CN108126765A - Elisa检测微流控芯片和elisa检测微流控芯片体系以及它们的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微流控芯片ELISA检测技术领域，特别涉及ELISA检测微流控芯片和ELISA检测微流控芯片体系以及它们的应用。芯片包括：进样单元(1)、储液单元(2)、反应单元(3)及废液单元(4)；该微流控芯片还包括用于对待检样本定量的第一定量单元(5)，第一定量单元包括第一狭缝(51)、以及由第一狭缝隔开的第一样本腔室(52)和第二样本腔室(53)；第一样本腔室与所述进样单元相通，第二样本腔室与所述废液单元相通。芯片体系由上中下三层组成；中层为所述芯片；上下层用于覆盖封闭中层；上层有与进样单元连接的进样孔，及对应储液单元的让位孔。所述芯片检测过程简单，可对反应样本进行定量，灵敏度高、重复性强。

Description

ELISA检测微流控芯片和ELISA检测微流控芯片体系以及它们 的应用
技术领域
本发明涉及微流控芯片ELISA检测技术领域，特别涉及一种ELISA检测微流控芯片和一种ELISA检测微流控芯片体系，以及它们在ELISA检测中的应用。
背景技术
微流控芯片技术(microfluidics)又被称为微流控芯片实验室或芯片实验室(lab-on-a-chip)，指的是在一块几平方厘米的芯片上构建的化学或生物实验室，它把化学和生物学等领域中所涉及的样品制备，反应，分离，检测，细胞培养，分选，裂解等基本操作单元集成到一块很小的芯片上，由微通道形成网络，以可控流体贯穿整个系统，用以实现生物，化学，医学诊断等领域中的各种功能。
微流控芯片技术的基本特征和最大优势是：多种单元结构在微小的芯片平台上可以灵活组合使得芯片设计上灵活多变且功能齐全；微小的芯片内部结构单元所需要的检测样本量非常少，且微结构单元的大比表面积允许内部试剂快速扩散以实现快速反应和检测；微流控芯片一般是由配套仪器自动完成内部反应，故而在实际测试过程中，微流控芯片技术可以减少对医学检测人员的技术要求，降低检测的人为失误，进而降低患者的医学检测成本；微流控芯片技术由于采用仪器自动化完成，故而内部反应过程完全可控，如此可以得到更加准确，更加灵敏的检测数据。
在医学检测领域中，体外诊断(In-Vitro-Diagnostics,IVD)是一个非常重要的分支，是指在人体体外，对来源于人体的样本(如血液，尿液，唾液等体液)进行检测从而获取临床诊断信息，根据该信息来判断受检者是否患有某种疾病或经受某种病菌感染的诊断方法。目前，随着生物技术，特别是生物化学，免疫学，分子生物学的快速发展，体外诊断根据检测原理和检测方法主要有生化诊断，免疫诊断，分子诊断，微生物诊断，凝血类诊断，流式细胞诊断等方面，其中生化，免疫，分子诊断是目前我国体外诊断的主要细分领域。
在免疫诊断领域中，目前所使用的检测方法根据原理主要有，胶体金法，乳胶比浊法，荧光免疫法，时间分辨荧光法，酶联免疫吸附测定法(ELISA)，化学发光法。其中胶体金法检测范围有限，准确度不高，乳胶比浊法虽然简单直观，但是只能针对特定体液蛋白质，而且检测范围比较窄，荧光免疫法只是在细菌，病毒，皮肤活性等领域应用较多，而且存在非特异性染色等问题，时间分辨荧光法是对荧光免疫法的进一步优化，但是其操作步骤较多，操作复杂，需要熟练的专业技能人员来操作。
酶联免疫吸附测定法(ELISA)是20世纪70年代发展起来的一种检测技术，但由于该方法具有灵敏度高，特异性强，准确率高，可检测的目标分子种类多等优势，在体外诊断中的应用也越来越广泛。目前，ELISA法在临床检验中可以用于体液中的各种蛋白质，包括含量极少的蛋白质，激素类比如小分子量的甾体激素等，抗生素和药物，病原体抗原，HBsAg，HBeAg等的检测。
但是，ELISA法通常是在实验室或检验科由专业技术人员来操作，该过程中手工操作步骤复杂，且整个操作过程耗时长，检测容易引起操作失误等，目前国内使用微流控芯片技术进行ELISA法检测的专利特别少，国内外将这两种技术结合进而开发出成熟的芯片产品的公司更少。经过专利调研发现，国内外近年来有少量使用微流控技术来进行ELISA法检测的专利，比如中国专利201510648955公开了一种用于梅毒螺旋体检测的ELISA检测装置和芯片，但该芯片是采用铂电极进行驱动，需要对铂电极施加高电压才能驱动芯片内部液体运动，且芯片内部通道结构简单，难以对待测样品进行精确定量；再比如中国专利201611159534中公开了一种基于距离检测靶标的集成化ELISA芯片及其检测方法，但采用免疫反应产生的气体体积来推动信号产生距离，根据距离来进行定量检测，检测方式相对于光学法检测灵敏度低，准确性难以保证，同时内部的免疫反应难以准确控制。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的如上问题，提供一种ELISA检测微流控芯片，该微流控芯片具有检测过程简单，能够对反应样本进行定量，各结构单元相互连通的特点，检测灵敏度高、重复性强。
为了实现上述目的，本发明提供一种ELISA检测微流控芯片，该微流控芯片包括：用于接收待检样本的进样单元、用于存储反应试剂的储液单元、为所述待检样本和所述反应试剂提供反应场所的反应单元以及用于收集废液的废液单元；该微流控芯片还包括用于对所述待检样本进行定量的第一定量单元；
其中，所述第一定量单元包括第一狭缝、以及由所述第一狭缝隔开的第一样本腔室和第二样本腔室；所述第一样本腔室与所述进样单元相通，所述第二样本腔室与所述废液单元相通。
优选的，该微流控芯片还包括在废液单元和第二样本腔室之间设置的第一报错单元，所述第一报错单元具有腔室，该腔室用于接收来自第一定量单元的第二样本腔室的液体。
优选的，所述第一报错单元与光学检测设备相连，所述光学检测设备用于对所述腔室进行光学检测，以判断腔室中的液体量；此处需要说明的是，此处所述“相连”可以不是物理相连，而只是位置对准即可。
优选的，该微流控芯片还包括用于对所述反应试剂进行定量的第二定量单元。
其中，所述第二定量单元包括第二狭缝、以及由所述第二狭缝隔开的第一试剂腔室和第二试剂腔室；所述第一试剂腔室与所述储液单元相通，所述第二试剂腔室与所述废液单元相通。
优选的，该微流控芯片还包括在废液单元和第二试剂腔室之间设置的第二报错单元，所述第二报错单元具有腔室，该腔室用于接收来自第二定量单元的第二试剂腔室的液体。
优选的，所述第二报错单元与光学检测设备相连，所述光学检测设备用于对所述腔室进行光学检测，以判断腔室中的液体量；此处需要说明的是，此处所述“相连”可以不是物理相连，而只是位置对准即可。
优选的，所述反应单元中设置有混合装置，以用于将待检样本和反应试剂混合。
优选的，所述混合装置选自竖立小柱、Z形微通道、W型混合器和三角形微结构中的至少一种。
优选的，该微流控芯片还包括与所述废液单元连接的通气单元，用于为微流控芯片体系提供所需的外部气压。
优选的，该微流控芯片还包括与所述通气单元连接的仪器接口，所述仪器接口用于连接流控芯片体系外的配套仪器，所述配套仪器提供的气压通过所述通气单元提供至所述微流控芯片体系。
优选的，所述配套仪器包括用于提供气压的气压泵、导气管以及与所述通气单元连接的气密性接口；所述气密性接口优选为喇叭形。
优选的，所述通气单元中还填充有透气但不透水的物质；优选的，所述透气但不透水的物质为气溶胶。
优选的，所述反应试剂通过试剂囊袋装填到所述储液单元中；所述试剂囊袋包括用于将其固定到所述储液单元上的定位孔，密封口以及用于将所述密封口打开并释放所述反应试剂的挤压区域或针刺结构。
优选的，所述进样单元和所述第一定量单元之间还设置有过滤单元以对待检样本进行过滤。
本发明的第二方面还提供一种ELISA检测微流控芯片体系，该微流控芯片体系由上层、中层和下层组成；
其中，中层结构为如上所述的ELISA检测微流控芯片；
其中，上层结构和下层结构用于覆盖封闭所述中间层；上层结构中设置有与进样单元连接的进样孔，以及对应于储液单元的让位孔，用于提供外部动力以释放储液单元中的反应试剂。
本发明的第三方面还提供如上所述的ELISA检测微流控芯片和/或如上所述的ELISA检测微流控芯片体系在ELISA检测中的应用。
本发明可以取得如下的有益效果：
1、本发明采用微流控芯片技术结合ELISA检测待检样本，具有检测光学背景低，检测灵敏度高，线性范围宽，检测可重复性强等优点，同时配合特定检测仪器，可以实现全自动芯片检测，无需人为干扰即可快速得到准确的检测结果。
2、本发明采用微流控芯片技术，对待检样本首先进行体积定量，使得只有特定体积的样本发生反应，保证检测结果的准确性，同时由于芯片结构固定，故而对于同一样本其检测可重复性强，保证检测结果的稳定性和可靠性。
3、本发明采用微流控芯片技术，将需要参与酶联免疫反应的液体试剂都预存在储液单元中，完全避免了常规实验检测中流路试剂的干扰和污染问题，同时全封闭式液体试剂保存可以延长芯片的保质期，确保在相当长一段时间内芯片仍然能够得到稳定而准确的检测结果。
4、本发明采用微流控芯片技术，对于每一个检测样本只进行一次检测，检测完成之后芯片立即废弃，完全避免了医院中不同样本之间的检测干扰，同时完全避免患者之间的交叉感染。
5、本发明采用微流控芯片技术，将反应完成之后的废液和多余样本都完全密封在芯片内部，不会导致废液或样本的泄露，对检测环境无公害，对医院检测人员安全性高，不会导致院内感染的发生。
附图说明
图1是本发明提供的一种具体的ELISA检测微流控芯片示意图。
图2显示了一种具体的配套仪器及其与ELISA检测微流控芯片的连接方式。
图3是本发明提供的芯片的第一定量单元的结构及其运作机理图。
图4是本发明提供的芯片的第二定量单元的结构及其运作机理图。
图5A是本发明提供的一种试剂囊袋的示意图；图5B示出了通过外部压力破裂试剂囊袋的方式；图5C显示了通过针刺破裂试剂囊袋的方式。
图6为本发明的ELISA检测微流控芯片体系的层结构示意图。
图7为本发明提供的一种上层结构的示意图。
附图标记说明
1进样单元 2储液单元 3反应单元
4废液单元 5第一定量单元 6第一报错单元
7通气单元 8仪器接口 9配套仪器
10第二定量单元 11第二报错单元 12过滤单元
21试剂囊袋 31混合装置 51第一狭缝
52第一样本腔室 53第二样本腔室 54第一挡板
91推动气压泵 92导气管 93气密性接口
101第二狭缝 102第一试剂腔室 103第二试剂腔室
104第二挡板 211定位孔 212密封口
213挤压区域 214针刺结构
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
如图1和图3所示，本发明第一方面提供一种ELISA检测微流控芯片，其特征在于，该微流控芯片包括：用于接收待检样本的进样单元1、用于存储反应试剂的储液单元2、为所述待检样本和所述反应试剂提供反应场所的反应单元3以及用于收集废液的废液单元4；该微流控芯片还包括用于对所述待检样本进行定量的第一定量单元5；
其中，所述第一定量单元5包括第一狭缝51、以及由所述第一狭缝51隔开的第一样本腔室52和第二样本腔室53；所述第一样本腔室52与所述进样单元1相通，所述第二样本腔室53与所述废液单元4相通。
根据本发明，第一定量单元5用于对要参与反应的待检样本进行定量分取，其可将多余的待检样本运送到废液单元4处，保证只有特定体积的待检样本参与后续的ELISA反应，从而保证本发明芯片检测的准确度。
现结合图3对所述第一定量单元5进行定量的原理进行说明：如图3A中示出的，第一定量单元5的主要结构有第一挡板54，第一样本腔室52，第二样品腔室53、第一狭缝51，并且在第一样本腔室52侧的微通道上设置有微阀门，所述第一挡板54与所述第一狭缝51相对但不相接，所述第一样本腔室52和第二样品腔室53通过所述第一挡板54与所述第一狭缝51界定的空间相通。该第一定量单元5对样本进行定量的主要工作原理是，在定量之前，先通过配套仪器9中的推拉杆来关闭微阀门(如图3B中示出的)，然后通过样本入口向第一样本腔室52中加入待定量样本，待定量样本会首先填充在第一样本腔室52中，多余的液体会越过第一狭缝51而进入到第二样品腔室53，进而通过与废液单元4连通的微通路流入下游结构单元(图3C)。然后如图3D中所示的，通过配套仪器9打开微阀门，定量后的样本会流入到下游结构单元中。
由于芯片结构均采用注塑成型的大批量制备方式，故而每一个芯片内部的第一挡板54，第一样本腔室52，第二样品腔室53、第一狭缝51的位置均相同，从而保证每个芯片该第一定量单元5的定量腔室的体积相同，进而保证不同芯片对同一个待测样本定量之后的体积也相同，该第一定量单元5提高了芯片的批内重复性和批间重复性。作为备选方案，该定量腔室还可以采用其他形状，比如圆形，梯形，正方形或其他各种不规则形状，定量挡板也可以采用其他形状，比如竖直挡板，圆弧形挡板等其他各种形状。
根据本发明，所述第一定量单元5与进样单元1和废液单元4之间均通过微通道进行连接，以便于液体的流动。优选的，微通道与废液单元4之间的连接口设在废液单元4的上部，其主要作用是将反应完成后的废液或多余的待检样本输送到废液单元4中，同时由于位置上的结构关系使得进入废液单元4内部的废液不会通过微通道而回流到芯片前部分。
其中，所述微通道的横截面的形状可以是矩形，圆形，三角形，梯形，或其他各种形状。微通道215的宽度可以是0.001mm-10mm，其深度可以是0.001mm-10mm。
其中，所述微阀门中优选设置有活塞结构，其打开或关闭可以完全由仪器根据预定程序来完成。平时没有仪器的介入下，微阀门处于打开状态或部分微阀门处于打开状态，而需要将其关闭时，由仪器中步进电机的转轴带动微阀门处的活塞，将活塞旋转一定角度，从而使得活塞内部的液体通路关闭，使得微阀门转变为关闭状态。因此，优选的，配套仪器9还包括步进电机。
作为一种备选的实施方式，所述活塞可以是竖直推拉式而非旋转式，在一般状态下微阀门的活塞处于打开状态，在需要关闭时，通过仪器的推拉杆推动微阀门处的活塞，将活塞推入到微通道内部从而阻塞微通道，使得该微阀门处于关闭状态。
作为另一种备选的实施方式，微阀门还可以通过铁片和电磁场的配合来进行打开和关闭操作，例如，可以在微阀门上方粘贴一个小铁片，在微阀门下方放置电磁铁，在一般状态下，电磁铁不通电，铁片位于微阀门上方，微阀门处于打开状态，在需要关闭时，通过仪器来对电磁铁通电，磁铁产生的电磁场会吸引微阀门上方的铁片，从而将铁片拉到微阀门下方，使得微阀门处于关闭状态。
此处需要说明的是，虽然如上仅是对第一定量单元5中的微阀门以及第一定量单元5与废液单元4通过微通路的连接方式及位置进行的介绍，但对于下文中提及的微阀门均适用。在没有相反说明的情况下，下文中提及的微阀门的作用和选择以及其他结构单元通过微通路与废液单元4连接的方式和位置均可参照上文。
根据本发明，优选情况下，为了保证检测能够顺利进行，本发明的微流控芯片还包括设置在第一定量单元5和废液单元4之间的第一报错单元6，所述第一报错单元6具有腔室结构，该腔室用于接收来自第一定量单元5的第二样本腔室53的液体。在液体经过第一定量单元5之后，多余的液体会在外力作用下被抽提进入到第一报错单元6的腔室结构中，并根据所述腔室结构中液体的充盈程度来判断检测是否可顺利进行。如果腔室结构中充满液体，可以认为第一定量单元5中第一样本腔室52处也充满液体，此时可认为芯片工作正常而不报错，如果第一报错单元6的腔室结构内部没有液体或液体量不够，则认为第一定量单元5中第一样本腔室52的液体体积也不足，此时需要报错并终止芯片的检测。这样芯片内部自检机制可以保证只有液体定量完全准确的情况下芯片才会继续进行后续的检测，从而保证检测结果的准确性。
其中，优选的，所述第一报错单元6与光学检测设备相连，所述光学检测设备可用于对所述腔室进行光学检测，从而判断腔室中的液体量。
根据本发明，本发明的芯片包括至少一个储液单元2，图1展示了9个储液单元2，该储液单元2的主要作用是将要参与酶联免疫反应的各种试剂，比如酶标记抗体试剂、样品稀释液、清洗液、酶联免疫底物试剂等预先装填到本发明芯片内部，在本发明芯片进行待检样本的测试时，再通过外力将该储液单元2内部的试剂按照顺序释放出来。此处需要说明的是，芯片内部的各个储液单元2的大小和形状可以相同，也可以不同，其形状也并不局限于图中所示的圆形，其他形状比如矩形，菱形，多边形或不规则形状也同样适用。同时各储液单元2的大小会根据所要预装的试剂的体积大小而发生改变，此时储液单元2的体积并不相同。
如图5A所示的，本发明提供了一种储液单元2的基本结构，预装反应试剂被预先装填到试剂囊袋21中，该试剂囊袋21优选为柔性材质，该材质包括但不限于：硝酸纤维素薄膜、塑料薄膜或金属铝箔，所述塑料薄膜可以为但不限于聚酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚碳酸酯(PC)、聚丙烯(PP)和聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)中的至少一种。其共同特点是可以通过挤压或针刺的方式释放内部的预装反应试剂。在预装反应试剂装填到试剂囊袋21中后，通过热塑封的方式将出口进行密封形成密封口211。此处的密封口211的密封程度要比较浅，使得在外力加压试剂囊袋21时，密封口211会破裂。定位孔212用于辅助将试剂囊袋21安装固定在芯片中的储液单元2处。在需要将储液单元2内部反应试剂释放时，可以通过图5B中的方式，通过挤压试剂囊袋21上的挤压区域213，从而使得密封口211破裂而释放液体，也可以采用图5C中的方式，通过刺针来刺破试剂囊袋21的底部区域如针刺结构214处，使得内部预装反应试剂释放出来。
根据本发明一种优选的实施方式，所述芯片还包括对所述反应试剂进行定量的第二定量单元10，以用于对反应试剂的精准定量。例如，当需要对待检样本进行稀释时，可以获得预定稀释倍数的稀释样本。如图4所示的，所述第二定量单元10包括第二挡板104、第二狭缝101、以及由所述狭缝101隔开的第一试剂腔室102和第二试剂腔室103；所述第一试剂腔室102与所述储液单元2相通，所述第二试剂腔室103与所述废液单元4相通。所述第二挡板104与所述第二狭缝101相对但不相接，所述第一试剂腔室102和第二试剂腔室103通过所述第二挡板104与所述第二狭缝101界定的空间相通。其中，所述第二定量单元10的定量原理与第一定量单元5的定量原理相同，此处不再重复赘述。
进一步优选的，为了进一步确保能够获得预定量的反应试剂，该微流控芯片还包括在废液单元4和第二试剂腔室103之间设置的第二报错单元11，所述第二报错单元11具有腔室，该腔室用于接收来自第二定量单元10的第二试剂腔室103的液体。其中，所述第二报错单元11的报错原理与第一报错单元6的报错原理相同，此处不再重复赘述。
其中，更为优选的，所述第二报错单元11与光学检测设备相连，所述光学检测设备用于对所述腔室进行光学检测，以判断腔室中的液体量。
此处需要说明的是，虽然如图1所示的，只限定了一个储液单元2的第二定量单元10。但本领域技术人员应该能够理解的是，第二定量单元10可以通过数量以及连接方式的设定，对不同的反应试剂进行定量。这些均应该视为在本发明的保护范围之内。
根据本发明，所述废液单元4优选位于芯片内液体流路系统的末端，以可收集各步ELISA反应的废液，防止废液流出芯片而污染外部环境。其中，该废液单元4在结构上并不局限于图1中所示的矩形，其他形状，比如圆柱形，圆锥形，或其他各种不规则形状的也同样适用。其中，所述废液单元4的体积应该要大于所有储液单元2(存在的情况下)内部试剂体积与待检样本的体积之和，从而可保证废液单元4可以对反应过程中可能产生的废液进行有效的收集。
根据本发明，反应单元3是提供给抗原抗体试剂发生免疫反应的主要场所，同时也是酶联免疫试剂参与底物反应后光学检测的主要场所，故此处将采用透光性比较好的材料来制备，比如聚甲基丙烯酸甲酯PMMA，或聚碳酸酯PC，或聚二甲基硅氧烷PDMS等。反应单元3与各个储液单元2通过微通道连接，便于储液单元2内部的试剂释放后直接进入该反应单元3，参与后续的酶联免疫反应。
虽然此反应单元3集合了免疫反应功能和光学检测功能，但作为备选方案，可以将这两部分功能分开在两个不同结构单元内进行。如此的设置以及在此基础上进行的任何组合和/或变形均应该视为在本发明的保护范围之内。
根据本发明一种优选的实施方式，所述反应单元3的内部还制备有混合装置31，其主要作用是辅助反应试剂和待检样本进行混合。作为一种优选的实施方式，所述混合装置31由多个竖立小柱构成，该竖立小柱可以位于反应单元内部两侧，在反应单元3内部被挤压时，会促使内部的液体发生混合，同时液体在经过竖立小柱时，会在小柱周围形成微小涡流，该微小涡流的扰动会加速液体之间的混合，从而加速各组分间的免疫反应，进而提高生化反应速度，减少芯片检测的总时间。虽然此处所示的混合装置31采用竖立小柱的形式来实现，但作为备选的其他微结构，比如Z型微通道，W型混合器，三角形微结构等其他结构形式也能辅助并加速试剂之间混合。
根据本发明，所述进样单元1用于接收用户注入的待检样本。所述待检样本可以为人或动物的全血，血浆，尿液，唾液，精液，脊髓，羊水等体液中的一种或多种。另外，本发明芯片还可以用于食品安全检测领域，其检测样品可以是食品浸出液，提取液，洗脱液或其他液体，对食品中残留农药，食品中的细菌，病毒或其他病原菌，食品内部所含营养物质的含量进行检测。同样的，本发明芯片还可以应用于环境检测领域，此时检测样品可以是河水，海水，或取自欲检测环境中的任何液体，可以对环境中的有毒有害物质，有机或无机污染物进行快速检测等。
其中，所述进样单元1的结构可以是圆柱形、圆锥形(例如，图1中所示的结构)、梯形，或其他各种不规则形状。其主要功能是接收用户注入的待检样本，使得待检样本在被注入到芯片后不会发生待测样本的泄漏，样本只能按照特定的微通道结构进行运转。
作为一种可选的实施方式，所述进样单元1还可以做成毛细作用进样结构，此时注入的待检样本会通过毛细作用进入到下游的结构单元，并且毛细作用会将待检样本吸附在芯片中，防止待测样本的泄漏而污染环境。
根据本发明，当所述待检样本为需要过滤的待检样本(例如，全血样本)时，所述微流控芯片还包括设置在所述进样单元1和所述第一定量单元5之间的过滤单元12，也即，所述过滤单元12位于进样单元1的下游，第一定量单元5的上游。过滤单元12内部可以预装有能够过滤待检样本，例如全血中红细胞的滤血膜，所述滤血膜的厚度要小于过滤单元10的高度，从而使得滤血膜能够完全放置于过滤单元10内部，同时该滤血膜的形状和过滤单元12的内壁结构相一致，使得到达过滤单元10的待检样本无法绕过滤血膜而直接进入下游通道。该滤血膜可通过物理孔径或生物、化学试剂使液体与红细胞分离，所述生物、化学试剂可以为凝血剂。该滤血膜的厚度可以为0.1mm-10mm，该过滤单元10的高度可以为0.1mm-20mm。
根据本发明一种优选的实施方式，本发明通过对芯片体系的微通路之间进行加压或减压从而控制各液体的流动，以便从一个结构单元进入到另一个结构单元。因此，所述微流控芯片还包括与所述废液单元4连接的通气单元7，用于为微流控芯片体系提供所需的外部气压，在外部气压的辅助下使得内部液体正常运转。同时通气单元7还可以防止废液单元4中的废液流出到芯片外部而污染外部环境。虽然如图1所示的通气单元7采用W型微通道设计，但其他设计，比如圆形，弧形，Z型等其他各种结构也同样能够起到通气并防止废液外流的作用，这些设计也均应视同在本发明的保护范围之内。
优选的，所述通气单元7内部还可以填充特定物质，起到通气但防止废液外流的作用，比如该物质可以是气溶胶，或透气但不透水的疏松孔状结构物质。
根据本发明一种优选的实施方式，本发明的微流控芯片优选通过外部的配套仪器9提供系统所需的气压。因此，优选的，该微流控芯片还包括与所述通气单元7连接的仪器接口8，所述仪器接口8用于连接流控芯片体系外的配套仪器9，所述配套仪器9提供的气压通过所述通气单元7提供至所述微流控芯片体系。其中，所述外部气压的大小可以比大气压大，也可以比大气压小，根据具体的使用情况不同可以方便的调节该气压的大小。同时，所述仪器接口8优选为气密性的，即芯片在和配套仪器9的气压调节装置进行对接时，该部位不漏气。该功能可以通过塑料密封环或其他组件来实现。配套仪器9的气压调节装置可以是气动泵，储气囊泡，气压泵，挤压泵等。
根据本发明一种优选的实施方式，如图2所示的，所述配套仪器9包括用于提供气压的推动气压泵91、导气管92以及与所述通气单元7连接的气密性接口93。当待测芯片被放入到配套仪器9中后，仪器内部的步进电机(图中未显示)会推动气压泵91，使得气密性接口93紧贴到待测芯片的仪器接口8处，该紧贴方式是气密性的，可以通过在所述气密性接口93上设置密封环或O型圈来完成。优选的，所述气密性接口93是喇叭形，在该优选的情况下，不需要将气密性接口93与仪器接口8精确对准，只需要仪器接口8位于该气密性接口93内部即可。待紧贴完成后，与气压泵91连接的步进电机处于锁定状态，此时气压泵91的位置固定。通过与气压泵91内部活塞相连的另外一个步进电机(图中未显示)的转动，可以推动或抽提活塞，从而调节气压泵91内部的气压，进而操控芯片内部的气压。在需要给芯片内部加压时，通过步进电机来推动活塞来完成，相反，在需要给芯片内部减压时，通过步进电机来抽提活塞来实现。芯片内部液路网络会由于气压的增大或减少而驱动流体发生转移。在待测芯片的整个测试流程完成之后，通过与气压泵91连接的步进电机的转动来使得该气密性接口脱离芯片。
如图6所示的，根据本发明的第二方面，提供一种ELISA检测微流控芯片体系，该微流控芯片体系由上层、中层和下层组成；
其中，中层结构为如上所述的ELISA检测微流控芯片；
其中，上层结构和下层结构用于覆盖封闭所述中间层；上层结构中设置有与进样单元1连接的进样孔，以及对应于储液单元2的让位孔，用于提供外部动力以释放储液单元2中的反应试剂。
如图7所示的，上层结构上面设置有进样孔(小孔)，用于待检样本的加样。所述进样孔与中层结构中的进样单元1相通，以保证待检样本通过进样孔能够进入到所述进样单元1中。此外，上层结构上还优选设置有至少一个让位孔(大孔)，所述让位孔对应于中层结构的储液单元2，用于配套仪器9的推杆的进入，从而为储液单元2提供外部压力，以将储液单元2内部预先封闭存储的试剂释放出来，因此，本发明的配套仪器9还包括至少一个推拉杆。所述让位孔大小和形状由中层结构中储液单元的储液囊袋21的结构大小和形状来决定，优选的，该让位孔的直径大小可以是0.5mm-50mm，其形状可以是圆形，矩形，多边形，菱形，甚至不规则形状等各种形状。
优选的，上层、中层和下层的材质各自独立地选自如聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚丙烯(PP)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、塑料薄膜、弹性乳胶、天然橡胶、塑料和硅胶。
优选的，上层结构的厚度为0.5-20mm，更优选为0.5-10mm，进一步优选为0.5mm-5mm；中层结构的厚度为0.5-50mm；更优选为2mm-20mm，进一步优选为3mm-15mm；下层结构的厚度为0.5-20mm，更优选为0.5-10mm，进一步优选为0.5mm-5mm。
本发明提供的ELISA检测微流控芯片的制备方法优选包括如下步骤：
步骤1)将酶联免疫反应所需反应试剂预装到所述试剂囊袋21中，并通过热塑封的方式将所述试剂囊袋21的密封口212进行密封；并通过定位孔211放置在芯片体系中层结构的特定储液结构处，进一步通过热塑封的方式将各储液的试剂囊袋21固定在芯片体系中层结构上。
步骤2)在芯片的反应单元3处进行点样固定捕获抗体，然后加入封闭蛋白试剂将反应单元3内部未固定捕获抗体的表面进行封闭。完成后再将下层结构贴合到中层结构的下面，其贴合方式包括但不仅限于超声热熔、胶粘、紫外光固化、热塑封等方式。
步骤3)将上层结构贴合到如上中层结构的上面，其贴合方式包括但不仅限于超声热熔、胶粘、紫外光固化、热塑封等方式。
采用本发明提供的ELISA检测微流控芯片体系进行ELISA检测的流程如下(以全血为例，且第二定量单元10设置在稀释液的下方以对稀释液进行定量)：
步骤1)通过移液器吸取一定量的全血，将全血加入到加样孔，再将微流控芯片体系放置在配套仪器9内开始测试。
步骤2)配套仪器9通过内部步进电机将气压泵91，气密性接口93移动到仪器接口8处后固定。关闭第一定量单元5与反应单元之间的微阀门，然后通过步进电机对气压泵91中的活塞进行抽提，在抽力的作用下，全血进入进样单元1中，然后再进入过滤单元12中进行红细胞过滤，过滤后的血浆进入到第一定量单元5，多余的血浆进入第一报错单元6中，通过配套仪器9的光检测单元来探测第一报错单元6的光信号(配套仪器9还包括光检测单元)，如果第一报错单元6的腔室为空或液体没有充满，则停止该芯片检测，并进行报错，如果此处液体充满，则继续进行后续的检测步骤。同样的方式释放储液单元2中的稀释液，并进行定量。
步骤3)打开第一定量单元5和第二定量单元10与反应单元3之间的微阀门，关闭反应单元与废液单元之间的微阀门，通过配套仪器9的推拉杆依次释放储液单元2中的各反应试剂：第一清洗液，第二清洗液，第三清洗液，酶标记抗体，第四清洗液，第五清洗液。将该试剂依次释放到反应单元3，其中在清洗过程中需要多次混合清洗完全，通过配套仪器9的推拉杆来挤压所述反应单元3以在混合装置31中进行混合。
步骤4)清洗完成之后的废液通过配套仪器9上的气压泵91抽取到废液单元4中，最后通过配套仪器9的推拉杆释放储液单元2中的第一显色底物和第二显色底物，使得底物进入到反应单元3，进行酶联免疫反应，通过配套仪器9上的光检测模块，比如CCD或PMT进行光检测，并给出检测结果。
本发明提供的化学发光检测微流控芯片体系检测的样本体积为10-200μL。
本发明中，配套仪器9为小型便携式设备，配套仪器9除了包括气压泵91、导气管92以及气密性接口93之外，还优选包括有推拉杆单元，步进电机模块，光检测模块。进一步优选的，所述配套仪器9还包括温控模块，以对芯片内的温度进行按需控制。
本发明的第三方面还提供了如上所述的ELISA检测微流控芯片和/或所述的ELISA检测微流控芯片体系在ELISA检测中的应用。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
实施例1
本实施例用于说明使用双抗体夹心法ELISA来检测人全血中的C反应蛋白(CRP)
本实施例所使用的酶标记抗体为辣根过氧化物酶标记CRP(HRP-CRP)，清洗液含有0.5％tween-20的磷酸盐缓冲液(pH 7.5)，稀释液是0.01mol/L的磷酸盐缓冲液(pH 7.2)，包被抗体是抗人CRP抗体，封闭试剂是含有0.2％BSA惰性蛋白的磷酸盐缓冲液(pH 7.5)。酶联免疫反应所需的反应底物是TMB显色底物。
(1)芯片体系的组装
将上述各反应试剂预装在试剂囊袋21中，并通过热塑封的方式(加热时间30s)将所述试剂囊袋21的密封口212进行密封；并通过定位孔211放置在芯片体系中层结构的特定储液结构处，进一步通过热塑封的方式将各储液的试剂囊袋21固定在芯片体系中层结构上。再使用点样仪将包被抗体试剂点样到反应单元3内部，点样后于40℃烘干3小时，使得点样在反应单元3处的包被抗体被充分固定在反应单元3内。用移液器加入100μL封闭试剂到反应单元3中，于40℃烘干3小时对抗体进行封闭处理。
通过光敏胶固化的方式(紫外光固化时间10min)将下层结构贴合到中层结构上，通过同样的光敏胶固化方式(紫外光固化时间10min)将上层结构贴合到中层结构上，如此制备出完整可用的芯片体系。
(2)样本检测
绘制标准曲线的方法：用正常人全血作稀释液，将CRP标准品稀释成如下浓度：0pg/mL，10pg/mL，50pg/mL，500pg/mL，1000pg/mL，5ng/mL，10ng/mL。每个浓度的CRP全血均进行下列操作：用移液器取50μL含CRP的全血标准品，通过芯片的进样孔注入到芯片体系的中层结构中，同时将该芯片放入配套仪器9中开始测试。
配套仪器9通过内部的气压泵91来调节芯片体系中层结构内部的气压，将待检样本依次吸入进样单元1并进入过滤单元10中进行红细胞过滤，然后过滤后的血浆进入到定量单元5，多余的待检样本进入到报错单元6，通过仪器对报错单元6的检测，判断此时定量单元5的定量结构53内部液体是否充满，如果处于正常的充满状态，则继续进行后续芯片检测，否则仪器报错退出检测流程。其他多余的待检样品被抽取到废液单元4中，然后通过配套仪器9的推拉杆依次释放储液单元2中的反应试剂：稀释液，第一清洗液，第二清洗液，第三清洗液，酶标记抗体试剂，第四清洗液，第五清洗液。将这些试剂依次释放到反应单元3中，在每次试剂释放完之后，配套仪器9通过推拉杆的作用将反应单元3处的试剂通过混合装置31进行充分混合，清洗完成之后的废液由配套仪器9抽取到废液单元4中，最后通过配套仪器9的推拉杆释放TMB显色底物试剂，使得底物试剂进入到反应单元3中进行酶联免疫反应，通过配套仪器9上的光检测模块检测光学信号的强度，(其检测波长为450nm)，并给出检测结果。总的检测时间为30min，每个标准品分别使用5个微流控芯片体系测定5次取其结果的平均值，绘制标准曲线。
采用同样的检测流程，取50μL待检测全血样本进行检测，根据光学信号的强度得出待检测全血样本中的CRP浓度。
结果表明，采用双抗体夹心法进行CRP浓度检测的最低检测限为40pg/mL，检测范围为40-8000pg/mL。通过将检测结果和实验室常规酶联免疫测试法的结果进行对比(给出一个具体的参考文献)，发现使用本发明芯片得出的检测结果和标准流程的实验室ELISA检测结果具有高度一致性，表明使用本发明芯片得出的检测结果具有准确性。同时，通过对同一全血样本进行多次(本实施例中采用10次)测定，获得的检测结果之间的变异系数均小于10％，表明本检测芯片具有良好的重复性，可以进一步作为CRP医学诊断的参考。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种ELISA检测微流控芯片，其特征在于，该微流控芯片包括：用于接收待检样本的进样单元(1)、用于存储反应试剂的储液单元(2)、为所述待检样本和所述反应试剂提供反应场所的反应单元(3)以及用于收集废液的废液单元(4)；该微流控芯片还包括用于对所述待检样本进行定量的第一定量单元(5)；
其中，所述第一定量单元(5)包括第一狭缝(51)、以及由所述第一狭缝(51)隔开的第一样本腔室(52)和第二样本腔室(53)；所述第一样本腔室(52)与所述进样单元(1)相通，所述第二样本腔室(53)与所述废液单元(4)相通。
2.根据权利要求1所述的ELISA检测微流控芯片，其中，该微流控芯片还包括在废液单元(4)和第二样本腔室(53)之间设置的第一报错单元(6)，所述第一报错单元(6)具有腔室，该腔室用于接收来自第一定量单元(5)的第二样本腔室(53)的液体；
优选的，所述第一报错单元(6)与光学检测设备相连，所述光学检测设备用于对所述腔室进行光学检测，以判断腔室中的液体量。
3.根据权利要求1或2所述的ELISA检测微流控芯片，其中，该微流控芯片还包括用于对所述反应试剂进行定量的第二定量单元(10)；
其中，所述第二定量单元(10)包括第二狭缝(101)、以及由所述第二狭缝(101)隔开的第一试剂腔室(102)和第二试剂腔室(103)；所述第一试剂腔室(102)与所述储液单元(2)相通，所述第二试剂腔室(103)与所述废液单元(4)相通；
优选的，该微流控芯片还包括在废液单元(4)和第二试剂腔室(103)之间设置的第二报错单元(11)，所述第二报错单元(11)具有腔室，该腔室用于接收来自第二定量单元(10)的第二试剂腔室(103)的液体；
优选的，所述第二报错单元(11)与光学检测设备相连，所述光学检测设备用于对所述腔室进行光学检测，以判断腔室中的液体量。
4.根据权利要求1所述的ELISA检测微流控芯片，其中，所述反应单元(3)中设置有混合装置(31)，用于将待检样本与反应试剂进行混合；
优选的，所述混合装置(31)选自竖立小柱、Z形微通道、W型混合器和三角形微结构中的至少一种。
5.根据权利要求1或2所述的ELISA检测微流控芯片，其中，该微流控芯片还包括与所述废液单元(4)连接的通气单元(7)，用于为微流控芯片体系提供所需的外部气压；
优选的，该微流控芯片还包括与所述通气单元(7)连接的仪器接口(8)，所述仪器接口(8)用于连接微流控芯片体系外的配套仪器(9)，所述配套仪器(9)提供的气压通过所述通气单元(7)提供至所述微流控芯片体系；
优选的，所述配套仪器(9)包括用于提供气压的气压泵(91)、导气管(92)以及与所述通气单元(7)连接的气密性接口(93)；所述气密性接口(93)优选为喇叭形；
优选的，所述通气单元(7)中还填充有透气但不透水的物质；优选的，所述透气但不透水的物质为气溶胶。
6.根据权利要求3所述的ELISA检测微流控芯片，其中，所述反应试剂通过试剂囊袋(21)装填到所述储液单元(2)中；所述试剂囊袋(21)包括用于将其固定到所述储液单元(2)上的定位孔(211)，密封口(212)以及用于将所述密封口(212)打开并释放所述反应试剂的挤压区域(213)或针刺结构(214)；
优选的，所述试剂囊袋(21)的材质选自硝酸纤维素薄膜、塑料薄膜和金属铝箔中的至少一种；
优选的，所述塑料薄膜的材质选自聚酯，聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯、聚丙烯和聚甲基丙烯酸甲酯中的至少一种。
7.根据权利要求1所述的ELISA检测微流控芯片，其中，所述进样单元(1)和所述第一定量单元(5)之间还设置有过滤单元(12)以对待检样本进行过滤。
8.根据权利要求1-7中任意一项所述的ELISA检测微流控芯片，其中，所述待检样本为机体体液、机体分泌物、食品、果蔬、水体或土壤。
9.一种ELISA检测微流控芯片体系，其特征在于，该微流控芯片体系由上层、中层和下层组成；
其中，中层结构为权利要求1-8中任意一项所述的ELISA检测微流控芯片；
其中，上层结构和下层结构用于覆盖封闭所述中层；上层结构中设置有与进样单元(1)连接的进样孔，以及对应于储液单元(2)的让位孔，用于提供外部动力以释放储液单元(2)中的反应试剂；
优选的，上层、中层和下层的材质各自独立地选自如聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚丙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、塑料薄膜、弹性乳胶、天然橡胶、塑料和硅胶；
优选的，上层结构的厚度为0.5-20mm；中层结构的厚度为0.5-50mm；下层结构的厚度为0.5-20mm。
10.权利要求1-8中任意一项所述的ELISA检测微流控芯片和/或权利要求9所述的ELISA检测微流控芯片体系在ELISA检测中的应用。
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