CN110082527A - 非洲猪瘟病毒化学发光试剂盒 - Google Patents

非洲猪瘟病毒化学发光试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及免疫检测技术领域，公开了一种非洲猪瘟病毒化学发光试剂盒，包括微流控芯片、稀释液、10×洗涤液、酶标抗体、化学发光底物、阳性对照血清以及阴性对照血清，微流控芯片包括依次连通的进样区、样本处理区、检测区和出样区；进样区上设有定量环，进样区通过定量环与样本处理区连通；检测区包括阳性对照区、空白对照区和反应区；微流控芯片还包括缓冲溶液池和洗涤液池以及加药池，缓冲溶液池和洗涤液池分别与样本处理区连通，加药池与检测池连通。本发明将微流控芯片用于检测非洲猪瘟病毒，操作简单、检测快速、成本低廉的优点，而且，本发明得到的试剂盒的灵敏度高，特异性强，亲和力高，不会与其它传播病毒发生血清交叉学反应。

Description

非洲猪瘟病毒化学发光试剂盒
技术领域
本发明涉及免疫检测技术领域，尤其涉及了一种非洲猪瘟病毒化学发光试剂盒。
背景技术
非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒(ASFV)感染家猪和各种野猪(如非洲野猪、欧洲野猪等)引起一种急性、出血性、烈性传染病。其特征是发病过程短，最急性和急性感染死亡率高达100％，临床表现为发热(达40～42℃)，心跳加快，呼吸困难，部分咳嗽，眼、鼻有浆液性或粘液性脓性分泌物，皮肤发绀，淋巴结、肾、胃肠粘膜明显出血。
我国是养猪及猪肉消费大国，生猪出栏量、存栏量以及猪肉消费量均位于全球首位，每年种猪及猪肉制品进口总量巨大，与多个国家贸易频繁；而且，我国与其它国家的旅客往来频繁，旅客携带的商品数量多、种类杂。因此，非洲猪瘟传入我国的风险日益加大，一旦传入，其带来的直接以及间接损失将不可估量。
病毒性动物疫病预防与控制的关键是快速检测疫病病毒。现有非洲猪瘟病毒的检测方法主要包括病毒分离法、反转录聚合酶链式反应法(RT-PCR)和胶体金免疫层析试纸条。病毒分离法是目前诊断和鉴定的金标准方法，灵敏度高，但检测时间太长，需要7～10天；RT-PCR是世界卫生组织推荐的检测方法，需要3～6小时，灵敏度较高，但需要复杂的样本前处理；试纸条检测时间短，通常在15分钟内，但灵敏度偏低，假阳性率偏高。现有非洲猪瘟病毒检测方法存在时间过长、操作复杂或准确性低的不足，这在一定程度上限制了基层动物疫病防控机构开展动物疫病快速筛查工作。
目前，专利申请号为201310193976.0的发明专利公开了一种检测非洲猪瘟病毒抗体的多抗原ELISA试剂盒，试剂盒中有抗原包被的酶标板、酶标二抗、阳性对照血清、阴性对照血清、稀释液、10×洗涤液、OPD与过氧化脲片剂、终止液，该专利将三种重组抗原以最佳比例混合，建立的检测ASFV抗体的多抗原ELISA(MA-ELISA)试剂盒，其特异性显著高于OIE推荐ELISA和进口同类试剂盒，而且扩大了毒株检测范围。但微流控芯片作为近几年新发展的一种技术，其尺寸小、比表面积大和成本较低，因此具有样本消耗少和反应速度快的优势，将其应用于非洲猪瘟病毒检测，可以使检测速度更快，成本更低。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的上述缺点，提供了一种非洲猪瘟病毒化学发光试剂盒。
为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决：
非洲猪瘟病毒化学发光试剂盒，包括微流控芯片、稀释液、10×洗涤液、酶标抗体、化学发光底物、阳性对照血清以及阴性对照血清，微流控芯片包括依次连通的进样区、样本处理区、检测区和出样区；进样区上设有定量环，进样区通过定量环与样本处理区连通；检测区包括阳性对照区、阴性对照区、空白对照区和反应区，阳性对照区内包被有鼠抗猪IgG抗体，空白对照区内包被有pH＝7.8的PBS缓冲液，阴性对照区内包被有非洲猪瘟病毒重组抗原，反应区内包被有非洲猪瘟病毒重组抗原，样本处理区分别与阳性对照区、阴性对照区、空白对照区和反应区连通，样本处理区与出样区连通，出样区上设有排空阀；微流控芯片还包括缓冲溶液池和洗涤液池以及加药池，缓冲溶液池内设有用于处理样本的稀释液，洗涤液池内设有用于处理样本的10×洗涤液，缓冲溶液池和洗涤液池分别与样本处理区连通，加药池与检测区连通；阳性对照血清为重组蛋白VP73和p54分别免疫猪获得的血清，阴性对照血清为非免疫健康猪血清，酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的鼠抗猪IgG抗体，化学发光底物为鲁米诺。
作为优选，稀释液为含5％(v/v)的细胞裂解液的PBS缓冲液，pH＝7.8。
作为优选，10×洗涤液为含0.5％(v/v)Tween-20的PBS缓冲液，pH＝7.8。
作为优选，重组蛋白VP73血清的获得方式为：将非洲猪瘟病毒的VP73基因插入到原核载体pET-30a(+)，转化大肠杆菌BL21，用IPTG诱导重组蛋白表达。
作为优选，重组蛋白p54血清的获得方式为：将非洲猪瘟病毒的p54基因插入到原核载体pET-30a(+)，转化大肠杆菌BL21，用IPTG诱导重组蛋白表达。
进样区的数量为3个，出样区的数量为1个，检测区中的阳性对照区、阴性对照区和空白对照区的数量分别为1个，反应区的数量至少为2个，阳性对照区和阴性对照区分别使用一个进样区，空白对照区和反应区共用进样区和出样区，有利于减少不必要的实验误差。
本发明的化学发光试剂盒以全血、血清或者血浆为样本。从受试猪体上获得样本，然后将待测样本、阴性对照血清和阳性对照血清分别从加样区通过定量环加入到样本处理区中进行处理，处理完成后，溶液进入检测区，酶标抗体从加药池加入到检测区中；然后加入化学发光底物，反应一段时间后，利用检测装置检测检测区内的光强度。
本发明由于采用了以上技术方案，具有显著的技术效果：
本发明将微流控芯片用于检测非洲猪瘟病毒，操作简单、检测快速、成本低廉的优点，而且，本发明得到的化学发光试剂盒的灵敏度高，特异性强，亲和力高，不会与其它传播病毒发生血清交叉学反应。
附图说明
图1是本发明的微流控芯片的结构示意图。
图2是本发明的化学发光试剂盒稀释200倍的特异性检测结果。
图3是本发明的化学发光试剂盒灵敏度的检测结果。
附图中各数字标号所指代的部位名称如下：1—微流控芯片、11—进样区、12—样本处理区、13—检测区、131—阳性对照区、132—空白对照区、133—阴性对照区、134—反应区、14—出样区、15—定量环、16—排空阀、17—缓冲溶液池、18—洗涤液池。
具体实施方式
下面结合附图与实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1
非洲猪瘟病毒化学发光试剂盒，如图1所示，包括微流控芯片1、稀释液、10×洗涤液、酶标抗体、化学发光底物、阳性对照血清以及阴性对照血清，微流控芯片1包括依次连通的进样区11、样本处理区12、检测区13和出样区14；进样区11上设有定量环15，进样区11通过定量环15与样本处理区12连通；检测区13包括阳性对照区131、阴性对照区133、空白对照区132和反应区134，阳性对照区131内包被有鼠抗猪IgG抗体，空白对照区132内包被有pH＝7.8的PBS缓冲液，阴性对照区133内包被有非洲猪瘟病毒重组抗原，反应区134内包被有非洲猪瘟病毒重组抗原，样本处理区12分别与阳性对照区131、阴性对照区133、空白对照区132和反应区134连通，样本处理区12与出样区14连通，阳性对照区131、阴性对照区133、空白对照区132和反应区134与出样区14连通，出样区14上设有排空阀16；微流控芯片1还包括缓冲溶液池17和洗涤液池18以及加药池19，缓冲溶液池17内设有用于处理样本的稀释液，洗涤液池18内设有用于处理样本的10×洗涤液，缓冲溶液池17和洗涤液池18分别与样本处理区12连通，加药池19与检测区11连通；阳性对照血清为重组蛋白VP73和p54分别免疫猪获得的血清，阴性对照血清为非免疫健康猪血清，酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的鼠抗猪IgG抗体，化学发光底物为鲁米诺。
稀释液为含5％(v/v)的细胞裂解液的PBS缓冲液，pH＝7.8。
10×洗涤液为含0.5％(v/v)Tween-20的PBS缓冲液，pH＝7.8。
重组蛋白VP73血清的获得方式为：将非洲猪瘟病毒的VP73基因插入到原核载体pET-30a(+)，转化大肠杆菌BL21，用IPTG诱导重组蛋白表达。
重组蛋白p54血清的获得方式为：将非洲猪瘟病毒的p54基因插入到原核载体pET-30a(+)，转化大肠杆菌BL21，用IPTG诱导重组蛋白表达。
进样区11的数量为3个，出样区14的数量为1个，检测区11中的阳性对照区131、阴性对照区133和空白对照区132的数量分别为1个，反应区134的数量为2个，阳性对照区131和阴性对照区133分别使用一个进样区11，空白对照区132和反应区134共用进样区11和出样区14。
在本实施例的微流控芯片上，血清样本(0.5μL×3)从加样区通过定量环加入到样本处理区中进行处理，在样本处理区利用稀释液稀释50倍；1.5min后，10×洗涤液从洗涤液池中进入样本处理区，洗掉多余血清样本；重复洗涤步骤2次。
在阴性对照区滴加阴性对照血清(0.5μL)，在阳性对照区滴加阳性对照血清(0.5μL)。
处理后的样本进入检测区。辣根过氧化物酶标记的鼠抗猪IgG抗体溶液(1:5000)从加药池加入到检测区中，静置2min后，利用10×洗涤液洗涤1min，重复3次；然后将200μL化学发光底物添加到检测区中，反应3min后，从出样区排出。最后用检测装置检测检测区，得到OD490值。
实施例2
选择含有猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、伪狂犬病毒、口蹄疫病毒、猪流感病毒以及正常猪血清作为参考样本，非洲猪瘟病毒重组抗原用浓度为10mmol/L的稀释液稀释不同倍数。如图2所示，本发明的非洲猪瘟病毒化学发光试剂盒具有良好的特异性，与上述参考样本均无交叉反应；如图3所示，本发明得到的化学发光试剂盒的检出范围为稀释倍数的100～12800。
因此，本发明的化学发光试剂盒灵敏度高，特异性强，亲和力高，不会与其它传播病毒发生血清交叉学反应。
实施例3
同实施例1，所不同的是反应区134的数量为3个。
总之，以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所作的均等变化与修饰，皆应属本发明专利的涵盖范围。

Claims (6)

1.非洲猪瘟病毒化学发光试剂盒，包括微流控芯片(1)、稀释液、10×洗涤液、酶标抗体、化学发光底物、阳性对照血清以及阴性对照血清，其特征在于：微流控芯片(1)包括依次连通的进样区(11)、样本处理区(12)、检测区(13)和出样区(14)；进样区(14)上设有定量环(15)，进样区(14)通过定量环(15)与样本处理区(12)连通；检测区(13)包括阳性对照区(131)、阴性对照区(133)、空白对照区(132)和反应区(134)，阳性对照区(131)内包被有鼠抗猪IgG抗体，空白对照区(132)内包被有pH＝7.8的PBS缓冲液，阴性对照区(133)内包被有非洲猪瘟病毒重组抗原，反应区(134)内包被有非洲猪瘟病毒重组抗原，样本处理区(12)分别与阳性对照区(131)、阴性对照区(133)、空白对照区(132)和反应区(134)连通，样本处理区(12)与出样区(14)连通，出样区(14)上设有排空阀(16)；微流控芯片(1)还包括缓冲溶液池(17)和洗涤液池(18)以及加药池(19)，缓冲溶液池(17)内设有用于处理样本的稀释液，洗涤液池(18)内设有用于处理样本的10×洗涤液，缓冲溶液池(17)和洗涤液池(18)分别与样本处理区(12)连通，加药池(19)与检测区(11)连通；阳性对照血清为重组蛋白VP73和p54分别免疫猪获得的血清，阴性对照血清为非免疫健康猪血清，酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的鼠抗猪IgG抗体，化学发光底物为鲁米诺。
2.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒化学发光试剂盒，其特征在于：稀释液为含5％(v/v)的细胞裂解液的PBS缓冲液，pH＝7.8。
3.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒化学发光试剂盒，其特征在于：10×洗涤液为含0.5％(v/v)Tween-20的PBS缓冲液，pH＝7.8。
4.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒化学发光试剂盒，其特征在于：重组蛋白VP73血清的获得方式为：将非洲猪瘟病毒的VP73基因插入到原核载体pET-30a(+)，转化大肠杆菌BL21，用IPTG诱导重组蛋白表达。
5.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒化学发光试剂盒，其特征在于：重组蛋白p54血清的获得方式为：将非洲猪瘟病毒的p54基因插入到原核载体pET-30a(+)，转化大肠杆菌BL21，用IPTG诱导重组蛋白表达。
6.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒化学发光试剂盒，其特征在于：进样区(11)的数量为3个，出样区(14)的数量为1个，检测区(11)中的阳性对照区(131)、阴性对照区(133)和空白对照区(132)的数量分别为1个，反应区(134)的数量至少为2个，阳性对照区(131)和阴性对照区(133)分别使用一个进样区(11)，空白对照区(132)和反应区(134)共用进样区(11)和出样区(14)。
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