CN108786940B - 基于磁珠的化学发光微流控芯片 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于磁珠的化学发光微流控芯片，包括芯片本体，该芯片本体设置有样品腔、反应腔和废液腔；样品腔通过样本进样管路与反应腔连通；所述反应腔的内壁呈圆弧形设置，且反应腔的内壁设置有通过强磁体磁性分离磁珠的磁吸富集区。因此，本发明所述的微流控芯片，在磁分离清洗步骤时，收集固定磁珠，磁珠能够保存，可以实现有效回收，避免清洗液的流通冲刷导致磁珠被洗丢的现象。
Description
技术领域
本发明公开了一种基于磁珠的化学发光微流控芯片。
背景技术
随着精准医疗和分级诊疗的迅速发展，体外诊断试剂越来越对检测的重复性和便携性这两个重要指标提出更高的要求。现阶段，小型的POCT快速诊断设备只能实现定性或者半定量的检测结果，同时检测试剂的灵敏度低，重复性差，而大型的化学发光设备价格昂贵，对于小型医院资金有限，样本量少，并不适合配备大型检测仪器，并且仅仅依靠大医院并不能完全覆盖所有的受众人群。因此开发操作简便，灵敏度高，重复性好，检测时间短的体外诊断试剂有着非常重大的临床意义和市场需求。
微流控芯片技术是通过对反应流程的结构进行微型化与集成化，将诊断试剂的功能最大限度地转移到便携的分析设备中甚至是芯片上的一种技术手段，因此本领域有一个更通俗的名称“芯片实验室”。微流控芯片容器容量在微升级，因此可以完成极少量的样品分析，对于常需面对微量分析问题的生物领域极为重要。由于微流控芯片容量小、样品用量小，所以反应时间短、扩散快、因此也节约了大量检测时间，使得该检测平台分析时间短、效率高。此外微流控芯片平台检测集成度高，微流控系统的可以将检测步骤中复杂的加样环节、温孵环节、清洗环节等步骤集成至芯片内部，大大简化了检测的流程，消除了测试中的人为操作步骤。正是由于微流控芯片技术的这些优点，使得它已经应用在生物医学、高通量药物合成筛选、农作物的优选优育、环境检测和保护、卫生免疫等众多领域有着非常重要的应用。
化学发光检测方法代表了目前灵敏度最高的检测方法，是一种通过化学反应过程中将发光试剂的化学能转化为光能的的现象，与传统的荧光检测或者放射同位素检测相比，化学发光不使用外来的激发光源，避免了背景光及瑞利散射等杂散光的干扰，并且能够达到甚至比荧光检测更高的灵敏度。同时化学发光检测系统具有仪器结构简单，操作方便，线性范围宽，分析速度快，价格便宜等优点，有利于微流控芯片分析系统的集成化和智能化，能实现真正意义上的微型化，因而成为微流控芯片最具吸引力的检测方法之一。
目前将微流控芯片和化学发光检测结合起来的专利以及学术文献并不多见，能够实现产业化的参考案例更加少。本质上来说微流控芯片通道内的多种液体需要按照预先设计的通道在特定时间内达到特定的位置参与反应，而实际情况并不一定理想，流体以及试剂的偏差会导致预定反应不充分或者不完全，使得反应结果不准确。针对化学发光的微流控芯片而言，该研究方向受限的原因主要有以下三点：
1. 化学发光反应时间与检测时间难以重合
由于芯片面积大小的限制,微通道长度一般不会太长。在有限长度的芯片管路内，待测组分需要保证其与发光试剂的反应能在极短的时间内完成，释放出尽可能多的光信号。否则，二者可能还没来得及发生反应完全，就已经进入废液池了，因此发光反应动力学曲线的时间轴需要尽可能多的与参加该反应的混合溶液流经检测区域的时间段相重合，才可以获得最佳的反应结果；
2.待测组分与发光试剂的混合效果好坏，对发光反应发射的光强度有着重要的影响
简单的层流运动使得发光反应的强度明显降低，如果二者能够在检测区域充分混合，则会大大提高化学发光检测的灵敏度；
3.磁珠试剂的把控困难
化学发光试剂中使用到的磁珠在芯片内部结构中易发生丢磁现象，导致一部分免疫复合物随着磁珠这一小颗粒损失掉，导致最终反应结果的测值波动较大。丢磁问题一部分是由于磁珠在反应过程中溶解困难，另一部分是由于芯片结构导致磁珠在磁分离时，分离的不彻底，从而被清洗掉。
总体来说化学发光分析步骤较为复杂，需要陆续添加各个组分进行反应，而每个反应步骤有需要进行孵育以及清洗，本发明针对上述三点受限因素，并将整个分析检测步骤整合为简单且快捷的方法，公开了一种使用磁颗粒的化学发光微流控芯片技术，同时实现检测的高效化以及准确性。
发明内容
本发明针对基于磁珠的化学发光微流控芯片，在清洗分离过程中出现的丢磁现象，设计了独特的芯片反应腔室结构，使得在磁分离清洗步骤时，收集固定磁珠，磁珠能够保存，可以实现有效回收，避免清洗液的流通冲刷导致磁珠被洗丢的现象。
为实现上述的技术目的，本发明将采取如下的技术方案：
一种基于磁珠的化学发光微流控芯片，包括芯片本体，该芯片本体设置有样品腔、反应腔和废液腔；样品腔通过样本进样管路与反应腔连通；所述反应腔的内壁呈圆弧形设置，且反应腔的内壁设置有通过强磁体磁性分离磁珠的磁吸富集区。
所述反应腔的内壁形状为椭圆形，且反应腔中,垂直于反应腔内液体流动方向的两侧，分别设置磁吸富集区。
所述磁吸富集区为紧靠着反应腔内壁设置，并相对于反应腔底部下陷的弧形凹槽。
所述弧形凹槽的槽深为0.1mm-0.2mm。
所述芯片本体分别设置有气路清洗管道入口、液路清洗管道入口以及显色液液路入口；气路清洗管道入口与气路清洗管道连通；液路清洗管道入口与液路清洗管道连接；显色液液路入口与显色液液路连接；且气路清洗管道与样本进样管路汇流后通过进样管道a与反应腔连通，液路清洗管道与显色液液路汇流后通过进样管道b与反应腔连通。
所述显色液液路入口能够与隔膜泵相连，可以实现底物高速地流入反应腔内。
所述反应腔能够与超声探头相连。
所述芯片本体为三片式结构，包括从上至下依次叠合的第一芯片层、第二芯片层和第三芯片层，其中：所述的样品腔，由设置于第三芯片层的样品池，设置于第二芯片层的进样孔，以及设置于第一芯片层上的样品腔上盖口拼接而成；
所述的反应腔，由设置于第三芯片层的反应池，设置于第二芯片层的反应池盖板，以及设置于第一芯片层上的观察视窗拼接而成；
所述反应池，呈椭圆形设置，并在该椭圆形反应池底部，垂直于反应池内液体流动方向的两侧，分别设置凹槽；同时，反应池内处于液体流动方向的中部位置处，并排设置有两个管道，分别为进样管道b、进样管道a；气路清洗管道与样本进样管路汇流后通过进样管道a与反应腔连通，液路清洗管道与显色液液路汇流后通过进样管道b与反应腔连通；
反应腔内涂覆有封闭液，以形成封闭层；
反应腔在第二芯片层的区域表面固定有磁珠，而在第三芯片层的区域表面固定标记抗体；
所述的废液腔，由设置于第三芯片层的废液池，设置于第二芯片层的废液腔中部的透气部和废液腔中部的通孔，以及设置于第一芯片层上的废液腔上盖板拼接而成；废液腔上盖板在与废液腔中部的透气部对应的位置处，设置有连通的透气孔；
所述第三芯片层还设有气路清洗管道、液路清洗管道、显色液液路；所述气路清洗管道与连通于样本池的样本进样管路交汇，所述液路清洗管道与显色液液路的流道交汇，且气路清洗管道与样本进样管路汇流后通过进样管道a与反应池连通，液路清洗管道与显色液液路汇流后通过进样管道b与反应池连通；反应池的出液口通过导电橡胶控制阀与废液池连通；
进样管道a、进样管道b与反应腔的连通入口处于反应池上侧，紧贴第三芯片层的上表面设置；同时，反应池的出液口也紧贴第三芯片层的上表面设置。
根据上述的技术方案，本发明具有如下的有益效果：
1、本发明应对基于磁珠的清洗分离过程中出现的丢磁现象，设计了独特凹槽型的芯片反应腔室结构，圆盘性的反应腔室结构在圆弧的两侧做了凹陷处理，其凹陷结构用于在磁分离清洗步骤时，收集固定磁珠，磁珠在凹槽内保存可以实现有效回收，避免清洗液的流通冲刷导致磁珠被洗丢的现象，而凹槽的设计深度在0.1-0.2mm之间，通过超声作用力，又可以实现富集的磁珠再度分散的情况。此外反应腔整体呈圆弧装设计结构，在清洗环节中，液体残留可以更少，检测本底可以更低。
2、本发明应对磁珠反应效率偏低，采用超声探头作为反应混匀的方式，对于磁分离后的磁珠，可以实现显色液与免疫磁珠的瞬间混匀，方便化学发光反应的进行，实现更高效的混合；应对绝大多数芯片清洗时产生的气泡问题，单独设计了气路清洗的管路装置，其气路清洗不仅可以将反应腔内液体的残留降至最低，同时还可以优化每次清洗的效果，消除反应腔内由于管路气压不均衡以及样本残留导致的气泡；
3、本发明应对加样效率不高，反应速度与化学发光速度不能完全重合的问题，设计采用隔膜泵的加样方法，实现显色液瞬间充满腔室，并且通过超声探头持续对反应腔室进行超声混匀处理，实现边注液边混合的同步效果。芯片在反应、清洗结束后，已经预先移动到光路检测模块，通过隔膜泵向芯片上预留的加样侧口定量注入显色液进行化学发光反应，与此同时，检测光路收集显色液注入后500ms内的发光信号，通过PMT光电倍增管对信号进行放大收集。
附图说明
图1为本发明所述微流控芯片的结构示意图；
图1中：1-第一芯片层；2-第二芯片层；3-第三芯片层；
图2是本发明所述第一芯片层的结构示意图；
其中：11-样本腔的上盖口；12-反应腔观察视窗；13-气路清洗管道的上接口；14-液路清洗管道的上接口；15-显色液路的上接口；16-导电橡胶检测口；17-导电橡胶下压口；18-废液腔上盖板的透气孔；
图3是本发明所述第二芯片层的结构示意图；
图3中：20-连接管道a；21-样品腔的进样孔；22-反应腔的反应池盖板；23-气路清洗管道的中间接口；24-液路清洗管道的中间接口；25-显色液路的中间接口；26-导电橡胶控制阀；27-废液腔的出气孔；28-废液腔中部的通孔；29-连接管道b；
图4是本发明所述第三芯片层的结构示意图；
图中：31-样品腔底部的样品池；32-反应腔底部的反应池；33-气路清洗管道的下接口；34-液路清洗管道的下接口；35-显色液路的下接口；36-废液腔底部的废液池；
图5是图4中样品池、反应池部分的局部放大图；
图6是本发明所述反应池所在部位的剖面图；
图6中：1-第一芯片层；2-第二芯片层；3-第三芯片层；321-反应池底部的左侧凹槽；322-进样管道b；323-进样管道a；324-反应池底部的右侧凹槽；
图7是本发明所述反应池所在部位剖面的立体结构示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图，对本发明作进一步详细说明。
如图1所示，本发明公开了一种基于磁珠的化学发光微流控芯片，包括芯片本体，所述芯片本体为三片式结构，包括从上至下依次叠合的第一芯片层、第二芯片层和第三芯片层，整体芯片具有三个腔室，分别为样品腔、反应腔以及废液腔。样品腔通过样本进样管路与反应腔连通；所述反应腔的内壁呈圆弧形设置，且反应腔的内壁设置有通过强磁体磁性分离磁珠的磁吸富集区。
本发明所述的反应腔，形状为椭圆形，有助于液体的混匀；并在该椭圆形反应腔处于长轴的两端底部，即附图中椭圆形反应腔的左侧和右侧，分别设置凹槽，以作为磁吸富集区使用。凹槽结构相对于反应腔的底面深度多0.1 mm--0.2 mm，且凹槽为平滑过度，无明显的折角或坡面，在外加磁场磁分离时，磁珠会优先在凹槽处富集并在清洗过程中，由于椭球形的腔体，凹槽结构尽可能少的受到液体的推动力，使得在清洗过程中磁珠的损失降低。所述磁吸富集区为设置于反应腔内壁的弧形凹槽。凹槽底部略低于反应腔的水平线，用于在磁分离时对磁珠进行保存，避免在清洗步骤时被洗丢，同时配合超声，分离后的磁珠又可以在短时间内重新复溶分散，便于清洗和显色反应。
所述芯片本体分别设置有气路清洗管道入口、液路清洗管道入口以及显色液液路入口；气路清洗管道入口与气路清洗管道连通；液路清洗管道入口与液路清洗管道连接；显色液液路入口与显色液液路连接；且气路清洗管道与样本进样管路汇流后依次通过连接管道a、进样管道a与反应腔连通，液路清洗管道与显色液液路汇流后依次通过连接管道b、进样管道b与反应腔连通；气路清洗管道与样本进样管路之间的汇流位点与连接管道a之间存在高度差，且气路清洗管道与样本进样管路之间的汇流位点低于连接管道a的入口，连接管道a的出口高于进样管道a的入口；液路清洗管道与显色液液路之间的汇流位点低于连接管道b的入口，连接管道b的出口高于进样管道b的入口，因此，连接管道a、连接管道b均能够抑制液体在气压变化后的回流现象，具有防回流功能。
所述显色液液路入口能够与隔膜泵相连。
所述反应腔能够与超声探头相连。
待测样品加入样本槽后通过气泵驱动，依次经过第一防回流装置、反应腔、导电橡胶控制阀、废液腔。其中：在反应腔室所处位置处的第二芯片层的背面以及第三芯片层的正面均涂覆有封闭液形成的封闭层，第二芯片层的反应腔区域表面固定有磁珠，而第三芯片层的反应腔区域表面固定标记抗体。导电橡胶控制阀的检测工作原理在于液体流过时导电橡胶的电容值会产生变化。
因此，本发明针对磁珠清洗时出现的丢磁问题进行优化改善，而设计的圆盘状反应腔室，不仅可以改善液体在反应腔内的残留情况，避免磁珠卡在芯片棱角内。同时额外设计的凹槽结构（磁吸富集区）提供了磁分离时，磁珠的分离位置，避免清洗液的冲刷导致部分磁珠的洗脱，凹槽的设计并不影响磁珠在超声作用下的重悬，且凹槽的设计避免了磁珠在显色液注入后过早的与其大面积接触，可以在超声后比较一致形成化学发光反应。
以下将结合附图详细地说明本发明的一个具体实施例。
如图1至6所示，本发明所述的样品腔，由设置于第三芯片层的样品池31，设置于第二芯片层的进样孔21，以及设置于第一芯片层上的样品腔上盖口11拼接而成；
如图1至6所示，本发明所述的反应腔，由设置于第三芯片层的反应池32，设置于第二芯片层的反应池盖板22，以及设置于第一芯片层上的观察视窗12拼接而成；
所述反应池32，如图5-图7所示，呈椭圆形设置，并在该椭圆形反应池底部，处于长轴方向的两端，即沿着流体流动的两端，分别设置凹槽，分别与附图中左侧凹槽321、右侧凹槽324对应，同时，处于长轴方向的中部位置处，并排设置有两个管道，分别为进样管道b322，进样管道a323；气路清洗管道与样本进样管路汇流后依次通过连接管道a、进样管道a与反应腔连通，液路清洗管道与显色液液路汇流后依次通过连接管道b、进样管道b与反应腔连通。连接管道a、连接管道b设置于第二芯片层；气路清洗管道、液路清洗管道与显色液液路均设置于第三芯片层。
如图1至6所示，本发明所述的废液腔，由设置于第三芯片层的废液池36，设置于第二芯片层的废液腔的出气孔27和废液腔中部的通孔28，以及设置于第一芯片层上的废液腔上盖板拼接而成；废液腔上盖板在与废液腔的出气孔27对应的位置处，设置有连通的透气孔18。
第一芯片层上设置有气路清洗管道的上接口、液路清洗管道的上接口、显色液路的上接口，
第二芯片层上设置有气路清洗管道的中间接口、液路清洗管道的中间接口、显色液路的中间接口以及安装导电橡胶控制阀的部位。
1. 芯片结构上侧口进样口增加至3个，从上至下分别为气路清洗管道，液路清洗管道以及显色液液路入口，其中气路清洗管路与样本进样口的流道合并，气路管道和样本管道合用一份管道。液路清洗管道管道与显色液管道合并使用一份管道，避免样本中的组分与显色液产生反应，形成污染，造成假阳性，而清洗液组分较为单一，经过验证，洗涤剂并不会导致显色液的反应产生发光，因此不存在污染的风险。两条管路并不形成交汇，单独进入反应腔室内，管道入口于反应腔上侧，紧贴芯片表面，而反应腔有一定深度，流出管道也位于芯片表层，使得液体可以充分留存在反应腔室内部，待液体填充满后才能流出。
气路清洗可以有效清除流道中的样本残留，避免反应结束后样本的继续干扰。气路清洗后同时也可以避免在检测不同类型样本时，液路清洗之前产生较多的气泡。液路清洗在气路清洗之后，液路清洗完成对反应腔内液体的置换，每次液路清洗前使用气路对反应腔进行吹干，避免清洗之间的交叉污染。气路液路的两种清洗模式，可以最大限度的降低反应的本底值，消除样本干扰。
2. 芯片的第一层包含样本腔的上口，芯片气路、液路清洗管道以及显色液路的上口，导电橡胶上口，废液腔的上盖口。其中样本上盖口结构较为简单，与第二层芯片的样本口处的结构构成密封圈环形结构，反应腔处做镂空处理，设计为反应观察腔，芯片结构的下端平行分别设计了气路清洗管道，液路清洗管道以及显色液液路开口，在此三通路开口右侧为导电橡胶开口，最右侧为废液腔的上盖口。
3. 微流控芯片的第二层反面的反应腔体结构中固定有标记抗体，芯片预先使用隔离缓冲液进行涂覆并烘干，在塑料芯片的表层形成一层保护膜后再加入标记抗体，通过真空抽干的方式固定在芯片内部，待加入样本以及稀释液后，标记抗体可重新复溶并与待测物反应，而隔离组分（主要成分为牛血清白蛋白，海藻糖、甘露醇以及聚电解质）不参与反应，同时可保持标记抗体的生物活性，并避免与芯片发生非特异吸附结合。第二层结构的正面包含圆锥型样本槽，样本槽下端包含通气口，样本槽背部为坡面开口设计，可配合滤血垫装置的安放。其侧部的气路清洗管道、液路清洗管道以及显色液液路的开口填装硅胶垫密封装置，右方填装导电橡胶，芯片底部废液腔填装吸水垫，废液腔上端为通大气开口。第二层芯片正面包含监测窗口，方便观测反应情况。
Claims (5)
1.一种基于磁珠的化学发光微流控芯片，包括芯片本体，该芯片本体设置有样品腔、反应腔和废液腔；样品腔通过样本进样管路与反应腔连通；其特征在于，所述反应腔的内壁呈圆弧形设置，且反应腔的内壁设置有通过强磁体磁性分离磁珠的磁吸富集区；
所述反应腔的内壁形状为椭圆形，且反应腔中，垂直于反应腔内液体流动方向的两侧，分别设置磁吸富集区；
所述磁吸富集区为紧靠着反应腔内壁设置，并相对于反应腔底部下陷的弧形凹槽；
所述芯片本体为三片式结构，包括从上至下依次叠合的第一芯片层、第二芯片层和第三芯片层，其中：所述的样品腔，由设置于第三芯片层的样品池，设置于第二芯片层的进样孔，以及设置于第一芯片层上的样品腔上盖口拼接而成；
所述的反应腔，由设置于第三芯片层的反应池，设置于第二芯片层的反应池盖板，以及设置于第一芯片层上的观察视窗拼接而成；
处于反应池长轴方向的中部位置处，并排设置有两个管道，分别为进样管道b、进样管道a；所述芯片本体分别设置有气路清洗管道入口、液路清洗管道入口以及显色液液路入口；气路清洗管道入口与气路清洗管道连通；液路清洗管道入口与液路清洗管道连接；显色液液路入口与显色液液路连接；且气路清洗管道与样本进样管路汇流后通过进样管道a与反应腔连通，液路清洗管道与显色液液路汇流后通过进样管道b与反应腔连通。
2.根据权利要求1所述的基于磁珠的化学发光微流控芯片，其特征在于，所述弧形凹槽的槽深为0.1mm-0.2mm。
3.根据权利要求1所述的基于磁珠的化学发光微流控芯片，其特征在于，所述显色液液路入口能够与隔膜泵相连。
4.根据权利要求1所述的基于磁珠的化学发光微流控芯片，其特征在于，所述反应腔能够与超声探头相连。
5.根据权利要求1所述的基于磁珠的化学发光微流控芯片，其特征在于，所述反应池，呈椭圆形设置，并在该椭圆形反应池底部，垂直于反应池内液体流动方向的两侧，分别设置凹槽；同时，反应池内处于液体流动方向的中部位置处，并排设置有两个管道，分别为进样管道b、进样管道a；气路清洗管道与样本进样管路汇流后通过进样管道a与反应腔连通，液路清洗管道与显色液液路汇流后通过进样管道b与反应腔连通；
反应腔内涂覆有封闭液，以形成封闭层；
反应腔在第二芯片层的区域表面固定有磁珠，而在第三芯片层的区域表面固定标记抗体；
所述的废液腔，由设置于第三芯片层的废液池，设置于第二芯片层的废液腔中部的透气部和废液腔中部的通孔，以及设置于第一芯片层上的废液腔上盖板拼接而成；废液腔上盖板在与废液腔中部的透气部对应的位置处，设置有连通的透气孔；
所述第三芯片层还设有气路清洗管道、液路清洗管道、显色液液路；所述气路清洗管道与连通于样本池的样本进样管路交汇，所述液路清洗管道与显色液液路的流道交汇，且气路清洗管道与样本进样管路汇流后通过进样管道a与反应池连通，液路清洗管道与显色液液路汇流后通过进样管道b与反应池连通；反应池的出液口通过导电橡胶控制阀与废液池连通；
进样管道a、进样管道b与反应腔的连通入口处于反应池上侧，紧贴第三芯片层的上表面设置；同时，反应池的出液口也紧贴第三芯片层的上表面设置。
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