CN106872551B - 一种注射用重组人尿激酶原的电泳纯度测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种注射用重组人尿激酶原的纯度电泳测定方法，包括如下步骤：(1)供试品溶液的制备：取注射用重组人尿激酶原置于冰上融化，MilliQ水稀释，加入非还原样品缓冲液后，置于55‑65℃加热1‑5分钟后，立即置于冰浴中得非还原态供试品溶液；(2)Marker溶液的制备：取Marker溶液融化后置于80‑100℃水浴1‑5分钟，立即置冰浴备用；(3)测定方法：采用垂直板凝胶电泳系统，对供试品溶液和Marker溶液进行检测，两种溶液的上样量为10‑20μl，仪器初始电压50‑60V，进入分离胶时调整电压100‑110V，当溴酚蓝条带跑到凝胶下边缘时，电泳结束，电泳后分别染色、脱色、得到图谱，根据图谱计算供试品溶液纯度。
Description
技术领域
本发明属于医药领域，尤其是涉及一种注射用重组人尿激酶原的电泳纯度测定方法。
背景技术
尿激酶原是尿激酶的前体，是一种糖蛋白，由411个氨基酸组成，其本身无活性，经纤维蛋白溶解酶和激肽酶的激活，使其Lys158-Ile159之间的肽链打开形成尿激酶，才能发挥其溶血栓的效能。是一种特异性的溶血栓的药物。
上海天士力生产的重组人尿激酶原为通过基因工程方法构建的中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)表达获得的，主要用于急性ST段抬高性心肌梗死的溶栓治疗，已于2011年作为国家一类新药成功上市。
聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术是以聚丙烯酰胺凝胶做支持物的一种区带电泳技术，聚丙烯酰胺凝胶具有网状立体结构，很少带有离子的侧基，惰性好，电泳时，电渗作用小，几乎无吸附作用，对热稳定，呈透明状，易于观察结果。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂亚甲基双丙烯酰胺(简称Bis)在催化剂的作用下，聚合交联而成的含有酰胺基侧链的脂肪族大分子化合物。
聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳系统主要仪器包括：电泳仪、垂直平板电泳槽、微量注射器、灯泡瓶、移液器、染色与脱色缸、量筒、滴管等。使用的试剂包括：1.丙烯酰胺(单体，简称Acr)，2.1％琼脂，3.N，N，N，，N，—四甲基乙二胺(TEMED)，4.N，N，—亚甲基双丙烯酰胺(交联剂，简称Bis)，5.过硫酸铵(聚合时的催化剂)，6.试剂A(pH8.9)：36.6g三羟甲基氨基甲烷(Tris)和48mL1mol/l HCl混合加水至100ml，7.试剂B(pH 6.7)：5.98g Tris和48ml1mol/lHCl混合加水至100ml，8.电极缓冲液：6.0gTris和28.8g甘氨酸混合加水至1000ml，用时稀释10倍，9.0.05％溴酚蓝，10.20％甘油，11.7％醋酸，12.1mol/l HCl，13.蛋白样品：人或动物血清。
聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳系统主要操作步骤包括：1.垂直平板电泳槽的安装，2.凝胶的制备，包括(1)分离胶的制备，(2)浓缩胶的制备3.加样，4.电泳，5.染色，6.鉴定等步骤。根据染色所出现的区带，分析样品的纯度。
对于重组人尿激酶原而言，为保证重组人尿激酶原的质量，需要对尿激酶原的纯度进行检测。目前的检测方法检测结果不准确，且供试品分离不理想，尿激酶原样品通常100℃高温处理，造成蛋白质破坏，以致测定方法准确度不高，不适合产业化生产的检验。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种注射用重组人尿激酶原的电泳纯度测定方法。该方法准确性好，适合产业化的日常检验。
本发明是通过如下技术方案实现的：
一种注射用重组人尿激酶原的纯度电泳测定方法，所述方法包括如下步骤：
(1)供试品溶液的制备：取注射用重组人尿激酶原置于冰上融化，MilliQ水稀释，加入非还原样品缓冲液后，置于55-80℃加热1-5分钟后，立即置于冰浴中得非还原态供试品溶液；
(2)Marker溶液的制备：取Marker溶液融化后置于80-100℃水浴1-5分钟，立即置冰浴备用；
(3)测定方法：采用垂直板凝胶电泳系统，对供试品溶液和Marker溶液进行检测，两种溶液的上样量为10-20μl，仪器初始电压50-60 V，进入分离胶时调整电压100-110V，当溴酚蓝条带跑到凝胶下边缘时，电泳结束，电泳后分别染色、脱色、得到图谱，根据图谱计算供试品溶液纯度。
其中，所述的非还原样品缓冲液是指，三羟基氨基甲烷0.2-0.5份、十二烷基硫酸钠0.5-1份、溴酚蓝0.001-0.003份，丙三醇2-6份、盐酸0.05-1份，加MilliQ注射用水溶解并定容到10份得到的缓冲液。优选的是，三羟基氨基甲烷(Tris，电泳纯)0.3份、十二烷基硫酸钠(SDS,电泳纯)0.8份、溴酚蓝0.002份，丙三醇(甘油)4份、盐酸0.2份，加MilliQ注射用水溶解并定容到10份即得。
本发明所述的份，固体是指重量(g)份，液体为体积(ml)份。例如1g＝1份、1ml＝1份。
其中，所述的Marker溶液，是购买自GE Healthcar、Takara、Geneshun、Solarbio、TIANGEN
其中，MilliQ注射用水，企业自制。
其中，所述垂直板凝胶电泳系统属于现有技术，本发明在现有技术的基础上对电泳条件进行了筛选。
本发明的电泳缓冲液采用以下缓冲液：三羟基氨基甲烷10-20份、甘氨酸65-85份，十二烷基硫酸钠4-8份、加MilliQ注射用水溶解，用盐酸调节pH至7.5-9.0后，继续用milliQ水定容到5000份，即得。优选的缓冲液为，三羟基氨基甲烷(Tris，至少分析纯级)15.0份，甘氨酸(至少分析纯级)72.0份，十二烷基硫酸钠(SDS，至少分析纯级)5.0份，加4000份左右的MilliQ注射用水溶解，用盐酸调节pH至8.3后，继续用milliQ水加至5000份，充分混匀，即得。
本发明所用的凝胶板为SDS-聚丙烯酰胺凝胶板，由玻璃板、15％分离胶溶液、5％浓缩胶溶液制备得到。其中所述的15％分离胶溶液包括MilliQ注射用水1-2.5份、30％凝胶贮备液1.5—3.5份、Tris-HCl缓冲液(PH8.8、1.5M)1-2.5份、10％SDS0.02-0.1份、10％AP0.01-0.05份、TEMED0.001-0.005份；优选的，所述15％分离胶溶液包括包括MilliQ注射用水1.2份、30％凝胶贮备液2.5份、Tris-HCl缓冲液(PH8.8、1.5M)1.25份、10％SDS0.05份、10％AP 0.025份、TEMED0.002份。所述5％浓缩胶溶液包括MilliQ注射用水1-2份、30％凝胶贮备液0.2-0.5份、Tris-HCl缓冲液(PH6.8、1.0M)0.1-0.5份、10％SDS0.01-0.04份、10％AP0.01-0.04份、TEMED0.001-0.005份。优选的，所述5％浓缩胶溶液包括MilliQ注射用水1.4份、30％凝胶贮备液0.33份、Tris-HCl缓冲液(PH6.8、1.0M)0.25份、10％SDS 0.02份、10％AP0.02份、TEMED 0.002份。
凝胶贮备液,是购买自Sigma、Cellchipbj、Maibio、普利莱
TEMED,是购买自Sigma、Macklin、Amethyst、TCI
SDS,是购买自Sigma、SERVA Electrophoresis Gmblt、Macklin、TCI
AP,是购买自国药集团化学试剂有限公司、Macklin、TCI、Amethyst
本发明的测定方法，步骤(1)中，加热温度优选55-65℃水浴加热3-5分钟。MilliQ水稀释至蛋白含量18-23μg/28-33μl，非还原态供试品溶液蛋白含量为18-23μg/38-43μl。最佳蛋白含量20μg/30μl，非还原态供试品溶液蛋白含量为20μg/40μl。
本发明的测定方法，步骤(2)中所述的Marker范围95KD-15KD。
本发明的测定方法，步骤(3)中，上样前供试品溶液和Marker溶液，过滤或离心后，冷冻待上样。优选采用离心机离心，离心条件为8000rmp/min，离心1min后置冰上冷冻。所述垂直板凝胶电泳系统的初始电压优选为58V，进入分离胶时调整电压108V，当溴酚蓝条带跑到凝胶下边缘时，电泳结束。
用本发明的方法，对真实的样品进行了检测，得到了电泳条带图谱，本发明用QuantityOne分析软件对电泳条带图谱的图像进行分析，得出要报告的参数(分子量KD(Mol.Wt)、扫描丰度Int×mm(Trace Qty)、百分比％(Relative Qty)等。
本发明的测定方法，其中电泳条件是经过筛选得到的，例如，本发明采用以下方法制备凝胶板，取得了意想不到的技术效果：
制备凝胶板方法如下：
安装玻璃板
1.带好乳胶手套，取出一套洁净(无尘、无污渍)的玻璃板，将短玻璃板放在长玻璃板有突起的一面，将两块玻璃板的下端与两边对齐。
2将紧贴的两块玻璃板放入玻板夹内，在确保两块玻板的下端与两边对齐后，卡紧玻板夹，并将此套装置固定于制胶架上。
3.配胶(在通风橱内进行，但配胶过程中，不能开风量)也可以采用商购预制胶进行实验。
表1：分离胶和浓缩胶配制表
4.配分离胶
◆按上述配方顺序在通风橱中配制分离胶于一个烧杯中；
◆每加一样试剂都要进行混匀，混匀时可以用手轻轻的摇动烧杯，使杯中的液体转起来，或用手中的移液枪进行吹吸混匀；待加完TEMED并混匀后，用移液枪迅速吸取配好的分离胶液体沿玻板夹缝边缘灌入到玻板夹缝中，每套玻板夹缝约加入3.2ml分离胶；
◆然后再于胶液液面上缓缓加入MilliQ注射用水(约2～3mm高)，封住胶液液面，这样形成的凝胶表面就会光滑平整。
◆等待约30-60分钟，分离胶凝固，小心倾倒出分离胶上方的MilliQ水，残液可用滤纸吸干，注意玻板夹缝中不要留有滤纸的毛屑。
5.配浓缩胶
◆分离胶上方的残余液体吸干后，即可开始配制浓缩胶。
◆按上述配方顺序配制浓缩胶于一个烧杯中，每加一样试剂都要进行混匀，混匀时可以用手轻轻的摇动烧杯，使杯中的液体转起来，或用手中的移液枪进行吹吸混匀。
◆待加完TEMED并混匀后，用移液枪迅速吸取浓缩胶液体沿玻板夹缝边缘灌入到分离胶上面，至玻璃板槽刚好被灌满为止。
6.插梳子
◆浓缩胶灌入后，迅速将电泳专用梳子(10孔，0.75mm)插入到玻板夹缝中；
◆插入时先使梳子一边接触到浓缩胶，再逐渐的把梳子的另一边接触浓缩胶，这样可以排除由于插入时带入的气泡。
◆将梳子一直插到底，使梳子柄上的突起碰倒玻板上缘即可，等待约30-60分钟浓缩胶凝固，此时形成的上样孔的最大上样量为33μl。
7.配制好的胶，宜放置过夜后使用(可以得到较好的分离效果)。为防止胶变干，玻板四周用封口膜封口，将制好的胶置于冰箱2-8℃冷藏条件下可保存14天。
本发明还包括步骤(4)染色，具体如下
将凝胶放入考马斯亮蓝R250染液中，在摇床上摇动染色(染色用的容器应能避光)过夜，染液的多少以摇动时液面仍没过凝胶为宜，期间要轻轻摇动，同时避免染液溢出。
当Marker的各分子量条带能清晰可见时，即可染色结束。
步骤(5)脱色
脱色液，共计更换3-5次脱色
若胶增加，应分别独立脱色，不能混放于一个容器内进行，会影响脱色的均一性。
当Marker条带清洗可见，凝胶底色几乎无色时，脱色结束。
步骤(6)：脱色好的凝胶用milliQ注射水清洗干净后，浸泡于milliQ水中。
步骤(7)图像采集及分析
将经脱色清洗后的凝胶置于成像仪中成像，获得凝胶图像。
1拍照结束后，取出胶用塑封膜封存。
采用QuantityOne分析软件对图像进行分析，测得重组人尿激酶原蛋白分子量为40.0～60.0KD。
本发明的有益效果通过下述试验例阐述
试验例一，供试品溶液制备优化试验
试验方法：按照实施例1的方法进行
试验结果：见表2
表2优化试验纯度比较
试验结论：
因重组人尿激酶原不耐受高温，温度对其有明显影响，故将供试品溶液的处理温度进行调整，表2，优化后SDS纯度有明显提高。3批样品的重现性好，提高检测结果的准确性。图1、2可以看出，优化样品处理步骤后，产品的杂质带明显减小。检验方法经优化后可以减少检验样品处理过程带来的干扰，保证检验结果的准确性。
试验例二，供试品前处理温度的选择
本发明的供试品溶液的处理方式是经过优化得到的：
由于重组人尿激酶原不耐受高温，温度对其有明显影响，故将供试品溶液的处理温度进行了优化，本发明的尿激酶原的处理温度分别采用：100℃、80℃、70℃、65℃、55℃，经电泳检测后，发现，尿激酶原在55-65℃下进行加热，最终得到的纯度最高。见表3、图3。
表3不同温度下的重组人尿激酶原纯度
附图说明
图1为供试品优化前电泳图像
图2为供试品优化后的电泳图像
图3为不同温度的电泳图像
具体实施方式
本发明的具体实施方式仅是用来说明本发明权利要求，对权利要求范围没有限定作用。
实施例1
真实样品的检测：
1、操作程序
1.1检验所需试剂、溶液
1.1.1 30％凝胶贮备液：电泳纯，2-8℃避光保存。
1.1.2 1.5mo1/L Tris-HCl缓冲液(pH8.8)：称取18.2g三羟基氨基甲烷(Tris，电泳纯)，加适量MilliQ注射用水溶解，用稀盐酸调节pH至8.8，定容至100ml，2-8℃保存。
1.1.3 1.0mol/L Tris-HCl缓冲液(pH6.8)：称取12.1g三羟基氨基甲烷(Tris，电泳纯)，加适量MilliQ注射用水溶解，用稀盐酸调节pH至6.8，定容至100ml，2-8℃保存。
1.1.4 10％十二烷基硫酸钠(SDS)：称取10g的十二烷基硫酸钠(SDS，电泳纯)，加入100ml MilliQ注射用水溶解，即得，常温保存。
1.1.5 10％过硫酸铵(AP)：称取0.1g的过硫酸铵，加入1ml milliQ注射用水溶解，50μl/支进行分装，即得，-20℃避光保存，有效期1个月。
1.1.6四甲基乙二胺溶液(TEMED)：电泳纯，2-8℃避光保存。
1.1.7非还原型样品缓冲液(4×)：称取三羟基氨基甲烷(Tris，电泳纯)0.303g、十二烷基硫酸钠(SDS,电泳纯)0.8g、溴酚蓝2mg，量取丙三醇(甘油)4ml、盐酸0.189ml，加MilliQ注射用水溶解并定容至10ml，0.25ml/支分装，-20℃保存。
1.1.8还原型样品缓冲液(4×)：称取三羟基氨基甲烷(Tris，电泳纯)0.303g、十二烷基硫酸钠(SDS,电泳纯)0.8g、溴酚蓝2mg，量取丙三醇(甘油)4ml、盐酸0.189ml、二硫苏糖醇(DTT)0.617g，加MilliQ注射用水溶解并定容至10ml，0.25ml/支分装，-20℃保存。
1.1.9电泳缓冲液：称取15.0g三羟基氨基甲烷(Tris，至少分析纯级)，72.0g甘氨酸(至少分析纯级)，5.0g十二烷基硫酸钠(SDS，至少分析纯级)，加4000ml左右的MilliQ注射用水溶解，用盐酸调节pH至8.3后，继续用milliQ水加至5000ml，充分混匀，即得。
1.1.10染色液：称取1.0g考马斯亮蓝，加入甲醇200ml、乙酸50ml、纯化水250ml，混匀即得，常温避光保存。
1.1.11脱色液：量取甲醇400ml、乙酸100ml与纯化水500ml混匀，即得。
1.1.12蛋白低分子量Marker：应购买涵盖95KD-15KD范围的Marker。
1.1.13蛋白低分子量Marker溶液：按照Marker说明进行配制。
1.2检验所需仪器：垂直板凝胶电泳系统，拍照成像系统。
1.3检验环境条件：20℃～30℃。
1.4检验前准备
1.4.1安装玻璃板
1.4.1.1带好乳胶手套，取出一套洁净(无尘、无污渍)的玻璃板，将短玻璃板放在长玻璃板有突起的一面，将两块玻璃板的下端与两边对齐。
1.4.1.2将紧贴的两块玻璃板放入玻板夹内，在确保两块玻板的下端与两边对齐后，卡紧玻板夹，并将此套装置固定于制胶架上。
1.4.2配胶(在通风橱内进行，但配胶过程中，不能开风量)也可以采用商购预制胶进行实验。
分离胶和浓缩胶配制表
1.4.2.1配分离胶
◆按上述配方顺序在通风橱中配制分离胶于一个烧杯中；
◆每加一样试剂都要进行混匀，混匀时可以用手轻轻的摇动烧杯，使杯中的液体转起来，或用手中的移液枪进行吹吸混匀；待加完TEMED并混匀后，用移液枪迅速吸取配好的分离胶液体沿玻板夹缝边缘灌入到玻板夹缝中，每套玻板夹缝约加入3.2ml分离胶；
◆然后再于胶液液面上缓缓加入MilliQ注射用水(约2～3mm高)，封住胶液液面，这样形成的凝胶表面就会光滑平整。
◆等待约30-60分钟，分离胶凝固，小心倾倒出分离胶上方的MilliQ水，残液可用滤纸吸干，注意玻板夹缝中不要留有滤纸的毛屑。
1.4.2.2配浓缩胶
◆分离胶上方的残余液体吸干后，即可开始配制浓缩胶。
◆按上述配方顺序配制浓缩胶于一个烧杯中，每加一样试剂都要进行混匀，混匀时可以用手轻轻的摇动烧杯，使杯中的液体转起来，或用手中的移液枪进行吹吸混匀。
◆待加完TEMED并混匀后，用移液枪迅速吸取浓缩胶液体沿玻板夹缝边缘灌入到分离胶上面，至玻璃板槽刚好被灌满为止。
1.4.2.3插梳子
◆浓缩胶灌入后，迅速将电泳专用梳子(10孔，0.75mm)插入到玻板夹缝中；
◆插入时先使梳子一边接触到浓缩胶，再逐渐的把梳子的另一边接触浓缩胶，这样可以排除由于插入时带入的气泡。
◆将梳子一直插到底，使梳子柄上的突起碰倒玻板上缘即可，等待约30-60分钟浓缩胶凝固，此时形成的上样孔的最大上样量为33μl。
1.4.2.4配制好的胶，宜放置过夜后使用(可以得到较好的分离效果)。为防止胶变干，玻板四周用封口膜封口，将制好的胶置于冰箱2-8℃冷藏条件下可保存14天。
1.4.3接电极
1.4.3.1先从制胶架上取下玻璃板夹(绿色)，再从玻璃板夹上卸下含凝胶的玻璃板；
1.4.3.2使短玻璃板朝向内，并将玻璃板三明治的下缘卡入电极下端的槽中，一个电极可接两份玻璃板三明治(若只作一块板电泳时，则电极的另一面放入一块塑料挡板)；
1.4.3.3将电极放入电极室中，锁紧电极室；
1.4.3.4将电极室放入电泳槽中，倒入电泳缓冲液(注意电极室内部注入的电泳缓冲
液的液面必须没过两块短玻璃板，但不能超过两块长玻璃板；电极室外部注入的电泳缓冲液不能没过任何一个玻璃板)；
1.4.3.5小心拔出梳子，不要把胶碰坏，使电泳缓冲液自然浸润上样槽，要使上样孔内的气泡全部排出,否则会影响加样效果。
1.5检验步骤
1.5.1样品制备
1.5.1.1供试品溶液制备
◆取待测样品置冰上，待样品融化后(待测样品仅可冻融1次)，根据样品的蛋白含量，用MilliQ水稀释至20μg/30μl。
◆向上述装有20μg/30μl浓度样品溶液的离心管中加入10μl的非还原样品缓冲液，即得。(非还原态供试品蛋白含量为20μg/40μl)。
1.5.1.2 Marker溶液制备：直接从冰箱中取出，待其融化后即可使用。
1.5.2样品处理
1.5.2.1供试品溶液：55℃水浴3分钟后，立即置冰浴备用。
1.5.2.2 Marker溶液：100℃水浴3分钟后，立即置冰浴备用。
1.5.3上样
1.5.3.1上样步骤
◆取经过处理的供试品溶液和Marker溶液，8000rmp/min离心1min后置冰上，待上样。
◆用微量注射器吸取样品溶液，将微量注射器针头插进上样孔，尽量接近上样孔底端，缓缓推入样品，使样品沉降在上样孔底端。
◆注射器不可插入过深，以防刺破胶体，也不可过浅，在样下沉时会发生扩散；为避免边缘效应，最好选用中部的孔上样。
1.5.3.2上样量
◆供试品溶液：20μl(即上样量10μg)
◆Marker溶液：根据mark说明书规定，确认上样量。
1.5.3.3上样注意事项：Marker与样品不宜上样在相邻泳道上(因为还原态样品与非还原态样品上样在相邻的泳道上会产生交互作用，从而影响电泳结果)。
1.5.4电泳
1.5.4.1将电泳槽的盖子盖上，注意正、负极连接正确(红接红，黑接黑)，打开电泳仪，调节电压到58v，按run键开始电泳。
1.5.4.2当溴酚蓝条带跑到浓缩胶和分离胶接壤处，调整电压到108v，当溴酚蓝条带跑到凝胶下边缘时，电泳结束。
1.5.5卸胶
1.5.5.1关闭电泳仪电源，取出电极室，倒掉室内的电泳缓冲液。
1.5.5.2打开电极室取出电极和胶板。
1.5.5.3取出胶板，用撬胶板从两块玻璃板间的狭缝轻轻撬开两块玻璃板，并取出电泳后的凝胶。
1.5.6染色
1.5.6.1将凝胶放入考马斯亮蓝R250染液中，在摇床上摇动染色(染色用的容器应能避光)过夜，染液的多少以摇动时液面仍没过凝胶为宜，期间要轻轻摇动，同时避免染液溢出。
1.5.6.2当Marker的各分子量条带能清晰可见时，即可染色结束。
1.5.7脱色
1.5.7.150ml脱色液40min/次(一块胶)，共计更换3次脱色液，共需120min。
1.5.7.2若胶增加，应分别独立脱色，不能混放于一个容器内进行，会影响脱色的均一性。
1.5.7.3当Marker条带清洗可见，凝胶底色几乎无色时，脱色结束。
1.5.8清洗：脱色好的凝胶用milliQ注射水清洗干净后，浸泡于milliQ水中。
1.5.10图像采集
1.5.10.1将经脱色清洗后的凝胶置于成像仪中成像，获得凝胶图像。
1.5.10.2拍照结束后，取出胶用塑封膜封存。
1.6凝胶电泳图谱分析
采用QuantityOne分析软件对图像进行分析，得出要报告的参数(分子量KD(Mol.Wt)、扫描丰度Int×mm(Trace Qty)、百分比％(Relative Qty)等。
1.7检验结果分析及报告
重组人尿激酶原蛋白分子量为40.0～60.0KD。
实施例2
将实施例1中所述的非还原样品缓冲液、电泳缓冲液、15％分离胶溶液5、％浓缩胶溶液替换如下：
非还原样品缓冲液是指称取三羟基氨基甲烷0.2g、十二烷基硫酸钠0.5g、溴酚蓝0.001g，量取丙三醇2ml、盐酸0.05ml，加MilliQ注射用水溶解并定容即可。
电泳缓冲液：称取三羟基氨基甲烷10g、甘氨酸65g，十二烷基硫酸钠4g、加MilliQ注射用水溶解，用盐酸调节pH至7.5-9.0后，继续用milliQ水定容，即得。
15％分离胶溶液包括MilliQ注射用水1ml、30％凝胶贮备液1.5ml、Tris-HCl缓冲液(PH8.8、1.5M)1ml、10％SDS0.02ml、10％AP 0.01ml、TEMED0.001ml；
所述5％浓缩胶溶液包括MilliQ注射用水1ml、30％凝胶贮备液0.2ml、Tris-HCl缓冲液(PH6.8、1.0M)0.1ml、10％SDS0.01ml、10％AP0.01ml、TEMED0.001ml。
实施例3
将实施例1中所述的非还原样品缓冲液、电泳缓冲液、15％分离胶溶液5、％浓缩胶溶液替换如下：
非还原样品缓冲液是指称取三羟基氨基甲烷0.5g、十二烷基硫酸钠1g、溴酚蓝0.003g，量取丙三醇6ml、盐酸1ml，加MilliQ注射用水溶解并定容即可。
电泳缓冲液：称取三羟基氨基甲烷20g、甘氨酸85g，十二烷基硫酸钠8g、加MilliQ注射用水溶解，用盐酸调节pH至7.5-9.0后，继续用milliQ水定容，即得。
所述的15％分离胶溶液包括MilliQ注射用水2.5ml、30％凝胶贮备液3.5ml、Tris-HCl缓冲液(PH8.8、1.5M)2.5ml、10％SDS0.02-0.1份、10％AP 0.01-0.05份、TEMED0.005ml；所述5％浓缩胶溶液包括MilliQ注射用水2ml、30％凝胶贮备液0.5ml、Tris-HCl缓冲液(PH6.8、1.0M)0.5ml、10％SDS0.04ml、10％AP0.04ml、TEMED0.005ml。
Claims (8)
1.一种注射用重组人尿激酶原的纯度电泳测定方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
（1）供试品溶液的制备：取注射用重组人尿激酶原置于冰上融化，MilliQ水稀释，加入非还原样品缓冲液后，置于55-65℃加热1-5分钟后，立即置于冰浴中得非还原态供试品溶液；
（2）Marker溶液的制备：取Marker溶液融化后置于80-100℃水浴1-5分钟，立即置冰浴备用；
（3）测定方法：采用垂直板凝胶电泳系统，对供试品溶液和Marker溶液进行检测，两种溶液的上样量为10-20μL，仪器初始电压50-60 V，进入分离胶时调整电压100-110V，当溴酚蓝条带跑到凝胶下边缘时，电泳结束，电泳后分别染色、脱色、得到图谱，根据图谱计算供试品溶液纯度；
其中，步骤（1）中所述非还原样品缓冲液其配制方法如下：三羟基氨基甲烷0.2-0.5份、十二烷基硫酸钠0.5-1份、溴酚蓝0.001-0.003份，丙三醇2-6份、盐酸0.05-1份，加MilliQ注射用水溶解并定容到10份得到的缓冲液；
其中，步骤（3）中所述采用垂直板凝胶电泳系统，系统用到的缓冲液为：三羟基氨基甲烷10-20份、甘氨酸65-85份，十二烷基硫酸钠4-8份、加MilliQ注射用水溶解，用盐酸调节pH至7.5-9.0后，继续用milliQ水定容到5000份，即得。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述非还原样品缓冲液其配制方法如下：三羟基氨基甲烷0.3份、十二烷基硫酸钠0.8份、溴酚蓝0.002份，丙三醇4份、盐酸0.2份，加MilliQ注射用水溶解并定容到10份即得。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述缓冲液为：三羟基氨基甲烷15.0份，甘氨酸72.0份，十二烷基硫酸钠5.0份，加4000份的MilliQ注射用水溶解，用盐酸调节pH至8.3后，继续用milliQ水加至5000份，充分混匀，即得。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中所述采用垂直板凝胶电泳系统，采用的凝胶板为SDS-聚丙烯酰胺凝胶板，其由玻璃板、15%分离胶溶液、5%浓缩胶溶液制备得到；所述15%分离胶溶液包括MilliQ注射用水1-2.5份、30%凝胶贮备液1.5—3.5份、Tris-HCL缓冲液1-2.5份、10%SDS0.02-0.1份、10%AP 0.01-0.05份、TEMED0.001-0.005份；所述5%浓缩胶溶液包括MilliQ注射用水1-2份、30%凝胶贮备液0.2-0.5份、Tris-HCL缓冲液0.1-0.5份、10%SDS0.01-0.04份、10%AP0.01-0.04份、TEMED0.001-0.005份，步骤（3）中上样前供试品溶液和Marker溶液，经过滤或离心后，冷冻待上样。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述15%分离胶溶液包括MilliQ注射用水1.2份、30%凝胶贮备液2.5份、Tris-HCL缓冲液1.25份、10%SDS0.05份、10%AP 0.025份、TEMED0.002份；所述5%浓缩胶溶液包括MilliQ注射用水1.4份、30%凝胶贮备液0.33份、Tris-HCL缓冲液0.25份、10%SDS 0.02份、10%AP0.02份、TEMED 0.002份，步骤（3）中，上样前供试品溶液和Marker溶液采用离心机离心，离心条件为8000rmp/min，离心1min后置冰上冷冻，所述垂直板凝胶电泳系统的初始电压优选为58V，进入分离胶时调整电压108V，当溴酚蓝条带跑到凝胶下边缘时，电泳结束。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，加热温度为55-65℃水浴加热3-5分钟，MilliQ水稀释至蛋白含量18-23μg/28-33μL，非还原态供试品溶液蛋白含量为18-23μg/38-43μL。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，MilliQ水稀释至蛋白含量20μg/30μL，非还原态供试品溶液蛋白含量为20μg/40μL。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）供试品溶液的制备：取注射用重组人尿激酶原待测样品置于冰上融化，水稀释，加入非还原样品缓冲液后，置于55-65℃加热3-5分钟后，立即置于冰浴中得非还原态供试品溶液备用；
（2）Marker溶液的制备：取Marker溶液融化后置于100℃水浴5分钟，立即置冰浴备用；
（3）测定方法：采用垂直板凝胶电泳系统，对供试品溶液和Marker溶液进行检测，两种溶液的上样量20μL，初始电压58V，进入分离胶时调整电压108V，当溴酚蓝条带跑到凝胶下边缘时，电泳结束，电泳后分别染色、脱色、得到图谱，根据图谱计算供试品溶液纯度；
其中，步骤（1）中所述非还原样品缓冲液其配制方法如下：三羟基氨基甲烷0.3份、十二烷基硫酸钠0.8份、溴酚蓝0.002份，丙三醇4份、盐酸0.2份，加MilliQ注射用水溶解并定容到10份即得；步骤（1）中，MilliQ水稀释至蛋白含量20μg/30μL，非还原态供试品溶液蛋白含量为20μg/40μL；
其中，步骤（3）中所述采用垂直板凝胶电泳系统，系统用到的缓冲液为：三羟基氨基甲烷15.0份，甘氨酸72.0份，十二烷基硫酸钠5.0份，加4000份的MilliQ注射用水溶解，用盐酸调节pH至8.3后，继续用milliQ水加至5000份，充分混匀，即得；所述采用垂直板凝胶电泳系统，采用的凝胶板为SDS-聚丙烯酰胺凝胶板，其由玻璃板、15%分离胶溶液、5%浓缩胶溶液制备得到；所述15%分离胶溶液包括MilliQ注射用水1.2份、30%凝胶贮备液2.5份、Tris-HCL缓冲液1.25份、10%SDS0.05份、10%AP 0.025份、TEMED0.002份；所述5%浓缩胶溶液包括MilliQ注射用水1.4份、30%凝胶贮备液0.33份、Tris-HCL缓冲液0.25份、10%SDS 0.02份、10%AP0.02份、TEMED 0.002份，步骤（3）中，上样前供试品溶液和Marker溶液采用离心机离心，离心条件为8000rmp/min，离心1min后置冰上冷冻，所述垂直板凝胶电泳系统的初始电压优选为58V，进入分离胶时调整电压108V，当溴酚蓝条带跑到凝胶下边缘时，电泳结束。
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2015
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