채널 (17)과 연결부 (7)의 직경의 차이 참조). 한 실시양태에서, 포트 또는 포트들은 다양한 커넥터 또는 튜브, 예컨대 모세관 (미국 특허 제6,190,616호, 미국 특허 제6,423,536호, 미국 특허 출원 제09/770,412호, 1-25-01, 미국 특허 출원 제60/402,959호에 기재된 바와 같음) 또는 모듈식 마이크로유체 포트를 갖는 하나 이상의 마이크로칩 (미국 특허 제6,870,185호 및 미국 특허 출원 제11/229,065호에 기재된 바와 같음)과 상호접촉할 수 있으며, 상기 문헌들은 모두 그 전문이 본원에 참고로 도입된다. 한 실시양태에서, 모듈식 마이크로유체 포트는 마이크로칩 또는 모세관이 불용 부피 또는 누출 없이 가역적으로 결합되도록 할 수 있다.
다른 실시양태에서, 챔버 (3)는 통로 (9) 및 원뿔부 (13)에 연결되어, 접합부 (120)로 인도한다. 챔버 (3)는 임의의 채널에서와 같이 반응을 위해 사용될 수 있다. 도 4에서, 카트리지 채널은 마이크로칩 (2) 상의 포트의 천공부로 직접 인도한다. 카트리지의 채널은 필요에 따라 서로 상호연결할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 카트리지 내의 하나 이상의 채널은 마이크로유체 마이크로칩에 물리적으로 연결되지 않는다. 다른 실시양태에서, 카트리지 내의 하나 이상의 채널은 마이크로유체 마이크로칩 내의 하나 이상의 마이크로채널에 유체적으로 연결된다. 연결부는 마이크로유체 마이크로칩 상의 천공부를 사용하거나 사용하지 않을 수 있다. 천공부는 마이크로칩과 카트리지 사이에 맞물리도록 설계된 개구부 또는 피팅일 수 있다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 피팅은 밀봉부, 예컨대 개스킷 또는 o-링을 포함한다.
B. 마이크로칩
한 실시양태에서, 카트리지 및 마이크로유체 마이크로칩은 함께 집적되어 단일 모듈 장치를 형성한다. 카트리지 및 마이크로유체 마이크로칩은 유체 또는 고체 접착제에 의해 또는 기계적으로 부착될 수 있다. 한 실시양태에서, 접착제는 폴리아크릴레이트, 접착 테이프, 양면 테이프 또는 당업자에게 공지된 임의의 다른 접착제이다. 카트리지는 마이크로유체 마이크로칩과 카트리지 사이의 접합부로 유체-기재 접착제를 운반할 수 있는 특징부 (12)를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 카트리지는 비-유체 접착제 층에 의해 마이크로유체 마이크로칩에 부착된다. 별법으로, 카트리지 및 마이크로칩은 클립, 클램프 또는 다른 홀딩 장치에 의해 함께 유지될 수 있다. 카트리지 및 마이크로칩은 시각적 단서에 의해 (현미경에 의하거나 그렇지 않음) 또는 물리적 인도 특징부에 의해 집적 전에 일렬로 정렬될 수 있다. 시각적 단서는 카트리지, 마이크로칩 또는 양자 모두에서 연신되거나, 에칭되거나 또는 다르게 존재하는 라인 또는 특징부를 포함할 수 있다. 물리적 인도 특징부는 적절한 어셈블리를 보조하거나 확실하게 하기 위해 "열쇠"채워질 수 있는 함몰부, 돌출부 및 연부를 포함한다.
몇몇 경우에, 마이크로유체 마이크로칩은 유체 유동의 제어를 위한 격막식 밸브를 갖는다. 유체 유동을 제어하는 격막식 밸브를 갖는 마이크로유체 장치는 미국 특허 제7,445,926호, 미국 특허 공개 제2006/0073484호, 제2006/0073484호, 제2007/0248958호 및 제2008/0014576호 및 PCT 공개 제WO 2008/115626호에 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 그 전문이 본원에 참고로 도입된다. 밸브는 공압 매니폴드를 통해 마이크로칩의 공압층에 양압 또는 음압을 가함으로서 제어될 수 있다.
한 실시양태에서, 마이크로칩은 "MOVe" 마이크로칩이다. 이러한 마이크로칩은 3개의 기능적 층을 포함한다 (마이크로유체 채널을 포함하는 유체층; 공압 채널을 포함하는 공압층; 및 2개의 다른 층 사이에 샌드위치된 구동층). 특정 실시양태에서, 유체층은 2개의 층을 포함한다. 한 층은 마이크로유체 채널 및 비아를 제공하는 그루브, 또는 외부 표면으로부터 유체 채널로 통과하는 홀을 포함할 수 있다. 제2 층은 구동층과 접촉하는 표면으로부터 다른 층 상의 공압 채널과 접촉하는 표면으로 통과하는 비아를 포함할 수 있다. 외부로 개방하여 채널을 유체 매니폴드와 연결하거나 또는 내부로 개방하여 채널을 활성화 층과 연결하는 내부 채널 및 비아를 포함하는 단일 유체층으로부터의 이들 2개의 층은 함께 접촉시 밸브, 챔버 또는 다른 기능적 항목을 형성한다. 구동층은 전형적으로 진공 또는 압력이 가해질 때 변형할 수 있는 변형가능한 물질, 예를 들어 엘라스토머 물질로 형성된다. 유체 채널 또는 공압 채널이 개방되거나 다르게 구동층과 접촉하는 점에서, 기능적 장치, 예컨대 밸브가 형성될 수 있다. 이러한 밸브는 도 1에 단면도로 도시된다. 유체층 및 공압층 양자 모두는 채널을 외부 표면에 포트로서 연결하는 포트를 포함할 수 있다. 이러한 포트는 유체 매니폴드, 예를 들어 카트리지 또는 공압 매니폴드를 결착시키도록 개질될 수 있다.
도 40에 나타낸 바와 같이, 마이크로유체 마이크로칩 (103)은 카트리지 (101)와 상호접촉될 수 있다. 마이크로유체 마이크로칩은 카트리지 (101)의 개구부 (117)에 맞물린 개구부를 갖는 챔버 (105)를 가질 수 있다. 챔버는 다양한 목적을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 챔버는 반응 챔버, 혼합 챔버 또는 포획 챔버로서 사용될 수 있다. 챔버는 자성 입자, 예컨대 자성 비드, 상자성 비드, 고체상 추출 물질, 모놀리스 또는 크로마토그래피 매트릭스를 포획하는데 사용될 수 있다.
자성 구성성분 (109)은 카트리지 저장소 (107) 및/또는 마이크로유체 챔버 (105) 내의 자성 입자가 마이크로유체 챔버 (105)의 표면에 대항하여 포획되도록 위치될 수 있다. 자성 구성성분은 영구 자석 및/또는 전자석을 사용하여 자기장 및/또는 전자기장을 생성할 수 있다. 영구 자석이 사용되는 경우, 자석은 마이크로유체 챔버에 자기장을 가하기 위해 자석을 마이크로유체 마이크로칩의 근처로 가져오도록 하나 이상의 방향으로 구동될 수 있다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 자석은 도 40에 나타낸 방향 (111)으로 구동된다.
별법으로, 임의의 다양한 장치가 마이크로유체 마이크로칩과 상호접촉될 수 있다. 예를 들어, 검출기, 분리 장치 (예를 들어, 기체 크로마토그래프, 액체 크로마토그래프, 모세관 전기영동, 질량 분광계 등), 광원 또는 온도 제어 장치가 마이크로유체 마이크로칩 다음에 위치되거나 또는 마이크로유체 마이크로칩과 함께 사용될 수 있다. 이들 장치는 저항, 정전용량, 흡광도 또는 방출, 형광, 또는 온도 또는 다른 화학적 또는 물리적 측정을 검출함으로써 분석물질을 검출할 수 있다. 별법으로, 이들 장치는 빛을 마이크로유체 마이크로칩의 영역 또는 구역에 도입할 수 있다.
마이크로유체 장치는 자성 입자의 포획을 위해 배치된 다수의 챔버를 갖도록 설계될 수 있다. 다수의 챔버 및 자성 구성성분은 자기장이 모든 챔버에 동시에 가해지도록 또는 다른 챔버와 독립적인 각 또는 몇몇 챔버에 가해질 수 있도록 배열될 수 있다. 챔버 및 자성 구성성분의 배열은 자성 입자의 더 신속한 또는 더 효율적인 회수를 촉진할 수 있다. 특히, 배열은 다수의 챔버 내의 자성 입자의 회수를 촉진할 수 있다.
도 41에 나타낸 바와 같이, 마이크로유체 마이크로칩 (103)은 유체층 (203), 엘라스토머층 (205) 및 공압층 (207)으로 형성될 수 있다. 유체층은 특징부, 예컨대 챔버 (105), 뿐만 아니라 채널, 밸브 및 포트를 함유할 수 있다. 채널은 챔버 및/또는 포트 사이에서 유체의 이동을 위해 사용되는 마이크로유체 채널일 수 있다. 밸브는 마이크로유체 장치에서 사용되는 임의의 유형의 밸브일 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 밸브는 마이크로규모 온-칩 밸브 (MOVe) (또한, 본원에서 마이크로유체 격막식 밸브라고 지칭됨)를 포함한다. 일련의 3개의 MOVe는 MOVe 펌프를 형성할 수 있다. MOVe 및 MOVe 펌프는 공압을 사용하여 구동될 수 있다. 공압 공급원은 마이크로유체 마이크로칩의 내부 또는 외부에 있을 수 있다.
MOVe 밸브의 예는 도 1에 나타낸다. 폐쇄된 MOVe 밸브의 단면도는 도 1A에 나타낸다. 개방된 MOVe 밸브의 단면도는 도 1B에 나타낸다. 도 1C는 MOVe 밸브의 하향도를 나타낸다. 유체층으로부터 유래하는 채널 (251)은 하나 이상의 비아 (257)에 의해 엘라스토머층 (259)과 상호접촉할 수 있다. 채널은 엘라스토머층 (259)이 자리 (255)와 접촉하는 경우 채널을 통한 유동을 방해하도록 하나 이상의 자리 (255)를 가질 수 있다. 엘라스토머층은 통상적으로 자리와 접촉하거나 또는 통상적으로 자리와 접촉하지 않을 수 있다. 유체 채널 (251)에 비해 공압 챔버 (253) 내의 압력을 증가시키거나 감소시키기 위해 공압 라인 (261)을 통한 양압 또는 음압의 적용은 엘라스토머층이 자리에 대항하여 밀려나거나 또는 자리로부터 멀리 당겨지도록 엘라스토머층을 변형시킬 수 있다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, MOVe는 자리를 갖지 않고, 유체 채널을 통한 유체 유동은 양압 또는 음압의 적용 하에 완전히 방해되지 않는다. 가해질 수 있는 진공은 극히 높은 진공, 중간 진공, 낮은 진공, 하우스 진공, 및 압력, 예컨대 5 psi, 10 psi, 15 psi, 25 psi, 30 psi, 40 psi, 45 psi 및 50 psi를 포함한다.
일련의 3개의 MOVe 밸브는 유입구 밸브로서 제1 MOVe, 펌핑 밸브로서 제2 MOVe 및 유출구 밸브로서 제3 MOVe를 사용하여 펌프를 형성할 수 있다. MOVe의 순차적 개방 및 폐쇄에 의해 유체는 일련의 MOVe를 통해 이동될 수 있다. 유체가 유입구 밸브에 공급되기 위해, 예시적 순서는 3개의 MOVe 모두가 폐쇄된 상태로부터 출발하여 (a) 유입구 밸브의 개방, (b) 펌핑 밸브의 개방, (c) 유입구 밸브의 폐쇄 및 유출구 밸브의 개방, (d) 펌핑 밸브의 폐쇄, 및 (e) 유출구 밸브의 폐쇄를 포함할 수 있다. 유입구 및 유출구 밸브는 동일한 구조를 가질 수 있기 때문에, MOVe 펌프는 유입구 또는 유출구 밸브의 개방의 순서의 재프로그래밍에 의해 어느 한 방향으로 유체를 이동시킬 수 있다.
유체층 (203)은 하나 이상의 물질 층으로 구축될 수 있다. 도 42에 나타낸 바와 같이, 유체층 (203)은 2개의 물질 층으로 구축될 수 있다. 채널 (301, 303, 305)은 2개의 물질 층 사이의 경계면에서 형성될 수 있고, 챔버 (105)는 1개의 물질 층의 일부의 완전한 제거에 의해 형성될 수 있다. 채널은 임의의 형상, 예를 들어, 한 측면이 둥근형 (301), 직사각형 (303) 또는 원형 (305)을 가질 수 있다. 채널은 오직 한 층 (301, 303)에서 함몰에 의해 또는 두 층 (305)에서 함몰에 의해 형성될 수 있다. 채널 및 챔버는 보여진 채널 및 챔버를 횡단하는 유체 채널에 의해 연결될 수 있다. 또한, 유체 채널 및 연결부가 다수의 유체층 사이에 제조된 다차원 마이크로칩이 본 발명의 범위 내에 포함된다.
제2 물질 층의 두께 (307)는 임의의 두께일 수 있다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 제2 층은 외부 자성 구성성분으로부터 제2 층을 가로질러 적용되는 챔버 (105) 내의 자기장의 감소를 최소화하거나 또는 열 이동의 감소를 최소화하는 두께를 갖는다.
도 43에 나타낸 바와 같이, 유체층 (203)은 단일 물질 층의 구축될 수 있다. 이어서, 채널 (305, 303) 및 챔버 (305)가 유체층과 엘라스토머층 (205) 사이에 형성되도록, 단일 층이 엘라스토머층와 상호접촉된다.
마이크로유체 마이크로칩은 당업자에게 공지된 임의의 물질로부터 구축될 수 있다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 유체층 및 공압층은 유리로부터 구축되고, 엘라스토머층은 PDMS로부터 형성된다. 별법의 실시양태에서, 엘라스토머는 변형가능한 물질, 예컨대 테플론 (PTFE), 규소의 박막 또는 다른 막에 의해 대체될 수 있다. 유체층 및 공압층의 특징부는 당업자에게 공지된 임의의 마이크로제작 기술, 예컨대 패턴화, 에칭, 밀링, 성형, 엠보싱, 스크린 인쇄, 레이져 융삭, 기판 침착, 화학적 증착 또는 이들의 임의의 조합을 사용하여 형성될 수 있다.
한 실시양태에서, 마이크로채널과 마이크로밸브 세트를 연결하는 마이크로채널 회로가 도 5에 나타낸 바와 같이 마이크로유체 마이크로칩 (2) 상에 형성된다. 한 실시양태에서, 마이크로밸브는 공압식으로 구동되는 밸브이다. 한 실시양태에서, 공압식으로 구동되는 밸브는 MOVe 마이크로밸브이다. 한 실시양태에서, 카트리지와 마이크로유체 마이크로칩 사이, 예컨대 챔버, 포트, 채널, 마이크로채널 및 다른 기능적 요소 사이의 유체 통로는 하나 이상의 마이크로밸브의 개방 또는 폐쇄에 의해 제어될 수 있다. 한 실시양태에서, 마이크로밸브는 컴퓨터와 같은 마이크로프로세서 제어에 의해 제어된다. 컴퓨터는 입력/출력 제어기, 또는 당업자에게 공지된 임의의 다른 구성성분, 예컨대 기억 장치 및 프로세서를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 마이크로밸브는 공압 공급원에 의해, 예컨대 공압 포트 (10, 20, 30, 40, 50, 60 또는 70)를 통해 구동되는 MOVe 밸브이다. 한 실시양태에서, 공압 공급원은 하나 이상의 솔레노이드에 의해 제어된다. 한 실시양태에서, 솔레노이드는 소형화되고, 진공 공급원 또는 압력원에 연결될 수 있다. 한 실시양태에서, 공압 공급원은 클램핑, 용수철, 공압 또는 나사 힘과 같은 힘을 사용하여 임의로 o-링에 의해 제공된 밀봉부에 의해 공압 포트에 연결된다.
한 실시양태에서, 도 5는 마이크로유체 마이크로칩 (2)의 상면도를 나타내고, 이 측면은 카트리지 (1)의 바닥과 접촉한다. 마이크로밸브 (110)은 마이크로채널 (101) 및 (121) 사이의 유체 통로를 제어한다. 마이크로밸브 (130)은 마이크로채널 (131) 및 (141) 사이의 유체 통로를 제어한다. 마이크로밸브 (150)은 마이크로채널 (151) 및 (152) 사이의 유체 통로를 제어한다. 마이크로밸브 (180)은 마이크로채널 (181) 및 (191) 사이의 유체 통로를 제어한다. 마이크로밸브 (200)은 마이크로채널 (201) 및 (212) 사이의 유체 통로를 제어한다. 마이크로밸브 (220)은 마이크로채널 (221) 및 (231) 사이의 유체 통로를 제어한다.
한 실시양태에서, 접합부는 하나 이상의 마이크로채널을 연결할 수 있다. 도 5는 도 4에 나타낸 카트리지와 맞물릴 수 있는 마이크로칩에 대한 개략도를 나타낸다. 도 5에서, 접합부 (100)은 단일 마이크로채널 (101)에 연결하고, 접합부 (140)은 단일 마이크로채널 (141)에 연결하고, 접합부 (160)은 단일 마이크로채널 (161)에 연결하고, 접합부 (230)은 단일 마이크로채널 (231)에 연결한다. 접합부 (190)은 2개의 마이크로채널 (191 및 201)에 연결한다. 접합부 (120)은 3개의 마이크로채널 (121, 131 및 151)에 연결한다. 한 실시양태에서, 3개 초과의 마이크로채널은 단일 접합부에 연결될 수 있다.
마이크로채널은 하나 이상의 기술, 예컨대 포토리소그래피, 성형, 엠보싱, 주형 또는 밀링에 의해 제작될 수 있다. 마이크로채널은 유리, 플라스틱, 중합체, 세라믹, 겔, 금속 또는 다른 적합한 고체과 같은 물질로 제조될 수 있다.
다른 실시양태에서, 장치는 3개 이상의 챔버, 1개 초과의 입력 포트 및 1개 초과의 출력 포트를 포함하는 카트리지를 포함한다 (도 28). 카트리지는 분석을 위해 핵산 샘플을 가공하도록 개질될 수 있다. 카트리지는 외부 시약 공급원으로부터 하나 이상의 시약을 수용하도록 개질될 수 있다. 시약은 상자성 비드, 비상자성 비드, 효소, dNTP, 완충 용액, 염 용액, 알코올 용액, EDTA를 포함하는 용액 또는 올리고뉴클레오티드 또는 다른 시약일 수 있다. 효소는 리가아제, 제한 효소, 중합효소 또는 키나제 또는 임의의 다른 효소 또는 RNA를 포함하는 촉매적 생체물질일 수 있다. 장치는 하나 이상의 챔버의 벽으로 상자성 비드를 끌어당길 수 있는 자석을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 챔버는 비드, 예컨대 비상자성 비드를 포획하기 위해 필터를 포함한다.
한 실시양태에서, 카트리지는 샘플 포트에 의한 챔버로의 샘플의 전달 및 시약 포트에 의한 챔버로의 상자성 입자의 전달을 포함하는 샘플 풍부화 방법에서 사용된다. 상자성 입자 (예를 들어, 상자성 비드)는 샘플 중의 하나 이상의 구성성분 (예컨대, DNA, RNA, 마이크로RNA, 단백질, 지질, 다당류 또는 다른 리간드)에 결합한다. 상자성 입자는 챔버 밖에 위치된 자석에 의해 발휘되는 자기력의 도움으로 챔버의 벽으로 끌어당겨진다. 상자성 입자는 시약 포트에 의해 상자성 입자를 포함하는 챔버로 전달된 세척 용액으로 세척되고, 세척 용액은 폐기물 포트에 의해 제거된다. 시약은 상자성 입자로부터 샘플의 구성성분을 용리하고 추가 가공 또는 분석을 위해 다른 장치로 샘플 구성성분을 출력하기 위해 첨가될 수 있다. 바람직한 실시양태는 상자성 입자 상의 샘플의 구성성분의 출력이다.
한 실시양태에서, 마이크로유체 마이크로칩을 포함하는 장치는 진단 방법에서 사용된다. 한 실시양태에서, 진단은 샘플 내의 감염원의 검출을 포함한다. 한 실시양태에서, 감염원은 박테리아, 바이러스, 진균, 미코플라즘 또는 프리온이다. 다른 실시양태에서, 마이크로유체 마이크로칩을 포함하는 장치는 유전병의 진단 방법에서 사용된다. 한 실시양태에서, 유전병은 하나 이상의 DNA 돌연변이에 의해 유발되며, 이러한 돌연변이는 삼염기 확장, 염기 치환 돌연변이, 결실 돌연변이, 첨가 돌연변이, 넌센스 돌연변이, 조기 스탑 코돈, 염색체 결실, 염색체 중복, 이수배수체, 부분 이수배수체 또는 일염색체를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 다른 실시양태에서, 마이크로유체 마이크로칩을 포함하는 장치는 암 또는 암에 대한 소인의 진단 방법에서 사용된다. 다른 실시양태에서, 마이크로유체 마이크로칩을 포함하는 장치는 유전병, 예컨대 자폐증, 다운 증후군, 삼염색체, 테이색스병 또는 기타 유전병의 진단 방법에서 사용된다. 몇몇 실시양태에서, 마이크로유체 마이크로칩을 포함하는 장치에서 진단에 사용되는 샘플은 혈액 샘플, 점액 샘플, 폐 세척액 샘플, 소변 샘플, 대변 샘플, 피부 샘플, 모발 샘플, 정액 샘플, 질 샘플 또는 양막 샘플이다.
다른 실시양태에서, 마이크로유체 마이크로칩을 포함하는 장치는 작용제의 환경 오염의 존재를 확인하는데 사용된다. 한 실시양태에서, 작용제는 생물학적 작용제, 예컨대 환경 샘플 내의 박테리아, 바이러스, 진균 또는 미코플라즘이다. 다른 실시양태에서, 작용제는 오염 작용제, 예컨대 살충제, 제초제 또는 비료이다. 한 실시양태에서, 환경 샘플은 토양 샘플, 물 샘플, 공기 샘플, 고기 샘플, 야채 샘플 또는 과일 샘플이다. 다른 실시양태에서, 작용제는 유전자 변형 유기체이다.
다른 실시양태에서, 마이크로유체 마이크로칩을 포함하는 장치는 유전자형분석, 개별 포유동물 (예컨대, 인간)의 확인, 법의학, 유전자 발현, 유전자 변형, 마이크로RNA 분석 또는 리보타이핑을 위해 사용된다.
다른 실시양태에서, 마이크로유체 마이크로칩은 샘플 내의 핵산의 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 증폭 (예컨대, 대립유전자-특이적 PCR, 어셈블리 PCR, 비대칭 PCR, 콜로니 PCR, 헬리카제-의존적 증폭, 핫스타트(Hot-start) PCR, 서열간-특이적 (ISSR) PCR, 역 PCR, 라이게이션-매개 PCR, 메틸화-특이적 PCR 다중 라이게이션-의존적 프로브 증폭, 다중-PCR, 네스티드(Nested) PCR, 중첩-연장 PCR, 정량 PCR 역전사 PCR-PCR, 열 비대칭 얽힌-PCR, 터치다운 PCR 또는 PAN-AC PCR), 등온 핵산 증폭 (예컨대, 루프-매개 등온 증폭 (LAMP); 닉 치환 증폭; 헬리카제 의존적 증폭 플랫폼 (HDA); 및 프리마제-기재 전체 게놈 증폭 플랫폼 (pWGA); 단일 프라이머 등온 증폭 (SPIA) 및 RNA에 대한 Ribo-SPIA; 가닥 치환 증폭 (SDA); EXPAR [문헌 [Van Ness J, Van Ness LK, Galas DJ. (2003) Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides. Proc Natl Acad Sci U S A. 100:4504-9]]; 회전환 증폭 (RCA); 전사-기재 증폭 시스템 (TAS) 및 그의 유도체, 예를 들어 자가-유지 서열 복제 (3SR), 등온 핵산 서열-기재 증폭 (NASBA) 및 전사-매개 증폭 (TMA); 리가아제 연쇄 반응 (LCR)), DNA 또는 RNA의 서열분석 반응 (예컨대, 맥삼-길버트(Maxam-Gilbert) 서열분석, 생어(Sanger) 사슬-종결 방법, 염료-터미네이터 서열분석 유화 PCR 서열분석, 대용량 병렬 서열분석, 폴로니 서열분석, 라이게이션에 의한 서열분석, 합성에 의한 서열분석 또는 혼성화에 의한 서열분석), 제한 단편 길이 다형성 (RFLP) 분석, 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP) 분석, 짧은 직렬 반복 (STR) 분석, 미세위성 분석, DNA 지문 분석, DNA 족문 분석 또는 DNA 메틸화 분석을 포함하나 이에 제한되지 않는 분자 생물학적 분석을 포함하는 방법에서 사용된다.
한 실시양태에서, 카트리지는 결합 수용체, 트랜스페린, 항체 또는 그의 단편 (예컨대, Fc 단편 또는 Fab 단편), 렉틴, 또는 DNA 또는 RNA 서열을 포함하나 이에 제한되지 않는 결합 잔기에 커플링된 비드를 사용한다. 다른 실시양태에서, 카트리지는 항응고제, 정착액, 안정화 시약, 보존제 또는 침전 시약과 같은 시약을 포함한다.
C. 공압 매니폴드
공압 매니폴드는 기압 또는 진공의 분포를 촉진하기 위해 본원에 기재된 임의의 마이크로칩 및/또는 카트리지와 집적될 수 있다. 기압 또는 진공은 마이크로칩 상의 밸브를 구동하는데 사용될 수 있다. 별법으로, 기압 또는 진공이 유체층 내의 유체 또는 기체를 이동시키는데 사용될 수 있는 마이크로칩의 유체층 내의 마이크로채널에 제공되도록, 기압 또는 진공이 카트리지에 공급될 수 있다. 공압 매니폴드는 도 3의 카트리지 (1) 상의 마이크로칩 (2) 상의 마이크로밸브를 작동시키거나 다른 장치 내의 마이크로밸브를 작동시키기 위해 기압 또는 진공을 제공한다.
공압 매니폴드는 마이크로유체 마이크로칩의 공압 라인을 외부 압력원에 맞물리게 하기 위해 사용될 수 있다. 공압 매니폴드는 마이크로유체 마이크로칩의 공압층 상의 포트와 일렬로 정렬하는 포트, 및 외부 압력원에 연결하는 배관에 연결될 수 있는 포트를 가질 수 있다. 포트는 액체 또는 기체 또는 포트 사이의 다른 물질의 유체 소통을 허용하는 하나 이상의 채널에 의해 연결될 수 있다.
공압 매니폴드는 마이크로칩의 임의의 표면 상에서 마이크로유체 마이크로칩과 상호접촉될 수 있다. 공압 매니폴드는 카트리지와 마이크로유체 마이크로칩의 동일한 또는 상이한 측면 상에 존재할 수 있다. 도 40에 나타낸 바와 같이, 공압 매니폴드 (113)는 카트리지와 반대편에 마이크로유체 마이크로칩의 표면 상에 위치될 수 있다. 또한, 공압 매니폴드는 마이크로유체 마이크로칩의 표면의 오직 일부를 차지하도록 설계될 수 있다. 공압 매니폴드의 배치, 설계 및/또는 형상은 마이크로유체 마이크로칩으로의 다른 구성성분의 접근을 허용할 수 있다. 공압 매니폴드는 다른 구성성분이 마이크로유체 마이크로칩에 인접하게 또는 근접하게 위치하는 것을 허용하는 컷-아웃 또는 환상 공간을 가질 수 있다. 이는 예를 들어, 자성 구성성분 (109)이 마이크로유체 마이크로칩 내의 챔버에 근접하게 위치하는 것을 허용할 수 있다.
공압 매니폴드는 당업자에게 공지된 임의의 물질로 구축될 수 있다. 예를 들어, 카트리지는 플라스틱, 유리 또는 금속으로 구축될 수 있다. 플라스틱 물질은 당업자에게 공지된 임의의 플라스틱, 예컨대 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 폴리에스테르, 폴리아미드, 폴리(염화비닐), 폴리카르보네이트, 폴리우레탄, 폴리비닐디엔 클로라이드, 시클릭 올레핀 공중합체 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 공압 매니폴드는 당업자에게 공지된 임의의 기술, 예컨대 소프트-리소그래피, 통상적인 리소그래피, 밀링, 성형, 엠보싱, 드릴링, 에칭 또는 이들의 임의의 조합을 사용하여 형성될 수 있다.
공압 매니폴드 (370)는 20개 초과의 배관 포트를 제거하고, 제어 시스템, 공압 솔레노이드 및 MOVe 입력 포트 사이에 단단한 재현가능한 경계면을 제공하도록 설계되었다 (도 20). 매니폴드 (370)는 함께 고정된 개스킷 (380) 및 바닥 플레이트 (390)를 갖는다. 카트리지 (1)은 도 20 삽입부에서 (370)의 배면에 나타낸 공압 라인과 도 5에 나타낸 마이크로유체 마이크로칩 (2) 상의 공압 포트 (10, 20, 30, 40, 50, 60 및 70)을 일렬로 정렬하는 위치에서 브래킷에 의해 플레이트 (370) 상에서 유지된다. 외부 공압은 소형화될 수 있고 진공 공급원 또는 압력원에 연결될 수 있는 솔레노이드 밸브 뱅크에 의해 제어된다.
도 21 및 도 22에 나타낸 기구는 도 20에 나타낸 공압 매니폴드를 혼입할 수 있다. 기구는 본원에 기재된 바와 같이 샘플 제조를 위해 사용될 수 있고, 카트리지를 혼입할 수 있다. 카트리지 (1) ('큐브'라고 표지됨)는 솔레노이드 (1819)에 의해 매니폴드 (370)에 부착된다. 카트리지 및 매니폴드의 어셈블리는 기구의 기저 플레이트 상에 탑재된다. 공압 매니폴드는 IO 제어기 (1803)에 의해 제어될 수 있다.
기체 공급부, 예컨대 원하는 압력 또는 진공에서 유지될 수 있는 저장소가 매니폴드에 기체를 공급할 수 있다. 기체 공급부는 외부 압력원 또는 진공 공급원에 연결될 수 있다. 기체 공급부 매니폴드에 공급하는 기체 공급부는 유입구 압력을 모니터링하기 위해 압력 게이지를 가질 수 있다. 기체 공급부는 기체 공급부 매니폴드 (1821)를 통해 시스템의 다수의 구성성분에 기체를 공급할 수 있다. 기체 공급부 매니폴드는 공압 매니폴드 (370) 및 개별 시약 용기 (1809) 및 (1807)에 기체를 공급할 수 있다. 분포 밸브 (390)에 기체를 공급하는 라인은 조정기 (1815)에 의해 조정될 수 있다.
시약 및/또는 샘플은 또한 시약 저장 영역 (380) 내의 용기 (1809) 및 비드 믹서 (1805) 상에 탑재된 비드 용액 용기 (1807)에 연결된 시약 분포 밸브 (390)를 통해 카트리지로 공급될 수 있다. 어댑터 (1817)는 전달 장치, 예컨대 주사기가 카트리지에 물질을 전달할 수 있도록 카트리지와 일렬로 정렬되고/거나 탑재될 수 있다. 어댑터 (1817)는 히터 컨트롤 (1801)에 의해 열로 조정될 수 있다. 어댑터는 히터 코일 또는 펠티어 장치에 의해 생성된 열을 분포시키기 위한 열 도체, 예컨대 베어링을 가질 수 있다. 어댑터는 약 20 내지 100, 20 내지 75, 또는 50 내지 60℃의 온도를 유지할 수 있다.
자석 어셈블리 (1811)는 카트리지에 인접하여 위치될 수 있다. 자석이 카트리지, 또는 카트리지와 집적되거나, 맞물리거나 또는 상호접촉된 마이크로칩 내에서 자기장을 가할 수 있도록, 자석 어셈블리의 자석 (300)은 카트리지 (1)에 인접하여 위치되고, 구동기에 의해 이동될 수 있다. 자기장은 카트리지 또는 마이크로칩 내의 상자성 또는 자성 입자, 예컨대 비드를 포획하고, 폐기물 물질로부터 입자에 결합된 물질을 분리하는데 사용될 수 있다. 카트리지 및/또는 마이크로칩으로부터의 폐기물은 폐기물 용기 (1813)로 전달될 수 있다.
도 21 및 도 22에 나타낸 기구는 카트리지 (1)를 작동시키기 위해 7개의 솔레노이드 밸브를 사용할 수 있다. 기구의 크기 및 복잡성은 MOVe 마이크로밸브로 추가로 감소될 수 있다. 도 23 및 도 24는 대략 2 인치 폭의 마이크로유체 마이크로칩 (600)을 함유하는 시약 분포 장치를 나타낸다. 솔레노이드 뱅크 (680 및 684)는 커넥터 (681, 682, 685 및 686)를 통해 실물 크기 외부 진공 및 압력으로의 연결부를 제공한다. 솔레노이드는 전기 접합부 (689 및 687)를 통해 제어된다. MOVe 밸브를 갖는 마이크로유체 마이크로칩 (600)은 클램프 (710)를 사용하여 부착부 (711)에 의해 매니폴드 (700)와 접촉하여 유지된다. 당업자에게 공지된 다른 방법이 마이크로칩을 공압 매니폴드 (700)에 연결하는데 사용될 수 있다.
도 25에 나타낸 바와 같이, 마이크로칩 (600)은 2개의 샘플 루프 (630 및 631) 및 마이크로유체 장치, 예컨대 카트리지 (1)일 수 있는 5개의 장치 (634, 635, 636, 637 및 638)와 5개의 시약 공급원 (621, 622, 623, 624 및 625)을 연결한다. 샘플 루프 (630 및 631)는 예정된 부피를 갖도록 배치될 수 있다. 샘플 루프는 제거가능한 부분을 가질 수 있다. 그러므로, 이들은 유체 조작 모듈 내의 포트에 제거가능하게 연결가능할 수 있다. 샘플 루프는 샘플 루프의 부피 조절을 허용하도록 제거될 수 있다. 샘플 루프의 일부는 모세관 배관, 임의의 다른 유형의 배관 또는 마이크로유체 채널일 수 있다. 샘플 루프는 본원에 기재된 임의의 유형의 접합부를 사용하여 마이크로칩에 연결될 수 있다. 예를 들어, 접합부는 캐뉼라, 업피트 배관, 마이크로배관 피팅, 업처치 배관 어댑터 또는 FROLC 커넥터에 연결할 수 있다 [요바노비치(Jovanovich, S. B.), 로난(G. Ronan), 로치(D. Roach) 및 존스턴(R. Johnston). 모세관 밸브, 커넥터 및 라우터. 2001년 2월 20일. 미국 특허 제6,190,616호]. 시약 공급원, 마이크로유체 장치 및 샘플 루프의 개수는 증가되거나 감소될 수 있다는 것은 명백하다. 각 마이크로유체 장치는 동일한 기능, 상이한 또는 보안적 기능을 수행할 수 있다. 장치는 모듈식 마이크로유체 포트를 통해 연결될 수 있다.
도 25에 나타낸 본 발명의 측면에서, 마이크로칩 (600)은 2개의 다른 제2 마이크로유체 채널과 교차하는 주요 마이크로유체 채널을 포함한다. 주요 마이크로유체 채널은 도 25에 나타낸 바와 같이 시약 공급원 (625)를 장치 (634)와 연결하는 채널일 수 있다. 제2 채널은 밸브 (606)을 샘플 루프 (630)에 연결하는 채널 및 밸브 (608)을 샘플 루프 (630)에 연결하는 채널일 수 있다. 이들 제2 채널 중 하나 이상 및 임의로 양자 모두는 유체가 주요 채널을 통해 유동하게 하는 유동-관통 밸브 (606 및 608)를 통해 주요 채널과 연결하나, 오직 유동 관통 밸브가 개방된 경우 제2 채널로 또는 그 밖으로 연결한다. 유동-관통 밸브는 인라인 밸브로서 재설계될 수 있다. 주요 채널은 또한 2개의 제2 채널의 교차점 사이에 중간 밸브 (674)를 포함한다. 각 제2 채널은 진입 포트에서 마이크로칩으로부터 개방한다. 규정된 부피의 채널을 갖는 샘플 루프 (630)는 진입 포트 각각에 제거가능하게 부착된다. 그러므로, 샘플 루프 내의 특정 부피의 유체가 중간 밸브 (674)의 폐쇄, 밸브 (606 및 608)를 통한 유동의 개방 및 주요 채널로의 압력의 적용에 의해 주요 채널에 주입될 수 있다. 샘플 루프는 또한 유체 루프 또는 시약 루프라고 지칭될 수 있다.
분포 매니폴드의 마이크로칩 (600)은 매니폴드를 통한 유동의 방향을 지정하기 위해 18개의 마이크로밸브 (601 내지 618)를 사용한다. 마이크로밸브는 공압 매니폴드 (700)로의 모듈식 마이크로유체 포트를 포함하는 다른 커넥터 또는 o-링을 갖는 공압 포트를 통해 작동된다. 예를 들어, 연결부 (671)은 마이크로밸브 (641)에 압력 또는 진공을 제공하고, 연결부 (673)은 마이크로밸브 (642)에 압력 또는 진공을 제공한다. 시약 공급원 (621, 622, 623, 624 및 625)으로부터의 시약의 유동은 샘플 루프를 개별적으로 충전하거나 또는 샘플을 장치 (634, 635, 636, 637 및 638)로 이동시키도록 지정될 수 있다.
도 26에 나타낸 바와 같은 매니폴드 (700) 상의 공압은 솔레노이드 뱅크 (680 및 681)를 통해 공압 채널 (683)에 압력원 (685) 및 진공 공급원 (686)을 연결하여, 포트 (671 및 673)를 포함하는 포트의 어레이 (684)로 인도한다. 도 26의 윗 부분은 솔레노이드로부터 마이크로칩의 공압층으로 인도하는 공압 매니폴드의 공압 라인을 나타낸다. 도 26의 아랫 부분은 솔레노이드 및 각 솔레노이드에 연결된 진공 공급원 (685) 및 압력원 (686)을 나타낸다. 솔레노이드 뱅크는 공통 진공 공급원 또는 압력원으로 각 개별 솔레노이드를 개방하고 폐쇄하는 전자기기에 의해 제어된다. 개별 진공 또는 압력 컨트롤이 또한 고려된다.
도 23에 나타낸 공압 매니폴드 (700)는 도 25에 나타낸 마이크로유체 마이크로칩 (600) 상의 마이크로밸브 (601 내지 618)를 작동시킬 수 있다. 예를 들어, 시약을 시약 공급원 (622)으로부터 샘플 루프 (630)로 이동시키기 위해, 마이크로밸브 (602, 606 및 608)는 개방되고, 관통형 밸브 (658)는 폐쇄된다. 별법으로, 시약은 T-밸브 (606 및 608)의 폐쇄 및 관통형 밸브 (658)의 개방에 의해 샘플 루프 (630)를 우회할 수 있다. 밸브는 공압 매니폴드에 유체적으로 연결된 공압 라인에 의해 제어될 수 있다. 예를 들어, 공압 라인 (672)은 마이크로밸브 (642)를 개방하거나 폐쇄하기 위해 도 23에 나타낸 공압 매니폴드 (700) 상의 솔레노이드에 의해 제어된다. 밸브 (603, 604, 605, 609, 610)는 마이크로채널 (641 내지 644 및 656 내지 668)을 함유하는 마이크로유체 회로를 통한 유동을 위해 항상 개방된다. 시약은 샘플 루프 (630)로 이동된다.
(622)와 (612) 사이의 회로는 필요하다면 과도충전되거나, 또는 유동의 조절 또는 타이밍의 제어를 위해 MOVe 마이크로밸브에 의해 정교하게 제어될 수 있다. 샘플 루프 (630)가 충전되면, 규정된 부피가 선택되었다. 마이크로유체 회로는 시약 부피를 추가로 규정하기 위해 주요 채널을 통해 세정 용액 또는 공기 또는 기체를 플러슁함으로써 세정될 수 있다. 시약 공급원 (621)이 압축된 공기 또는 기체 공급원 (압력 및 진공은 가압 유동 시스템 내의 시약의 유형임)인 경우, 마이크로밸브 (601) 및 마이크로밸브 (606, 610 및 616)의 개방은 샘플 루프 (630) 내의 측정된 시약을 장치 (636)로 이동시기 위한 회로를 생성시킨다. 한 실시양태에서, 임의의 수의 시약 공급원을 마이크로장치, 예컨대 카트리지 (1)로 연결하기 위한 수단이 제공된다.
II. 샘플의 병렬 가공
본 발명의 몇몇 실시양태에서, 하나 이상의 카트리지가 샘플의 병렬 가공을 허용하도록 동시에 작동될 수 있다. 도 16은 면봉 추출 어셈블리 (800) 내의 단일 공압 매니폴드 상의 마이크로밸브를 갖는 다수의 카트리지의 병렬 또는 집단 작동을 예시한다. 매니폴드 (370)는 솔레노이드 (680)를 사용하여 도면에 나타낸 4개의 카트리지 (1)를 작동하기 위해 조정된 진공 및 압력을 분포시킨다. 솔레노이드 (680)는 공압 매니폴드 (370, 380, 390)를 통해 각 카트리지와 집적된 마이크로칩의 공압층으로의 압력을 제어한다. 공압 매니폴드는 상단 플레이트 (370), 개스킷 (380) 및 바닥 플레이트 (390)에 의해 형성된다. 상단 플레이트는 에칭된 채널을 가질 수 있다. 채널은 바닥 플레이트 (390)에 의해 상단 플레이트에 대해 샌드위치된 개스킷에 의해 밀봉될 수 있다. 구동기 (310)는 자석 (320)을 카트리지 (1)로 인접하게 또는 멀리 떨어지게 이동시키기 위해 막대 (810)를 이동시킨다. 클램프 (805)는 카트리지 (1)를 정위치에서 유지한다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 마이크로칩과 집적된 단일 카트리지는 병렬 채널을 사용하여 한번에 다수의 샘플을 가공할 수 있다. 도 14 및 도 15는 모세관 공급부 및 자석을 갖는 조립된 포획 및 반응 마이크로칩을 나타낸다. 이 마이크로칩은 비드 용액을 포획하고 4개의 STR-PCR 반응을 동시에 수행할 수 있다. 도 14는 마이크로칩에 접착된 카트리지 (1203) 및 마이크로칩의 안으로 및 밖으로 인도하는 튜브 (1205, 1207, 1209, 1211, 1213, 1215, 1217 및 1219)와 함께 마이크로칩 (1201)을 나타낸다. 총 8개의 튜브가 보여지고, 병렬 반응 당 2개의 튜브가 사용된다. 예를 들어, 병렬 가공 장치의 한 유닛은 튜브 (1205 및 1213)에 의해 작동된다.
다른 실시양태에서, 4-채널 샘플 제조 장치 (도 66)는 4개의 샘플이 동시에 및 신속하게 가공될 수 있게 하는, 시약을 동시에 단일 집적된 카트리지 (도 68)의 4개의 채널 모두로 계량하고 전달하는 4-채널 병렬 시약 전달 장치 (도 67)를 조합한다.
4-채널 병렬 시약 전달 장치는 공압 제어 매니폴드 상에 탑재된 유체 매니폴드와 칩 C 마이크로칩 (도 67 참조)을 조합한다. 시약은 각 채널에 대해 본원에 기재된 샘플 루프와 유사할 수 있는 2개의 상이한 크기 시약 루프 중 하나를 사용하여 계량되고, 샘플 제조 장치의 4개의 채널 모두에 병렬로 전달된다. 병렬 시약 전달 장치를 사용하여 샘플 제조 장치의 4개의 채널 모두에 동시에 시약을 전달하는 것은 <4 분 걸릴 수 있으며, 이는 가공되는 4개의 샘플 당 약 15 분 걸리는 제1 세대 일련의 시약 전달 장치와 비교하여 >11 분의 가공 시간 절약을 나타낸다.
결합된 공압 매니폴드는 접착제 결합 접근법을 사용하여 매니폴드를 제작함으로써 시약 전달 및 샘플 제조 장치를 제어하는데 사용될 수 있으나, 이들은 서브시스템에서 사용되는 공압 압력, 및 매니폴드의 크기 및 복잡성으로 인해 시간에 따라 박리하는 경향이 있을 수 있다. 열로 결합된 매니폴드는 박리 문제를 경감시킬 수 있으나, 오직 시약 전달 장치와 같은 상대적으로 작고 덜 복잡한 매니폴드 설계에 대한 실용적인 접근법일 수 있다. 솔레노이드 제어 밸브에 공압 포트를 연결하는 배관을 갖는 폴리카르보네이트의 단일 조각으로 제조된 단일체 매니폴드는 4-채널 샘플 제조 카트리지를 작동시킬 수 있고, 결합된 공압 매니폴드의 대안으로서 실용적인 것으로 입증되었다 (예를 들어, 도 45 및 도 46 참조). 이 공압 매니폴드 설계 컨셉은 또한 증폭후 STR (단일 직렬 반복) 세정 서브시스템 상의 칩 A 마이크로칩의 제어에 사용되고 있다.
4-채널 샘플 제조 카트리지의 유체 매니폴드 및 마이크로칩에 대한 어셈블리 공정이 또한 개선되었다. 역사적으로, 규소 에폭시는 마이크로칩과 큐브 사이에 접착제를 운반함으로써 그의 회합 MOVe 마이크로칩에 카트리지를 부착시키는데 사용될 수 있다. 에폭시의 이동 제어의 고유의 결핍은 마이크로칩 또는 큐브 상의 포트로 이를 때때로 운반하여, 장치를 쓸모없게 하는 유체 통로의 차단을 생성하게 할 수 있다. 이 공정은 유체 큐브 및 마이크로칩을 조립하기 위해 양면 접착 테이프 (Adhesives Research ARcare90106)를 사용함으로써 개선되었고; 이는 이제 하기 기재된 증폭후 STR 세정 서브시스템 내의 증폭후 장치, 4-채널 시약 전달 카트리지 및 샘플 제조 장치에서 사용되는 바람직한 어셈블리 방법이다.
칩 D 마이크로칩과 집적된 4-채널 샘플 제조 카트리지 (도 69 참조)를 시험하였다. 칩 D 마이크로칩 (도 69 왼쪽 패널에 나타냄)은 PDMS 막이 MOVe 마이크로칩 상의 유동 관통 밸브에 인접한 유체 채널을 우연히 폐쇄하는 설계와 관련된 문제를 강조하였다. 이론 또는 추측에 제한되지 않고, 이러한 효과는 마이크로칩 어셈블리 도중 정렬의 미세한 차이, 마이크로칩의 유체층의 에치 깊이, 및 샘플 제조 장치 상의 마이크로칩을 작동시키는데 사용되는 공압 압력을 포함하는 변수들의 조합으로 인한 것으로 생각된다. 도 69 오른쪽 패널에 나타낸 마이크로칩, 칩 E는 칩 D 마이크로칩 내의 2개의 양분 채널 사이의 T-접합부를 형성하는 모든 유동 관통 밸브를 채널의 중간을 통해 통과하는 오직 하나의 채널을 갖는 인라인 채널로 전환시키도록 설계되었다. 칩 E 마이크로칩은 밸브 폐쇄 도중 우연한 채널 폐쇄의 발생을 감소시킬 수 있다. 도 69 왼쪽 패널에서, 마이크로칩의 중간을 따라 위치된 4개의 원은 독립적으로 작동될 수 있고, 면봉으로부터 분석물질을 추출하는데 사용될 수 있는 면봉 추출 장치에 각각 유체적으로 연결된다. 마이크로칩 내의 다른 포트는 뉴클레오티드 결합과 같은 반응의 수행을 위해 마이크로칩 (도 68에 나타냄)에 맞물리는 카트리지 내의 챔버 (도 3 및 도 4에 기재된 포트 및 챔버와 유사함)에 연결될 수 있다. 마이크로칩과 집적된 4-채널 샘플 제조 카트리지의 작동은 도 3 및 도 4에 나타낸 장치의 작동과 유사하다.
본원에 기재된 시스템 및 장치로의 섬유의 우연한 도입으로 인한 마이크로칩 차단은 마이크로유체공학에서 문제가 될 수 있다. 차단을 최소화하기 위해, 상자성 비드 용액을 제외한 모든 시약은 마이크로칩 차단을 최소화하는데 사용되는 로딩 및 인라인 필터 전에 여과될 수 있다.
제2-세대 샘플 제조 장치의 서브시스템 시험은 시스템 재현가능성 및 실패 모드의 특징화에 초점을 맞추었다. 총 80개의 샘플을 서브시스템에서 63%의 성공률로 가공하였다. 실패 모드는 우연히 단절된 시약 라인 (2.5%), 칩 차단 (3.75%), 관찰된 STR 프로파일링 없음 (9%), 및 DNA 수율 <0.08 ng (22%) (하류 시스템의 검출의 한계임)을 포함하였다. 정제된 DNA 수율의 평균 수율은 0.26 ng인 것으로 밝혀졌다. STR 반응에서 시험된 샘플의 대략 절반은 전체 프로파일을 제공하였고, 절반은 부분 프로파일을 제공하였다 (도 70 참조). 세정되고 재순환된 카트리를 사용하여 시스템에서 많은 블랭크 샘플을 가공하였고, 실행-대-실행 교차 오염은 무시가능한 것으로 밝혀졌다.
III. 집적된 샘플 제조 및 중합효소 연쇄 반응
본 발명의 몇몇 실시양태에서, 카트리지는 중합효소 연쇄 반응 및 생성물 분석을 수행하기 위한 장치와 집적될 수 있다. 이러한 장치는 도 6에 나타낸다. 도 6은 집적 마이크로칩 (1), 온도 조절 장치 (400) 및 하류 분석 장치 (500)를 갖는 카트리지를 나타낸다. 특정 실시양태에서, 장치는 마이크로칩에 맞물리거나 또는 다르게 유체적으로 연결된 카트리지를 포함하는 유체 제조 모듈; 카트리지를 통해 유체 채널, 예컨대 튜브를 갖는 유체 수송기를 통해 유체 제조 모듈에 연결되고, 유체 수송기에서 온도를 조절하도록 배치된 오프-칩 열 조절 모듈을 포함하며, 여기서 유체 수송기는 추가로 유체를 하나 이상의 후속 장치로 선택적으로 보낼 수 있는 유체 채널 및 밸브를 갖는 제2 마이크로칩에 유체적으로 연결된다. 이 장치는 열 순환 또는 등온 반응에서 사용될 수 있다.
집적 마이크로칩을 갖는 카트리지는 본원에 기재된 임의의 카트리지 및 마이크로칩, 예를 들어 도 3, 도 4 및 도 5에 나타낸 카트리지 및 마이크로칩으로 형성될 수 있다. 이동가능한 자석 (300)은 카트리지에 인접하게 위치될 수 있다. 이동가능한 자석은 구동기 (310)에 의해 이동될 수 있다. 이동가능한 자석은 카트리지 또는 마이크로칩 내에 자기장을 가하는데 사용될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 이동가능한 자석은 카트리지 또는 마이크로칩 내의 챔버의 벽을 대항하여 비드를 모으거나 수집하는 것을 촉진하는데 사용될 수 있다.
온도 조절기는 반응 채널 (250)을 통해 카트리지 및 마이크로칩에 유체적으로 연결될 수 있다. 반응 챔버 (250)는 말단 (251)에서 카트리지에 연결될 수 있다. 온도 조절기는 샘플 (집합적으로 PCR 반응 샘플이라고 지칭됨)로부터 풍부하게 된 핵산 및 반응 혼합물을 함유하는 반응 채널 (250)의 온도를 열 순환하는데 사용될 수 있다. 제어 메카니즘은 온도 조절기의 작동을 제어하는데 사용될 수 있다. 광학 어셈블리는 반응을 모니터링하거나 제어하는데 사용될 수 있다. 광학 어셈블리는 빛을 도입하거나 검출할 수 있다. 예를 들어, 광학 어셈블리 (410)는 실시간 PCR 또는 다른 실시간 또는 종점 측정을 수행하는데 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 온도 조절기는 열-커플링된 펠티어 열전기 모듈, 통상적인 열전기 모듈, 고온 공기, 적외선 또는 마이크로웨이브를 사용한다. 한 실시양태에서, 온도 조절기는 필요한 만큼 PCR 반응 샘플을 가열하고 냉각하기 위해 반응 채널의 외부의 펠티어 열전기 모듈을 사용한다. 열전기 모듈의 가열 및 냉각은 영역 (350)에 걸쳐 분포될 수 있다. 온도 조절기 (400)의 추가 도면은 도 7 및 도 8에 나타낸다. 도 7은 온도 제어된 영역 (350)과 접촉하는 반응 채널 (250)을 나타낸다. 온도 조절기는 또한 구동기 (330)에 의해 위치된 이동가능한 자석 (320)을 포함할 수 있다. 이동가능한 자석은 도 6에 나타낸 바와 같은 위치 (340)에서 자성 입자를 포획하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 온도 제어된 영역은 2개의 부분을 포함한다. 2개의 부분은 반응 채널 (250)와 열 접촉을 유지하기 위해 함께 클램핑되거나, 채워지거나 또는 유지되는 클램쉘의 부분일 수 있다. 온도 제어된 영역의 한 부분인 도 8의 부분 (711)은 온도 제어된 영역의 제2 부분으로 힌지될 수 있다. 온도 제어된 영역은 도 7의 오른쪽 및 도 8에 나타낸 바와 같이 하나 이상의 반응 채널의 배치를 위해 그루브 채널을 가질 수 있다. 도 7의 왼쪽은 폐쇄된 배치에서 온도 제어된 영역을 나타낸다. 또한, 온도 제어된 영역은 하나 이상의 수축 구성성분 (도 8에서 (709) 및 (701)로서 나타냄)을 포함할 수 있다. 수축점은 반응 채널의 한 부분이 반응 채널의 다른 부분으로부터 단리되도록 반응 채널을 핀칭할 수 있다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 반응 채널은 유체의 몸체, 예컨대 반응 혼합물이 단리되도록 두 위치에서 핀칭된다. 수축 구성성분 (709 및 701)은 반응 채널의 핀칭을 촉진하기 위해 추가 수축 구성성분 (707 및 705)과 맞물릴 수 있다.
별법으로, 온도 조절기는 도 65에 나타낸 바와 같은 핀치 클램프를 사용하여 반응 배관을 수축시킬 수 있다. 울템과 같은 플라스틱으로 형성될 수 있는 핀치 클램프의 사용은 반응 채널로의 열 이동을 감소시킬 수 있다. 열 이동의 감소는 반응 채널이 열순환 또는 온도 조정 도중 용접 폐쇄될 가능성을 감소시킬 수 있다. 별법으로, 상이한 물질 배관은 반응 채널이 열순환 또는 온도 조정 공정 전 및 후에 그의 형상을 유지할 수 있다는 것을 확실하게 하기 위해 반응 채널로서 사용될 수 있다. 상이한 물질 배관은 또한 온도 조절 공정 도중 증발률을 감소시키는데 사용될 수 있다. 물질의 예로는 에틸비닐 아세테이트, 실리콘 및 실란화된 c-플렉스 배관이 포함된다.
온도 조절 장치는 초당 0.5 내지 3℃ 초과의 속도로 온도를 조절할 수 있다. 히터는 약 25 내지 100 와트를 사용할 수 있고, 온도 조절 장치를 냉각시키는데 사용될 수 있는 팬은 적어도 약 75, 100, 130, 150, 200, 250 또는 300 cfm의 공기 유속을 생성할 수 있다.
한 실시양태에서, 카트리지에서 유체의 이동을 제어하는데 사용될 수 있는 마이크로유체 마이크로칩 (1)과 집적된 카트리지를 포함하는 샘플 제조 장치는 유동-관통 PCR 열 순환기로서 온도 조절기 (400)와 함께 사용될 수 있다. 유체를 이동시키기 위한 추진력은 외부 압력원 또는 내부 압력원, 예컨대 마이크로칩 내의 MOVe 밸브일 수 있다. 유동-관통 PCR 열 순환기는 고도로 민감한 또는 높은 처리량 PCR이 바람직한 경우 사용될 수 있다. 민감한 PCR 검정에서 공기, 혈액, 물, 타액, 세포 샘플 또는 다른 배지를 샘플링할 것을 원하는 많은 상황이 존재한다. 이는 인플루엔자, 박테리아 병원체 및 임의의 수의 바이러스 또는 박테리아 병원체를 포함하는 다양한 생물학적 오염물질을 찾는데 사용될 수 있다. 유동-관통 PCR은 PCR이 인간 상호작용을 필요로 하지 않고 자동화 방식으로 실시되도록 할 수 있다. 유동-관통 PCR 시스템은 또한 건물, 비행기, 버스 및 다른 수송수단의 HVAC 시스템에서 조기 경보 시스템으로서 작용할 수 있고, 감염원 또는 오염물질의 존재에 대해 혈액, 물 또는 다른 샘플 공급원을 모니터링하는데 사용될 수 있다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 유동-관통 PCR 장치는 수집 장치, 예컨대 협측 면봉, 주사기, 공기 샘플러, 유체 샘플러 또는 다른 샘플러로부터 샘플을 취하고, 이를 샘플 제조 장치 (1)로 전달한다. 도 6은 척도를 위해 반드시 연신되어야 하는 것은 아니다. 샘플은 제조 장치 (1)에서 제조되며, 이는 몇몇 실시양태에서 세포 용해, DNA, RNA 또는 마이크로RNA 풍부화 또는 정제, 여과 또는 역전사를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 하나 이상의 핵산이 풍부하게 된다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 풍부하게 된 핵산은 핵산을 PCR 시약 (예컨대, 하나 이상의 DNA 중합효소, RNA 중합효소, dNTP, 완충액 또는 염) 및 프라이머 (예컨대, 검정-특이적 프라이머 또는 다수의 표적 병원체에 대해 광범위하게 적용가능한 프라이머 세트)에 첨가함으로써 PCR을 위해 제조된다. 이들 프라이머는 특정 병원체 (예컨대, 곰팡이, 바이러스, 박테리아, 기생충 또는 아메바)로부터 단리된 하나 이상의 핵산, 유전자, 다른 원하는 핵산 또는 이들의 임의의 조합을 선택적으로 증폭시키기 위해 선택될 수 있다. 샘플로부터 풍부하게 된 하나 이상의 핵산, PCR 시약 및 프라이머를 포함하는 조성물은 PCR 반응 샘플이라고 불린다. 한 실시양태에서, 유동-관통 PCR은 연속적 유동 장치로서 사용될 수 있으며, 다른 실시양태에서 샘플은 열 순환 영역으로 이동되고 정지된다.
그 후, PCR 반응 샘플은 반응 채널 (250)을 통해 온도 제어된 장치 또는 영역 (350)으로 유동한다. 몇몇 실시양태에서, 반응 채널은 깨끗하거나 또는 투명하다. 다른 실시양태에서, 반응 채널은 불투명하다. 한 실시양태에서, 반응 채널은 원통형이다. 다른 실시양태에서, 반응 채널의 단면도는 삼각형, 정사각형, 직사각형, 오각형, 육각형, 칠각형, 팔각형, 구각형, 십각형 또는 기타 다각형과 같은 형상을 형성하는 하나 이상의 평면을 포함한다. 한 실시양태에서, PCR 반응 샘플의 부피는 반응 채널 내의 공간의 작은 개별 길이를 차지하고, 나머지는 공기, 기체 또는 비반응성 액체, 예컨대 광유에 의해 채워지도록 한다. 공기, 기체 또는 비반응성 액체는 개별 PCR 반응 샘플을 서로 분리하는데 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 온도 제어된 영역 (350)은 열-커플링된 펠티어 열전기 모듈, 통상적인 열전기 모듈, 고온 공기, 마이크로웨이브 또는 적외선을 포함하나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 모듈에 의해 열로 조절된다. 한 실시양태에서, 열 순환기는 필요한 만큼 샘플을 가열하고 냉각하기 위해 튜브의 외부의 펠티어 열전기 모듈을 사용한다. 한 실시양태에서, 검출 모듈 (410)은 온도 제어 영역과 위치되는 동안 또는 온도 제어 영역을 떠난 후에 PCR 반응 샘플로부터 방출된 신호를 검출하기 위해 형광, 발광, 흡광도 또는 다른 광학 특성을 측정한다. 검출 모듈은 PCR 반응 샘플 중의 형광 염료 (예컨대, 브롬화 에티디움 또는 사이버 그린(Syber green)을 포함하나 이에 제한되지 않는 삽입성 염료)를 여기시키는데 사용되는 광원 (예컨대, 간섭성 광원 또는 비간섭성 광원)을 포함할 수 있고, 여기광은 광검출기 (예컨대, CCD, CMOS, PMT 또는 다른 광학 검출기)로 감지된다. 검출 전자기기는 검출 모듈 (410)로부터 보내진 신호를 평가할 수 있다.
한 실시양태에서, 원하는 수의 열 순환이 완료된 후, PCR 반응 샘플은 압력 또는 진공을 사용하여 펌핑되거나 반응 채널 아래로 추가로 밀리며, 온도 제어된 영역에서 배출되고 제2 마이크로유체 마이크로칩 (500)으로 통과한다. 제2 마이크로칩 (500)은 말단 (252)에서 반응 채널 (250)에 부착될 수 있다. 마이크로유체 마이크로칩 (500)은 마이크로밸브 (510, 520, 530 및 545)를 포함할 수 있다. 임의의 3개의 마이크로밸브 (예컨대 (510, 520 및 530) 또는 (510, 520 및 545))는 펌프를 형성할 수 있다. 마이크로채널 (505, 515, 525 및 540)은 마이크로칩 상의 펌프를 연결할 수 있다. 하류 장치 (535 및 550)는 마이크로칩에 연결될 수 있다. 장치 (535 및 550)로의 물질의 유동은 마이크로밸브에 의해, 예를 들어 유체의 펌핑 또는 이동 도중 밸브 (530 또는 545)를 폐쇄된 상태로 유지함으로써 제어될 수 있다. 한 바람직한 실시양태에서, 하류 장치는 전기영동, 질량 분광법 또는 당업자에게 공지된 다른 분석 기술을 수행하기 위해 사용될 수 있는 분석 장치이다.
한 실시양태에서, 제2 마이크로유체 마이크로칩은 추가 가공 또는 분석을 위해 모듈 또는 영역으로 PCR 반응 샘플을 전달할 수 있다. 다른 실시양태에서, 다수의 반응 채널은 샘플 처리량을 증가시키기 위해 병렬로 사용될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 시스템은 표적 서열이 존재한다는 것을 나타내는 증폭이 발생했을 때 (양성 결과) 사용자에게 경보를 발할 수 있다. 한 실시양태에서, 반응 채널은 오직 단일 사용을 위해 사용된 후, 처분된다. 별법의 실시양태에서, 반응 채널은 다수의 샘플 중의 PCR 증폭 생성물을 증폭시키고 그의 존재 또는 부재를 검출하는데 사용될 수 있다. 하나 초과의 PCR 반응 샘플은 간격을 두고 로딩되고, 상호혼합을 방지하기 위한 기체 또는 액체의 장벽 볼루스로 공간을 둘 수 있다. 한 실시양태에서, 한 샘플은 열 순환 진행중에 있고 다른 샘플은 의문부호 진행중 검출 영역에 있게 하는 방식으로 샘플을 서로 떨어트린다. PCR 증폭이 열 순환을 사용할 수 있거나 또는 등온 반응일 수 있는 다른 핵산 증폭 기술에 의해 대체될 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다.
다른 실시양태에서, 장치는 존재하는 표적의 양의 판독을 제공하는 검출 모듈 (410)에 의해 세포, 단백질, 독소 또는 다른 표적이 존재하는가를 결정하기 위해 항체 또는 아프타머와 같은 친화성 시약을 사용하여 샌드위치 검정과 같은 등온 반응을 수행할 수 있다. 이들 적용에서, 카트리지 (1)는 IMS 정제와 같은 친화성 정제를 수행한 후, 부착된 형광 라벨을 가질 수 있는 이차 항체를 첨가할 수 있다. 그 후, 샘플은 열 제어가 반응을 최적화하도록 설정된 영역 (350)으로 이동할 수 있다. 그 후, 검출 모듈 (410)은 반응을 모니터링할 수 있다. 한 실시양태에서, 다수의 카트리지는 반응 채널 (250)로 군집화되고, 일련의 볼루스는 검출기 (410)로 판독될 수 있다.
IV. 모세관 전기영동을 위한 장치
한 실시양태에서, 완전한 샘플-투-앤써 시스템이 사용되며, 이는 부피 및 농도를 매칭하기 위해 모든 단계를 함께 커플링하는 것을 필요로 하는 마이크로유체공학을 포함할 수 있다. 모세관 전기영동을 사용하는 샘플 분석은 상기 기재된 바와 같은 마이크로유체 샘플 제조 방법과 함께 사용될 수 있는 표준 분석 방법이다. 모세관 전기영동은 마이크로유체 마이크로칩으로 용이하게 개질가능하다. 본 발명에서, 마이크로칩 상의 모세관 전기영동은 MOVe 밸브와 조합되어, 샘플의 제어를 제공하고, 비드를 가공하여 샘플을 농축시키고, 로딩 및 분리를 개선시킨다.
한 실시양태에서, 트윈(Twin)-T 주입 시스템이 분리를 위한 마이크로유체 주입기의 설계에서 사용된다. 별법의 실시양태에서, 포크형 캐쏘드 주입기 (도 30)를 위한 설계가 사용된다. 레이아웃은 트윈-T와 유사하나 (여기서, 샘플 플러그는 분리 채널에 인접한 채널의 단면에 의해 기재됨), 핵심 차이가 존재한다. 첫째, 캐쏘드 채널은 2개의 부분으로 분할되고, 이는 주입을 2개의 부분으로 전기적으로 분할하여, 주어진 샘플 플러그 치수에 대한 주입된 물질의 양을 배가한다. 둘째, 샘플 채널 및 분리 채널은 서로에 대해 우각에 있다. 이는 샘플 채널이 직선이고 완충액 (분리 중합체 아님)으로 충전되게 하여, 이는 펌프를 갖는 이 채널의 내용물 및 유체 유동을 조작하는 것을 촉진하고, 분리 중합체 경계면을 날카롭게 한다. 마지막으로, 주입기는 자기장 증폭된 샘플 적재 (FASS)를 허용하는 방식으로 실행될 수 있다.
도 30은 포크형 캐쏘드로서 마이크로채널을 사용하는 포크형 캐쏘드 주입기의 예를 나타낸다. 도 30에 나타낸 바와 같이, 샘플은 샘플 로딩 채널 (화살표로 더 아래 왼쪽의 도면에 나타냄)을 가로질러 동전기적으로 이동된다. 그 후, 샘플은 후진력이 샘플 및 폐기물에 적용되는 동안 분리 채널과 캐쏘드 암 (2개의 채널 강하) 사이에 전기장을 적용함으로써 분리 채널 (수직 채널)로 추진된다. 초기 샘플 플러그 치수는 캐쏘드 암 사이의 거리에 의해 정의된다. 채널의 배치는 더 재현가능한 플러그 및 MOVe 마이크로유체 시스템과의 더 양호한 집적을 허용한다.
도 30에 나타낸 본 발명의 측면에서, 유체 채널 (3003)은 포크형 전극 (3001 및 3002)과 전기 접촉한다. 채널과 전극의 접촉점은 떨어져 있으며, 이에 의해 전기장이 존재하는 채널에서 세그먼트를 생성한다. 분리 채널 (3004)은 포크형 전극의 접촉점 사이의 세그먼트의 한 지점에서 유체 채널 (3003)과 교차한다. 반대 전하의 다른 전극은 분리 채널과 전기 접촉하게 놓인다. 이러한 방법으로, 전압이 분리 채널을 통해 가해진다.
도 62는 분리 채널 (6011)과 맞물린 샘플 채널 (6005) (또한 로딩 채널이라고 지칭됨)에 연결된 샘플 공급원 (6009)을 나타낸다. 분리 채널에 전기장을 가하기 위해 2개의 전극 (6003 및 6001)이 사용될 수 있다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 샘플 공급원은 샘플 채널 내에서 유체 유동을 추진하는데 사용되는 마이크로칩 내의 MOVe 펌프를 통해 통과할 수 있다. 샘플 채널은 마이크로유체 채널 또는 주입 배관일 수 있다. 주입 배관은 가요성 배관 또는 다른 가요성 커넥터일 수 있다. 가요성 배관의 예로는 폴리테트라플루오로에틸렌 배관 또는 규소 배관이 포함된다. 또한, 가요성 커넥터는 마이크로칩과 상호접촉된 다른 카트리지에 연결할 수 있다. 별법으로, 가요성 커넥터는 가요성 커넥터로부터 유래된 카트리지로 돌아갈 수 있다. 분리 채널은 마이크로유체 채널, 모세관 배관 또는 모세관 전기영동 배관일 수 있다. 모세관 배관은 약 150 내지 500 마이크로미터의 외부 직경 및 약 10 내지 100 마이크로미터의 내부 직경을 가질 수 있다. 모세관은 폴리이미드 또는 폴리테트라플루오로에틸렌 클래드일 수 있다. 모세관은 약 2 내지 100 cm 길이일 수 있다. 모세관은 먼저 주입 배관으로 홀을 드릴링한 후 가요성 배관으로 모세관을 삽입함으로써 주입 배관 또는 가요성 배관에 맞물릴 수 있다. 별법으로, 모세관은 가요성 배관을 예비드릴링하지 않고 가요성 배관으로 삽입될 수 있다.
2개의 전극 중 하나, 예를 들어 전극 (6003)은 캐쏘드일 수 있고, 다른 전극, 예를 들어 (6001)은 애노드일 수 있다. 캐쏘드는 임의의 캐쏘드, 예컨대 본원에 기재된 포크형 캐쏘드일 수 있다. 애노드는 당업자에게 공지된 임의의 장치를 사용하여 분리 채널에 연결될 수 있다. 예를 들어, 분리 채널은 금속성 전극일 수 있는 애노드와 전기 접촉하는 업처치 피팅에 의해 저장소에 결합될 수 있다.
본 발명의 몇몇 실시양태에서, 안정화 구성성분 (도 63에서 분리 모세관 및 주입 배관의 교차점에 나타냄)은 분리 모세관과 주입 배관 사이의 연결부를 일렬로 정렬하고/거나 밀봉하고/거나 보호하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 다수의 주입 배관은 안정화 구성성분을 사용하여 다수의 분리 모세관과 일렬로 정렬된다. 도 64에 나타낸 바와 같이, 안정화 구성성분은 4개의 주입 배관 (도면에 수직 배관으로 나타냄)을 보유하고, 4개의 분리 모세관 (나타내지 않음)과의 연결부를 안정화시킬 수 있다.
도 62의 패널 1 내지 6은 샘플을 분리 채널로 주입하는 공정을 나타낸다. 패널 1에서, 샘플 채널 (6005)에 샘플이 존재하지 않는다. 패널 2에서, 샘플 공급원 (6009)으로부터 샘플 채널에 진입하는 샘플을 나타낸다. 샘플이 샘플 채널 아래로 이동하기 때문에, 샘플이 분리 모세관과 교차한다 (패널 3에 나타냄). 샘플에 대한 상류 및 하류에서 기체의 볼루스에 의해 샘플을 단리할 수 있다. 샘플이 분리 채널에 인접하면, 전기장 (25 내지 500 V/cm일 수 있음)이 제1 전극 (6003) (캐쏘드 또는 포크형 캐쏘드일 수 있음)과 제2 전극 (6001) (애노드일 수 있음) 사이에 가해진다. 전기영동 완충액 (샘플 공급원으로부터 샘플 채널로 진입하는 것으로 나타냄)이 또한 샘플 채널에 진입할 수 있다 (패널 3에 나타냄). 애노드와 캐쏘드 사이의 전위 및/또는 전류는 샘플 채널과 분리 채널 사이의 접합부에 의해 공기 볼루스가 통과할 때 강하할 수 있으며, 이는 분리 채널로의 공기의 주입을 감소시키거나 방지한다. 샘플 및/또는 전기영동 완충액이 분리 채널에 인접하는 것을 확인하기 위해 전위 및/또는 전류 강하를 검출할 수 있다. 전기영동 완충액이 분리 채널에 인접하면 (패널 5에 나타냄), 애노드와 캐쏘드 사이의 전류 및/또는 전압 강하가 증가될 수 있다. 이는 전기영동 완충액이 고성능 분리를 위한 이온을 제공하기 때문에, 패널 6에 나타낸 바와 같이 분리 채널 내의 분석물질의 분리를 허용할 수 있다.
FASS는 낮은 전도성의 구역에 의해 유발된 전기장의 증가를 이용하여, 샘플 구역에서 분석물질 이동성을 증가시키고 더 낮은 이동성의 구역의 경계면에서 (즉, 분리 매트릭스에서) 분석물질을 농축시키는 크로마토그래피 기술이다. 이 방식으로 주입기를 실행시키는 순 효과는 도 31에서 볼 수 있다. 샘플 플러그 길이 (본원에서 적재라고 지칭됨)의 유의한 감소가 관찰될 수 있다.
주입기가 완충액으로 충전된 후 (점선), 경계면을 쓸면서 분리 중합체가 로딩된다 (실선). 샘플 채널 (수평 채널)이 낮은 이온 세기 매질 중 샘플 반응 생성물로 충전된다. 이는 샘플 적재를 허용하고, 중요하게는 샘플 주입 플러그 크기를 감소시킨다. 이는 왼쪽 패널의 모든 중합체 주입과 비교하여 도 31의 오른쪽의 5개의 프레임에서 보여진다. 완충액 희석이 증가하고 이온 세기가 감소하기 때문에, 이온 세기 및 적재의 효과가 왼쪽 두번째로부터 오른쪽으로의 이미지에서 보여진다. 샘플 플러그는 대략 300 마이크로미터로부터 100 마이크로미터 미만으로 좁아진다.
한 실시양태에서, STR 분석을 위한 주입 공정은 다음과 같다:
마이크로유체 채널이 완충액으로 충전될 수 있다.
완충액이 샘플 채널을 가로질러 당겨지면서 분리 채널이 겔로 충전될 수 있으며, 그러므로 분리 채널 및 샘플 채널에 의해 형성된 단면으로부터 분리 중합체를 쓸어내린다.
STR 증폭된 샘플 (탈염되고 비드 상에 포획됨)이 마이크로칩 (500)에서 포획되고, 크기 표준을 함유하는 낮은 전도성 유체 (물)에서 용리되고, MOVe 기술에 의해 샘플 채널로 펌핑될 수 있다.
샘플 및 폐기물 암에 대한 "후진력" 전압으로 캐쏘드 및 애노드를 가로질러 전기장을 적용하여, 샘플을 분리 채널로 추진할 수 있으며, 여기서 샘플은 분리 중합체의 헤드에서 적재된다.
샘플이 주입되기 때문에, 샘플 채널의 전도성은 단일 단계 주입을 제공하는 캐쏘드 암에서 완충액과 신속하게 평형화될 수 있다.
MOVe 제어된 포크형 캐쏘드 주입기 설계 (도 32)는 마이크로칩 채널에서 DNA 분리를 위해 최적화될 수 있다. 상기 기재된 FASS 이외에, 독특한 집적된 주입기 설계는 또한 샘플을 탈염시키고 농축하기 위한 자성 비드 기술의 사용을 용이하게 하는 MOVe 펌핑 시스템을 혼입한다.
정제된 STR 증폭 생성물은 자성 비드로부터 용리되고, 열 변성되고, 포크형 캐쏘드 주입기의 로딩 채널을 통해 펌핑된다. 중합체 컬럼의 헤드에서 FASS 주입을 촉진하기 위해 전압 요법이 적용되고, 중합체 충전된 마이크로-채널에서 DNA 분리가 수행된다 (도 33). 도 33에서, 사진은 STR 샘플 주입 메카니즘을 예시하기 위해 주입기에서의 염료의 이동을 나타낸다. 주입이 개시되는 경우 전기장 증폭된 적재가 중합체 헤드에서 발생한다.
별법으로, 포크형 전극 또는 캐쏘드는 도 60에서 나타낸 바와 같이 2개의 금속성 도체일 수 있다. 도 60에 나타낸 바와 같은 분석될 샘플을 위한 유체 통로는 로딩 채널을 따라 존재할 수 있다. 샘플의 위치가 분리 채널에 인접한 경우, 포크형 전극은 본원에 기재된 바와 같이 샘플을 분리 채널로 주입하는데 사용될 수 있다. 샘플 채널 내의 물질의 전도도는 분리 중합체일 수 있는 분리 채널 내의 물질의 전도도보다 낮을 수 있다. 전도도의 차이는 전기장이 포크형 전극 (캐쏘드일 수 있음) 및 하류 전극 (애노드일 수 있음)을 통해 가해지는 경우 샘플 적재를 유발할 수 있다. 포크형 전극 및 하류 전극의 극성은 포크형 캐쏘드가 애노드이고 하류 전극이 캐쏘드가 되도록 역전될 수 있다.
본 발명의 몇몇 실시양태에서, 분리 채널에 가해진 전기장의 손실을 야기할 수 있는 분리 채널로의 기체의 주입 또는 샘플 로딩 채널 내의 버블 형성을 감소시키기 위해 추가 전극이 사용될 수 있다. 분리 채널로의 기체의 주입 또는 샘플 로딩 채널 내의 버블 형성은 분석물질의 일관성없는 분리를 초래할 수 있고, 분리 채널에 전기장을 가하기 위해 사용된 애노드와 캐쏘드 사이의 일관성없는 전류에 의해 검출될 수 있다. 분리 채널로의 기체 또는 버블의 주입을 우회하거나 감소시키기 위한 추가 전극의 사용은 도 61에 나타낸다. 추가 전극은 단일 와이어 실행 전극 또는 캐뉼라형 실행 전극일 수 있다. 캐뉼라형 실행 전극의 증가된 표면적 및/또는 더 큰 내부 직경은 분리 채널로의 버블 형성 또는 차단 및/또는 주입을 유의하게 감소시킬 수 있다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 캐뉼라형 실행 전극을 위해 사용되는 캐뉼라는 약 1/64, 1/32, 1/16, 1/8 또는 1/4 인치 이상의 내부 직경을 갖는다.
V. mRNA 증폭
본 발명의 장치는 마이크로어레이 샘플 제조 공정을 위해 사용될 수 있다. 유전자 발현 마이크로어레이는 세포 전령 RNA (mRNA) 수준을 모니터링한다. 그러나, mRNA는 세포의 총 RNA의 오직 1 내지 3%를 구성할 수 있다. 세포 RNA의 대부분은 리보솜 RNA (rRNA)이고, 이들 분자는 마이크로어레이 프로브로의 혼성화를 위해 mRNA와 경쟁함으로써 mRNA 분석을 방해할 수 있다. 본원에 기재된 장치, 예를 들어 LAMP, TLAD (에버윈(Eberwine)) 및 MDA에 의해 임의의 mRNA 증폭 방법이 수행될 수 있다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 등온 mRNA 증폭 방법은 본원에 기재된 장치를 사용하여 수행될 수 있다. 다른 실시양태에서, 열 순환은 PCR 또는 순환 서열분석을 달성하기 위해 수행될 수 있다.
에버윈 mRNA 증폭 절차는 증폭을 위해 폴리아데닐화된 mRNA (polyA+ mRNA)를 특이적으로 표적으로 하여 rRNA 간섭을 실제로 제거한다. 이러한 특징은 비효율적이고 시간-소모적이고 고가의 공정일 수 있는 총 RNA로부터 mRNA를 예비정제하는 것에 대한 임의의 필요성을 제거한다. 또한, 마이크로어레이 혼성화에서 이용가능한 표적 RNA (즉, 증폭된 mRNA 또는 aRNA)의 양을 크게 증가시킴으로써, mRNA 증폭은 훨씬 더 작은 샘플 (세포수가 매우 적음)을 분석할 수 있게 한다. 이는 마이크로어레이 분석에서 필요한 상대적으로 많은 양 (전형적으로 15 ug)의 표적 RNA를 종종 얻기 힘들기 때문에 유용할 수 있다. 또한, 이는 세포를 매우 소량 함유하는 샘플, 예를 들어 미세 바늘 흡입 (FNA) 또는 레이져 포획 미세절제 (LCM)로부터 유래된 샘플을 분석하는 많은 중요한 임상 진단 적용에서 필수적일 수 있다.
상대적 mRNA 존재 수준을 변화시키는 임의의 공정은 정확한 유전자 발현 프로파일링을 잠재적으로 방해할 수 있다. 에버윈 증폭 절차의 중요한 측면은 PCR과 같은 지수 증폭 방법보다 mRNA 집단으로 치우치는 경향이 적을 수 있는 선형 증폭 반응을 사용한다는 것이다.
본래 에버윈 프로토콜은 암비온(Ambion)과 같은 매각인에 의해 합리화되고 단순화되었다. 도 44에 나타낸 바와 같이, 암비온 절차는 3개의 이원 (2개의 구성성분) 첨가, 이어서 RNA 정제 공정을 포함한다. 각 이원 첨가에 이어서, 도 44에 나타낸 바와 같이 특정 온도에서의 인큐베이션이 따라올 수 있다. 초기 역전사 (RT) 반응은 3개의 입력 (프라이머, 총 RNA 및 역전사효소 [RT] 믹스)을 가질 수 있으나, 총 RNA 및 프라이머는 편리하게는 예비혼합될 수 있다. 이러한 제1 반응을 위한 전형적인 부피는 5 ul RNA+프라이머 5 ul RT 믹스일 수 있다. 오직 mRNA가 올리고 dT 프라이머로 혼성화되고, DNA로 전사된다. 제2-가닥 반응은 제2-가닥 믹스 20 ul의 첨가에 의해 개시될 수 있고, 최종 T7 증폭 반응은 T7 믹스 30 ul의 첨가에 의해 개시될 수 있다. 합성된 RNA는 바이오틴-표지 리보뉴클레오티드의 혼입에 의해 이 단계에서 표지될 수 있다. 믹스들은 지정된 효소와 함께 완충액 (트리스(Tris)), 일가 및 이가 염 (KCl, NaCl, MgCl2), 뉴클레오티드 및 DTT를 함유한다. 전형적으로, 효소는 사용 직전에 농축된 믹스와 예비혼합될 수 있다.
합성 후, aRNA는 효소, 완충액, 염, 비혼입된 뉴클레오티드, 피로포스페이트 등을 제거하기 위해 정제될 수 있다. 정제는 전형적으로 구아니디늄 히드로클로라이드 (GuHCl) 또는 티오시아네이트 (GuSCN)와 같은 카오트로프 염의 존재하에 실리카 막 또는 비드와 aRNA의 회합을 이용하는 상업적 키트에 따른다. 결합 후, 실리카는 70% 에탄올 (EtOH)로 세척되고, 건조되고, aRNA는 물로 용리된다.
이들 단계는 각각 본원에 기재된 장치에서 수행될 수 있다 (미국 특허 가출원 제61/140,602호 참조). 예를 들어, 시약 및 샘플은 카트리지 내의 포트를 통해 공급된 후, 마이크로유체 마이크로칩으로 전달될 수 있다. 온-칩 밸브는 시약 및 샘플을 채널을 통해 카트리지 및 마이크로유체 마이크로칩 내의 챔버 및 저장소로 펌핑하는데 사용될 수 있다. 온도 제어는 내부 또는 외부 가열 및 냉각 장치를 사용하여 달성될 수 있다. 반응 생성물은 추가 조작을 위해 카트리지의 생성물 유출구 포트로 이동될 수 있다. 별법으로, 반응 생성물은 본 발명의 장치를 사용하여 정제되거나 분리될 수 있다.
VI. 분리 및 세정
다양한 분리가 본원에 기재된 장치를 사용하여 수행될 수 있다. 이들 분리에는 크로마토그래피, 친화성, 정전기, 소수성, 이온-교환, 자성, 드래그-기재 및 밀도-기재 분리가 포함된다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 친화성 또는 이온-교환 상호작용은 비드와 같은 고체상 물질에 물질을 결합시키는데 사용된다. 비드는 당업자에게 공지된 임의의 방법을 사용하여 유체 용액으로부터 분리될 수 있다.
자기 분리는 상자성 비드 및 자기장을 사용하는 기계론적으로 단순화된 포맷을 사용하여 단일 단계로 물질을 포획하고 농축시키는데 사용될 수 있다. 비드는 특이적 표적 항원, 단백질, 탄수화물, 독소, 핵산, 세포, 바이러스 및 포자를 포획하고, 농축시키고 이어서 정제하는데 사용될 수 있다. 비드는 특이적 친화성 시약, 전형적으로 표적에 결합하는 항체, 아프타머 또는 DNA를 가질 수 있다. 별법으로, 정전기 또는 이온-짝짓기 또는 염-브릿지 상호작용이 표적에 결합시킬 수 있다. 비드는 외부 자기장의 존재하에 오직 자성인 상자성 비드일 수 있다. 별법으로, 비드는 영구 자석을 함유할 수 있다. 비드는 복잡한 샘플, 예컨대 에어로졸, 액체, 체액, 추출물 또는 음식에 첨가될 수 있다. 표적 물질, 예컨대 DNA의 결합 후 (또는 전), 자기장의 적용에 의해 비드가 포획될 수 있다. 결합되지 않은 또는 느슨하게 결합된 물질은 상용성 완충액으로 세척함으로써 제거되며, 이는 표적을 본래 샘플 내의 다른 원치않는 물질로부터 정제한다. 비드는 작을 수 있고 (nm 내지 um), 높은 수준의 표적에 결합할 수 있다. 자기력에 의해 비드가 농축되는 경우, 비드는 nL-uL 부피의 비드층을 형성할 수 있으며, 그러므로 표적을 농축시키면서 동시에 정제시킨다. 정제되고 농축된 표적을 편리하게는 온-비드 도중 수송하거나, 변성하거나, 용해하거나 또는 분석할 수 있거나, 또는 추가 샘플 제조 또는 분석을 위해 비드를 용리시킬 수 있다.
분리는 음식, 체액 및 다른 매트릭스 내의 미생물의 검출을 포함하는 많은 적용에서 광범위하게 사용된다. 상자성 비드는 용이하게 혼압되고 조작될 수 있으며, 마이크로규모 및 마이크로유체 적용으로 개질가능하다. 이러한 기술은 거시적 규모-내지-마이크로규모 경계면으로 우수한 해결책을 제공한다: 비드는 거시적 규모에서 샘플을 정제한 후, 마이크로유체 또는 나노유체 플랫폼으로의 도입을 위해 나노규모 (수백 nL)로 농축시킬 수 있다. 자기 분리는 실시간 PCR, 전기화학발광, 자기력 식별, 자기영동, 모세관 전기영동, 자기장-유동 분리, 또는 당업자에게 익히 공지된 다른 분리 방법 전에 상류 정제 단계로서 사용될 수 있다.
본 발명의 장치는 자성 비드의 사용을 수용할 수 있다. 예를 들어, 비드 또는 비드 슬러리는 카트리지의 포트로 공급될 수 있다. 비드는 펌핑, 자기장 또는 외부 믹서를 사용하여 카트리지 내의 용액에서 혼합되거나 현탁될 수 있다. 그 후, 비드는 마이크로유체 장치 또는 카트리지 내의 원하는 챔버 또는 저장소로 펌핑될 수 있다. 비드는 자기장을 사용하여 챔버 내에서 포획될 수 있다. 용액 중의 비드는 용액이 자기장을 따라 움직이기 때문에 포획될 수 있거나, 또는 비드는 정체 용액에서 포획될 수 있다.
카트리지의 사용 방법을 예시하기 위해 여러 실시예가 하기 기재되어 있다. 제1 실시예는 샘플의 정제를 위한 상자성 비드에 의한 협측 면봉으로부터의 핵산의 가공, 이어서 PCR 증폭 및 PCR 생성물의 비드 정제를 기재한다. 제2 실시예는 비드에 커플링된 결합 잔기를 사용하여 세포, 단백질 또는 다른 항원성 물질을 정제하기 위한 면역자기 분리의 수행을 기재한다. 제3 실시예는 서열분석 기술, 예컨대 합성에 의한 서열분석, 혼성화에 의한 서열분석 또는 라이게이션에 의한 서열분석을 위한 샘플의 제조를 위한 분자 생물학의 수행을 기재한다. 많은 상이한 화학 및 생화학이 본 발명에서 사용될 수 있다는 것을 당업자는 알 것이다. 이들에는 효소 반응, 겔 상의 정제, 모놀리스, 비드, 패킹층, 표면 반응, 분자 생물학, 및 다른 화학적 및 생화학 반응이 포함되나 이에 제한되지 않는다.

<실시예>

실시예 1: 핵산 정제를 위한 카트리지의 작동

본 실시예는 마이크로칩에 맞물린 카트리지를 포함하는 장치의 사용에 관한 것이다. 숫자는 도 5의 회로 설계를 갖는 마이크로칩에 맞물린 도 3 및 도 4의 카트리지를 지칭한다. 이 서브-어셈블리는 또한 도 6의 기계 내의 유체적으로 연결된 다른 서브-어셈블리일 수 있다. 참고로, 마이크로칩과 맞물린 카트리지는 또한 도 40 및 도 59에 나타낸다.

유전자형분석, 동정, 법의학, 유전자 발현, 유전자 변형, 마이크로RNA 분석, 리보타이핑, 진단학 또는 치료학을 포함하나 이에 제한되지 않는 많은 목적을 위해 다양한 매트릭스로부터 핵산을 정제할 수 있다. 입력 샘플은 고체, 면봉, 액체, 슬러리, 에어로졸 또는 기체일 수 있다.

분자 진단학 및 법의학의 경우, 면봉을 통상적으로 사용한다. 토출가능한 팁을 갖는 면봉 및 도 4의 연결부 (7)에 부착된 주사기로 토출된 면봉을 사용하여 협측 면봉을 취할 수 있었다. 도 4의 연결부 (5)는 실물 크기 밸브의 개방에 의해 또는 압력 하에 또는 진공에 의해 이동되는 시약을 갖는 MOVe 밸브의 개방에 의해 다수의 시약으로부터 단일 시약을 선택할 수 있는 시약 매니폴드로 배관 또는 모세관에 의해 인도하였다. 도 4의 마이크로칩 (2) 상의 MOVe 또는 다른 마이크로펌프는 또한 유체 또는 기체를 이동시킬 수 있었다.

한 실시양태에서, 포트 (7)로 삽입된 주사기 내에서 가열된 카오트로프제 및/또는 다른 상용규격품 (COTS) 화학물질을 갖는 완충액을 사용하여 면봉 내의 인간 및 다른 세포를 먼저 용해시켰다. 핵산을 비드로 흡착시키기 위해 저장소로부터 상자성 비드가 첨가된 DNA 단리 챔버 (도 4 #3)로 용해물을 수송하였다. 그 후, 완충액을 사용하여 자동으로 세척하는 단리 챔버의 측면 상으로 비드를 포획하기 위해 이동가능한 자석을 구동시켰다. 그 후, 다중 PCR을 수행하는 작은 직경 튜브 (250)을 통해 비드에 여전히 결합된 정제된 DNA를 펌핑하였다. 규정 데브링크(DevLink)™ 소프트웨어는 완전 공정을 자동화하였다. 데브링크 소프트웨어는 다른 소프트웨어 개발 접근법보다 더 간단하고, 더 융통성이 있고, 실행하기 더 신속한 표준화된 자동화 설계에서 소통 및 명령 프로토콜 세트를 정의한다. 데브링크 이행 프레임워크는 다수의 작동 시스템, 개발 언어 및 소통 프로토콜에 미치는 핵심 기술을 기초로 한다. 소프트웨어 추진기는 시스템의 개별 스마트 구성성분을 감싸서, 전형적인 드노보 시스템 소프트웨어 개발에 필요한 시간을 크게 감소시켰다. 이는 COM- 또는 .NET-기재인 다수의 시스템 모듈 (펌프, 밸브, 온도 제어기, I/O 제어기 등)의 작동을 집적하는 것을 상대적으로 간단하게 하였다. 데브링크는 생성물 방출 및 유지를 통한 프로토타이핑을 위한 전문가용 소프트웨어 개발 시스템을 제공한다.

DNA 증폭은 샘플의 양성 확인에 유용하나, DNA 증폭 반응에 대해 억제성인 화합물을 함유하는 다양한 기질 및 매트릭스로부터 미생물을 얻을 수 있었다. 원래의 샘플은 대개 헴, 금속 이온, 흄산 및 풀브산, 킬레이터, DNase, 프로테아제 및 곰팡이와 같은 억제제를 포함할 수 있는 복잡한 혼합물이다. IMS에 의한 샘플 매트릭스로부터의 표적 유기체 및 독소의 초기 단리는 이들 억제제의 대부분을 제거해야 하나, 성공적인 증폭을 방해하지 않도록 용해된 세포 구성성분 및 용해제를 또한 핵산 샘플로부터 제거하거나 희석할 필요가 있을 수 있다.

한 실시양태에서, 작은 부피 핵산 정제를 사용하였다. 이들 정제 방법은 광범위한 샘플, 예컨대 혈액, 에어로졸, 협측 면봉으로 사용할 수 있었다. 다양한 샘플 공급원으로부터 DNA를 정제하기 위해 개시된 장치에서 상자성 비드를 사용할 수 있었다. 한 실시양태에서, 마이크로규모 반응에서 서열분석을 위한 핵산 생성물을 정제하기 위한 자성 비드 및 시약을 사용하여 핵산을 서열분석하기 위해 마이크로유체 마이크로칩을 사용할 수 있었다. 한 실시양태에서, 마이크로유체 마이크로칩은 24-채널 마이크로유체 마이크로칩이었다.

한 실시양태에서, 카르복실화된 자성 비드 상에서 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)-기재 핵산 정제를 사용하였다. 이러한 PEG-촉진 공정은 상류 면역자기 분리 (IMS) 포획된 샘플로부터 80% 초과의 수율을 생성할 수 있었다. 만능 샘플 제조 모듈 (USPM)의 개발은 도 21 또는 도 16에 나타낸 장치와 같은 카트리지를 함유하는 장치로 PEG-기재 핵산 정제를 유도하는 것에 부분적으로 관여할 수 있었다. 다른 실시양태에서, 아겐코트(Agencourt) 오라퓨어(Orapure) 또는 프로메가(Promega) DNA IQ 화학을 본 발명의 장치와 함께 사용하였다.

비드 분배 및 전달.

핵산을 정제하기 위해, 상이한 표면 화학을 갖는 상자성 비드를 시약 용기에서 혼합할 수 있었다. 그 후, 압력을 가하여, 시약을 연결부 (5)로 보냈다. 개방이라고 언급되지 않는 한 MOVe 마이크로밸브 또는 다른 밸브를 폐쇄할 수 있었다. 상자성 비드를 반응 챔버 (3)로 이동시키기 위해 마이크로밸브 (180 및 150)를 개방하였다. 연결부 (5)를 통해 접합부 (190) 및 마이크로채널 (191)로 인도하는 채널 (15)로 비드를 이동시켰다. 마이크로밸브 (180 및 150)를 개방하고, 마이크로밸브 (200 및 170) 및 다른 마이크로밸브를 폐쇄하였기 때문에, 개방된 마이크로유체 연결부는 마이크로채널 (191)로부터 마이크로밸브 (180)을 통해 마이크로채널 (181)로 마이크로칩 (152)를 통해 개방된 마이크로밸브 (150)로, 및 마이크로칩 (151)을 통해 접합부 (120)로 이어진다. 접합부 (120)는 원뿔부 (13) 및 챔버 (3)로 인도하고, 이를 비드로 충전할 수 있었다. 시약 밸브 및 마이크로밸브의 개방의 시간을 조정하거나 또는 마이크로칩 또는 카트리지에 연결된 샘플 루프를 충전하고 비움으로써 챔버 (3)에 공급된 비드의 부피를 제어할 수 있었다.

아겐코트 (미국 매사추세츠주 월섬 소재)로부터의 오라퓨어 및 프로메가 (미국 위스콘신주 매디슨 소재)로부터의 DNA IQ를 포함하나 이에 제한되지 않는 상업적 비드 기재 화학을 개시된 시스템에서 사용할 수 있었다. DNA IQ는 실리카 비드 및 카오트로프 화학의 한 예인 반면, 오라퓨어는 카르복실화된 비드 표면 및 SPRI 화학을 사용한다. 올리고뉴클레오티드, 봉쇄형 핵산, 축퇴 염기, 합성 염기, 형태, 핵산 구조를 갖는 비드 또는 다른 혼성화 및 특이적 포획 방법을 포함하나 이에 제한되지 않는, 상자성 비드 또는 핵산을 가공하기 위한 화학의 다른 실시양태를 개시된 시스템과 함께 사용할 수 있었다.

비드로 챔버 (3)를 충전함.

오라퓨어 또는 DNA IQ 비드의 경우, 150 마이크로리터 샘플 루프 (630 또는 631)의 3개의 충전물을 사용하여 450 마이크로리터를 챔버 (3)로 이동시킬 수 있었다. 그 후, 구동기 (310)에 부착된 이동가능한 자석 (300)을 (3)의 측면 가까이 카트리지 (1)를 향해 이동시켜, 챔버 (3)의 측면으로 비드를 끌어당길 수 있었다. 특정 적용에 적절한 자기장을 생성하기 위해 자석 크기 및 배향을 조절할 수 있었다. 그 후, 마이크로밸브 (180, 150 및 110)가 개방된 상태에서 시약 매니폴드를 통해 가압 공기를 적용할 수 있었다. 마이크로밸브 (110)의 개구부는 접합부 (120) 및 마이크로채널 (121 및 101)을 통해 시약 매니폴드로 연결하는 접합부 (190)로부터, 채널 (14)을 통해 연결부 (4) 및 폐기물로 인도하는 연결부 (100)로 연결하였다. 공기는 회로를 통해 임의의 잔여 액체를 이동시킬 수 있었다. 또한, 비드를 건조시키거나, 용매를 휘발시키거나 버블-가능 혼합 (본원에 기재된)을 위해 공기 또는 다른 기체를 사용할 수 있었다.

챔버 (3)를 통한 기체의 버블링.

마이크로밸브 (180, 150 및 220)가 개방되고, 모든 다른 마이크로밸브가 폐쇄되면, 압력은 챔버 (3)을 통해 채널 (9)로, 및 마이크로채널 (211 및 221)을 통해 채널 (19) 아래로 접합부 (210)로, 개방 마이크로밸브 (220) 및 마이크로채널 (231)을 통해 접합부 (230)으로, 채널 (16)을 통해 환기될 수 있는 연결부 (6)로 공기를 가압할 수 있었다. 이러한 순서는 챔버 (3)을 통해 공기 또는 다른 기체를 버블링할 수 있고, 챔버 (3)에서 반응물을 혼합하거나 또는 기체 상을 변화시키기 위해 사용할 수 있었다.

챔버 (3)으로부터 폐기물로의 액체 및 비드의 이동.

반응 챔버 (3) 또는 임의의 다른 위치로부터 폐기물로 액체 및 비드를 이동시킬 수 있었다. 비드를 세척하고, 채널을 플러슁하고, 액체 또는 비드를 폐기물로 이동시키기 위해 이를 사용할 수 있었다. 마이크로밸브 (220 및 110)가 개방되고 모든 다른 마이크로밸브가 폐쇄된 상태에서 연결부 (6)에 압력을 가한 경우, 압력은 채널 (16)을 통해 접합부 (230)으로 마이크로채널 (231)로, 개방 마이크로밸브 (220) 및 마이크로채널 (222 및 221)을 통해, 접합부 (210) 및 채널 (19 및 9)를 통해 반응 챔버 (3)으로, 및 접합부 (120)을 통해, 마이크로채널 (121), 개방 마이크로밸브 (110), 마이크로채널 (101), 채널 (14)를 통해, 및 연결부 (4)로 공기를 가압할 수 있었다.

연결부 (6)이 환기부이면, 기압의 어떠한 추가 제어도 없이 진공을 연결부 (4)에 가함으로써 동등한 효과를 얻을 수 있었다. 기압 또는 진공은 챔버 (3) 내의 임의의 액체를 폐기물 연결부 (4)로 이동시킬 수 있었다. 자석 (300)이 챔버 (3)에 인접한 경우, 상자성 비드는 챔버 (3)의 측면 상에 잔류할 수 있고, 그 결과 액체가 제거되었다. 자석 (300)이 챔버 (3)로부터 충분히 멀리 있는 경우, 상자성 비드는 챔버 (3)의 측면 상에 잔류할 수 없고, 그 결과 액체 및 비드가 제거되었다.

상자성 비드를 세정하기 위해, 자석 (300)에 의해 챔버 (3)의 측면으로 비드를 끌어당기고 (도 6 참조), 액체를 폐기물로 제거하였다. 완충액 450 마이크로리터를 시약 매니폴드로부터 분배하고, 마이크로밸브 (180 및 150)의 개방에 의해 챔버 (3)에 첨가할 수 있었다. 필요하다면 비드를 방출시킨 후, 자석 (300)을 이동시켜 재포획하고, 이어서 액체를 제거할 수 있었다. 샘플을 가공할 준비가 된 비드를 제조하기 위해 이를 총 3회 반복하였다.

면봉 상의 세포로부터 핵산의 용해 및 추출.

연결부 (7)에 삽입된 주사기 원통부에 면봉을 로딩한 후, 마이크로밸브 (180 및 170)가 개방된 상태로 시약 연결부 (5)를 통해 용해 완충액을 첨가함으로써 용해시킬 수 있었다. 몇몇 실시양태에서, 오라퓨어 또는 DNA IQ 화학을 사용하였다.

용해된 세포 물질의 챔버 (3)로의 이동 및 비드와의 혼합.

주사기에 압력을 가함으로써 또는 환기부 (6)에 진공을 가함으로써 연결부 (7)에 연결된 주사기 내의 물질을 챔버 (3)로 이동시킬 수 있었다. 진공을 사용한 경우, 마이크로밸브 (170, 150 및 220)를 개방하였다. 물질을 연결부 (7)로부터 챔버 (3)로 밀어내기 위해 진공은 마이크로채널 (231, 221, 211) 및 채널 (9 및 19)를 통해, 및 챔버 (3), 마이크로채널 (151, 152, 171 및 161)을 통해 연결하였다. 챔버 (3)에 상자성 비드를 로딩하고 세정한 경우, 용해된 샘플 물질은 자석이 멀리 위치된 챔버 (3)에서 비드와 혼합되었다.

비드 상의 핵산의 정제.

그 후, 상자성 비드를 용해된 샘플과 함께 인큐베이션하였다. 계속적 공기 또는 기체 유동으로 혼합을 도울 수 있었다. 그 후, 자석 (300)을 폐쇄된 위치로 이동시키고, 챔버 (3)의 벽 상의 비드를 포획하였다. 그 후, 샘플 용해물을 챔버 (3)로부터 폐기물로 제거하고, 오라퓨어 화학 또는 DNA IQ 화학에 대한 제조자의 설명서에 따라 큰 부피의 세척 용액을 첨가할 수 있었다. 비드 상의 샘플 구성성분을 이제 정제하였고, 카트리지 내의 반응을 위해 준비하거나 또는 샘플 생성물 연결부로 방출하였다. 한 실시양태에서, 샘플로부터의 핵산 구성성분을 풍부하게 하기 위해 비드를 사용하였다.

샘플 생성물 연결부 (8)를 통한 샘플의 배출.

마이크로밸브 (180, 150 및 130)를 개방한 상태에서 시약 연결부 (5)에 압력을 가함으로써 비드 상의 정제된 샘플 구성성분을 연결부 (8)로 이동시킬 수 있었다. 한 실시양태에서, 연결부 (8)를 반응 채널 (250), 예컨대 c-플렉스 배관 (콜 파머(Cole Parmer))과 연결하고, 반응 채널에서 추가 반응을 수행하였다.

STR 마커의 다중 PCR 증폭.

PCR 증폭에 의해 DNA 증폭을 수행할 수 있었다. 본 발명은 PCR 반응 뿐만 아니라 많은 다른 DNA 증폭 및 변형 반응을 가능하게 하였다. 챔버 (3)에서, 튜브 (250) (도 3, 도 4, 도 6)일 수 있는 연결부 (8)에 부착된 반응 채널 (250)에서, 또는 튜브 (250)에 연결된 마이크로장치 또는 다른 장치에서 반응을 수행할 수 있었다. 이는 열 순환을 포함하는 DNA 반응을 위한 샘플 제조의 유용성을 나타내었다.

반응 채널에서 비드를 함유하는 핵산의 포획.

말단 (252)에 압력을 가하거나 또는 별법으로 진공을 가함으로써 정제된 DNA 출력물을 샘플 생성물 연결부 (8)를 통해 말단 (251)에서 반응 채널 (250)로 이동시켰다. 구동기 (330)는 자석 (320)을 소프트웨어 제어 하에 비드 포획 영역 (340)에 인접한 위치로 이동시켰다. 상이한 크기 및 형상의 고정된 자석 (예컨대, 희토류 자석) 뿐만 아니라 전자석 또는 초전도 자석을 사용할 수 있었다. 비드를 함유하는 용액은 영역 (340)을 통해 이동하기 때문에, 자기장은 반응 채널의 측면으로 비드를 끌어당기고, 이를 제자리에서 유지시켰다. 그 후, 유체를 시약 연결부 (5)를 통해 기압하에 두고, 비드 영역 (340)을 공기 중에 방치하였다.

시약의 첨가 및 반응 영역으로의 샘플의 이동.

기재된 바와 같이 시약 매니폴드로부터 시약을 첨가할 수 있었다. 한 실시양태에서, 반응 채널 (250)의 말단 (252)으로부터 시약을 첨가하였다. 마이크로밸브 (510, 520, 530 및 540)를 포함하는 마이크로유체 마이크로칩 (500)에 말단 (252)을 부착하였다. 임의의 3개의 마이크로밸브 (예컨대 (510, 520 및 530) 또는 (510, 520 및 540))는 펌프를 형성할 수 있었다. 마이크로밸브 (530)은 마이크로채널을 통해 하류 장치 (535)에 연결하고, 이를 시약 저장소로 인도하는 배관에 연결할 수 있었다. 마이크로밸브 (540)은 마이크로채널을 통해 하류 장치 (545)에 연결하고, 이를 시약 저장소로 인도하는 배관에 연결할 수 있었다.

시약 저장소 (600) 내의 매스터 믹스 및 프라이머 (예컨대, 검정-특이적 프라이머 또는 다수의 표적 병원체에 대해 광범위하게 적용가능한 프라이머 세트), 또는 완전 PCR 매스터 믹스, 예컨대 프로메가 (미국 위스콘신주 매디슨 소재)로부터의 파워플렉스 16 또는 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems) (미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재)로부터의 아이덴티필러 또는 미니필러(MiniFiler)를 포함하나 이에 제한되지 않는 반응 믹스 (예컨대, 하나 이상의 DNA 중합효소, dNTP, 완충액 및 염)를, 마이크로밸브 (530, 520 및 510)에 의해 형성된 마이크로펌프에 의해 배관 (610) 및 마이크로채널 (531, 521, 511 및 512)을 통해 반응 채널 (250)의 말단 (252)으로 전달할 수 있었다 (도 6에 나타냄). MOVe 마이크로밸브는 유체를 정교하게 위치시키고, 반응 믹스가 핵산을 포함하는 비드를 접하는 영역 (340)으로 유체를 이동시킬 수 있었다. 반응 채널 (250)의 내부 표면으로부터 비드를 방출하는 구동기 (330)에 의해 자석 (320)을 반응 채널 (250)로부터 멀리 이동시켰다. 마이크로칩 (500) 상의 MOVe 마이크로밸브는 온도 제어된 영역 (350)을 형성하는 반응 채널 (250)의 구역을 갖는 장치 (400)로 비드를 펌핑하였다. 영역 (350)을 등온 온도에서 유지하거나, 열 순환하거나, 또는 당업자에게 익히 공지된 바와 같이 다양하게 할 수 있었다. 영역 (350)은 온도 조절기이거나, 또는 온도 조절기에 열로 커플링될 수 있었다.

도 7은 반응 채널을 열순화시키기 위해 가열 및 냉각을 위한 온도 조절기를 사용하여 열 조절할 수 있는 온도 제어 장치 (400)를 나타낸다. 한 실시양태에서, 온도 조절기는 펠티어 모듈, 적외선 모듈, 마이크로웨이브 모듈, 고온 공기 모듈 또는 광 모듈을 포함하였다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 일정한 온도 대역후 반응 채널 내부로 PCR 반응 샘플을 이동시켰다.

도 9는 카트리지 (1)에서 협측 면봉 샘플로부터 제조되고 도 7에서 온도 제어 장치 (400)를 사용하여 반응 채널 (250)에서 가공된 파워플렉스 16 STR 반응의 증폭을 나타낸다. 표준 조건으로부터 기구 (1000)에 대해 최적화된 Mg로 STR 마커를 증폭시켰다.

온도 제어 장치 (400)는 또한 검출기 (410)를 가질 수 있었다. 검출기는 광학 검출, 예컨대 흡광도, 형광, 화학발광, 영상 및 당업자에게 익히 공지된 다른 양상, 또는 측정, 예컨대 IR, NMR 또는 라만 분광법을 검출할 수 있었다. 검출기는 PCR 반응 샘플 중의 형광 또는 발광 염료를 여기하는데 사용되는 광원을 포함할 수 있고, 광검출기 (예컨대, CCD, CMOS, PMT 또는 다른 광학 검출기)로 여기광을 감지하였다. 한 실시양태에서, 광원은 간섭성 광원, 예컨대 레이져 또는 레이져 다이오드였다. 다른 실시양태에서, 광원은 간섭성 광원, 예컨대 광 방출 다이오드 (LED) 또는 할로겐 광원 또는 수은 램프가 아니었다.

핵산 증폭을 위해, 실시간 PCR는 온도 제어된 영역 (350)에서 튜브 (250)에서 수행되고 검출기 (410)로 검출될 수 있는 핵산 검정 방법의 한 예였다.

온 마이크로칩 반응

배관으로의 이동 이외에, 기구 (1000) (도 6에서 나타냄)는 물질을 마이크로칩으로 이동시킬 수 있었다. 가공을 위한 마이크로유체 장치로의 이 용액의 이동을 촉진하기 위해, 높은 부피 펌핑 및 비드 포획을 위한 큰 MOVe 밸브, 입력 및 출력 모세관과 접속하기 위한 단계별 포트, 시약 도입을 위한 측면 포트 및 1 ㎕ 반응 챔버를 갖도록 마이크로칩을 특정하게 설계하였다. 마이크로칩 세부사항에 대해 도 11, 도 12 및 도 14를 참조한다.

도 11은 마이크로칩 개략도를 나타낸다. 도 11의 왼쪽 도면은 카트리지 및 기구 장치로부터 비드의 도입 및 포획을 도표로 나타낸다. 카트리지로부터 모세관에 의해 큰 펌프 (101) 및 자성 비드 포획 챔버 (103)를 공급하였다. 입력 모세관은 카트리지를 통해 샘플을 첨가하는 곳을 나타낸다. 출력 모세관은 카트리지를 통해 샘플을 제거하는 곳을 나타낸다. 비드를 입력 모세관에 위치시킨 후, 입력 모세관과 자성 비드 포획 챔버 (103) 사이의 밸브의 펌핑에 의해 자성 비드 포획 챔버로 이동시킬 수 있었다. 밸브는 흑색 원 및 맞은편 삼각형에 의해 나타낸다. 비드를 담지하는 용액이 자성 비드 포획 챔버를 통해 유동하기 때문에, 자성 비드를 포획하기 위해 자성 비드 포획 챔버에 인접하게 이동가능한 자석을 위치시킬 수 있었다. 오른쪽 다이어그램은 샘플을 반응 챔버로 이동시킬 때 STR 프리-믹스 내의 비드 및 DNA의 재현탁을 예시한다. 오른쪽 다이어그램에서 2개의 화살표는 STR 프리-믹스 및 DNA를 마이크로칩에 첨가할 수 있는 곳을 나타낸다. 비드의 재현탁을 위한 자성 비드 포획 챔버로 DNA 또는 STR 프리-믹스를 펌핑한 후, 반응 챔버로 펌핑하는데, 화살표에 의해 나타낸 위치와 반응 챔버 사이의 밸브를 사용할 수 있었다.

도 12 및 도 13은 카트리지 장치로부터 이동 후 마이크로칩 상의 비드 포획을 나타낸다. 마이크로칩의 챔버 내에 자기장을 가하도록 마이크로칩에 인접하게 위치된 자석을 사용함으로써 비드 포획을 수행할 수 있었다. 비드의 펌핑 및 포획에 사용할 수 있는 큰 용량 (500 nL) MOVe 밸브를 도 12 및 도 13에 나타낸다. 비드의 포획은 포획된 비드층을 갖는 삽입물에 나타낸다. 도 13에 나타낸 바와 같이, 마이크로칩의 밸브 (1101) 위에 자석 (1103)을 위치시켰다. 유체 채널 (1111 및 1107)을 통해 밸브의 내부 또는 외부로 유동할 수 있는 비드를, 자석에 의해 발휘된 자기장으로 인해 밸브의 벽에 대항하여 포획하였다. 밸브의 유체 챔버와 비교하여 양압 또는 음압을 전달할 수 있는 공압 채널 (1109)에 의해 밸브를 구동하여, 밸브의 엘라스토머층을 상승시키거나 하강시킬 수 있었다.

1 마이크로리터 온 마이크로칩 반응을 양호한 신호 세기 및 상대적으로 양호한 위치 균형으로 성공적으로 실행하였다. 도 17은 동등한 오프 마이크로칩 반응 및 오직 크기 표준을 함유하는 템플릿 비함유 대조군 (NTC)과 비교하여 1 마이크로리터 온 마이크로칩 반응을 사용한 반응의 결과를 나타낸다. 피크는 뉴클레오티드 염기 쌍의 검출을 나타낸다.

비드 상의 반응 생성물의 정제.

한 실시양태에서, 그 후, (201, 212, 211)을 통해 접합부 (210)로, 및 채널 (19 및 9)을 통해 챔버 (3)으로, (131, 141 및 140)을 통해 반응 채널 (250)로 연결하는 통로를 갖는 개방 마이크로밸브 (200 및 130)에 의해 시약 연결부 (5)에 가해진 진공을 사용하여, 비드 상의 반응 생성물을 카트리지 (1)로 이동시킬 수 있었다. 마이크로칩 (500) 상의 마이크로밸브는 진공 및 유동을 조절할 수 있었다. 상기 기재된 바와 같이 제자리에서 세정된 비드로 로딩될 수 있는 챔버 (3)로 반응 생성물을 이동시킬 수 있었다.

비드는 비드 정제, 면역자기 분리, 및 비드, 나노입자, 양자점 또는 다른 유형의 입자와의 반응을 사용하여 친화성 또는 당업자에게 익히 공지된 다른 상호작용을 사용하여 많은 유형의 생체분자를 포획할 수 있었다.

STR 실시예에 계속하여, STR 증폭이 완료된 후, 진공을 사용하여 반응 생성물을 카트리지 (1)로 다시 이동시켰다. 증폭된 STR 생성물을 정제하고, 탈염하고, 협측 면봉으로부터의 DNA의 단리를 위해 장치 상에 존재하는 동일한 오라퓨어 자성 비드를 사용하여 주입 전에 농축시켰다. 이때, 비드를 오직 에탄올과 함께 사용하였고; 면봉 추출을 위해 상기 기재된 바와 같은 PEG/NaCl 용액은 사용하지 않았다.

비드를 큐브 믹스 챔버에 로딩하고, 포획하고, 70% 에탄올로 세정하였다. 그 후, STR 반응물 5 내지 10 ㎕를 순환 대역으로부터 챔버로 다시 끌어당기고, 비드와 접촉시켰다. 전기영동 실행 완충액 (분리 서브시스템에서의 그의 이용율 때문에 선택됨)의 20 ㎕ 추적 용액을 끌어 당겨, 반응 채널 내의 임의의 남은 STR 반응 용액을 청소하고, 100% 에탄올을 첨가하여, 용액을 95% 이하의 총 에탄올 농도로 만들었다.

도 19는 이 방식으로 면봉 추출기에서 제조되고 메가베이스(MegaBACE)에서 분석된 표준 물질에 대한 데이터를 나타낸다. 카트리지 (1)를 사용하여 면봉 추출기로서 배치된 샘플 제조 장치에서 생성물을 오라퓨어 비드로 세정하고, 클린세크(CleanSeq) (아겐코트)로 가공된 수동으로 제조된 대조군을 사용하여 세정된 생성물과 비교하였다. 동일한 공정 수행 오프 장치와 비교하여 약 ~60% 회수율이 관찰되었다. 면봉 추출기 세정된 물질이 샘플을 1:50 내지 1:100 만큼 희석시키는 통상적으로 사용되는 공정과 비교하여 상당히 더 효율적인 주입을 얻는다는 것을 주목해야 한다.

다른 실시양태에서, 증폭후 STR 세정 장치는 STR 반응 프리믹스를 열순환기로 전달하고; 단리된 DNA 비드 포획 도중 샘플을 계량하고; STR 증폭된 생성물에 대해 비드 세정을 수행하고; 희석된 생성물을 캐쏘드로 전달하고; 분리 및 검출 장치 및 샘플 주입 공정의 준비 중에 캐쏘드 어셈블리에 시약을 제공하였다.

4-채널 증폭후 STR 세정 장치는 공압 제어 매니폴드 (도 72) 상에 탑재되고 세정 챔버 (도 71)를 갖는 확대된 유체 매니폴드와 칩 A 마이크로칩 (도 47에 나타냄)을 조합하였다. 아겐코트 클린세크 비드를 세정 챔버에 전달하고, 반응 배관 (250)을 통해 열순환기로부터 세정 챔버로 샘플을 펌핑하고, 에탄올을 첨가하였다. 비드로의 DNA 포획을 촉진하기 위해 공기 버블링에 의해 샘플을 혼합하였다. 장치의 기저에서 자석을 구동시켜, DNA 및 비드가 세정 챔버의 바닥에 대항하여 포획되도록 한 후; 남은 액체를 폐기물로 펌핑하였다. 자석을 장치로부터 멀리 이동시키고, 포름아미드 용액 중 형광으로 표지된 DNA 크기 표준을 함유하는 용리액을 세정 챔버로 펌핑하였다. STR 증폭 생성물을 이 용액에서 용리시키고, 자석을 다시 한번 구동시켜, 정제되고 농축된 샘플 및 크기 표준을 분리 모세관으로 바로 주입가능한 캐쏘드로 펌핑하기 전에 비드를 포획하였다.

칩 A를 사용하는 증폭후 장치의 시험은 이 마이크로칩의 시약 통로 내의 저항의 높은 수준으로 인해 칩 A 마이크로칩을 통한 에탄올의 펌핑 및 프라이밍과 관련된 문제점을 강조하였다. 마이크로칩 설계, 칩 E (도 73)는 채널을 넓히고 3원 MOVe 라우터를 MOVe 마이크로밸브 한 쌍으로 대체함으로써 증폭후 장치의 기능성 및 견고성을 상당히 개선시켰다.

실시예 2: 만능 샘플 제조

이전 실시예는 개시된 기구가 분석을 위해 샘플을 제조하는데 사용될 수 있는 한 실시양태를 예시하였고, STR 증폭의 한 예를 나타내었다. 다른 실시양태는 만능 샘플 제조 모듈 (USPM)의 사용을 포함하였다. USPM 장치는 샘플 가공 카트리지 (1), 카트리지를 작동시키기 위한 동반 기구, 마이크로프로세서, 및 하류 분석 장치에 용이하게 상호접촉될 수 있는 소프트웨어로 구성될 수 있었다. 한 실시양태에서, USPM을 분석 장치와 단단히 집적하여, 모듈식 샘플-투-앤써 시스템을 형성할 수 있었다. 전기장 모니터링 공정을 위해 면봉 또는 액체 (에어로졸 샘플 포함)를 가공할 수 있는 일회용 단일-사용 장치로서, 또는 희귀 양성으로 원거리 작동을 위한 재사용가능한 유동-관통 포맷으로 카트리지를 배치할 수 있었다. 상자성 비드에 부착된 특이적 항체 (선택된 표적에 결합함)의 사용을 통해 USPM의 표적 특이성을 부여하고; 상이한 카트리지에 표적의 다양한 혼합물을 공급할 수 있었다.

USPM은 하류 분석을 위한 생물학적 샘플을 제조하기 위한 다단계 전자동화 공정을 사용할 수 있었다. 도 18에서 한 예는 면봉 또는 액체를 사용할 수 있고; 오퍼레이터는 샘플 유형을 선택한 후, 샘플을 입력 포트(들)에 삽입할 수 있었다. 제1 단계는 용액으로부터의 표적 분자를 상자성 비드로의 포획, 농축 및 정제를 위해 면역자기 분리 (IMS)를 사용할 수 있었다. 이미 시험된 표적은 세포, 포자, 바이러스, 단백질 또는 독소를 포함하였다. 독소 및 단백질 검출을 위해, 또는 촉발 장치로서 사용하기 위해, IMS로부터의 포획된 표적을 하류 분석 장치로 직접 배출할 수 있었다. 핵산 검출을 위해, 제2 단계는 기계적 또는 다른 용해 기술을 사용하여 세포 또는 포자를 용해시켜, DNA 및/또는 RNA를 방출할 수 있었다. 제3 단계, 핵산 정제는 핵산을 상자성 비드의 제2 세트로 흡착시키고 농축시키고 정제하고, 또는 하류 분석을 위해 핵산, 정제된 탈착된 핵산을 갖는 비드를 배출할 수 있었다.

카트리지 (1)를 참조하여, 항체를 갖는 시약 비드 또는 다른 면역자기, 친화성 자성 또는 표면 화학 자기 분리를 사용함으로써 면역자기 분리를 수행할 수 있었다. 예를 들어, 항체를 갖는 면역자기 비드를 카트리지 (1)에 첨가하여, 세포, 바이러스, 포자, 독소 및 다른 생체분자를 비드로 포획하고 정제하고 농축시킬 수 있었다.

USPM을 위한 상류 샘플 가공을 샘플 제조 장치에서 수행할 수 있었으며, 상기 장치는 마이크로유체 카트리지 (1) (도 21)에서 0.6 mL 초과의 샘플을 가공할 수 있었다. 자동으로 면봉으로부터 수집된 협측 세포를 제거하기 위해 샘플 가공 카트리지 (약 1 입방 인치 치수) (도 3, 도 21)를 개발하였으며, 세포를 용해시키고, 자성 비드 상의 방출된 세포 DNA를 정제하였다. 비드층은 전형적으로 100 nL였고, 마이크로유체 장치에 의한 하류 STR 분석 또는 실물 크기 qPCR 반응을 위해 사용할 수 있었다.

샘플 제조 장치는 큐브의 바닥 (도 3, 화살표 (2))과 상호접촉된 MOVe 마이크로밸브 마이크로칩을 사용하여, 유체, 비드 및 샘플로 구성된 압력-추진된 유동을 시약 및 반응 저장소를 따라 향하게 하였다. MOVe 마이크로밸브는 저장소 사이의 통상적인 밸브 및 배관을 대체하여, 이에 의해 누출불가능한 배향성 유체 수송을 제공하고, 전체 큐브 및 샘플 제조 장치의 소형화를 가능하게 하였다.

이 샘플 제조 장치 기술은 상기 기재된 바와 같이 협측 면봉으로부터의 DNA 추출을 자동화하는데 사용하였다. 도 10은 압력 추진된 유동, 진동 혼합, MOVe 밸브, 구동된 자석 및 자성 비드를 사용하여 자동화된 샘플 제조 장치에서 혈액 25 uL로부터 DNA의 자동화된 제조를 나타낸다. 전자동화 공정은 5분 미만 내에 바로 STR 분석가능한 DNA를 생성하였다.

본 발명자들은 관심있는 표적에 대해 특이적인 항체로 코팅된 자성 비드를 사용하여 액체 샘플 (1 내지 10 mL)로부터 세포, 바이러스 및 독소를 포획하고 농축시키고 정제하기 위한 자동화 시스템을 개발하였다. 그러므로, 이 자동화 시스템으로 다양한 표적을 농축시키고 정제하였다. 이 접근법을 사용하여, 이. 콜라이 세포를 15개 세포/mL/샘플만큼 낮은 세포 농도에서 포획하고 검출하였다 (도 27). 표적으로서 간균 포자, Gm+ 및 Gm- 무성 세포, 모델 바이러스 (박테리오파지 fd), SEB 및 난백 알부민을 사용하여 90% 초과의 포획 효율의 유사한 결과를 얻었다. 정제된 샘플을 샘플 제조 장치에서 추가로 가공하고 (예를 들어, 용해 및 핵산 정제), 분석을 위해 마이크로칩으로 이동시키거나, 오프-칩 PCR/qPCR 장치와 함께 사용할 수 있었다.

IMS 포획이 복잡한 샘플, 예컨대 에어로졸에서 및 생물학적 클러터의 존재하에 잘 작동한다는 것을 입증하였다 (전문이 본원에 참고로 도입된 미국 특허 공개 제20080014576호 참조). 클러터의 경우, 첨가된 박테리아의 105배 이하 수준이 포획 효율의 오직 2배 감소를 생성한다는 것을 입증하였다. 복잡한 샘플의 경우, 애드-백(add-back) 실험은 많은 상이한 에어로졸 샘플을 사용하여 에어로졸 샘플이 IMS 비드로의 비. 세레우스(B. cereus) 포자의 결합을 50% 미만 만큼 감소시킨다는 것을 확립하였다. 따라서, 복잡한 현실 샘플에서 민감성의 2배 미만의 손실이 존재하였다.

독소를 포획하고 농축시키고 검출하기 위해 IMS를 사용하였다. 난백 알부민 및 SEB에 대한 IMS 검정을 개발하고, 검정을 다중으로 하고, IMS 검정을 자동화하는 2세대 완전 집적 마이크로유체 시스템을 개발하였다. 밀접하게 관련된 스타필로코칼(Staphylococcal) 장독소의 간섭 없이 샘플 1 mL에서 10 ng 미만의 SEB를 믿을 수 있게 검출할 수 있었다.

IMS가

· 간섭물질의 높은 배경으로 샘플로부터 표적 유기체를 선택하고 (선택성),

· 2종의 상이한 균주 또는 종의 박테리아를 구분하고 (특이성),

· 광범위한 샘플로부터 광범위한 농도에 걸쳐 세포 및 독소를 효과적으로 포획하고 (민감성, 견고성)

· 표적 샘플 부피를 상당히 (mL로부터 nL 부피로) 감소시킬 수 있다는 것을 입증하였다.

본 발명 및 기구 및 방법은 IMS를 시행하고 이를 핵산 추출에 커플링시킬 수 있었다.

USPM에서 다음 단계는 세포, 바이러스, 프리온 또는 포자의 경우 포획된 표적의 용해이었다. 포자의 용해는 특히 해볼 만하였다. 간균 및 다른 포자, 뿐만 아니라 무성 세포의 효율적인 용해를 위해 매그밀(MagMill) 또는 자성으로 추진된 용해 또는 균질화 장치를 개발하였다. 매그밀은 샘플-함유 용기 (2003) 또는 구획 (도 75) 내에 함유된 다른 자석 (2002)의 회전을 추진하는 모터 (2001)에 의해 구동되는 급속 회전 자석 (2000) (도 74)으로 구성되었다. 샘플-함유 용기 내에 함유된 자석 (2002)은 임의의 형상을 가질 수 있었다. 예를 들어, 자석은 막대, 구형, 원통형, 직사각형, 타원형, 육각형 또는 프로펠러 형상을 가질 수 있었다. 별법으로, 자석이 자기장에 의해 회전하는 경우 액체가 홀을 통해 가압되고 샘플에 가해지는 전단력을 증가시킬 수 있도록, 자석은 이를 관통하는 홀을 가질 수 있었다. 동일한 기본 구성성분을 소형화하거나, 마이크로유체 포맷으로 혼입하거나 또는 마이크로유체 포맷에 연결할 수 있었다. 전체 효과는 자성 교반 플레이트와 유사하였다 (샘플을 샘플 튜브 내에서 급속하게 볼텍싱함). 매그밀 처리에 의해 자성으로 추진된 샘플 진탕을 사용하여, 실리카, 지르코니아 또는 다른 비드 없이 포자 용해를 달성하였다. 포자가 자석 및 용기 벽 사이를 통과할 때 생성된 전단력에 의해 용해를 달성할 수 있었다. 자석은 약 10, 50, 100, 150, 200, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 5000 또는 10000 rpm 초과의 속도로 회전할 수 있었다.

이 장치는 실리카/지르코니아 비드를 사용하는 전형적인 비드 비팅과 유사한 효율로 포자를 파괴하였다 (도 76). 포자 (3.2 x 107)를 1 ml의 부피에서 용해시키고, 트립틱 소이 아가(Tryptic Soy Agar) 상에 플레이팅 함으로써 생존성을 결정하고; 결과는 이중복사 샘플 (총 n=4)로 각각 실행된 2개의 별개의 실험의 평균이었다. 자성으로-추진된 포자 용해물의 비생존성은 지르코니아/실리카 (96%였음) 또는 실리카 비드 (80%였음)를 사용하는 전형적인 비드 비팅 (바이오스펙 비터(BioSpec beater)) 용해물과 비교하여 93%였다. 동일한 패턴을 qPCR에 의해 확인하였다.

매그밀 (대 전형적인 비드 비팅)의 사용의 장점은 설계가 기계적으로 더 견고하고, 그러므로 실패 없이 많은 사용 순환을 견딜 수 있고, 추적 검출 민감성의 손실을 야기하는, 방출된 DNA에 결합하는 것으로 입증된 실리카/지르코니아 비드의 포함에 대한 필요성 없이 단지 샘플에서 자석의 교반을 사용하여 샘플을 용해시킬 수 있다는 것이다. 매그밀의 기본 특징부를 샘플 제조 장치로 집적될 수 있는 소형화된 포맷으로 재배치할 수 있었다. 시스템은 잠재적으로 마이크로유체 마이크로칩에 맞추기 위해 크기를 줄일 수 있었다. 그러나, 배치 변화에도 불구하고, 용해를 추진하는 원리, 샘플 용기 내에 함유된 급속 회전 자석의 원리는 동일하게 유지되었다.

실시예 3: 라이브러리 구축을 위한 샘플 제조

DNA 샘플의 비드-기재 조작으로 작은 부피에서 일련의 복잡한 분자 생물학 반응을 수행하기 위해, 카트리지 (1) 기술 및 샘플 제조 장치를 추가로 사용할 수 있었다. 다음 세대 서열분석 시스템 (즉, 로슈(Roche) 454 시스템 또는 어플라이드 바이오시스템스 솔리드(SOLiD)), 실시간 PCR 또는 다른 DNA 검정 시스템을 위한 게놈 라이브러리를 제조하기 위해 DNA를 가공할 수 있었다.

역전사효소 단계를 혼입함으로써, RNA 라이브러리를 또한 본질적으로 동일한 방법에 의해 DNA 라이브러리로 전환할 수 있었다. RNA 라이브러리 구축의 장점은 증폭이 단일 분자 증폭을 기초로 하기 때문에 최종 증폭된 라이브러리에서의 표시가 본래 출발 물질을 직접 반영할 것이라는 점이다.

라이브러리 구축 모듈 (LCM)을 위한 설계 컨셉은 벌크 시약을 유지하고, 개별 라이브러리를 가공하는 작은 일회용 라이브러리 구축 모듈 카트리지에 유체 제어를 제공하는 기계이었다. LCM 기계는 데브링크 소프트웨어를 통해 LCM 카트리지에서 유체 유동, 혼합, 온도 및 비드 조작을 제어할 수 있었다. 온도 제어된 저장소에 저장된 시약의 어레이는 밸브 (컴퓨터-지정 공압식 (700)에 의해 구동됨)의 MOVe 블록을 통해 접근가능할 수 있었다. 단일 분자로부터 부착된 증폭된 DNA와 함께 비드를 생성하기 위한 작업흐름은 도 29에 나타낸다. 라이브러리 구축 모듈은 바람직한 시행으로서 카트리지를 사용하였다.

MOVe 밸브는 통상적인 밸브와 비교하여 극히 내구성이 있고, 소형이고, 저렴하며, 약 10 nL의 불용 부피를 갖고, 100 nL만큼 낮은 부피를 분배하는데 상용성이 있었다. 기계는 유체를 시약 저장소로부터 MOVe 밸브 블록을 통해 LCM 일회용 카트리지 내의 반응 챔버로, 및 최종 샘플 출력 용기 밖으로 이동시키기 위해 압력-추진된 유동을 사용할 수 있다 (도 25). 가압 유동, 진동 혼합 및 공압-추진된 MOVe 밸브를 사용하여 샘플 제조 장치에서 시약 및 기질을 혼합할 수 있고; 데브링크-제어 구동된 자석을 사용하여 자성 비드를 포획하고 방출하였다.

각 일회용 LCM 카트리지는 묻힌 MOVe 밸브 (도 28)를 함유할 수 있었다. MOVe 밸브는 시약 저장소로부터 유체의 방향을 지정하고, 3개의 반응 챔버를 연결하였다. 한 챔버 (가공 챔버 A)는 순차적 용액-기재 분자 생물학 반응을 수행할 수 있었다. 제2 정제 챔버 B는 중간 생성물의 비드-기재 정제를 위한 것일 수 있었다. 제3 챔버 (어닐링 챔버 C)는 유리 비드로의 최종 어닐링을 수행할 수 있었다. 어닐링 챔버는 주변 용액으로부터 비드를 분리하기 위한 필터를 포함할 수 있었다. 공압 라인 (P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7 및 P8)은 챔버로의 유동을 제어하고/거나 가압하는 마이크로칩의 밸브를 제어할 수 있었다.

MOVe 밸브를 통한 압력 추진된 유동은 챔버 사이에서 유체를 이동시킬 수 있었다. 가공 챔버 및 어닐링 챔버는 내용물을 혼합하고 열 제어를 혼입할 수 있었다.

다음 섹션에서, LCM을 사용하여 DNA 라이브러리 샘플을 제조하기 위한 작업흐름이 예로서 기재되어 있다. RNA 라이브러리가 역전사효소 단계 후 제조될 수 있다는 것은 쉽게 명백하다.

emPCR 이전 마이크로유체 반응의 실연

라이브러리 구축 모듈을 위한 출발 입력물을 연무화하고, 800 내지 1,000 bp로 크기 분별된 DNA를 전단하고 정제할 수 있고, 작은 단편 (<500 bp)을 이미 갖는 것을 제거할 수 있었다. 또한, 자성 비드, 예를 들어 암퓨어(AMPure) (아겐코트)로의 선택적 결합에 의해 LCM 상에서 크기 분별을 수행할 수 있었다. 입력 DNA를 바이오애널라이저(BioAnalyzer) 2100 (아질런트(Agilent))에서 및 염료 결합 (피코-그린(Pico-Green), 콴트-잇(Quant-it), 인비트로젠(Invitrogen))에 의해 크기 및 농도에 대해 평가할 수 있었다. 반응 순서는 도 29에서 라이브러리 구축 모듈 상자로 개략적으로 나타낸다.

단편 말단 연마

한 실시양태에서, DNA 연무화는 추가 조작을 수행할 수 있기 전에 충전/평활-말단화를 필요로 하는 닳은 말단이 우세한 단편을 생성하였다 (뱅키어(Bankier) 1987). 또한, 5' 히드록실 말단의 인산화는 어댑터의 후속 라이게이션을 필요로 하였다. 이는 T4 DNA 중합효소 및 T4 폴리뉴클레오티드 키나제의 연속 활성을 통해 달성할 수 있었다. 기질을 작은 반응 부피 (초기에 25 uL)에서 반응 완충액, BSA, ATP, dNTP 및 2종의 효소와 합하고, 먼저 12℃에서 15분 동안, 이어서 25℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 하드 기계 경계면 상에 탑재된 펠티어 장치를 통해서 온도를 제어할 수 있었다. 연마 반응을 위한 컨트롤은 형광 영상화 및 정량을 사용하거나 방사능표지된 dNTP를 사용하여 검정된, 형광으로 표지된 dNTP의 혼입에 의존할 수 있었다.

마이크로유체 비드-기재 정제

연마 후, 비드로의 침전에 의해 단편을 정제하였다. LCM 기계는 유체를 LCM 카트리지 (도 28 참조)로 이동시켜, DNA를 비드로 가압하고, 자석을 구동시켜 정제 챔버의 벽으로 비드를 농축시킨 후, 비드를 세척할 수 있었다. 필요에 따라, 비드로부터 DNA를 용리할 수 있고, DNA를 가공 챔버 A로 이동시키고, 비드를 버리거나, 추가 가공을 위해 비드를 다른 챔버로 이동시킬 수 있었다. 공정 전체에 걸쳐 이 방법을 수회 재사용할 수 있었다. 그러므로, 컬럼-기재 정제를 비드-기재 정제로 대체하였다. 샘플 제조 장치는 통상적으로 DNA 서열분석, 법의학 및 생체방어 적용을 위해 자성 SPRI 비드 (아겐코트 바이오사이언시스(Agencourt Biosciences)), DNA IQ(프로메가) 및 카르복실화된 비드 (인비트로젠)를 각각 사용하여 카트리지에서 DNA를 정제하였다. 정제된 생성물을 바이오애널라이저 (아질런트)에서 및 염료 결합 (피코-그린, 콴트-잇, 인비트로젠)에 의해 검정할 수 있었다.

어댑터의 라이게이션

다음, 어댑터를 정제된 DNA에 라이게이션하였다. 먼저, 정제 챔버 내의 DNA를 비드로부터 라이게이션 완충액으로 용리할 수 있으며, 이를 압력 추진된 유동에 의해 반응 챔버로 이동시키고, 어댑터 및 리가아제를 첨가하였다. 어댑터는 네스티드 PCR 및 서열분석 프라이밍 부위, 평활 3' 말단 및 5' 오버행(overhang)을 함유할 수 있으며; 각 쌍의 한 어댑터는 5' 말단 상에 바이오틴을 가질 수 있었다. 각 어댑터는 샘플 및 가공 단계를 확인하는 작용을 하는 뉴클레오티드-기재 '키' 및 염기-결정을 돕기 위한 '서열분석 키'를 혼입할 수 있었다. 라이게이션 및 추가 선택은 각 말단 상에 상이한 어댑터 (하나는 바이오틴을 포함하고, 하나는 포함하지 않음)를 갖는 단편을 선택하였다. 스트렙타비딘 비드에 결합하기 전에 이 시점에 정제 챔버 및 라이브러리 내의 비드 상의 라이게이션 생성물을 다시 정제하고 가공 챔버로 다시 이동시킬 필요가 있을 수 있었다.

리가아제, 예컨대 퀵 리가아제 (뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)), 완충액 및 어댑터로 라이게이션을 수행하고, 15분 동안 25℃에서 인큐베이션하였다. 프로브를 위한 PCR 프라이밍 부위 및 5' 서열분석 프라이밍 부위를 사용하여 Q-PCR에 의해 어댑터의 라이게이션에 대해 생성물을 검정할 수 있었다. 관련 단계 후 출발 물질의 양 및 수율을 비교함으로써 라이게이션의 효율 및 표적의 회수를 계산할 수 있었다. 또한, 상자성 비드로의 바이오틴-스트렙타비딘 결합을 통한 한 어댑터의 예비결합은 비드-결합된 단편을 초래하였으며, 이는 이어서 제2 어댑터와의 라이게이션의 제2 라운드로 처리할 수 있었다. 이 접근법은 바이오티닐화된 어댑터를 갖지 않는 단편 및 2개의 바이오티닐화된 어댑터를 갖는 단편의 생성을 방지할 수 있었으며, 둘 모두 가공 도중 손실되었다. 이는 템플레이트의 최종 수율을 상당히 개선할 수 있었다. 라이게이션 후, 생성물을 다시 비드-정제하였다.

라이브러리 고정화

라이브러리 결합 완충액에 재현탁된 예비세척된 스트렙타비딘-코팅된 비드를 시약 저장소로부터 가공 챔버로 다시 이동시킨 정제된 라이게이션 반응 생성물에 첨가하고, RT에서 혼합하면서 20분 동안 인큐베이션할 수 있었다. 그 후, 물질을 정제 챔버에서 스트렙타비딘 비드 상에서 비드 정제하여, 어댑터 이량체를 제거하였다.

닉 복구

라이게이션은 3' 닉을 초래하였으며, 이를 Bst DNA 중합효소 (큰 단편)에 의해 복구할 수 있었다. 충전 완충액 및 dNTP를 비드에 직접 첨가하고, 65℃에서 30분 동안 인큐베이션할 수 있었다. 그 후, 정제 챔버에서 비드를 정제하였다.

u

예비혼합된 용융 용액 (125 mM NaOH) 25 uL를 정제 챔버에서 세척된 비드에 직접 첨가하고, 혼합하고, 자석을 사용하여 비드 펠렛화하고, 얻은 상등액을 가공 챔버로 이동시킬 수 있었으며, 여기에 중화 용액 (0.15% 아세트산) 62.5 uL를 첨가할 수 있었다. 비드를 변성제로 처리하는 제2 라운드는 총 부피 113 uL의 단일 가닥 템플레이트를 초래하였다. 10 uL의 부피에서 용리하기 전에 이들을 다시 정제하였다.

자동화, 입력 물질의 상류 표준화 또는 제한된 양의 비드의 사용은 라이브러리의 균일한 생성 및 증폭을 크게 도울 수 있는 다양한 단계이며, 이는 이 점에서 품질 체크의 제거에 이르게 할 수 있었다.

한 실시양태에서, 연속적 품질 평가 및 기능적 정량을 수행할 수 있었다. SS 라이브러리의 품질을 오프라인에서, 필요하다면 단편의 크기 범위를 제공할 수 있는 아질런트 2100 바이오애널라이저를 사용하여 평가할 수 있으며; 또한 Q-PCR 또는 염료 결합 (리보그린(RiboGreen), 콴트-잇, 인비트로젠)을 사용하여 수율을 평가할 수 있었다. 일련의 희석물을 형성하고, 유화 PCR (emPCR) 및 피로서열분석을 수행하여 emPCR에 대한 작업 희석물을 결정함으로써 라이브러리를 추가로 기능적으로 시험할 수 있었다. 또한, 자동화된 단편 분리를 장치에 혼입할 수 있었다.

포획 비드로의 결합

이전 단계에서 제조된 SS DNA를 라이게이션된 어댑터의 말단에 상보적인 결합된 DNA 포획 프라이머로 제어된 다공성 유리 (CPG) 또는 스티렌 비드에 어닐링할 수 있었다. 이들과 같은 비자성 비드의 조작은 펌핑된 여과 기술 (원심분리의 사용을 회피하기 위함)의 사용을 필요로 할 수 있었다. 사용된 시약을 정제하고, 임의의 미립자 및 비드를 예비세척하고, 쿨터 카운터(Coulter Counter) (베크만 쿨터(Beckman Coulter))를 사용하여 정량할 수 있기 때문에, 필터 막힘은 문제가 되지 않았다.

비드를 템플레이트 라이브러리 (현재 단일 가닥임)에 첨가하고, 어닐링 챔버에서 혼성화 용액 중 단일 템플레이트/비드의 우세 어닐링으로 혼합할 수 있었다. 초기에, 비드-템플레이트 혼합물을 후속 에멀젼 생성을 위해 분취액으로 분할하고, 표준 열 순환기에서 80℃로부터 10℃ 간격으로 상승시킴으로써 어닐링할 수 있었다. 또한, 온도-상승 능력을 LCM 장치에 혼입할 수 있었다. 필터를 역류 세척함으로써 여과물 (즉, 세척된 비드)의 재현탁을 달성할 수 있었다. 비드 혼성화 전 및 후에 분취액 상의 Q-PCR에 의한 상등액 중 혼성화되지 않은 SS DNA에 대해 검정함으로써 SS 라이브러리의 혼성화를 평가할 수 있었다. 이러한 가공 단계에서, 비드 상의 단일 가닥 템플레이트를 emPCR 생성 모듈 또는 추가 가공을 위한 유사한 장치로 이동시킬 수 있었다.

실시예 4: 마이크로칩-기재 샘플 세정 및 분리와 샘플 제조 장치의 커플링

도 34 및 도 35는 포크형 주입기 설계 (도 32에 나타냄), 겔 충전 매니폴드 (2903) 및 관련 구성성분을 혼입하도록 설계된, 카트리지 (2907) 및 마이크로칩 (2901)을 갖는 장치를 나타낸다. 카트리지를 공압 매니폴드 및 배관 (2905)에 유체적으로 연결하였다. 주입기 설계, 분리 채널 길이 및 분리 중합체의 상이한 배치를 시험하였다. 도 36은 공초점 현미경 브레드보드 시스템에서의 샘플 검출과 함께 포크형 캐쏘드 주입기를 사용하여 마이크로칩 채널에 주입되고 분리된 M13 T 트랙의 전기영동도를 나타낸다. 샘플을 동등하게 표시된 짧은 DNA 단편 및 긴 DNA 단편으로 균일하게 주입하였다. 결과는 M13 T 트랙 DNA 래더를 균일하게 주입할 수 있고, 단일 염기쌍 분할을 20분 미만 내에 대략 330개 염기쌍으로 얻을 수 있다는 것을 나타낸다. 통상적인 트윈 T 설계를 사용한 주입과 비교하여 더 높은 샘플 신호 세기를 얻었다. 검출 시스템과 집적된 경우, 양호한 해상도로 분리를 얻기 위해 마이크로칩을 일정한 50℃에서 유지하였다.

이들 공정을 사용하여, 액체 샘플의 MOVe 집적된, 전기장 증폭된 적재 주입에 대해 우수한 결과를 얻었다 (도 37). MOVe 마이크로밸브를 사용하여 소프트웨어 제어하에 모든 샘플 로딩, 조작 및 주입 공정을 수행하여, 이 데이터를 생성하였다. 데이터를 최소로 가공하고, 8개의 다이오드 채널을 사용하는 검출기로부터 4개의 염료 추적으로 색상을 수정하였다.

MOVe 샘플 제조 장치와 포크형 캐쏘드를 조합한 마이크로칩의 한 실시양태는 도 38에 나타낸다. 이 장치는 시스템의 나머지, 즉, 샘플 제조 장치 (1000, 도 22에 나타냄), 반응 채널 (250, 도 6에 나타냄), 및 STR 실시예에 기재된 바와 같은 STR 정제의 출력부와의 집적을 가능하게 하는 추가 공정을 포함하였다. 도 38은 증폭후 STR 정제 시스템과의 집적을 위한 MOVe 유체 및 셔틀 샘플 로딩을 갖는 포크형 캐쏘드를 나타낸다. 부품은 다음과 같다: 1 - 시약 입력 포트, 2 - 시약 펌프 헤드, 3 - 샘플 입력 포트, 4 - 크기 표준/용리액 입력 포트, 5 - 포획 밸브, 6 - 폐기물 포트, 7 - 용리 밸브, 8 - 샘플 폐기물 포트, 9 - 캐쏘드, 10 - 캐쏘드 포트, 11 - 샘플 밸브, 12 - 샘플 포트 및 13 - 분리 채널. 채널의 하류에 있는 애노드 포트는 나타내지 않았다.

분리될 샘플을 에탄올 중 비드 용액으로서 도입하였다. 이는 상기 기재된 바와 같이 비드 출력 상의 정제된 반응 생성물일 수 있었다. 한 실시양태에서, 샘플은 STR 반응물이었다. 다른 실시양태에서, 샘플은 생어 화학에 의한 DNA 서열분석을 포함하는 다른 반응 화학에 의해 생성된 상이한 길이의 핵산 단편일 수 있었다. 포획 밸브 및 다른 개재 밸브가 개방된 상태에서 샘플을 함유하는 용액을 샘플 입력 포트로부터 샘플 폐기물 포트로 유동시켰다. 개방된 포획 밸브는 스트림 유동의 저속화 및 밸브의 위 또는 아래에 위치된 고정된 자석에 의한 비드 포획을 촉진하였다. 에탄올 용액을 시스템을 통해 완전히 실행시킨 후, 밸브 내의 정제된 생성물을 갖는 상대적으로 건조하고 깨끗한 비드층을 공기 수득하였다. 이 시점에 밸브를 폐쇄하고 재개방하여 (다른 밸브와 조합하여) 관련 포트로부터 용리 용액을 충전하였다. STR 분석 또는 내부 크기 표준이 필요한 다른 분석을 위해, 용리액은 크기 표준을 함유할 수 있었다. 용액을 용리 밸브 및 포획 밸브 사이에서 이동시켜, 혼합을 촉진시켜 용리 밸브 내의 용액에 이르게 하였다. 그 후, 샘플 채널을 통해 샘플을 "셔틀"하기 위해 용리 밸브를 폐쇄함과 조합하여 샘플 밸브를 개방하여, 충전되도록 하였다. 상기 기재된 바와 같이 샘플 FASS 주입을 수행하였다. 장치의 추가 주목할 만한 기능은 한 실시양태에서, 샘플 제조 장치에서의 DNA의 면봉 추출 후 계량된 STR 반응 프리믹스를 반응 채널 (250, 도 6에 나타냄)에 제공하는데 시약 입력 포트 및 시약 펌프를 사용하고; 다른 실시양태에서, 장치는 다른 핵산 반응 시약, 예컨대 순환 서열분석 혼합물을 제공하거나, 또는 PCR 증폭을 수행하기 위해 PCR 시약을 제공한 후, 필요에 따라 집적된 비드-기재 세정 반응과 함께 순환 서열분석을 수행하기 위해 순환 서열분석 시약을 제공할 수 있다는 것이다. 다른 화학이 당업자에게 명백할 것이다.

실시예 5: 집적된 핵산 단리, 증폭, 분리 및 검출 시스템.

카트리지(들) 및 열 조정 장치를 갖는 샘플 제조 장치를 하류 검출 시스템과 집적하여, 샘플-투-앤써 완전 집적 시스템을 제조할 수 있었다. 벤치탑 또는 휴대용 장치 (도 39에 나타냄)로서 실험실, 임상 및 분야 작동과 상용성이 있는 컴팩트 포맷으로 시스템을 만들 수 있다. 도 39는 입력 협측 면봉, 액체, 고체 및 다른 물질로부터 핵산을 정제하기 위해 카트리지 (1)를 사용하는 5-채널 면봉 추출 어셈블리 (800)를 사용하여 면봉 또는 다른 물질을 추출할 수 있는 시스템의 한 실시양태를 나타낸다. 비드 상의 정제된 핵산을 열 순환 모듈 (400)에서 PCR 증폭시켰다. 한 실시양태에서, 카트리지 (1)를 사용하여 면봉 추출 어셈블리 (800)에서 샘플을 비드 정제하여, 원하는 생성물을 비드로 정제하였다. 비드를 분리 및 검출 모듈 (900)로 이동시켜, 비드 상에 생성물을 수용하고, 샘플을 용리시키고, 검출 방법, 예컨대 레이져 유도 형광 또는 질량 분광법과 함께 모세관 전기영동 또는 마이크로칩 모세관 전기영동 또는 다른 분리 방법에 의해 이를 분리하였다. 모세관 전기영동 또는 마이크로칩 모세관 전기영동을 위해, 겔 주입 모듈 (850)은 분리 매트릭스 또는 겔 또는 다른 물질을 펌핑하여 분리 컬럼을 제공하고 이를 재생성시켰다. 다른 실시양태에서, 겔 주입 모듈 (850)은 HPLC 또는 다른 액체 크로마토그래피 방법에 의해 분리하는 경우 크로마토그래피 매질을 펌핑할 수 있었다. 전자기기 및 전원 공급 모듈 (860)은 제어 및 전원 기능을 제공하였다. 공압 모듈 (870)은 조정된 공기 및 진공을 공급하여, 면봉 추출 어셈블리 (800)를 작동시켰다. 시약을 시약 저장소 (880)에 저장하였다. 시약을 용액에서 또는 탈수된 또는 안정화된 형태, 예컨대 레디-투-고 (지이 헬스케어(GE Healthcare)) 및 동결건조된 형태로 저장할 수 있었다.

한 실시양태에서, 협측 면봉의 STR 분석을 수행하도록 시스템을 배치하였다. 협측 면봉을 어셈블리 (800)에서 추출하고, STR 증폭을 위한 시약을 사용하여 열 순환 모듈 (400)에서 증폭된 샘플을 추출하였다. 예를 들어 오라퓨어 또는 DNA IQ 화학 및 비드를 사용하여 비드로의 핵산 추출을 사용하여 증폭된 샘플을 정제하였다. 비드 상의 정제된 STR 생성물을 분리 및 검출 모듈 (900)로 이동시키고, 비드를 포획하고 바람직하게는 MOVe 마이크로밸브를 갖는 마이크로칩 상에서 DNA 희석시켰다. 그 후, 겔, 예컨대 동적 코팅 겔, V2E (지이 헬스케어), 폴리디메틸 아크릴아미드, POP 족의 매트릭스 (어플라이드 바이오시스템스), 히드록시메틸셀룰로스, 구아린 및 선형 폴리아크릴아미드에 의한 모세관 겔 전기영동 분리를 사용하여 샘플을 바람직하게는 마이크로칩 상의 포크형 캐쏘드 주입기 또는 마이크로칩에 커플링된 모세관 전기영동 모세관으로 주입하였다. 형광 표지를 갖는 검출된 생성물을, 이동함에 따라 피크를 검출하는 레이져 유도 형광 검출기로 통과시켰다.

다른 실시양태에서, 집적 DNA 서열분석기로서 시스템을 배치하였다. 샘플을 어셈블리 (800)에서 추출하고, PCR 증폭을 위한 시약을 사용하여 열 순환 모듈 (400)에서 추출된 샘플을 증폭시켰다. 샘플은 제한없이 전체 유기체, 조직, 세포, 바이러스, 공기, 액체 또는 고체일 수 있었다. 비드-기재 정제 방법, 예컨대 오라퓨어 (아겐코트)를 사용하는 DNA 추출은 비특이적일 수 있거나, 또는 덜 복잡한 샘플을 생성하기 위해 입력 샘플로부터 하나 이상의 영역을 선택하는 혼성화 또는 다른 방법을 사용할 수 있다. IMS, 이어서 핵산 정제에 의한 USPM 작업흐름은 또한 많은 다른 초기 정제 작업흐름에 의해 대체된 면봉 추출 및 샘플 제조 장치 (800)로 개질될 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. PCR 증폭은 단일 영역이거나 또는 표적 다수의 영역으로 다중화될 수 있다. 예를 들어 오라퓨어 또는 DNA IQ 화학 및 비드를 사용하여 비드로의 핵산 추출을 사용하여 증폭된 PCR 샘플을 정제하였다. 그 후, 비드 상의 정제된 PCR 생성물을 열 순환 모듈 (400)로 이동시키고, 순환 서열분석 매스터 믹스를 첨가하고, 샘플을 순환 서열분석하였다. 이는 UV 또는 다른 방법에 의해 표지없는 검출에 대한 표지되지 않은 프라이머의 4개 세트로서 또는 형광 표지에 의한 것일 수 있었다. 그 후, 순환 서열분석된 샘플을 어셈블리 (800)로 이동시키고, 원치않는 이온 및 표지 및 다른 물질을 제거하기 위해 비드 정제하였다. 그 후, 비드를 분리 및 검출 모듈 (900)로 이동시키고, 비드를 포획하고, 바람직하게는 MOVe 마이크로밸브를 갖는 마이크로칩 상으로 또는 모세관으로 DNA를 용리하였다. 그 후, 겔, 예컨대 동적 코팅 겔, V2E (지이 헬스케어), 폴리디메틸 아크릴아미드, POP 족의 매트릭스 (어플라이드 바이오시스템스), 히드록시메틸셀룰로스, 구아린 및 선형 폴리아크릴아미드에 의한 모세관 겔 전기영동 분리를 사용하여 샘플을 바람직하게는 마이크로칩 상의 포크형 캐쏘드 주입기 또는 마이크로칩에 커플링된 모세관 전기영동 모세관으로 주입하였다. 형광 표지를 갖는 검출된 생성물을, 이동함에 따라 피크를 검출하는 레이져 유도 형광 검출기로 통과시켰다.

다른 실시양태에서, 단백질, 탄수화물 또는 다른 검정을 수행하고, 질량 분석법, 영상화, HPLC, GC 또는 당업자에게 익히 공지된 다른 분석법에 의해 검출하였다.

DNA의 경우, 가공된 샘플을 PCR, 회전환, 분지된 DNA, EXPAR 및 당업자에게 익히 공지된 다른 DNA 증폭 방법에 의해 증폭시키거나, 질량 분광법 또는 단일 분자 검출 방법에 의해 분석할 수 있었다. RNA를 역전사효소 실시간-PCR에 의해 가공하거나, 또는 DNA 마이크로어레이 또는 다른 분석 방법을 위해 샘플을 제조할 수 있었다. 실시간 또는 종점 분석을 기구로 수행할 수 있었다. 단백질의 경우, 효소 검정, 샌드위치 면역검정, 항체 침전, 단백질 소화, 단백질 및 펩티드 표지화, 및 다른 통상적으로 사용되는 단백질 분석 방법을 포함하는 검정을 카트리지에서 수행할 수 있었다. 유사하게, 기구에서 표준 방법을 사용하여 다른 세포 구성성분 또는 화학물질을 추출하거나 정제할 수 있었다. 분자 생물학 방법을 기구에 맞게 용이하게 개질하였다. 샘플을 단일 카트리지에서 기구 상에서 완전히 분석하거나, 별개의 카트리지로 이동시키거나, 또는 모세관 전기영동 시스템 또는 마이크로칩 모세관 전기영동; 다차원 겔 및 모세관 전기영동; 질량 분광법, HPLC에 의한 다차원 질량 분광법, ICP, 라만 분광법, 입자, 나노입자 및 비드 기재 검출, 영상화 (형광 포함), IR, 광학 또는 당업자에게 익히 공지된 임의의 다른 분석 시스템을 포함하는 별개의 기계에서 분석하거나 또는 추가로 가공할 수 있었다.

DNA 단편의 분리를 위한 많은 입력 및 샘플 유형 및 마이크로칩-기재 모세관 전기영동 장치로부터 DNA 샘플을 제조하기 위해 카트리지를 혼입하는 완전 샘플-투-앤써 기계의 집적은 DNA 서열분석, 단편 크기조절 및 법의학에 대해 교시되어 있다.

실시예 6: 4개의 가공 채널을 갖는 장치

마이크로칩 또는 마이크로유체 마이크로칩을 사용하여 mRNA를 증폭시키고, 자성 비드 상에서 핵산을 농축시키고 정제된 샘플을 전기영동 분리 모세관으로 주입할 수 있었다. 도 45 및 도 46에 나타낸 바와 같이, 마이크로칩 (505)을 카트리지 (503) 및 공압 매니폴드 (507)와 상호접촉시킬 수 있었다. 도 45는 마이크로칩, 카트리지 및 공압 매니폴드의 확대도를 나타낸다. 도 46은 공압 매니폴드와 상호접촉된 마이크로칩과 상호접촉된 카트리지의 도면을 나타낸다. 카트리지는 마이크로칩의 표면을 완전히 덮을 수 있었다. 또한, 블록 (501)은 카트리지 (503)의 포트 (511)로 또는 이로부터 전달된 인큐베이션 물질을 유지하는 것을 돕는 홀 (509)을 가졌다. 블록은 열 블록 또는 온도 제어 블록일 수 있었다. 홀 (509)을 유지 피펫 팁을 유지하기 위해 사용하거나 또는 큰 부피 반응기 또는 프로세서로서 사용할 수 있었다. 카트리지 및 마이크로칩으로 전달되거나 카트리지 및 마이크로칩으로부터 제거될 물질의 온도를 제어하기 위해 블록 (509)을 가열하거나 냉각할 수 있었다. 블록을 카트리지와 열 접촉시킬 수 있었다. 카트리지의 포트는 마이크로칩 (505) 상의 포트 (515)와 접속하는 포트에 유체적으로 연결된 저장소로 인도할 수 있었다. 마이크로칩 (505)은 공압 매니폴드의 포트 (517)와 맞물리는 공압 라인 포트 (519)를 가질 수 있었다. 공압 매니폴드의 포트는 마이크로칩으로의 공압 매니폴드를 밀봉하는 o-링 개스킷을 가질 수 있으며, 이는 압력 또는 진공의 노출 없이 또는 손실 감소로 고압 및 저압이 전달되도록 하였다. 볼트 또는 다른 고정 물체를 사용하여, 카트리지 및 공압 매니폴드의 개구부 (513, 501)를 통해 통과하는 카트리지, 마이크로칩 및 공압 매니폴드를 함께 유지할 수 있었다.

칩 A 마이크로칩의 다이어그램은 도 47에 나타낸다. 마이크로칩은 다음 3개의 층을 포함하였다: (i) 유체 채널 및 웰을 담지하는 상단 유체층 (예를 들어, 유리), (ii) 공압 채널 및 웰을 담지하는 바닥 공압층 (예를 들어, 유리), 및 (iii) 중간 가요성 막, (예를 들어, 250 um 두께, PDMS 층) (나타내지 않음). PDMS 막은 특징이 없을 수 있었다. PDMS 막은 공압 채널 시스템 (도 47에서 점선)에 의해 규정된 국소화된 영역으로 가해진 양압 또는 음압에 반응하여 편향할 수 있었다. 공압 및 유체 채널 에치 깊이는 전형적으로 50 um이고, 치수 수압 저항을 제공하도록 설계할 수 있었다. 마이크로유체 시스템 내의 밸브는 펌프 밸브를 포함할 수 있었다. 펌프 밸브는 원하는 펌프 용량에 따라 다른 밸브보다 더 클 수 있고, 밸브 자리가 없을 수 있었다. 밸브 자리의 제거는 펌핑 용량 또는 펌프 스트로크 당 펌핑되는 유체의 부피를 증가시킬 수 있었다. 다른 밸브는 더 작고, 단단히 폐쇄시키는 밸브 자리를 가질 수 있었다. 이러한 부피 감소된 온/오프 밸브는 마이크로유체 마이크로칩 내의 전체 공극 공간을 감소시킬 수 있었다. 유입구 및 유출구 밸브는 이러한 온/오프 밸브일 수 있었다.

도 47에 나타낸 바와 같이, 마이크로칩은 4개의 동일한 가공 채널을 가지며, 이들은 각각 오프-마이크로칩에 대한 시약 유동 또는 온-마이크로칩 자성-비드-기재 핵산 농도 및 모세관 전기영동 샘플 주입을 제어할 수 있었다. 4개의 가공 채널은 4개의 입력 웰로부터 입력 시약을 선택할 수 있는 공통 "시약 레일"에 의해 공급하였다 (5번째 웰은 폐기물 포트로서 사용될 수 있음). 개별 샘플을 채널-특이적 샘플 웰로부터 각 가공 채널로 공급할 수 있고, 병렬로 가공할 수 있다 (나타낸 마이크로칩은 4-플렉스 가공 장치임). 각 가공 채널은 0.8 ㎕ 펌프, 샘플 입력 웰, 2개의 출력 웰 및 폐기물 웰을 가질 수 있었다. 비드, 예컨대 자성 비드를 임의의 웰, 예를 들어 출력 웰 중 하나 또는 양자 모두에서 포획할 수 있었다. 이 출력 웰은 카트리지 또는 유체 매니폴드와 상호접촉할 수 있었다.

칩 A 마이크로칩의 사진은 도 48에 나타낸다. 마이크로칩의 상단 표면 상의 웰로의 유체 저장소와 맞물리는 상단 유체 매니폴드, 및 o-링 밀봉부를 통해 마이크로칩의 바닥 표면 상의 웰로의 공압 제어 라인과 맞물리는 바닥 공압 매니폴드 사이에 마이크로칩을 탑재할 수 있었다. 마이크로칩 밸브 및 펌프를 컴퓨터 스크립트, 예컨대 데브링크 스크립트 또는 다른 소프트웨어에 의해 추진되는 공압 제어 시스템에 의해 구동시킬 수 있었다. 시스템은 밸브를 폐쇄하기 위해 양압 (대략 +10 psi) 및/또는 밸브를 개방하기 위해 음압 (대략 -20 psi 또는 진공)을 공급할 수 있었다. 동일한 공압 시스템은 음압이 펌프 몸체 (엘라스토머층의 유체 채널 측면 상에)를 충전하는 작용을 하고 양압이 이를 비우는 작용을 하도록 마이크로칩 펌프를 작동시킬 수 있었다. 본원에 기재된 바와 같이, 펌핑 작용은 펌프의 조화 작용 및 유입구 및 유출구 밸브의 측면배치에 의존하였다.

실시예 7: 4개의 가공 채널을 갖는 장치를 사용하는 mRNA 증폭

칩 A를 사용하여 에버윈 프로토콜의 제1 역전사 반응을 수행하였다. 효과적인 혼합 및 인큐베이션 방법을 개발하였다.

대략 10 ul 반응물을 위한 온도 제어를 제공하기 위해, 8개의 200 ul 피펫 팁을 담지하는 간단한 가열된 알루미늄 블록 (509)을 제작하고, 유체 매니폴드에 맞물리게 하였다 (도 45, 도 46 및 도 49에 나타냄). 각 피펫 팁을 마이크로칩 출력부에 연결하였다. 실험에서, 마이크로칩 출력-1 웰에 연결된 오직 4개의 팁 (도 47에 나타냄)을 실제로 사용하였다. 접착제로 블록의 외부 표면에 부착된 박막 히터에 의해 가열 (50℃)을 달성하였다. 열커플링을 블록의 중심에 삽입하고, 데브링크 PID 제어 루프에 의해 히터를 제어하였다.

혼합을 위해, 각 개별 저장소로부터 출력-1에 맞물리는 피펫 팁으로 대략 0.6 ul를 교대로 펌핑함으로써 샘플 및 시약을 1:1 비율로 혼합하는 데브링크 스크립트를 개발하였다. 음식 염료에 의한 실험은 교대 펌핑이 팁에서 2개의 구성성분을 효과적으로 혼합하였다는 것을 확인하였다.

반응을 수행하기 위해, (물 중) 총 RNA 및 T7 프로모터-프라이머의 혼합물을 샘플 웰 저장소로 피펫팅하고, 슈퍼스크립트(Superscript) III 역전사효소를 함유하는 2배 농축된 RT 믹스를 시약 저장소로 피펫팅하였다. 15 ul를 팁으로 로딩한 후 (12회 펌프 순환), 스크립트를 종결시키고, 15분 동안 50℃에서 인큐베이션하여 반응을 계속하였다. 이 시점에, 팁을 제거하고, 0.2 ml PCR 튜브로 비우고, 85℃에서 5분 동안 열순환기에서 인큐베이션하여 반응을 종결시켰다.

이들 반응을 벤치에서 전체 수행하고, 15분 동안 5℃에서 열순환기에서 인큐베이션한 것을 제외하고, 양성 대조군 반응물을 동일하게 처리하였다. 음성 대조군 반응물을 혼합하고 (벤치에서), 5분 동안 85℃에서 인큐베이션하여 즉시 종결시켰다.

Gusb 프라이머 및 프로브 세트 (ABI)를 사용하여 TaqMan 실시간 정량 PCR에 의해 반응을 분석하였다. 대략 500 ng 총 RNA (래트 간) 및 10 U/㎕ 슈퍼스크립트 III RT를 함유하는 반응물 15 ㎕에 대한 결과는 도 50에 나타낸다. iK에 의해 나타낸 벤치에서 전체 수행된 것에 대한 결과와 함께 채널 1 내지 4로부터의 결과를 나타낸다. 도 50에서, 각 채널 1, 2, 3, 4 및 iK에 대해 나타낸 막대 쌍은 복제 반응을 나타낸다. 결과는 마이크로칩 및 벤치 반응이 제1-가닥 Gusb cDNA의 수율과 동일함을 나타내었다. 두 반응 모두 26 내지 27의 Ct를 생성하였다. 음성 대조군 반응물은 Ct > 35를 생성하였다 (데이터는 나타내지 않음).

실시예 8: 비드 세정 챔버를 갖는 장치

mRNA를 증폭시키고 핵산을 자성 비드 상에서 농축시키고 정제하는데 마이크로칩 또는 마이크로유체 마이크로칩을 사용할 수 있었다. 도 51은 2개의 피스 (1313, 1315) 및 공압 매니폴드 (1301)로 제조된 카트리지와 상호접촉될 수 있는 마이크로칩 (1307)을 갖는 장치의 확대도를 나타낸다. S자형 채널 (1311), 웰, 저장소 및 챔버를 갖는 제1 피스, 및 웰 및 챔버를 갖는 제2 피스 (1315)로 카트리지를 제조하였다. S자형 채널 내에 함유된 유체와 열 분포 피스 사이의 열 이동을 증가시키는데 S자형 채널을 사용할 수 있었다. S자형 채널이 상단 측 상에 봉입되도록 제2 피스 및 제1 피스를 함께 결합시킬 수 있었다. 카트리지는 열 제어 블록 (1323, 1321)으로부터 열을 분포시키는 열 분포 피스 (1317)와 열 접촉하거나 오버레이할 수 있었다. 열 제어 블록은 열전기 냉각기 (TEC 또는 펠티어 장치), 박막 히터 또는 다른 열 제어 장치일 수 있었다. 열 분포 피스 및 열 블록을 카트리지에 결합하거나 결합하지 않거나 고정시키지 않을 수 있었다. 나사, 볼트 및/또는 힌지는 카트리지로의 열 분포 피스 및/또는 열 블록의 고정을 촉진시킬 수 있었다. 도 52는 공압 매니폴드와 상호접촉된 마이크로칩과 상호접촉된 카트리지의 도면을 나타낸다. 공압 블록은 마이크로유체 마이크로칩의 공압층과 공압 라인 사이에서 상호접촉하는 포트 (1303) 및 볼트 및/또는 나사에 대한 환상 공간 (1305, 1309)을 가질 수 있었다. 공압층의 추가 도면은 도 53, 도 54, 도 55 및 도 56에 나타낸다. 도 53 및 도 55는 시야에서 가려진 점선 표시 연부를 갖는 도면을 나타낸다. 도 53 및 도 54는 공압층의 3차원 도면을 나타낸다. 도 55 및 도 56은 공압층의 상면도를 나타낸다.

도 57 및 도 58은 비드 세정 챔버를 갖는 칩 B 마이크로칩인 마이크로유체 마이크로칩의 다이어그램을 나타낸다. 도 58에 관하여, 마이크로칩은 4개의 주요 섹션을 갖는다: 시약 레일, 비드 레일, 프로세서 1 및 프로세서 2. 2개의 레일 및 2개의 프로세서는 거울 기하학을 가졌다. 어느 하나의 시약 레일이 어느 하나의 프로세서를 공급할 수 있도록 마이크로칩을 배치하였다. 상단 프로세서를 위한 밸브 Vr 및 Vb 및 바닥 프로세서를 위한 밸브 Vrb 및 Vbb에 의해 프로세서로의 접근을 제어하였다. 상단 프로세서의 시약 가공 및 효소 반응 도중, Vr를 개방하고, Vb를 폐쇄하였다. 바닥 프로세서의 시약 가공 및 효소 반응 도중, Vrb를 개방하고, Vbb를 폐쇄하였다. 세정 도중에는 반대로 적용하였다, 즉 상단 프로세서의 경우 Vr을 폐쇄하고 Vb를 개방하였고, 바닥 프로세서의 경우 Vrb를 폐쇄하고 Vbb를 개방하였다. 상단 프로세서 및 바닥 프로세서는 병렬로 또는 개별적으로 작동할 수 있는 것으로 보여질 수 있었다. 시약 레일 및 비드 레일 설계는 칩 A 설계를 근접하게 따랐다. 각 레일은 4개의 상이한 시약 (R1-4 및 B1-4), 비아 밸브 Vr1-4 및 Vb1-4 각각에 접근할 수 있고, 각 레일은 밸브 Vrw 및 Vbw 각각에 의해 접근되는 폐기물 웰 (RW 및 BW)을 가졌다. 각 프로세서는 샘플 입력 웰 (S), 2개의 출력 웰 (Oa, Ob), 및 밸브 Vs, Voa, Vob, Vbs 각각에 의해 접근되는 비드 측면 채널을 가졌다. 비드 측면 채널은 비드 저장소 (R), 및 폐기물 (W) 및 용리 (E) 웰에 각각 접근하는 2개의 밸브 (Vw 및 Ve)를 가졌다. 공압 라인 및 밸브 제어를 위한 포트를 도 57에서 점선으로 나타내었다.

아래 설명을 위해, 프로세서 (1) 및 프로세서 (2)가 병렬로 동일하게 작동하고, 칩 B가 2개의 샘플을 동시에 가공하는 듀플렉스 장치인 것으로 가정하였다. 명확하게 하기 위해, 오직 상단 프로세서의 작동을 상세히 설명하였다. 그러나, 비-병렬 작동이 또한 가능하다. 또한, 웰 Oa 및 Ob가 유체 매니폴드 또는 배관 내의 적절한 용량 저장소에 연결된 것으로 가정하였다. 저장소는 피펫 팁, 카트리지 내의 저장소일 수 있거나, 또는 더 큰 부피로의 배관에 의해 연결될 수 있었다. 마이크로유체 마이크로칩은 75 ㎛ 채널 깊이, 250 ㎛ (최종) 유체 채널 폭 및 0.6 ㎕ (추정) 펌핑 스트로크 부피를 가질 수 있었다.

도 58에 관하여, 시약 1 및 샘플을 포함하는 반응물을 교대 4-순환 펌핑 (A, B, C, D)에 의해 웰 Oa 내에서 조립할 수 있었다. 모든 밸브는 초기에 폐쇄된 것으로 가정하였다. 순환 A에서, 밸브 Vr1 및 Vr을 개방하여, 펌프 P가 다운-스트로크 (밸브를 개방하기 위해 펌프 P에 가해진 음압)로 웰 R1로부터 시약 1을 끌어당기게 하였다. 순환 B에서, 밸브 Vr1 및 Vr을 폐쇄하고 밸브 Voa를 개방하여, 펌프 P가 업-스트로크 (폐쇄하기 위해 펌프 P에 가해진 양압)로 웰 Oa로 그의 내용물 (본 실시예에서 R1로부터)을 배출하게 하였다. 순환 C에서, 밸브 Vs를 개방하고 밸브 Voa를 폐쇄하여, 펌프 P가 다운-스트로크로 웰 S로부터 샘플을 끌어당기게 하였다. 순환 D에서, 밸브 Vs를 폐쇄하고 Voa를 개방하여, 펌프 P가 업-스트로크로 웰 Oa로 그의 내용물을 배출하게 하였다. 충분한 부피가 Oa로 밀려질 때까지 이들 4개의 순환을 반복하였다. 순환 AB:CD의 비율에 의해 샘플과 시약 1의 혼합 비율을 결정하였다. 상기 기재된 공정에서, 혼합 비율은 1:1이었으나, 원칙적으로 임의의 값일 수 있었다. 마지막으로, Vr1을 적절한 밸브로 치환함으로써 임의의 시약 (R1-4)을 샘플 S와 혼합하는데 유사한 절차를 사용할 수 있었다. 도 58에 관하여, 4-순환 펌핑에서, 제1 단계에서 제1 공급원 웰로부터 펌핑 밸브 내의 공간으로 제1 방향으로 유체를 펌핑할 수 있었다. 제2 단계에서 유체를 펌핑 밸브로부터 혼합 웰로 이동시킴으로써 제1 방향과 반대 방향으로 유체를 펌핑할 수 있었다. 제1 공급원 웰 대신에 제2 공급원 웰로 제3 및 제4 단계를 반복할 수 있었다. 혼합 웰에서 혼합을 얻기 위한 반대 방향으로의 펌핑은 펌핑 밸브가 공급원 웰 및 혼합 웰 사이에 위치하지 않도록 채널을 따라 위치된 펌핑 밸브, 공급원 웰 및 혼합 웰을 갖는 결과를 가져올 수 있었다. 이 배치는 마이크로유체 마이크로칩 내의 불용 공간을 감소시키고, 혼합을 개선하거나 시약 및 샘플 취급의 균일성을 개선할 수 있었다. 또한, 이 배치는 중앙 펌프가 적절한 밸브의 개방 및 폐쇄를 통해 마이크로유체 마이크로칩 상의 많은 상이한 웰 간에 액체를 이동시킬 수 있게 하였다.

도 57 및 도 58에 나타낸 밸브 및 본원에 나타낸 임의의 다른 밸브는 종종 T-형 접합부에 위치하였다. 밸브를 폐쇄하여 다른 2개의 채널 사이에서 계속 유동하게 하면서 T의 한 채널로부터 T로 인도하는 다른 2개의 채널로 유동시킬 수 있었다. 예를 들어, 밸브 Voa의 폐쇄는 유체가 펌프 P로부터 Oa로 유동하는 것을 방지하나, 밸브 Vs가 개방되면 유체가 펌프 P로부터 S로 유동하는 것을 방지하지 않았다. 별법으로, 밸브는 T로 인도하는 모든 채널 간의 유동을 방해할 수 있었다. 4, 5, 6개 이상의 채널의 접합부에 위치된 밸브에 동일하게 적용할 수 있었다. 또한, 상기 밸브를 필요에 따라 시약 또는 비드 채널에만 있는 밸브로 대체할 수 있었다.

실시예 9: 비드 세정 챔버를 갖는 장치를 사용하는 mRNA 증폭

상기 기재된 바와 같이, 에버윈 mRNA 증폭 절차는 3개의 이원 첨가의 캐스케이드였다. 에버윈 서열을 실행하기 위해, R1은 RT 믹스를 함유하고, R2는 2S (제2-가닥) 믹스를 함유하고, R3은 T7 믹스를 함유하였다 (도 58에 나타냄). 2S 믹스의 2배 (2X) 부피를 RT 반응에 첨가할 수 있고, T7 믹스의 1배 부피를 2S 반응에 첨가할 수 있었다 (도 44에 나타냄). 이는 2S 믹스 첨가의 경우 2:1 펌핑 비율 (AB:CD) 및 T7 믹스 첨가의 경우 1:1 비율을 필요로 하였다.

본원에 기재된 방법을 사용하여 웰 S로부터의 총 RNA+프라이머 및 웰 R1로부터의 2X RT 믹스의 1:1 혼합물과의 제1 (RT) 반응물을 형성시킬 수 있었다. 적절한 인큐베이션 기간 후, 제2-가닥 반응물을 웰 Oa (웰 S 아님)로부터의 연신, 및 웰 R2 (웰 R1로부터가 아님)로부터의 연신에 의해 웰 Ob에서 조립할 수 있었다. 실시예 8에 기재된 바와 유사한 4-순환 펌핑식 (A, B, C, D)을 사용할 수 있었다. 순환 A에서 Vr1이 아닌 Vr2가 개방하고, 순환 B에서 Voa가 아닌 Vob가 개방하고; 순환 C에서 Vs가 아닌 Voa가 개방하고; 순환 D에서 Voa가 아닌 Vob가 개방하였다. 필요로 하는 2:1 혼합 비율을 얻기 위해, 2개의 순환은 Oa로부터 연신하는 각 순환에 대해 R2로부터 연신할 수 있었다.

다른 적절한 인큐베이션 기간 후, 제3 (T7) 반응물을 웰 Oa에서 유사한 방식으로 (R3 및 Ob로부터 연신, 1:1 비율) 조립할 수 있었다. 그러므로, 최종 T7 반응물은 Oa에 존재할 수 있었다. 적절한 인큐베이션 기간 후, aRNA는 바로 정제가능할 수 있었다.

정제는 시약 레일이 아닌 비드 레일의 작동을 포함하였다. 그러므로, 마이크로칩 작동의 이러한 기 도중, 밸브 Vr은 폐쇄된 채로 유지되고, Vb를 개방할 수 있었다.

aRNA를 정제하기 위해, 저장소 R을 먼저 자성 비드로 로딩해야 하였다. 이는 펌프 P로의 입력부는 비아 밸브 Vb4 및 Vb (순환 A)일 수 있고, 펌프 P로부터의 출력부는 비아 밸브 Vbs 및 Vw (순환 B)일 수 있다는 것을 제외하고, 실시예 8의 순환 A 및 B와 유사한 2-순환 절차로 달성할 수 있었다. 이 서열은 웰 B4로부터 펌프 P로 비드 슬러리를 연신하고, 펌프 P로부터 저장소 R을 통해 폐기물 웰 W로 비드 슬러리를 배출할 수 있었다. 슬러리가 저장소 R을 통해 통과하기 때문에, 저장소 R 아래에 위치된 자석에 의해 비드를 포획할 수 있었다.

aRNA (웰 Oa 내의)를 포획할 수 있기 전에, 결합 완충액과 혼합해야 하였다. 이는 비드 레일 내의 웰 B1로부터 결합 완충액을 연신할 수 있고, 혼합물을 웰 Ob에 축적할 수 있다는 것을 제외하고, 실시예 8과 유사한 다른 4-순환 절차로 달성할 수 있었다.

그 후, 웰 Ob의 내용물을 저장소 R을 통해 폐기물 웰 W로 펌핑함으로써 저장소 R 내의 비드에 의해 웰 Ob 내의 aRNA를 포획할 수 있었다. 이는 펌프 P가 충전된 비아 밸브 Vob (순환 A) 및 텅빈 비아 밸브 Vbs 및 Vw (순환 B)인 2-순환 절차로 달성할 수 있었다.

그 후, 로딩된 비드를 웰 B2로부터 펌핑된 에탄올로 세척할 수 있었다. 이는 펌프 P가 충전된 비아 밸브 Vb2 및 Vb (순환 A) 및 텅빈 비아 밸브 Vbs 및 Vw (순환 B)인 2-순환 절차로 달성할 수 있었다. 웰 B2로부터의 에탄올이 소진된 후, 공기를 비드 상에서 끌어당겨 이를 건조시키기 위해 계속 펌핑할 수 있었다.

최종적으로, 펌프 P가 충전된 비아 밸브 Vb3 및 Vb (순환 A) 및 텅빈 비아 밸브 Vbs 및 Ve (순환 B)인 2-순환 절차로 저장소 R을 통해 물을 펌핑함으로써 비드로부터 웰 E로 aRNA를 희석할 수 있었다.

실시예 10: 실시간 PCR 검출을 갖는 장치를 사용하는 짧은 RNA 증폭

마이크로RNA (miRNA)는 더 큰 RNA를 가공함으로써 생성되는 짧은 (19 내지 25개의 뉴클레오티드) 단일 가닥 RNA인 반면, siRNA는 더 큰 RNA를 가공함으로써 또한 생성되는 짧은 (20 내지 25개의 뉴클레오티드) 이중 가닥 RNA이다. miRNA는 mRNA의 번역을 조절하는데 관여하는 반면, siRNA는 유전자의 전사를 침묵시키거나 활성화시킬 수 있다. 집합적으로 작은 RNA인 miRNA 및 siRNA 양자 모두는 본원에 기재된 장치를 사용하여 검정할 수 있었다. 작은 RNA를 검정하기 위해, 도 58의 장치를 재배치하였다: 1) 짧은 RNA를 폴리아데닐화하기 위한 혼합물을 함유하는 R3, 2) 실시간 PCR 프라이머 및 실시간 매스터 믹스를 함유하는 R4, 및 3) R1 내의 RT 혼합물은 T7 프로모터 대신에 실시간 PCR 증폭을 위한 5' 서열을 갖는 폴리T 서열을 함유할 수 있었다. 시약 공급원으로서 R3을 사용하여 폴리아데닐화된 작은 RNA를 생성하기 위해 작은 RNA에 제1 폴리A 꼬리를 첨가한 것을 제외하고 실시예 9에 기재된 바와 같이 반응을 진행하였다. 실시예 9에 기재된 바와 같이 역전사 및 제2 가닥 합성을 작동시킬 수 있었다. 그 후, R4로부터의 실시간 PCR 프라이머 및 매스터 믹스를 제2 가닥 생성물과 혼합함으로써 T7 전사의 최종 단계를 대체하였다. 그 후, 실시간 검출을 갖는 PCR을 사용하여 실시간 PCR 프라이머를 증폭하였다. 증폭은 오프-마이크로칩 또는 검출기에서 일어날 수 있고, 열 순환을 마이크로칩 상에 또는 가열 블록 (509) 내에 혼입할 수 있었다. 마이크로칩 상의 실시간 PCR은 예를 들어 요바노비치(Jovanovich, S.), 블라가(I. Blaga) 및 랭크(D. Rank). 마이크로유체 장치. 미국 특허 공개 제2007/0248958호 및 PCT 공개 제WO/2006/032044호에 이미 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본원에 참고로 도입된다. 폴리아데닐화 단계를 생략함으로써 본 실시예에 기재된 바와 같이 다른 mRNA를 가공할 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다.

본 발명의 바람직한 실시양태가 본원에 나타내고 기재되어 있으나, 이러한 실시양태는 예시로만 제공된다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명에서 벗어나지 않고 수많은 변형, 변화 및 치환이 이제 당업자에게 일어날 것이다. 예를 들어, 임의의 MOVe 밸브, 펌프, 라우터 또는 본원에 기재된 다른 MOVe 장치는 임의의 공압식으로 구동되는 밸브, 펌프 라우터 또는 다른 장치로 대체될 수 있다. 본원에 기재된 본 발명의 실시양태에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 하기 청구항은 본 발명의 범위를 규정하고, 이들 청구항의 범위 내의 방법 및 구조 및 그의 균등물은 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 의도된다.

Claims (94)

  1. 마이크로유체 마이크로칩 내의 하나 이상의 마이크로유체 채널에 유체적으로 연결된 하나 이상의 포트 천공부를 포함하는 마이크로유체 마이크로칩 (여기서, 상기 채널은 채널을 통한 유체의 이동을 제어하는 하나 이상의 밸브를 포함함); 및
    마이크로칩에 맞물리고 챔버를 포함하는 카트리지 (여기서, 상기 챔버는 상기 마이크로유체 마이크로칩의 포트 천공부와 각각 일렬로 정렬된 2개의 챔버 천공부를 포함함)
    를 포함하는 장치.
  2. 제1항에 있어서, 상기 카트리지가 하나 이상의 샘플 또는 하나의 시약을 수용하도록 개질된 것인 장치.
  3. 제1항에 있어서, 상기 카트리지가 다른 마이크로칩에 맞물린 다른 카트리지에 유체적으로 연결된 것인 장치.
  4. 제1항에 있어서, 상기 카트리지가 2개 이상의 챔버를 포함하는 것인 장치.
  5. 제4항에 있어서, 상기 2개 이상의 챔버 중 하나 이상이 이동가능한 자석에 인접한 것인 장치.
  6. 제4항에 있어서, 상기 2개 이상의 챔버 중 하나 이상이 온도 제어되는 것인 장치.
  7. 제4항에 있어서, 상기 2개 이상의 챔버 중 하나 이상이 필터를 포함하는 것인 장치.
  8. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 챔버가 5 ㎕ 이상의 유체 부피를 포함하는 것인 장치.
  9. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 챔버가 10 ㎕ 이상의 유체 부피를 포함하는 것인 장치.
  10. 제1항에 있어서, 상기 카트리지의 유체 부피가 상기 마이크로유체 마이크로칩의 유체 부피의 100 X인 장치.
  11. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 챔버 중 하나가 필터를 더 포함하는 것인 장치.
  12. 제1항에 있어서, 카트리지 또는 마이크로유체 마이크로칩에 자기장을 가하기 위한 자석을 더 포함하는 장치.
  13. 제1항에 있어서, 밸브가 공압식으로 구동되는 것인 장치.
  14. 제1항에 있어서, 상기 카트리지가 상기 하나 이상의 시약 또는 상기 하나 이상의 샘플의 전달을 위한 하나 이상의 압력원에 연결되도록 개질된 것인 장치.
  15. 제1항에 있어서, 상기 압력원이 카트리지에 양압 또는 음압을 제공하는 것인 장치.
  16. 제14항에 있어서, 상기 하나 이상의 압력원이 공압 솔레노이드에 의해 제어되는 것인 장치.
  17. 제14항에 있어서, 상기 하나 이상의 압력원이 공압 매니폴드인 장치.
  18. 제1항에 있어서, 마이크로유체 마이크로칩이 유체층, 엘라스토머층 및 공압층을 포함하는 것인 장치.
  19. 제1항에 있어서, 상기 카트리지가 하나 이상의 입력 포트를 더 포함하며,
    상기 하나 이상의 입력 포트가 전달 장치와 맞물리도록 개질되고,
    상기 전달 장치가 상기 마이크로유체 마이크로칩의 유체층에 유체적으로 연결되고;
    상기 하나 이상의 챔버 중 하나가 상기 마이크로유체 마이크로칩의 유체층에 유체적으로 연결된 폐쇄된 반응 챔버인 장치.
  20. 제19항에 있어서, 상기 전달 장치가 온도 조절기에 열로 커플링된 것인 장치.
  21. 제19항에 있어서, 상기 전달 장치가 주사기인 장치.
  22. 제1항에 있어서, 상기 카트리지가
    상기 샘플로부터의 하나 이상의 구성성분을 풍부하게 하도록 설계되고,
    하나 이상의 샘플 입력 포트를 포함하며,
    상기 하나 이상의 챔버가 비드를 포함하는 폐쇄된 반응 챔버이고,
    상기 비드가 상기 하나 이상의 구성성분에 결합하는 것인 장치.
  23. 제1항에 있어서, 카트리지가 핵산을 증폭시키기 위한 시약을 포함하는 하나 이상의 시약 저장소를 더 포함하고, 하나 이상의 시약 저장소가 마이크로칩을 통해 챔버에 유체적으로 연결된 것인 장치.
  24. 제23항에 있어서, 카트리지가 증폭된 핵산에 결합하기 위한 비드를 포함하는 하나 이상의 비드 저장소를 더 포함하고, 하나 이상의 비드 저장소가 마이크로칩을 통해 챔버에 유체적으로 연결된 것인 장치.
  25. 제22항에 있어서, 상기 비드가 상자성 비드 또는 유리 비드인 장치.
  26. 제22항에 있어서, 비드로의 하나 이상의 구성성분의 상기 결합이 가역적인 것인 장치.
  27. 제22항에 있어서, 상기 비드가 상자성 비드이고,
    상기 폐쇄된 반응 챔버의 벽으로 상기 상자성 비드를 끌어당길 수 있는 이동가능한 자석을 더 포함하는 것인 장치.
  28. 제22항에 있어서, 상기 카트리지가 샘플로부터의 하나 이상의 구성성분을 풍부하게 하도록 설계되고, 상기 하나 이상의 구성성분이 DNA, RNA, 마이크로RNA, siRNA, 단백질, 지질 또는 다당류인 장치.
  29. (a) 제1항의 장치를 제공하는 단계, 및
    (b) 상기 챔버 내에서 하나 이상의 효소 반응을 수행하는 단계
    를 포함하는, 생화학 반응을 수행하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 하나 이상의 효소 반응이 라이게이션, 평활화, 닉(nick) 복구, 변성, 중합, 가수분해, 인산화 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인 방법.
  31. 제29항에 있어서, 고체상 입자를 사용하여 상기 효소 반응의 생성물을 분리하는 것을 더 포함하는 방법.
  32. (a) 제19항의 장치의 상기 입력 포트에 전달 장치를 맞물리게 하는 단계,
    (b) 풍부화에 대한 상기 하나 이상의 구성성분의 이용율을 증가시키기 위해 상기 샘플을 하나 이상의 시약으로 처리하는 단계,
    (c) 상기 하나 이상의 구성성분을 상기 카트리지의 상기 하나 이상의 반응 챔버로 전달하는 단계,
    (d) 상기 하나 이상의 폐쇄된 반응 챔버에서 상기 구성성분을 하나 이상의 입자에 결합시키는 단계,
    (e) 폐기물을 제거하기 위해 상기 입자 결합된 구성성분을 세척하는 단계, 및
    (f) 상기 입자 결합된 구성성분을 용리시키는 단계
    를 포함하는, 샘플로부터의 하나 이상의 구성성분을 풍부하게 하는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 전달이 마이크로유체 마이크로칩의 상기 하나 이상의 밸브를 통해 상기 하나 이상의 구성성분을 상기 하나 이상의 반응 챔버로 펌핑하는 것을 포함하는 것인 방법.
  34. 제32항에 있어서, 상기 결합이 마이크로유체 마이크로칩의 상기 하나 이상의 밸브를 통해 상기 입자를 카트리지 내의 시약 포트로부터 상기 하나 이상의 반응 챔버로 펌핑하는 것을 포함하는 것인 방법.
  35. 제29항에 있어서, 상기 입자가 상자성 비드, 나노입자, 수지 또는 고체상 입자인 방법.
  36. 제29항에 있어서, 상기 하나 이상의 구성성분이 DNA, RNA, 마이크로RNA, siRNA, 단백질, 지질 또는 다당류인 방법.
  37. 제29항에 있어서, 단계 (b)가 상기 전달 장치를 열로 조절하는 것을 더 포함하는 것인 방법.
  38. 제29항에 있어서, 단계 (b)가 풍부화에 대한 상기 하나 이상의 구성성분의 이용율을 증가시키기 위해 용해 시약 또는 구성성분 단리 시약을 상기 카트리지 상의 시약 포트로부터 상기 전달 장치로 전달하는 것을 더 포함하는 것인 방법.
  39. 제29항에 있어서, 단계 (d)의 비드가 상자성 비드인 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 세척 단계 (e)가 이동가능한 자석에 의해 상기 상자성 비드를 끌어당기는 것을 포함하는 것인 방법.
  41. 제29항에 있어서, 상기 마이크로유체 마이크로칩이 상기 폐기물의 유동을 제2 방향으로 향하게 하는 것인 방법.
  42. 제29항에 있어서, 단계 (c)가 상기 하나 이상의 구성성분을 상기 카트리지의 상기 하나 이상의 폐쇄된 반응 챔버로 전달하기 위해 마이크로유체 마이크로칩 내의 공압식으로 구동되는 밸브 또는 외부 압력원을 사용하는 것을 포함하는 것인 방법.
  43. 제29항에 있어서, 외부 압력원이 마이크로유체 마이크로칩에 양압 또는 음압을 제공하는 것인 방법.
  44. 제29항에 있어서, 상기 샘플 전달 장치가 주사기인 방법.
  45. (a) (i) 마이크로유체 마이크로칩 내의 마이크로유체 채널에 유체적으로 연결된 포트 천공부를 포함하는 제1 마이크로유체 마이크로칩
    (여기서, 상기 채널은 채널을 통한 유체의 이동을 제어하는 하나 이상의 밸브를 포함함); 및
    (ii) 마이크로유체 마이크로칩에 맞물리고 하나 이상의 샘플 입력 포트, 하나 이상의 챔버, 출구 포트를 포함하는 카트리지
    (여기서, 샘플 입력 포트는 포트 천공부에 연결되고,
    상기 하나 이상의 출구 포트 중 하나 이상은 상기 제1 마이크로유체 마이크로칩의 출구 포트 천공부와 일렬로 정렬되고,
    상기 하나 이상의 챔버는 상기 제1 마이크로유체 마이크로칩의 유체층에 유체적으로 연결됨)
    를 포함하는 제1 유체 조작 모듈;
    (b) 반응 채널 (여기서, 상기 반응 채널은 상기 제1 마이크로칩 내에 함유되지 않음);
    (c) 온도 조절기
    (여기서, 상기 반응 채널은 상기 출구 포트에 유체적으로 연결된 상기 카트리지 상의 포트에 유체적으로 연결되고, 상기 반응 채널의 한 부분 이상은 상기 온도 조절기와 열 접촉함); 및
    (d) 마이크로유체 마이크로칩, 카트리지 또는 반응 채널에 자기장을 가하기 위한 자석
    을 포함하는 장치.
  46. 제45항에 있어서, 상기 자석이 상기 반응 채널에 인접한 것인 장치.
  47. 제45항에 있어서,
    상기 반응 채널을 통해 상기 제1 마이크로유체 마이크로칩에 유체적으로 연결된 제2 마이크로유체 마이크로칩
    을 더 포함하는 장치.
  48. 제45항에 있어서, 상기 온도 조절기가 펠티어(Peltier) 장치인 장치.
  49. 제45항에 있어서, 상자성 비드를 더 포함하는 장치.
  50. 핵산을 함유하는 샘플을 제45항의 장치로 전달하는 단계;
    온도 조절기와 열 접촉하는 반응 채널의 부분을 통해 핵산 및 유효량의 시약을 1회 이상 수송하는 단계;
    핵산을 증폭시키는 단계; 및
    증폭된 핵산을 분석하는 단계
    를 포함하는 방법.
  51. 제50항에 있어서, 온도 조절기를 사용하여 열순환을 수행하는 것을 더 포함하는 방법.
  52. 제50항에 있어서, 상기 시약이 중합효소 연쇄 반응 또는 순환 서열분석을 위한 시약인 방법.
  53. (a) 유체층, 구동층 및 공압층을 포함하는 제1 마이크로유체 마이크로칩
    (여기서, 유체층은 하나 이상의 마이크로유체 채널을 포함하고,
    상기 하나 이상의 마이크로유체 채널 중 하나 이상은 출구 천공부를 포함함);
    (b) 가요성 커넥터의 제1 말단에서 출구 천공부에 유체적으로 연결된 가요성 커넥터;
    (c) 상기 가요성 커넥터에 유체적으로 연결된 모세관; 및
    (d) 제1 전극 및 제2 전극
    (여기서, 제1 전극 및 제2 전극은 모세관 통로를 따라 전기장을 생성하도록 배치됨)
    을 포함하는 장치.
  54. 제53항에 있어서, 가요성 커넥터가 수술용 폴리(테트라플루오로에틸렌) 또는 규소 배관(tubing)인 장치.
  55. 제53항에 있어서, 가요성 커넥터가 탄성 배관인 장치.
  56. 제53항에 있어서, 가요성 커넥터가 약 1.5 내지 3 mm의 외부 직경 및 약 0.25 내지 0.5 mm의 내부 직경을 갖는 것인 장치.
  57. 제53항에 있어서, 가요성 커넥터가 또한 가요성 커넥터의 제2 말단에서 제2 마이크로유체 마이크로칩 또는 제1 마이크로유체 마이크로칩에 유체적으로 연결된 것인 장치.
  58. 제53항에 있어서, 가요성 커넥터가 캐뉼라, 업피트 배관, 마이크로배관 피팅(fitting) 또는 업처치(upchurch) 배관 어댑터에 의해 출구 천공부에 유체적으로 연결된 것인 장치.
  59. 제53항에 있어서, 모세관이 약 150 내지 500 마이크로미터의 외부 직경 및 약 10 내지 100 마이크로미터의 내부 직경을 갖는 것인 장치.
  60. 제53항에 있어서, 모세관이 폴리아미드 또는 폴리(테트라플루오로에틸렌) 코팅된 것인 장치.
  61. 제53항에 있어서, 모세관이 분리 겔을 포함하는 것인 장치.
  62. 제53항에 있어서, 모세관이 약 10 내지 100 cm 길이인 장치.
  63. 제53항에 있어서, 제1 전극이 포크형 전극인 장치.
  64. 제63항에 있어서, 상기 포크형 전극이 하나 이상의 전도성 채널 또는 하나 이상의 금속성 도체를 포함하는 것인 장치.
  65. 제53항에 있어서, 제1 전극 및 제2 전극이 약 25 내지 500 V/cm인 전기장을 생성하는 것인 장치.
  66. 유체층, 엘라스토머층 및 공압층을 포함하는 마이크로유체 마이크로칩에 조성물을 제공하는 단계;
    마이크로유체 마이크로칩에 유체적으로 연결된 가요성 커넥터로 조성물을 전달하는 단계;
    조성물을 모세관으로 이동시키기 위해 전기장을 제공하는 단계; 및
    크기 또는 전하를 기준으로 구성성분을 분리하기 위해 조성물에 대해 모세관 전기영동을 수행하는 단계
    를 포함하는 방법.
  67. 제66항에 있어서, 전기장이 약 25 내지 500 V/cm인 방법.
  68. 제66항에 있어서, 상기 튜브 내의 상기 조성물이 기체의 제1 및 제2 볼루스(bolus)에 인접하며, 기체의 상기 제1 볼루스가 상기 조성물의 상류에 있고, 기체의 상기 제2 볼루스가 상기 튜브 내의 상기 조성물의 하류에 있는 것인 방법.
  69. 제67항에 있어서, 기체의 상기 제1 및 제2 볼루스가 상기 조성물을 다른 조성물로부터 단리하는 것인 방법.
  70. 제66항에 있어서, 조성물이 핵산, 단백질, 지방산 또는 다당류인 하나 이상의 구성성분을 포함하는 것인 방법.
  71. 제70항에 있어서, 핵산이 마이크로RNA, DNA, RNA 또는 siRNA인 방법.
  72. (a) 로딩 채널에 유체적으로 연결된 분리 채널;
    (b) 로딩 채널 및 로딩 채널을 통해 분리 채널에 전기적으로 연결된 2개 이상의 전극을 포함하는 포크형 전극
    (여기서, 분리 채널과 로딩 채널 사이의 유체 연결부는 로딩 채널로의 2개의 전극의 전기 연결부 사이에 위치됨); 및
    (c) 로딩 채널에 유체적으로 연결된 공압식으로 구동되는 밸브
    를 포함하는 장치.
  73. 제72항에 있어서, 상기 포크형 전극과 전기 접촉하는 캐뉼라형 전극을 더 포함하며, 상기 캐뉼라형 전극의 내부 직경이 약 0.2 mm 이상인 장치.
  74. 제72항에 있어서, 상기 캐뉼라형 전극이 상기 분리 채널로의 기체의 주입을 감소시키도록 배치된 것인 장치.
  75. 제72항에 있어서, 분리 채널이 모세관이고, 모세관이 가요성 연결부를 사용하여 공압식으로 구동되는 밸브에 유체적으로 연결된 것인 장치.
  76. 제72항에 있어서, 분리 채널이 마이크로채널인 장치.
  77. 제72항에 있어서, 분리 채널 및 공압식으로 구동되는 밸브가 마이크로유체 마이크로칩 상에 집적된 것인 장치.
  78. 제72항에 있어서, 로딩 채널이 로딩 채널 용액을 포함하고, 분리 채널이 분리 채널 용액을 포함하고, 샘플 용액이 분리 채널 용액보다 더 낮은 전기 전도성을 갖는 것인 장치.
  79. 제72항에 있어서, 2개 이상의 전극이 분리 채널과 로딩 채널 사이의 유체 연결부의 어느 한 측면 상의 로딩 채널에 유체적으로 연결된 한 말단, 및 베이스 채널에 유체적으로 연결된 다른 말단 상에 있는 2개 이상의 마이크로채널을 포함하는 것인 장치.
  80. 제72항에 있어서, 2개 이상의 전극 각각이 전압원 및 로딩 채널에 전기적으로 연결된 금속성 도체인 장치.
  81. 결합되어 삼원 접합부를 형성하는 제1, 제2 및 제3 마이크로유체 채널을 포함하며,
    여기서 제1 마이크로유체 채널은 포크형 전극의 제1 전극에 전기적으로 연결되고,
    제2 마이크로유체 채널은 포크형 전극의 제2 전극에 전기적으로 연결되고,
    제1, 제2 및 제3 마이크로유체 채널은 각각 공압식으로 구동되는 밸브에 유체적으로 연결된 것인 장치.
  82. 제72항의 장치를 제공하는 단계;
    분리 채널에 분리 채널 용액을 제공하는 단계;
    로딩 채널에 조성물을 전달하는 단계 (여기서, 공압식으로 구동되는 밸브는 로딩 채널로의 조성물의 전달을 제어하는데 사용됨);
    포크형 전극을 사용하여 분리 채널을 따라 전기장을 가하는 단계; 및
    크기 또는 전하를 기준으로 구성성분을 분리하기 위해 조성물에 대해 모세관 전기영동을 수행하는 단계
    를 포함하는, 모세관 전기영동을 수행하는 방법.
  83. 제82항에 있어서, 조성물이 분리 채널 용액보다 더 낮은 전기 전도성을 갖는 것인 방법.
  84. 제82항에 있어서, 조성물이 상기 전기장의 적용에 의해 농축되는 것인 방법.
  85. (a) (1) 제1 밸브를 포함하는 제1 채널;
    (2) 제1 밸브의 한 측면 상에서 제1 채널과 교차하는 제2 채널;
    (3) 제1 밸브의 다른 측면 상에서 제1 채널과 교차하는 제3 채널
    (여기서, 제2 채널 또는 제3 채널 중 하나 이상은 T-밸브에서 제1 채널과 교차하거나, 또는 제2 채널 또는 제3 채널 중 하나 이상은 제2 밸브를 포함하고,
    제2 채널 및 제3 채널은 각각 포트에 연결됨)
    을 포함하는 마이크로유체 마이크로칩; 및
    (b) 유체가 제1 채널로부터 유체 루프로 유동할 수 있도록 포트에 제거가능하게 부착된 유체 루프
    를 포함하는 마이크로유체 장치.
  86. (a) 하나 이상의 공압식으로 구동되는 밸브를 포함하는 마이크로칩; 및
    (b) 마이크로유체 마이크로칩 내의 포트를 통해 하나 이상의 공압식으로 구동되는 밸브에 유체적으로 연결되고, 고정된 부피를 갖고, 제거가능한 샘플 루프
    를 포함하는 마이크로유체 장치.
  87. 제85항에 있어서, 상기 공압식으로 구동되는 밸브가 마이크로유체 장치 내의 하나 이상의 공압 채널에 의해 구동되는 것인 장치.
  88. 제85항에 있어서, 샘플 루프가 모세관 튜브를 포함하는 것인 장치.
  89. 제85항에 있어서, 샘플 루프가 제1 접합부 및 제2 접합부에서 관통형 마이크로유체 채널에 유체적으로 연결되고, 관통형 마이크로유체 공압식으로 구동되는 밸브가 제1 접합부와 제2 접합부 사이의 관통형 마이크로유체 채널에 위치된 것인 장치.
  90. 제89항에 있어서, 하나 이상의 접합부가 T-밸브를 포함하고, T-밸브의 폐쇄가 관통형 마이크로유체 채널을 통한 유체의 통과를 방지하지 않는 것인 장치.
  91. 제89항에 있어서, 샘플 루프가 제1 채널 및 제2 채널을 통해 관통형 마이크로유체 채널에 연결되고, 제1 채널 및 제2 채널 중 하나 이상이 샘플 루프 밸브를 포함하는 것인 장치.
  92. 원하는 부피를 포함하고 제거가능한 샘플 루프를 갖는 장치를 배치하는 단계;
    마이크로유체 장치 상의 하나 이상의 공압식으로 구동되는 밸브를 사용하여 샘플 루프를 고정된 부피의 유체로 충전하는 단계; 및
    마이크로유체 장치로 유체를 전달하는 단계
    를 포함하는, 마이크로유체 장치로 고정된 부피의 유체를 전달하는 방법.
  93. 제92항에 있어서, 샘플 루프 및 관통형 마이크로유체 채널이 제1 접합부 및 제2 접합부에서 유체적으로 연결되고, 하나 이상의 접합부가 T-밸브를 포함하는 것인 방법.
  94. 제93항에 있어서, 관통형 마이크로유체 채널이 제1 접합부와 제2 접합부 사이에 위치된 관통형 마이크로유체 밸브를 포함하는 것인 방법.
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