CN105734045B

CN105734045B - 一种基于微流控芯片的快速多通量提取血液样本dna的方法

Info

Publication number: CN105734045B
Application number: CN201410768138.6A
Authority: CN
Inventors: 秦建华; 苏文涛; 姜雷; 李艳峰
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2014-12-11
Filing date: 2014-12-11
Publication date: 2019-02-01
Anticipated expiration: 2034-12-11
Also published as: CN105734045A

Abstract

本发明提供了一种基于微流控芯片的快速多通量提取血液样本DNA的方法。所述微流控芯片为4层膜结构，分别为液路层、气路控制层、和磁铁控制层和玻璃基底层四部分；所述气体控制层位于液路层下方，所述基底层位于气体控制层下方；所述磁铁控制层位于基底层下方。该方法以微泵阀控制的微流控芯片为平台，利用微泵阀控制进气和抽气，从而实现血液样品、磁珠、清洗液和洗脱液的引入、混合，非DNA杂质的清洗直至DNA收集过程。该方法将血液样品DNA纯化的全过程集中到单个芯片上进行。另外，该方法具有快速、多通量、无人工操作等优势。

Description

一种基于微流控芯片的快速多通量提取血液样本DNA的方法

技术领域

本发明涉及一种血样样本基因组DNA的提取方法，具体涉及一种基于微流控芯片的快速多通量提取血液样本DNA的方法。

背景技术

基因组DNA的提取是进行分子生物学各方面研究的基础，是生命科学研究与应用中的关键技术。DNA样品制备的效率和质量，将直接影响后续实验的结果。经典方法中，从血液样品溶液中去除蛋白质采用酚/仿抽提，其标准程序是酚抽提一次，酚/仿抽提一次，氯仿抽提一次，有些情况下还要重复几次，这样就大大增加了工作量。同时，经典方法中用到的苯酚和氯仿对试验操作人员造成了极大的威胁；耗时繁琐的提取步骤也降低了核酸检测的速度。

微流控芯片平台将DNA纯化技术带入了一个崭新的阶段，在一块几平方厘米的芯片上，由网络化的微通道控制流体，可以完成从血液样本裂解、DNA特异性结合和洗脱的血液样品提取的全过程。基于该平台的方法用于血液样本基因组DNA提取具有如下优点：降低样品或试剂消耗；实现快速混合，缩短反应时间；具有高通量分析的潜能等。因此，本发明预期建立基于微流控芯片的快速多通量提取血液样本DNA的方法。

发明内容

本发明的目的是建立基于微流控芯片的快速多通量提取血液样本DNA的方法。该方法将血液样品DNA纯化的全过程集中到单个芯片上进行具有快速、多通量、无人工操作等优势。

一种微流控芯片，利用集成有气动泵阀的微流控芯片作为平台，通过操作气动微阀控制下述内容之一或其组合：样品的引入、样品的混合及核酸样品的收集。

所述微流控芯片为4层膜结构，分别为液路层、气路控制层、和磁铁控制层和玻璃基底层四部分；所述气体控制层位于液路层下方，所述基底层位于气体控制层下方；所述磁铁控制层位于基底层下方；

所述液路层包括上样缓冲液、磁珠、清洗液、DNA洗脱液入口，液体通道，流通池，样品池，储液池，储样池，DNA收集池，废液池，加入样品池的样品进入储样池；加入上样缓冲液、磁珠、清洗液、DNA洗脱液入口的液体在流通池产生的负压下，经液体通道进入储液池，与储样池的样品混合进入DNA收集池，废液池收集每一步产生的多余液体；

所述的气路控制层含有14个气阀，所述气阀由进气口、气体通道、气动微阀构成；气动微阀分别位于液体通道和储液池下方通过气动微阀控制液体通道的开关；

所述的磁铁控制层含有磁铁放置区域，磁铁放置区域的位置与储液池和储样池相对应。

所述的气动微阀由液路层1a和气路控制层1b之间的PDMS薄膜构成；液路层1a和气路控制层1b之间只通过气动微阀相联系，二者内部并不连通。

所述的14个气阀，具体分布和描述如下：1#气阀，2#气阀，3#气阀，4#气阀和6#气阀具1个呈细长方形的气动微阀，1#气阀，2#气阀，3#气阀，4#气阀的气动微阀位于上样缓冲液、磁珠、清洗液、DNA洗脱液入口的液体通道下方、6#气阀的气动微阀位于流通池的液体通道下方，控制相应液体通道开关；

7#气阀,8#气阀,10#气阀,12#气阀,13#气阀,14#气阀具4个呈细长方形的气动微阀，气动微阀分别位于四个混合区域的液体通道下方，可同时控制四个混合区域的液体通道开关，其中7#气阀控制进入储液池前的液体通道，8#气阀控制样品池至储样池之间的液体通道，10#气阀控制储液池至储样池之间的液体通道，12#气阀控制储样池至DNA收集池之间的液体通道，13#气阀控制储液池至废液池之间的液体通道，14#气阀控制储样池至废液池之间的液体通道；

5#气阀具1个呈圆形的气动微阀，位于流通池的下方，产生负压提供液体在液体通道中流动的动力；

9#气阀和11#气阀具4个呈正方形的气动微阀，气动微阀分别位于四个混合区域储液池、储样池的下方，控制液体进出储液池和储样池。

液路层中液体流动通道的横截面为弧形结构，气体控制层中气体通道的横截面积为矩形结构。

一种基于微流控芯片的快速多通量提取血液样本DNA的方法，采用上述微流控芯片，按照以下步骤进行：

(A)引入血液样本；

(B)引入用于DNA纯化的超顺硅珠；

(C)通入细胞裂解液对引入的细胞样品进行裂解，得到含核酸物质的细胞裂解液；

(D)从细胞裂解液中提取纯化DNA。

操作步骤A，血液样本的引入的具体过程包括：样品池4加血液样本，气动泵阀在8#气阀16和11#气阀19进气口抽气，血液样本进入储样池6。

操作步骤B和C中超顺硅珠和细胞裂解液引入的具体过程包括：在上样缓冲液、磁珠、清洗液、DNA洗脱液入口1加入超顺硅珠和细胞裂解液，开动气动泵阀在7#气阀15和9#气阀17进气口抽气，超顺硅珠细胞裂解液进入储液池5，开动气动泵阀在10#气阀18和11#气阀19进气口抽气，超顺硅珠细胞裂解液进入储样池6，与血液样本混合。

操作步骤D中进行血液样本DNA的纯化，具体过程为：在磁铁放置区域28放置磁铁，以固定核酸-磁纳米颗粒复合物，在上样缓冲液、磁珠、清洗液、DNA洗脱液入口1加入样品清洗液，样品洗脱液，开动气动泵阀在7#气阀15和9#气阀17进气口抽气，超顺硅珠细胞裂解液进入储液池5，开动气动泵阀在10#气阀18和11#气阀19进气口抽气，样品清洗液，样品洗脱液进入储样池6，完成血液样本DNA纯化过程，最后气动微阀在进气口9#气阀17和11#气阀19进气口进气，进气口10#气阀18和12#气阀20进气口抽气，收集含有纯化核酸的洗脱液到DNA收集池7。

上述试剂的配制：

(1)细胞裂解液(pH 6.1)：5M硫氰酸胍,20mM EDTA，1％(V/V)Triton X-100，0.1MTris–chloride，0.5％(V/V)20mg/mL蛋白酶K；

(2)样品洗涤液：80％(V/V)异丙醇水溶液；

(3)样品洗脱液(pH 7.5)：10mM Tris，1mM EDTA。

本发明的提取方法平均基因组DNA含量通过荧光分光光度计测定，结果为2.99土0.89ng/μL。以同样的样品试剂进行手工提取，结果为0.59土0.37ng/μL。即利用本方法提取DNA得率高于手工提取方法。

本发明的优点：

1.本发明将气动微阀用于液体的操控，通过调节气动微阀的顺序开启和关闭，灵活控制样品液体的自动引入和混合，无需使用注射泵。

2.本发明可以同时处理四个血液样本，具有通量优势，且血液样本间核酸纯化过程独立进行，互不干扰。

3.本发明将细胞裂解、非核酸物质清洗及核酸的收集纯化集中到一个微流控芯片上，具有时间短(DNA纯化过程约10min)、耗试剂量少(约10μL)的优点。

4.本发明采用采用微泵阀系统实现了核酸纯化各步骤的自动运行，避免了人为操作，减少误差，实现了传统方法难以实现的时空分辨信息。

附图说明

图1为本发明微流控核酸纯化芯片平面结构示意图。a液路层结构；b气路层结构；c磁铁控制层结构，d各层组合位置效果图；

其中：1上样缓冲液、磁珠、清洗液、DNA洗脱液入口；2液体通道；3流通池；4样品池；5储液池；6储样池；7DNA收集池；8废液池；9为1#气阀，10为2#气阀，11为3#气阀，12为4#气阀，13为5#气阀，14为6#气阀，15为7#气阀，16为8#气阀。17为9#气阀，18为10#气阀，19为11#气阀，20为12#气阀，21为13#气阀，22为14#气阀，23为进气口，24为气体通道，25为长方形气动微阀,26为圆形气动微阀，27为方形气动微阀，28磁铁放置区域；29混合区域。图2基于微流控芯片DNA提取流程图。

图3基于本发明方法和传统手工提取方法用于血液样本DNA提取结果。

图4血液样本DNA纯化的收集液进行PCR扩增的产物电泳图。

具体实施方式

本发明所用缓冲液配制方法为：

(1)细胞裂解液(pH 6.1)：5M硫氰酸胍,20mM EDTA，1％Triton X-100，0.1M Tris–chloride，0.5％20mg/mL蛋白酶K；

(2)样品洗涤液：80％异丙醇水溶液；

(3)样品洗脱液(pH 7.5)：10mM Tris，1mM EDTA。

一种微流控芯片，利用集成有气动泵阀的PDMS微流控芯片作为平台，通过操作气动微阀控制下述内容之一或其组合：样品的引入、样品的混合及核酸样品的收集。

所述微流控芯片如图1所示，为4层膜结构，分别为液路层、气路控制层、和磁铁控制层和玻璃基底层四部分；所述气体控制层位于液路层下方，所述基底层位于气体控制层下方；所述磁铁控制层位于基底层下方，

所述液路层包括上样缓冲液、磁珠、清洗液、DNA洗脱液入口1；液体通道2；流通池3；样品池4；储液池5；储样池6；DNA收集池7；废液池8，加入样品池4的样品进入储样池6；加入上样缓冲液、磁珠、清洗液、DNA洗脱液入口1的液体在流通池3产生的负压下，经液体通道2进入储液池5，与储样池6的样品混合进入DNA收集池7，废液池8收集每一步产生的多余液体；

所述的气路控制层含有14个气阀，所述气阀由进气口23、气体通道24、气动微阀构成；气动微阀分别位于液体通道2和储液池5下方通过气动微阀控制液体通道2的开关；

所述的磁铁控制层含有磁铁放置区域28，磁铁放置区域28的位置与储液池5和储样池6相对应。

所述的气动微阀由液路层和气路控制层之间的PDMS薄膜构成；液路层和气路控制层之间只通过气动微阀相联系，二者内部并不连通。

所述的14个气阀，具体分布和描述如下：

1#气阀9，2#气阀10，3#气阀11，4#气阀12和6#气阀14具1个呈细长方形的气动微阀，1#气阀9，2#气阀10，3#气阀11，4#气阀12的气动微阀位于上样缓冲液、磁珠、清洗液、DNA洗脱液入口1的液体通道2下方、6#气阀14的气动微阀位于流通池3的液体通道下方，控制相应液体通道开关；

7#气阀15,8#气阀16,10#气阀18,12#气阀20,13#气阀21,14#气阀22具4个呈细长方形的气动微阀，气动微阀分别位于四个混合区域的液体通道2下方，可同时控制四个混合区域的液体通道开关，其中7#气阀15控制进入储液池5前的液体通道，8#气阀16控制样品池4至储样池6之间的液体通道，10#气阀18控制储液池5至储样池6之间的液体通道，12#气阀20控制储样池6至DNA收集池7之间的液体通道，13#气阀21控制储液池5至废液池8之间的液体通道，14#气阀22控制储样池6至废液池8之间的液体通道；

5#气阀13具1个呈圆形的气动微阀，位于流通池3的下方，产生负压提供液体在液体通道中流动的动力；

9#气阀17和11#气阀19具4个呈正方形的气动微阀，气动微阀分别位于四个混合区域储液池5、储样池6的下方，控制液体进出储液池5和储样池6。

具体控制方式如下所述：打开1#气阀，7#气阀，使上样缓冲液、磁珠、清洗液、DNA洗脱液入口1至储液池5的液体通道联通；上样缓冲液、磁珠、清洗液、DNA洗脱液入口1加入液体，打开5#气阀，9#气阀，产生负压，使液体由上样缓冲液、磁珠、清洗液、DNA洗脱液入口1进入储液池5；打开6#气阀，14#气阀，使流通池3、储液池5至废液池8联通，多余液体进入废液池8。

打开8#气阀，使样品池4至储样池6的液体通道联通；样品池4加入样品，打开11#气阀，产生负压，使样品由样品池4进入储样池6；打开14#气阀，使样品池6至废液池8的液体通道联通，多余样品进入废液池8.

打开9#气阀，使储液池5至储样池6液体通道联通；打开11#气阀，产生负压，使样品由储液池5进入储样池6与样品混合；打开12#气阀，使储样池6至DNA收集池7的液体通道联通，混合样品进入DNA收集池7。

所述液路层1a中液体流动通道的横截面为弧形结构，气体控制层1b中气体通道的横截面积为矩形结构。

一种基于微流控芯片的快速多通量提取血液样本DNA的方法，如图2所示，采用上述微流控芯片，按照以下步骤进行：

(A)引入血液样本；

(B)引入用于DNA纯化的超顺硅珠；

(D)从细胞裂解液中提取纯化DNA。

操作步骤D中进行血液样本DNA的纯化，具体过程为：在磁铁放置区域28放置磁铁，以固定核酸-磁纳米颗粒复合物，在上样缓冲液、磁珠、清洗液、DNA洗脱液入口1加入样品清洗液，样品洗脱液，开动气动泵阀在7#气阀15和9#气阀17进气口抽气，超顺硅珠细胞裂解液进入储液池5，开动气动泵阀在10#气阀18和11#气阀19进气口抽气，样品清洗液，样品洗脱液进入储样池6，完成血液样本DNA纯化过程，最后气动微阀在进气口9#气阀17和11#气阀19进气口进气，进气口10#气阀18和12#气阀20进气口抽气，收集含有纯化核酸的洗脱液到DNA收集池7。采用发明方法和传统手工提取方法用于血液样本DNA提取结果如图3所示。

具体步骤包括：

1.将含有裂解的细胞溶液与超顺磁性纳米颗粒充分混合，在pH 6.1酸性条件下，核酸与超顺磁性纳米颗粒相结合形成核酸-磁纳米颗粒复合物而被固定；

2.通入洗涤液对未结合到超顺磁性纳米颗粒上的蛋白质、脂类细胞杂质成分进行洗涤；

3、通入pH 7.5的碱性的缓冲液对核酸-磁纳米颗粒复合物进行洗脱，碱性条件下，核酸与超顺磁性纳米颗粒分离，收集含有纯化DNA的洗脱液。

纯化的DNA样本用于PCR扩增，所用引物序列为：

5’-AACTGTTGCTTTATAGGATTTT-3’(正义链)

5’-AGGAGCTTATTGATAACTCAGAC-3’(反义链)

扩增产物为人类基因组β-球蛋白基因650bp片段。

配制的25μL PCR反应液包括2.5μL 10XPCR缓冲液，0.5μL dNTP混合物(每种浓度为10mM),0.5μL正、反义引物(20μM)，0.2μL Ex-Taq DNA聚合酶(5U/μL)，2.5μL洗出液作为模板。PCR扩增在商品化的热循环仪GeneAmp^TM PCR System 2700(Applied Biosystems，Singapore)上进行。

PCR扩增条件为：95℃预变性5分钟，然后进行35个循环，包括94℃30秒、55℃30秒、72℃30秒，最后在72℃后延伸10分钟。利用自行搭建的激光诱导荧光(LIF)检测系统以及自制的玻璃芯片，对PCR产物进行芯片电泳的分离和检测。DNA筛分介质包括POP7分离胶，1×TTE缓冲液，及1μM GeneFinderTM荧光染料。检测场强为200V/cm，检测有效距离为4.5cm。结果见图4。

从芯片电泳结果(如图4所示)，可以看出，利用本发明所示方法从血液样本中纯化的基因组DNA可成功地进行PCR扩增，并且扩增产物(650bp)的量与常规方法(阳性对照)相当，说明本发明中基于微流控芯片的血液样本基因组DNA的纯化和萃取效率较高，从而为本发明在核酸分析中的应用奠定了基础。

Claims

1.一种基于微流控芯片的快速多通量提取血液样本DNA的方法，其特征在于,采用微流控芯片，按照以下步骤进行：

(A)引入血液样本；

(B)引入用于DNA纯化的超顺硅珠；

(D)从细胞裂解液中提取纯化DNA；

所述微流控芯片，利用集成有气动泵阀的微流控芯片作为平台，通过操作气动微阀控制下述内容之一或其组合：样品的引入、样品的混合及核酸样品的收集；

所述微流控芯片为4层膜结构，分别为液路层、气路控制层、和磁铁控制层和玻璃基底层四部分；所述气路控制层位于液路层下方，所述基底层位于气路控制层下方；所述磁铁控制层位于基底层下方；

所述的磁铁控制层含有磁铁放置区域，磁铁放置区域的位置与储液池和储样池相对应；

所述的气动微阀由液路层1a和气路控制层1b之间的PDMS薄膜构成；液路层1a和气路控制层1b之间只通过气动微阀相联系，二者内部并不连通；

所述的14个气阀，具体分布和描述如下：

1#气阀，2#气阀，3#气阀，4#气阀和6#气阀具1个呈细长方形的气动微阀，1#气阀，2#气阀，3#气阀，4#气阀的气动微阀位于上样缓冲液、磁珠、清洗液、DNA洗脱液入口的液体通道下方、6#气阀的气动微阀位于流通池的液体通道下方，控制相应液体通道开关；

2.按照权利要求1所述的基于微流控芯片的快速多通量提取血液样本DNA的方法，其特征在于操作步骤A，血液样本的引入的具体过程包括：样品池4加血液样本，气动泵阀在8#气阀16和11#气阀19进气口抽气，血液样本进入储样池6。

3.按照权利要求1所述的基于微流控芯片的快速多通量提取血液样本DNA的方法，其特征在于操作步骤B和C中超顺硅珠和细胞裂解液引入的具体过程包括：在上样缓冲液、磁珠、清洗液、DNA洗脱液入口1加入超顺硅珠和细胞裂解液，开动气动泵阀在7#气阀15和9#气阀17进气口抽气，超顺硅珠细胞裂解液进入储液池5，开动气动泵阀在10#气阀18和11#气阀19进气口抽气，超顺硅珠细胞裂解液进入储样池6，与血液样本混合。

4.按照权利要求1所述的基于微流控芯片的快速多通量提取血液样本DNA的方法，其特征在于所述操作步骤D中进行血液样本DNA的纯化，具体过程为：在磁铁放置区域28放置磁铁，以固定超顺硅珠，在上样缓冲液、磁珠、清洗液、DNA洗脱液入口1加入样品清洗液，样品洗脱液，开动气动泵阀在7#气阀15和9#气阀17进气口抽气，超顺硅珠细胞裂解液进入储液池5，开动气动泵阀在10#气阀18和11#气阀19进气口抽气，样品清洗液，样品洗脱液进入储样池6，完成血液样本DNA纯化过程，最后气动微阀在进气口9#气阀17和11#气阀19进气口进气，进气口10#气阀18和12#气阀20进气口抽气，收集含有纯化核酸的洗脱液到DNA收集池7。