CN105203477A - 一种流感亚单位疫苗单价原液血凝素含量的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种流感亚单位疫苗单价原液血凝素含量的快速检测方法，该方法的步骤包括：一、总蛋白含量测定。二、SDS-PAGE电泳及分析。三、血凝素含量换算。所述方法操作简便，结果准确，比传统的单向免疫扩散法大大缩短了检测时间，提高了检测效率，可在生产中快速测定样品中血凝素含量，而且该方法也可以在无标准抗原和抗血清的情况下，通过总蛋白质含量检测结合电泳检测的方法计算样品中血凝素的含量，是一种新的血凝素检测方法。

Description

一种流感亚单位疫苗单价原液血凝素含量的检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种流感亚单位疫苗单价原液血凝素含量的检测方法，用于快速检测流感亚单位疫苗单价原液中血凝素的含量。

背景技术

流行性感冒是由流感病毒引起的急性呼吸道疾病。其通过呼吸道传播，具有相对高的感染率，可造成大规模流行的人、禽畜共患的急性呼吸道传播疾病，并且其中的一些可以导致严重的发病率和致死率，给社会带来巨大的损失。据统计，全球每年约有5％～15％的人口感染流感病毒，并导致300万～500万的严重病例和50万的死亡病例。最大规模的流感大流行发生于1918～1919年，造成2100～4000万人死亡，超过第一次世界大战的战争死亡人数。到2010年3月30日为止WHO报道了492例禽流感病例，并且有291例死亡，各国的公共卫生部门进行了努力来预防该危险，并且WHO建立了全球监控网络，并且希望能够根据该监控来进行预警。流行性感冒病毒分甲、乙、丙三型。其中，甲型致病力最强，可感染动物和人类并引起流行甚至是世界范围内的大流行；乙型致病力稍弱，可引起局部流行。流感病毒经常发生抗原漂移和抗原转移，逃避机体免疫系统的防御，这也是造成大流行的原因。到现在为止，控制感染性疾病传播的最有效方法是疫苗。尤其对于流感病毒来说，流感疫苗接种是预防和控制流感病毒传播的最有效的手段。

疫苗的应用使流感病毒传染得到了有效的控制，有效地降低了了这些传染病的发病率和死亡率。疫苗中主要有效成分为血凝素，流感病毒血凝素(HA)蛋白是一种保护性抗原，相对分子量为61000，由HA1(相对分子量约37000)和HA2(相对分子量约为25000)两个亚基以二硫键连接，其通过诱导中和抗体(nAb)来保护宿主。因此，流感疫苗的质量是对血凝素的含量来进行评价的，并且疫苗的效果是通过血凝素抑制抗体的滴度来评价的。当前血凝素含量测定的标准方法为单向免疫扩散法，具体步骤如下：

将抗原参考品稀释至控制浓度，然后以9∶1的比例分别将抗原参考品和样品裂解剂混匀，室温静置30分钟。抗原参考品再进行100％、75％、50％、25％稀释，样品稀释至抗原参考品范围内，取对应型别的抗体加入1％琼脂中制板，打孔，置湿盒20～25℃孵育18～24小时。用PBS浸泡1小时后，干燥、染色、脱色。准确测量抗原参考品和供试品形成的沉淀环的直径，以抗原参考品形成的沉淀环的直径对其相应抗原浓度作直线回归，求得直线回归方程，代入供试品的沉淀环直径，即可得到供试品的血凝素含量。

在疫苗的生产中发现，疫苗的检测速度制约了生产周期，检测结果支持下一步工作的进行，仅仅单向免疫扩散试验周期至少需要24小时，需要耽搁一天生产进度。同时，在流感亚单位疫苗生产中，作为内控检测我们需要对单价原液样品的检测包含以下2项：“SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测供试品纯度试验”和“总蛋白含量测定试验”我们发现将现有试验所得数据综合分析即可得知血凝素在样品中的含量，且试验速度快，周期短，检测时间不超过3小时，所得结果可以作为单向免疫扩散法的补充与预判断，指导下一步生产工作。

发明内容

针对上述存在的问题，本发明的目的在于，提供了一种流感亚单位疫苗单价原液血凝素含量的检测方法，所述检测方法能能够快速检测流感亚单位疫苗单价原液中血凝素的含量。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种流感亚单位疫苗单价原液血凝素含量的快速检测方法，所述检测方法包括以下步骤：

(1)总蛋白含量测定；

(2)SDS-PAGE电泳及电泳图分析；

(3)血凝素含量换算：

血凝素HA含量＝总蛋白含量×(HA1百分比+HA2百分比)。

进一步的，步骤(1)所述的总蛋白含量测定方法为Lowry法、BCA法或考马斯亮蓝法。

优选的，所述总蛋白含量测定方法为Lowry法，具体步骤包括：

1)蛋白标准曲线绘制：

量取100μg/ml的标准蛋白溶液0.0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml，分别置于试管中加水至1.0ml，分别再向上述试管中依次加入5.0ml碱性铜溶液，漩涡振荡器混匀，室温放置10分钟。分别再向上述试管中依次快速加入酚试剂0.5ml，漩涡振荡器混匀，室温放置30分钟；

紫外可见分光光度计检测波长650nm处的吸光度值OD₆₅₀，按照标准管蛋白的浓度及其对应的OD₆₅₀绘制标准曲线；以标准曲线的蛋白浓度及其对应的OD₆₅₀，使用计算机计算出直线回归方程以及相关系数；

2)样品测定：

量取一定体积供试品置于试管内，其中含蛋白质30～60μg，再加水至总体积为1.0ml；或将样品稀释至蛋白含量约50μg/ml，取1ml置于试管内；别再向上述试管中加入碱性铜溶液5.0ml，漩涡振荡器混匀，室温放置10分钟；依次再向每支试管快速加入酚试剂0.5ml，漩涡振荡器混匀，室温放置30分钟；显色后，如发现浑浊，可以经每分钟3000转离心15分钟后，取上清液进行测定；在波长650nm处测定吸光度OD₆₅₀；将所测得的供试品的OD₆₅₀带入直线回归方程，计算出供试品的总蛋白质含量。

进一步的，步骤(2)所述的SDS-PAGE电泳为还原型SDS-PAGE电泳，其具体步骤包括：

1)配胶：

配制聚丙烯酰胺凝胶，下层10～15％分离胶，上层5％浓缩胶；

2)上样：

根据步骤(1)中总蛋白含量测定进行的检测结果稀释样品，样品加入还原型上样缓冲液，充分混匀后，煮沸5分钟后上样，样品蛋白含量为5～10μg/孔；

3)电泳：

将制备好的凝胶放入电泳槽中，加入Tris-甘氨酸电极缓冲液，淹没内槽和至少三分之一的外槽，然后用进样器将上述处理好的样品和Marker加入到SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)的样品孔中；凝胶所加电压为60伏，当溴酚蓝染料前沿进入分离胶后，将电压提高到100～140伏，室温总电泳时间为1～2小时，电泳结束后小心从玻璃板中取出凝胶，做标记；

4)凝胶固定和染色：

将凝胶用纯化水漂洗3次以后，放入适量蛋白电泳凝胶固定液中，置于水平摇床缓慢摇动约20分钟，将凝胶取出用纯化水漂洗3次，置于蛋白电泳凝胶染色液中，确保染色液可以充分覆盖凝胶，置于水平摇床缓慢摇动，染色2小时或者过夜；

5)凝胶脱色：

加入适量蛋白电泳凝胶脱色液，确保脱色液可以充分覆盖凝胶，置于水平摇床缓慢摇动，室温脱色，期间至少更换脱色液2～3次，直至蓝色背景基本上全部被脱去，并且蛋白条带染色效果达到预期。

进一步的，步骤(2)中所述的电泳图分析指凝胶脱色完毕后用凝胶成像分析仪拍照，使用凝胶图谱分析软件对亚单位流感疫苗单价原液图片进行图片导入、数据分析，测定其中HA1、HA2条带在总蛋白中的含量百分比。

本发明相比现有技术的有益效果是：

1、本发明所述的流感亚单位疫苗单价原液血凝素含量的快速检测方法，检测试验简单，能够快速检测出血凝素蛋白在样品中的含量，可以作为单向免疫扩散法的补充与预判断，指导下一步生产工作。

下面结合实施例，对本发明作进一步说明。

附图说明

图1-图3为实施例2-4中SDS-PAGE电泳图。

具体实施方式

实施例1

一种流感亚单位疫苗单价原液血凝素含量的快速检测方法，所述检测方法包括以下步骤：

(1)总蛋白含量测定；

(2)SDS-PAGE电泳及电泳图分析；

(3)血凝素含量换算：

血凝素HA含量＝总蛋白含量×(HA1百分比+HA2百分比)。

进一步的，步骤(1)所述的总蛋白含量测定方法为Lowry法、BCA法或考马斯亮蓝法。

优选的，所述总蛋白含量测定方法为Lowry法，具体步骤包括：

1)蛋白标准曲线绘制：

量取100μg/ml的标准蛋白溶液0.0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml，分别置于试管中加水至1.0ml，分别再向上述试管中依次加入5.0ml碱性铜溶液，漩涡振荡器混匀，室温放置10分钟。分别再向上述试管中依次快速加入酚试剂0.5ml，漩涡振荡器混匀，室温放置30分钟；

紫外可见分光光度计检测波长650nm处的吸光度值OD₆₅₀，按照标准管蛋白的浓度及其对应的OD₆₅₀绘制标准曲线；以标准曲线的蛋白浓度及其对应的OD₆₅₀，使用计算机计算出直线回归方程以及相关系数；

2)样品测定：

量取一定体积供试品置于试管内，其中含蛋白质30～60μg，再加水至总体积为1.0ml；或将样品稀释至蛋白含量约50μg/ml，取1ml置于试管内；别再向上述试管中加入碱性铜溶液5.0ml，漩涡振荡器混匀，室温放置10分钟；依次再向每支试管快速加入酚试剂0.5ml，漩涡振荡器混匀，室温放置30分钟；显色后，如发现浑浊，可以经每分钟3000转离心15分钟后，取上清液进行测定；在波长650nm处测定吸光度OD₆₅₀；将所测得的供试品的OD₆₅₀带入直线回归方程，计算出供试品的总蛋白质含量。

进一步的，步骤(2)所述的SDS-PAGE电泳为还原型SDS-PAGE电泳，其具体步骤包括：

1)配胶：

配制聚丙烯酰胺凝胶，下层10～15％分离胶，上层5％浓缩胶；

2)上样：

根据步骤(1)中总蛋白含量测定进行的检测结果稀释样品，样品加入还原型上样缓冲液，充分混匀后，煮沸5分钟后上样，样品蛋白含量为5～10μg/孔；

3)电泳：

将制备好的凝胶放入电泳槽中，加入Tris-甘氨酸电极缓冲液，淹没内槽和至少三分之一的外槽，然后用进样器将上述处理好的样品和Marker加入到SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)的样品孔中；凝胶所加电压为60伏，当溴酚蓝染料前沿进入分离胶后，将电压提高到100～140伏，室温总电泳时间为1～2小时，电泳结束后小心从玻璃板中取出凝胶，做标记；

4)凝胶固定和染色：

将凝胶用纯化水漂洗3次以后，放入适量蛋白电泳凝胶固定液中，置于水平摇床缓慢摇动约20分钟，将凝胶取出用纯化水漂洗3次，置于蛋白电泳凝胶染色液中，确保染色液可以充分覆盖凝胶，置于水平摇床缓慢摇动，染色2小时或者过夜；

5)凝胶脱色：

加入适量蛋白电泳凝胶脱色液，确保脱色液可以充分覆盖凝胶，置于水平摇床缓慢摇动，室温脱色，期间至少更换脱色液2～3次，直至蓝色背景基本上全部被脱去，并且蛋白条带染色效果达到预期。

进一步的，步骤(2)中所述的电泳图分析指凝胶脱色完毕后用凝胶成像分析仪拍照，使用凝胶图谱分析软件对亚单位流感疫苗单价原液图片进行图片导入、数据分析，测定其中HA1、HA2条带在总蛋白中的含量百分比。

实施例2

本实施例是在实施例1基础上的优选方案。

本实施例所用的疫苗为天士力金纳生物技术(天津)有限公司生产的流感亚单位疫苗甲1型(H₁N₁)单价病毒原液，按以下步骤进行测定并与单向免疫扩散法检测结果对比：

一、总蛋白含量测定

1)蛋白标准曲线绘制：

量取100μg/ml的标准蛋白溶液0.0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml，分别置于试管中加水至1.0ml。分别再向上述试管中依次加入5.0ml碱性铜溶液，漩涡振荡器混匀，室温放置10分钟。分别再向上述试管中依次快速加入酚试剂0.5ml，漩涡振荡器混匀，室温放置30分钟。

紫外可见分光光度计检测波长650nm处的吸光度值OD₆₅₀，按照标准管蛋白的浓度及其对应的OD₆₅₀绘制标准曲线。以标准曲线的蛋白浓度及其对应的OD₆₅₀，使用计算机计算出直线回归方程以及相关系数。

2)样品测定：

量取一定体积供试品(含蛋白质50μg左右)置于试管内，再加水至总体积为1.0ml；或将样品稀释至蛋白含量约50μg/ml，取1ml置于试管内。别再向上述试管中加入碱性铜溶液5.0ml，漩涡振荡器混匀，室温放置10分钟。依次再向每支试管快速加入酚试剂0.5ml，漩涡振荡器混匀，室温放置30分钟。显色后，如发现浑浊，可以经每分钟3000转离心15分钟后，取上清液进行测定。在波长650nm处测定吸光度OD₆₅₀。将所测得的供试品的OD₆₅₀带入直线回归方程，计算出供试品的蛋白质含量。

二、SDS-PAGE电泳及分析。

1)配胶：

配制聚丙烯酰胺凝胶，下层12％分离胶，上层5％浓缩胶。

2)上样：

根据前面步骤中蛋白含量测定(Lowry法)进行的检测结果稀释样品，样品加入还原型上样缓冲液，充分混匀后，煮沸5分钟后上样(样品蛋白含量约为10μg/孔)。

3)电泳：

将制备好的凝胶放入电泳槽中，加入Tris-甘氨酸电极缓冲液，淹没内槽和至少三分之一的外槽，然后用进样器将上述处理好的样品和Marker加入到SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)的样品孔中；凝胶所加电压为60伏，当溴酚蓝染料前沿进入分离胶(大约30分钟)后，酌情将电压提高到100～140伏，室温总电泳时间约2小时，电泳结束后小心从玻璃板中取出凝胶，做标记。

4)凝胶固定和染色：

将凝胶用纯化水漂洗3次以后，放入适量蛋白电泳凝胶固定液中，置于水平摇床缓慢摇动约20分钟。将凝胶取出用纯化水漂洗3次，置于蛋白电泳凝胶染色液中，确保染色液可以充分覆盖凝胶。置于水平摇床缓慢摇动，染色2小时或者过夜。

5)凝胶脱色：

加入适量蛋白电泳凝胶脱色液，确保脱色液可以充分覆盖凝胶。置于水平摇床缓慢摇动，室温脱色。期间至少更换脱色液2～3次，直至蓝色背景基本上全部被脱去，并且蛋白条带染色效果达到预期。

6)凝胶拍照及分析：

脱色完毕后用凝胶成像分析仪拍照，使用图谱分析软件AlphaView对亚单位流感疫苗单价原液图片进行图片导入、数据分析，测定其中HA1(相对分子量37000)、HA2(相对分子量为25000)条带在总蛋白中的含量百分比。

三、血凝素含量换算：

血凝素HA含量＝总蛋白含量×(HA1百分比+HA2百分比)

结果：

单价原液	总蛋白含量	HA含量百分比	HA含量	SRID测定
					H1N1	808.76ug/ml	68.75％	556.02ug/ml	513.14ug/ml

实施例3

本实施例所用的疫苗为天士力金纳生物技术(天津)有限公司生产的流感亚单位疫苗甲3型(H₃N₂)单价病毒原液按以下步骤进行测定并与单向免疫扩散法检测结果对比：

一、总蛋白含量测定

1)蛋白标准曲线绘制：

量取100μg/ml的标准蛋白溶液0.0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml，分别置于试管中加水至1.0ml。分别再向上述试管中依次加入5.0ml碱性铜溶液，漩涡振荡器混匀，室温放置10分钟。分别再向上述试管中依次快速加入酚试剂0.5ml，漩涡振荡器混匀，室温放置30分钟。

紫外可见分光光度计检测波长650nm处的吸光度值OD₆₅₀，按照标准管蛋白的浓度及其对应的OD₆₅₀绘制标准曲线。以标准曲线的蛋白浓度及其对应的OD₆₅₀，使用计算机计算出直线回归方程以及相关系数。

2)样品测定：

量取一定体积供试品(含蛋白质50μg左右)置于试管内，再加水至总体积为1.0ml；或将样品稀释至蛋白含量约50μg/ml，取1ml置于试管内。别再向上述试管中加入碱性铜溶液5.0ml，漩涡振荡器混匀，室温放置10分钟。依次再向每支试管快速加入酚试剂0.5ml，漩涡振荡器混匀，室温放置30分钟。显色后，如发现浑浊，可以经每分钟3000转离心15分钟后，取上清液进行测定。在波长650nm处测定吸光度OD₆₅₀。将所测得的供试品的OD₆₅₀带入直线回归方程，计算出供试品的蛋白质含量。

二、SDS-PAGE电泳及分析。

1)配胶：

配制聚丙烯酰胺凝胶，下层12％分离胶，上层5％浓缩胶。

2)上样：

根据前面步骤中蛋白含量测定(Lowry法)进行的检测结果稀释样品，样品加入还原型上样缓冲液，充分混匀后，煮沸5分钟后上样(样品蛋白含量约为10μg/孔)。

3)电泳：

将制备好的凝胶放入电泳槽中，加入Tris-甘氨酸电极缓冲液，淹没内槽和至少三分之一的外槽，然后用进样器将上述处理好的样品和Marker加入到SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)的样品孔中；凝胶所加电压为60伏，当溴酚蓝染料前沿进入分离胶(大约30分钟)后，酌情将电压提高到100～140伏，室温总电泳时间约2小时，电泳结束后小心从玻璃板中取出凝胶，做标记。

4)凝胶固定和染色：

将凝胶用纯化水漂洗3次以后，放入适量蛋白电泳凝胶固定液中，置于水平摇床缓慢摇动约20分钟。将凝胶取出用纯化水漂洗3次，置于蛋白电泳凝胶染色液中，确保染色液可以充分覆盖凝胶。置于水平摇床缓慢摇动，染色2小时或者过夜。

5)凝胶脱色：

加入适量蛋白电泳凝胶脱色液，确保脱色液可以充分覆盖凝胶。置于水平摇床缓慢摇动，室温脱色。期间至少更换脱色液2～3次，直至蓝色背景基本上全部被脱去，并且蛋白条带染色效果达到预期。

6)凝胶拍照及分析：

脱色完毕后用凝胶成像分析仪拍照，使用图谱分析软件AlphaView对亚单位流感疫苗单价原液图片进行图片导入、数据分析，测定其中HA1(相对分子量37000)、HA2(相对分子量为25000)条带在总蛋白中的含量百分比。

三、血凝素含量换算：

血凝素HA含量＝总蛋白含量×(HA1百分比+HA2百分比)

结果：

单价原液	总蛋白含量	HA含量百分比	HA含量	SRID测定
					H3N2	861.62ug/ml	84.68％	792.62ug/ml	747.59ug/ml

实施例4

本实施例所用的疫苗为天士力金纳生物技术(天津)有限公司生产的流感亚单位疫苗乙型(B)单价病毒原液按以下步骤进行测定并与单向免疫扩散法检测结果对比：

一、总蛋白含量测定

1)蛋白标准曲线绘制：

量取100μg/ml的标准蛋白溶液0.0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml，分别置于试管中加水至1.0ml。分别再向上述试管中依次加入5.0ml碱性铜溶液，漩涡振荡器混匀，室温放置10分钟。分别再向上述试管中依次快速加入酚试剂0.5ml，漩涡振荡器混匀，室温放置30分钟。

紫外可见分光光度计检测波长650nm处的吸光度值OD₆₅₀，按照标准管蛋白的浓度及其对应的OD₆₅₀绘制标准曲线。以标准曲线的蛋白浓度及其对应的OD₆₅₀，使用计算机计算出直线回归方程以及相关系数。

2)样品测定：

量取一定体积供试品(含蛋白质50μg左右)置于试管内，再加水至总体积为1.0ml；或将样品稀释至蛋白含量约50μg/ml，取1ml置于试管内。别再向上述试管中加入碱性铜溶液5.0ml，漩涡振荡器混匀，室温放置10分钟。依次再向每支试管快速加入酚试剂0.5ml，漩涡振荡器混匀，室温放置30分钟。显色后，如发现浑浊，可以经每分钟3000转离心15分钟后，取上清液进行测定。在波长650nm处测定吸光度OD₆₅₀。将所测得的供试品的OD₆₅₀带入直线回归方程，计算出供试品的蛋白质含量。

二、SDS-PAGE电泳及分析。

1)配胶：

配制聚丙烯酰胺凝胶，下层12％分离胶，上层5％浓缩胶。

2)上样：

根据前面步骤中蛋白含量测定(Lowry法)进行的检测结果稀释样品，样品加入还原型上样缓冲液，充分混匀后，煮沸5分钟后上样(样品蛋白含量约为10μg/孔)。

3)电泳：

将制备好的凝胶放入电泳槽中，加入Tris-甘氨酸电极缓冲液，淹没内槽和至少三分之一的外槽，然后用进样器将上述处理好的样品和Marker加入到SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)的样品孔中；凝胶所加电压为60伏，当溴酚蓝染料前沿进入分离胶(大约30分钟)后，酌情将电压提高到100～140伏，室温总电泳时间约2小时，电泳结束后小心从玻璃板中取出凝胶，做标记。

4)凝胶固定和染色：

将凝胶用纯化水漂洗3次以后，放入适量蛋白电泳凝胶固定液中，置于水平摇床缓慢摇动约20分钟。将凝胶取出用纯化水漂洗3次，置于蛋白电泳凝胶染色液中，确保染色液可以充分覆盖凝胶。置于水平摇床缓慢摇动，染色2小时或者过夜。

5)凝胶脱色：

加入适量蛋白电泳凝胶脱色液，确保脱色液可以充分覆盖凝胶。置于水平摇床缓慢摇动，室温脱色。期间至少更换脱色液2～3次，直至蓝色背景基本上全部被脱去，并且蛋白条带染色效果达到预期。

6)凝胶拍照及分析：

脱色完毕后用凝胶成像分析仪拍照，使用图谱分析软件AlphaView对亚单位流感疫苗单价原液图片进行图片导入、数据分析，测定其中HA1(相对分子量37000)、HA2(相对分子量为25000)条带在总蛋白中的含量百分比。

三、血凝素含量换算：

血凝素HA含量＝总蛋白含量×(HA1百分比+HA2百分比)

结果：

单价原液	总蛋白含量	HA含量百分比	HA含量	SRID测定
					B	705.57ug/ml	73.44％	518.17ug/ml	481.28ug/ml

由上述实施例中的数据可以看出，本发明提供的方法能够快速准确的检测出流感病毒亚单位疫苗单价原液中血凝素的含量，与标准检测法(单向免疫扩散法)相差不大，误差在10％以内。

Claims (5)

1.一种流感亚单位疫苗单价原液血凝素含量的快速检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：

(1)总蛋白含量测定；

(2)SDS-PAGE电泳及电泳图分析；

(3)血凝素含量换算：

血凝素HA含量＝总蛋白含量×(HA1百分比+HA2百分比)。

2.根据权利要求1所述的流感亚单位疫苗单价原液血凝素含量的快速检测方法，其特征在于，步骤(1)所述的总蛋白含量测定方法为Lowry法、BCA法或考马斯亮蓝法。

3.根据权利要求2所述的流感亚单位疫苗单价原液血凝素含量的快速检测方法，其特征在于，所述总蛋白含量测定方法为Lowry法，具体步骤包括：

1)蛋白标准曲线绘制：

量取100μg/ml的标准蛋白溶液0.0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml，分别置于试管中加水至1.0ml，分别再向上述试管中依次加入5.0ml碱性铜溶液，漩涡振荡器混匀，室温放置10分钟。分别再向上述试管中依次快速加入酚试剂0.5ml，漩涡振荡器混匀，室温放置30分钟；

紫外可见分光光度计检测波长650nm处的吸光度值OD₆₅₀，按照标准管蛋白的浓度及其对应的OD₆₅₀绘制标准曲线；以标准曲线的蛋白浓度及其对应的OD₆₅₀，使用计算机计算出直线回归方程以及相关系数；

2)样品测定：

量取一定体积供试品置于试管内，其中含蛋白质30～60μg，再加水至总体积为1.0ml；或将样品稀释至蛋白含量约50μg/ml，取1ml置于试管内；别再向上述试管中加入碱性铜溶液5.0ml，漩涡振荡器混匀，室温放置10分钟；依次再向每支试管快速加入酚试剂0.5ml，漩涡振荡器混匀，室温放置30分钟；显色后，如发现浑浊，可以经每分钟3000转离心15分钟后，取上清液进行测定；在波长650nm处测定吸光度OD₆₅₀；将所测得的供试品的OD₆₅₀带入直线回归方程，计算出供试品的总蛋白质含量。

4.根据权利要求1所述的流感亚单位疫苗单价原液血凝素含量的快速检测方法，其特征在于，步骤(2)所述的SDS-PAGE电泳为还原型SDS-PAGE电泳，

其具体步骤包括：

1)配胶：

配制聚丙烯酰胺凝胶，下层10～15％分离胶，上层5％浓缩胶；

2)上样：

根据步骤(1)中总蛋白含量测定进行的检测结果稀释样品，样品加入还原型上样缓冲液，充分混匀后，煮沸5分钟后上样，样品蛋白含量为5～10μg/孔；

3)电泳：

将制备好的凝胶放入电泳槽中，加入Tris-甘氨酸电极缓冲液，淹没内槽和至少三分之一的外槽，然后用进样器将上述处理好的样品和Marker加入到SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)的样品孔中；凝胶所加电压为60伏，当溴酚蓝染料前沿进入分离胶后，将电压提高到100～140伏，室温总电泳时间为1～2小时，电泳结束后小心从玻璃板中取出凝胶，做标记；

4)凝胶固定和染色：

将凝胶用纯化水漂洗3次以后，放入适量蛋白电泳凝胶固定液中，置于水平摇床缓慢摇动约20分钟，将凝胶取出用纯化水漂洗3次，置于蛋白电泳凝胶染色液中，确保染色液可以充分覆盖凝胶，置于水平摇床缓慢摇动，染色2小时或者过夜；

5)凝胶脱色：

加入适量蛋白电泳凝胶脱色液，确保脱色液可以充分覆盖凝胶，置于水平摇床缓慢摇动，室温脱色，期间至少更换脱色液2～3次，直至蓝色背景基本上全部被脱去，并且蛋白条带染色效果达到预期。

5.根据权利要求1所述的流感亚单位疫苗单价原液血凝素含量的快速检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述的电泳图分析指凝胶脱色完毕后用凝胶成像分析仪拍照，使用凝胶图谱分析软件对亚单位流感疫苗单价原液图片进行图片导入、数据分析，测定其中HA1、HA2条带在总蛋白中的含量百分比。