CN114235933A - 一种彩色聚丙烯酰胺凝胶的染料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种彩色聚丙烯酰胺凝胶的染料及其制备方法，属于生物电泳领域的蛋白质分离技术领域。本发明中，通过碱性条件下，连二硫酸钠放出电子，染料分子接受电子而被还原成可溶性钠盐，解决了羰基染料不能直接溶于水的问题，染料颜色鲜艳且种类丰富，染料颜色可调节性腔，使聚丙烯酰胺凝胶的制备过程更加方便安全，彩色浓缩胶容易制备，且染料性质稳定，不会随着电泳迁移，不会影响蛋白质正常迁移，使聚丙烯酰胺凝胶电泳的点样更加方便，上样孔可观察性高。
Description
技术领域
本发明属于生物电泳领域的蛋白质分离技术领域，尤其涉及一种彩色聚丙烯酰胺凝胶的染料及其制备方法。
背景技术
聚丙烯酰胺凝胶电泳，又称PAGE(polyacrylamide gel electrophoresis)，是以聚丙酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳技术，常用于蛋白质样品的分离。它分为非变性聚丙烯酰胺电泳(Native-PAGE)和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)两种形式。主要是由丙烯酰胺单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺在过硫酸铵催化作用下形成的三维网状结构。在SDS-PAGE中，SDS带有大量负电荷，与蛋白质结合形成SDS-蛋白质复合物，复合物所带的负电荷远远超过蛋白质本身所带的电荷，这就掩盖了蛋白质本身电荷之间的差异。这时SDS-蛋白质的复合物呈现椭圆棒形，其只与蛋白质亚基的分子量相关，这样就可以在电泳时，只根据蛋白质亚基分子量大小而将蛋白质分离开。实验室常用的SDS-PAGE凝胶为不连续聚丙烯酰胺凝胶系统，分为浓缩胶和分离胶，电泳时浓缩胶位于垂直电泳体系的上层，具有浓缩效应，分离胶位于下层，蛋白样品进入分离胶之后就会按照分子量大小进行分离，是目前实验室中使用的最有效的样品分离和检测的手段。
然而在实际配制凝胶以及电泳的过程中，聚丙烯酰胺凝胶也存在一些缺点，特别是由于凝胶无色透明，上样孔不清晰，尤其是对于新手来说，很容易出现上样孔难以辨别而浪费样品的情况；其次是凝胶配方复杂，需要逐一加入不同含量的多种溶液，且这个过程中实验人员会频繁接触丙烯酰胺、TEMED等有毒试剂，严重损害实验人员的身体健康。
发明内容
本发明的目的在于：为了解决聚丙烯酰胺凝胶无色透明，上样孔不清晰，容易出现上样孔难以辨别而浪费样品情况的问题，而提出的一种彩色聚丙烯酰胺凝胶的染料及其制备方法。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种彩色聚丙烯酰胺凝胶的染料的制备方法，具体包括以下步骤：
S101、以1：18-22的比例分别加入原始染料分子和水，混合均匀；
S102、加入25-35mL/L的34-38％的氢氧化钠溶液，搅拌均匀，调整溶液pH值至碱性；
S103、将S102制备的溶液加热至55-65℃并恒温保温留置备用；
S104、缓慢加入连二亚硫酸钠，使得终浓度为4.8-5.2g/L；
S105、将S104制备的溶液搅拌均匀，保温反应10min即可得到凝胶染料母液；
S106、在配制聚丙烯酰胺凝胶的过程中加入适量凝胶染料母液使其带有鲜艳的颜色即可。
作为上述技术方案的进一步描述：
所述原始染料分子为羟基染料中的一种或几种。
作为上述技术方案的进一步描述：
所述原始染料分子结构中不含水溶性基团。
作为上述技术方案的进一步描述：
所述羰基染料为蒽醌类染料或硫靛类染料中的任意一种染料。
作为上述技术方案的进一步描述：
所述凝胶染料制备步骤的化学反应方程式如下：
其中，碱性条件下，连二硫酸钠放出电子，染料分子接受电子而被还原成可溶性钠盐，得到可用于聚丙烯酰胺凝胶的凝胶染料母液。
作为上述技术方案的进一步描述：
彩色聚丙烯酰胺凝胶的染料制备彩色聚丙烯酰胺凝胶的步骤如下：
S201、分离胶的制备：根据染色后凝胶的浓度加入30％Acr-Bis、1.5M Tris-HCl(pH8.8)、10％SDS以及去离子水混合均匀，接着加入配方量10％过硫酸铵和TEMED，混合均匀后将溶液迅速灌入已经组装好的垂直电泳玻璃板之间，分离胶上缘距玻璃板上缘约3cm，在分离胶上加入少量水，静置至分离胶聚合之后用滤纸吸去水层；
S202、浓缩胶的制备：在烧杯中按照配比加入30％Acr-Bis、1.0M Tris-HCl(pH6.8)、10％SDS去离子水以及适量凝胶染料母液混合均匀，凝胶染料母液的终浓度一般为0.05-1.0mg/mL，接着加入配方量10％过硫酸铵和TEMED，混合均匀后将溶液灌入分离胶上方至满，缓慢插入梳子，静置至凝固之后即可电泳。
作为上述技术方案的进一步描述：
制得的彩色聚丙烯酰胺凝胶进行蛋白质样品的分离，具体包括以下步骤：
S301、将带有凝胶染料的浓缩胶缓冲液混合制成彩色聚丙烯酰胺凝胶预混液；
S302、在制胶时，将分离胶缓冲液与分离胶溶液混合均匀加入凝胶促凝胶即可得到直接灌胶；
S303、在配制彩色浓缩胶时将浓缩胶缓冲液与浓缩胶溶液混合加入凝胶促凝剂即可得到不同颜色的浓缩胶凝胶，无需额外添加染料。
作为上述技术方案的进一步描述：
所述预混液分为分离胶缓冲液、分离胶溶液、浓缩胶缓冲液、浓缩胶溶液和凝胶促凝剂，分别由以下成分制成：
彩色浓缩胶缓冲液：1.0M Tris-HCl(pH6.8)、TEMED、dH2O、凝胶染料；
分离胶缓冲液：1.5M Tris-HCl(pH8.8)、TEMED、dH2O；
分离胶溶液：30％Acr-Bis、dH2O；
浓缩胶溶液：30％Acr-Bis、dH2O；
凝胶促凝剂：10％过硫酸铵。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
本发明中，通过碱性条件下，连二硫酸钠放出电子，染料分子接受电子而被还原成可溶性钠盐，解决了羰基染料不能直接溶于水的问题，提供制备可以用来对聚丙烯酰胺凝胶进行着色的染料的方法，染料颜色鲜艳且种类丰富，通过多种颜色的蒽醌和硫靛类染料即可达到染色效果，染料颜色可调节性腔，使聚丙烯酰胺凝胶的制备过程更加方便安全，彩色浓缩胶容易制备，且染料性质稳定，不会随着电泳迁移，不会影响蛋白质正常迁移，使聚丙烯酰胺凝胶电泳的点样更加方便，上样孔可观察性高，可以用来判断样品是否准确地加入到上样孔中，有利于判断上样孔是否破损扭曲，需要同时进行多组电泳的时候，不同的凝胶的浓缩胶颜色不同，可以用来分辨不同的样品不同的电泳。
附图说明
图1为实施例1制备的含不同浓度梯度的绿色染料的聚丙烯酰胺凝胶；
图2为实施例1中染料浓度为0.3mg/mL的绿色聚丙烯酰胺凝胶装入电泳槽中的效果；
图3为实施例1中染料浓度为0.3mg/mL的绿色聚丙烯酰胺凝胶电泳之后的图片；
图4为实施例1中染料浓度为0.3mg/mL的绿色聚丙烯酰胺凝胶电泳之后用考马斯亮蓝染色液染色后的蛋白质条带胶图；
图5为实施例2制备的红色聚丙烯酰胺凝胶；
图6为实施例2制备的红色聚丙烯酰胺凝胶电泳完之后的图片；
图7为实施例3制备的紫色聚丙烯酰胺凝胶；
图8为实施例3制备的紫色聚丙烯酰胺凝胶电泳完之后示意图；
图9为实施例4制备的彩色聚丙烯酰胺凝胶浓缩胶缓冲液；
图10为对照例制备的普通聚丙烯酰胺凝胶。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种技术方案：一种彩色聚丙烯酰胺凝胶的染料的制备方法，具体包括以下步骤：
S101、以1：18-22的比例分别加入原始染料分子和水，混合均匀；
S102、加入25-35mL/L的34-38％的氢氧化钠溶液，搅拌均匀，调整溶液pH值至碱性；
S103、将S102制备的溶液加热至55-65℃并恒温保温留置备用；
S104、缓慢加入连二亚硫酸钠，使得终浓度为4.8-5.2g/L；
S105、将S104制备的溶液搅拌均匀，保温反应10min即可得到凝胶染料母液；
S106、在配制聚丙烯酰胺凝胶的过程中加入适量凝胶染料母液使其带有鲜艳的颜色即可。
所述原始染料分子为羟基染料中的一种或几种，所述原始染料分子结构中不含水溶性基团，所述羰基染料为蒽醌类染料或硫靛类染料中的任意一种染料；
所述凝胶染料制备步骤的化学反应方程式如下：
其中，碱性条件下，连二硫酸钠放出电子，染料分子接受电子而被还原成可溶性钠盐，得到可用于聚丙烯酰胺凝胶的凝胶染料母液；
彩色聚丙烯酰胺凝胶的染料制备彩色聚丙烯酰胺凝胶的步骤如下：
S201、分离胶的制备：根据染色后凝胶的浓度加入30％Acr-Bis、1.5M Tris-HCl(pH8.8)、10％SDS以及去离子水混合均匀，接着加入配方量10％过硫酸铵和TEMED，混合均匀后将溶液迅速灌入已经组装好的垂直电泳玻璃板之间，分离胶上缘距玻璃板上缘约3cm，在分离胶上加入少量水，静置至分离胶聚合之后用滤纸吸去水层；
S202、浓缩胶的制备：在烧杯中按照配比加入30％Acr-Bis、1.0M Tris-HCl(pH6.8)、10％SDS去离子水以及适量凝胶染料母液混合均匀，凝胶染料母液的终浓度一般为0.05-1.0mg/mL，接着加入配方量10％过硫酸铵和TEMED，混合均匀后将溶液灌入分离胶上方至满，缓慢插入梳子，静置至凝固之后即可电泳。
制得的彩色聚丙烯酰胺凝胶进行蛋白质样品的分离，具体包括以下步骤：
S301、将带有凝胶染料的浓缩胶缓冲液混合制成彩色聚丙烯酰胺凝胶预混液；
S302、在制胶时，将分离胶缓冲液与分离胶溶液混合均匀加入凝胶促凝胶即可得到直接灌胶；
S303、在配制彩色浓缩胶时将浓缩胶缓冲液与浓缩胶溶液混合加入凝胶促凝剂即可得到不同颜色的浓缩胶凝胶，无需额外添加染料。
所述预混液分为分离胶缓冲液、分离胶溶液、浓缩胶缓冲液、浓缩胶溶液和凝胶促凝剂，分别由以下成分制成：
彩色浓缩胶缓冲液：1.0M Tris-HCl(pH6.8)、TEMED、dH2O、凝胶染料；
分离胶缓冲液：1.5M Tris-HCl(pH8.8)、TEMED、dH2O；
分离胶溶液：30％Acr-Bis、dH2O；
浓缩胶溶液：30％Acr-Bis、dH2O；
凝胶促凝剂：10％过硫酸铵。
实施例1
绿色凝胶染料的制备
本实施例所用的绿色凝胶染料的原始染料分子为蒽醌类染料中的绿色染料的一种或多种，具体地为Vat Green 1；
取10g蒽醌类染料Vat Green 1加入200mL去离子水混合均匀；
加入6mL36％的氢氧化钠溶液，搅拌均匀，调整pH至碱性；
将上述溶液加热至60℃并保温；
缓慢加入1g连二亚硫酸钠，使得终浓度约为5g/L；
搅拌均匀，保温反应10-15min，即得到绿色的凝胶染料母液。
绿色聚丙烯酰胺凝胶的配制
分离胶配制
按照以下的表格依次加入所需的试剂，混合均匀，灌入事先组装好的玻璃板中，分离胶液面距离玻璃上缘3cm左右，加入少量去离子水压胶使液面水平，待凝胶聚合之后用滤纸吸去水层。
绿色的浓缩胶配制
按照以下的表格依次加入去离子水、30％Acr-Bis、1.0M Tris-HCl(pH6.8)、10％SDS等所需的试剂，混合均匀后分别加入不同浓度梯度的绿色凝胶染料，混合均匀，再分别加入配方量10％过硫酸铵和TEMED，混合均匀后分别将不同颜色的凝胶溶液灌入分离胶上方，缓慢插入梳子，静置使凝胶聚合，即可得到几个不同颜色梯度的绿色浓缩胶的聚丙烯酰胺凝胶。
上述不同浓度梯度的绿色聚丙烯酰胺凝胶凝固之后如图1所示，染料浓度为0.3mg/mL的聚丙烯酰胺凝胶装入电泳槽中效果如图2，浓缩胶呈现鲜艳的绿色，可以清晰地观察到上样孔。
如图3所示的电泳之后的凝胶图，取浓缩胶染料浓度为0.3mg/mL的聚丙烯酰胺凝胶进行凝胶电泳，电泳条件为Tris-Glycine缓冲液150V电泳1h；浓缩胶所带的绿色凝胶染料没有随着电泳迁移，仍然留在凝胶原处；
如图4所示，使用考马斯亮蓝快速染色液进行染色，凝胶成像仪照胶，图4中的蛋白质条带显示正常，没有出现条带扭曲、蛋白迁移率改变等现象，说明凝胶染料没有影响蛋白质的正常电泳迁移。
以上结果均证明本发明实施例1所用的凝胶染料可以使聚丙烯酰胺凝胶电泳更加简单方便，而且不会产生任何负面影响。
实施例2
红色聚丙烯酰胺凝胶的配制
红色凝胶染料的制备
本实施例所用的红色凝胶染料的原始染料分子为硫靛类染料中的红色染料的一种或多种，具体地为Vat Red 1；
取10g硫靛类染料Vat Red 1加入200mL去离子水混合均匀；
加入6mL 36％的氢氧化钠溶液，搅拌均匀，调整pH至碱性；
将上述溶液加热至60℃并保温；
缓慢加入1g连二亚硫酸钠，使得终浓度约为5g/L；
搅拌均匀，保温反应10-15min，即得到红色的凝胶染料母液。
红色聚丙烯酰胺凝胶的配制
本实施例红色聚丙烯酰胺凝胶的配制过程同实施例1中聚丙烯酰胺凝胶的配制过程，其中红色染料在浓缩胶凝胶中的终浓度为0.3mg/mL。
实施例3
紫色聚丙烯酰胺凝胶的配制
紫色凝胶染料的制备
本实施例所用的紫色凝胶染料的原始染料分子为异紫蒽酮蒽醌染料中的紫色染料的一种或多种，具体地为Vat Violet 1；
取10g异紫蒽酮蒽醌染料Vat Violet 1加入200mL去离子水混合均匀；
加入6mL36％的氢氧化钠溶液，搅拌均匀，调整pH至碱性；
将上述溶液加热至60℃并保温；
缓慢加入1g连二亚硫酸钠，使得终浓度约为5g/L；
搅拌均匀，保温反应10-15min，即得到紫色的凝胶染料母液。
紫色聚丙烯酰胺凝胶的配制
本实施例紫色聚丙烯酰胺凝胶的配制过程同实施例1中聚丙烯酰胺凝胶的配制过程，其中紫色染料在浓缩胶凝胶中的终浓度为0.15mg/mL。
实施例4
彩色聚丙烯酰胺凝胶预混液
为了使聚丙烯酰胺凝胶配制的过程更加方便，无需每次制胶时单独加入计算并加入凝胶染料，我们可以将带有凝胶染料的浓缩胶缓冲液混合制成彩色聚丙烯酰胺凝胶预混液，方便配制凝胶。所述预混液分为分离胶缓冲液、分离胶溶液、浓缩胶缓冲液、浓缩胶溶液以及凝胶促凝剂，分别由以下成分制成：
彩色浓缩胶缓冲液：1.0M Tris-HCl(pH6.8)、TEMED、dH2O、凝胶染料分离胶缓冲液：1.5M Tris-HCl(pH8.8)、TEMED、dH2O
分离胶溶液：30％Acr-Bis、dH2O
浓缩胶溶液：30％Acr-Bis、dH2O
凝胶促凝剂：10％过硫酸铵
制胶时只需将分离胶缓冲液与分离胶溶液混合均匀加入凝胶促凝胶即可得到直接灌胶；同理在配制彩色浓缩胶时将浓缩胶缓冲液与浓缩胶溶液混合加入凝胶促凝剂即可得到不同颜色的浓缩胶凝胶，无需额外添加染料，节省了步骤。本实施例所制的彩色浓缩胶缓冲液所图9所示，颜色多样，可以随取随用；
对比例：普通聚丙烯酰胺凝胶
凝胶配制方法同实施例1的分离胶和浓缩胶配制方法，但是不用添加凝胶染料，凝胶凝固之后如图10所示，可以看到普通的聚丙烯酰胺凝胶完全透明，无法清晰地辨别分离胶和浓缩胶，也无法一眼分辨上样孔。
有上述实施例可知，本发明方法制备的彩色聚丙烯酰胺凝胶能够实现较高的样品处理效果，彩色浓缩胶容易制备，且染料性质稳定，不会随着电泳迁移，不会影响蛋白质正常迁移。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种彩色聚丙烯酰胺凝胶的染料的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
S101、以1：18-22的比例分别加入原始染料分子和水，混合均匀；
S102、加入25-35mL/L的34-38％的氢氧化钠溶液，搅拌均匀，调整溶液pH值至碱性；
S103、将S102制备的溶液加热至55-65℃并恒温保温留置备用；
S104、缓慢加入连二亚硫酸钠，使得终浓度为4.8-5.2g/L；
S105、将S104制备的溶液搅拌均匀，保温反应10min即可得到凝胶染料母液；
S106、在配制聚丙烯酰胺凝胶的过程中加入适量凝胶染料母液使其带有鲜艳的颜色即可。
2.根据权利要求1所述的一种彩色聚丙烯酰胺凝胶的染料的制备方法，其特征在于，所述原始染料分子为羟基染料中的一种或几种。
3.根据权利要求2所述的一种彩色聚丙烯酰胺凝胶的染料的制备方法，其特征在于，所述原始染料分子结构中不含水溶性基团。
4.根据权利要求2所述的一种彩色聚丙烯酰胺凝胶的染料的制备方法，其特征在于，所述羰基染料为蒽醌类染料或硫靛类染料中的任意一种染料。
5.根据权利要求1所述的一种彩色聚丙烯酰胺凝胶的染料的制备方法，其特征在于，所述凝胶染料制备步骤的化学反应方程式如下：
其中，碱性条件下，连二硫酸钠放出电子，染料分子接受电子而被还原成可溶性钠盐，得到可用于聚丙烯酰胺凝胶的凝胶染料母液。
6.一种彩色聚丙烯酰胺凝胶的染料，其特征在于，由权利要求1-5任一项所述的制备方法制得。
7.根据权利要求6所述的一种彩色聚丙烯酰胺凝胶的染料，其特征在于，应用所述彩色聚丙烯酰胺凝胶的染料制备彩色聚丙烯酰胺凝胶的步骤如下：
S201、分离胶的制备：根据染色后凝胶的浓度加入30％Acr-Bis、1.5MTris-HCl(pH8.8)、10％SDS以及去离子水混合均匀，接着加入配方量10％过硫酸铵和TEMED，混合均匀后将溶液迅速灌入已经组装好的垂直电泳玻璃板之间，分离胶上缘距玻璃板上缘约3cm，在分离胶上加入少量水，静置至分离胶聚合之后用滤纸吸去水层；
S202、浓缩胶的制备：在烧杯中按照配比加入30％Acr-Bis、1.0M Tris-HCl(pH6.8)、10％SDS去离子水以及适量凝胶染料母液混合均匀，凝胶染料母液的终浓度一般为0.05-1.0mg/mL，接着加入配方量10％过硫酸铵和TEMED，混合均匀后将溶液灌入分离胶上方至满，缓慢插入梳子，静置至凝固之后即可电泳。
8.一种彩色聚丙烯酰胺凝胶的应用方法，其特征在于，根据权利要求7所述制备方法制得的彩色聚丙烯酰胺凝胶进行蛋白质样品的分离，具体包括以下步骤：
S301、将带有凝胶染料的浓缩胶缓冲液混合制成彩色聚丙烯酰胺凝胶预混液；
S302、在制胶时，将分离胶缓冲液与分离胶溶液混合均匀加入凝胶促凝胶即可得到直接灌胶；
S303、在配制彩色浓缩胶时将浓缩胶缓冲液与浓缩胶溶液混合加入凝胶促凝剂即可得到不同颜色的浓缩胶凝胶，无需额外添加染料。
9.根据权利要求8所述的一种彩色聚丙烯酰胺凝胶的应用，其特征在于，所述预混液分为分离胶缓冲液、分离胶溶液、浓缩胶缓冲液、浓缩胶溶液和凝胶促凝剂，分别由以下成分制成：
彩色浓缩胶缓冲液：1.0M Tris-HCl(pH6.8)、TEMED、dH2O、凝胶染料；
分离胶缓冲液：1.5M Tris-HCl(pH8.8)、TEMED、dH2O；
分离胶溶液：30％Acr-Bis、dH2O；
浓缩胶溶液：30％Acr-Bis、dH2O；
凝胶促凝剂：10％过硫酸铵。
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