CN111337332A - 一种巴氏染色液ea50及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种巴氏染色液EA50及其制备方法,每1000ml巴氏染色液EA50中,包括以下组分:亮绿0.15g‑0.4g,水溶性伊红3g‑5g,甲醇200ml‑300ml,冰醋酸10ml‑50ml,磷钨酸2g‑5g,醇溶性伊红0.05g‑0.1g,无水乙醇450ml‑800ml,其余为纯水。本发明提供的一种巴氏染色液EA50通过对传统的EA50染液配制方法的改良,达到了比较理想的染色效果及使用时间,放弃了易对环境造成污染的碳酸锂溶液,延长了EA50染液的保存时间,缩短了EA50的染色时间,有效地降本增效。
Description
技术领域
本发明涉及细胞染色技术领域,尤其涉及一种巴氏染色液EA50及其制备方法。
背景技术
巴氏染色是一种经典的细胞化学染色方法,广泛应用于细胞脱落学、病理学等领域,染色效果显著。但是在实际操作过程中步骤繁琐、试剂配制麻烦且容易过期、干扰因素多等缺点。EA50染液作为巴氏染色主要的染液之一,主要是使细胞浆、肌纤维、胶元纤维等染成蓝绿色、淡蓝或淡绿色、粉红色或桔黄色等不同的颜色,适用于妇科细胞学涂片染色,如筛查宫颈癌和癌前病变,也适用于胸水、腹水、痰液等非妇科细胞样本的染色。
传统的巴氏染液染色不均,染色效果不稳定,镜下团状细胞无法分辨,细胞核结构无法分辨,影响疾病的判断。
发明内容
本发明针对现有技术的不足,提供了一种巴氏染色液EA50及其制备方法,改良了传统的EA50染液配制方法,达到了比较理想的染色效果及使用时间。
为实现上述目的,本发明采用以下技术方案:
本发明的第一方面提供了一种巴氏染色液EA50,每1000ml巴氏染色液EA50中,包括以下组分:亮绿0.15g-0.4g,水溶性伊红3g-5g,甲醇200ml-300ml,冰醋酸10ml-50ml,磷钨酸2g-5g,醇溶性伊红0.05g-0.1g,无水乙醇450ml-800ml,其余为纯水。
本发明的第二方面是提供该巴氏染色液EA50的制备方法,包括如下步骤:
S1制备试剂甲:称取一定量的亮绿溶于纯水中,混合并搅拌直至充分溶解,使亮绿的浓度为0.03g/ml;
S2制备试剂乙:称取一定量的水溶性伊红溶于纯水中,混合并搅拌直至充分溶解,使水溶性伊红的浓度为0.2g/ml;
S3制备试剂丙:称取一定量的醇溶性伊红溶于无水乙醇中,混合并搅拌直至充分溶解,使醇溶性伊红的浓度为0.008g/ml;
S4制备试剂丁:称取一定量的磷钨酸溶于纯水中,混合并搅拌直至充分溶解,使磷钨酸的浓度为1g/ml;
S5制备试剂戊:量取无水乙醇和纯水,混合均匀,配制成95%的乙醇溶液;
S6将试剂甲5-10毫升和试剂乙10-16毫升混合并搅拌10秒钟;
S7加200-240毫升甲醇,搅拌15秒钟;
S8加入500-800毫升试剂戊,搅拌10秒钟;
S9加入2.5-3.8毫升试剂丁搅拌20秒钟;
S10加入10.0-16.0毫升冰醋酸,搅拌20秒钟;
S11加入5.0-10.0毫升试剂丙,搅拌25秒钟。
进一步地,试剂甲的体积为5ml,8ml或10ml。
进一步地,试剂乙的体积为10ml,12ml或16ml。
进一步地,试剂丙的体积为5ml,8ml或10ml。
进一步地,试剂丁的体积为2.5ml,3.0ml或3.8ml。
进一步地,试剂甲与试剂丙体积比为1:1,5:8或8:5。
进一步优选地,试剂甲与试剂丙体积比为1:1。
进一步地,试剂乙与冰醋酸体积比为1:1,10:12或12:10。
进一步优选地,试剂乙与冰醋酸体积比为1:1。
进一步地,甲醇的体积为200ml,220ml或240ml。
进一步地,冰醋酸的体积为10ml,12ml或16ml。
本发明采用以上技术方案,与现有技术相比,具有如下技术效果:
1、试剂中不含有易对环境造成污染的碳酸锂溶液;
2、在配制过程中限定溶解顺序及搅拌时间,增加了试剂与溶剂的溶解度;
3、试剂中增加醇溶性伊红溶液,使染色细胞层次更分明、饱和度更高、颜色更亮丽。
4、保存期长:适用于规模化生产适用(保存期最长可达24个月)。
5、实际染液用量少:每1000毫升染液可染色10000张左右切片。
6、染色效果好:胞质颜色鲜艳亮丽,透明性好,纹理清晰,细胞核结构清晰,更细腻展示细胞内染色质及细胞核结构。
7、染色速度快:常规EA50染色时间一般为3-5分钟。本发明的改良的EA50染色时间为15秒至3分钟,大大缩短了染色时间,为快速病理创造了条件。
综上所述,本发明提供的一种巴氏染色液EA50通过对传统的EA50染液配制方法的改良,达到了比较理想的染色效果及使用时间,放弃了易对环境造成污染的碳酸锂溶液,延长了EA50染液的保存时间,缩短了EA50的染色时间,有效地降本增效。
附图说明
图1为本发明实施例2中的巴氏染色液EA50进行细胞染色的效果图;
图2为本发明实施例2中的巴氏染色液EA50进行细胞染色的效果图;
图3为本发明实施例3中的巴氏染色液EA50进行细胞染色的效果图;
图4为本发明实施例4中的巴氏染色液EA50进行细胞染色的效果图;
图5为本发明对比例中的巴氏染色液EA50进行细胞染色的效果图。
具体实施方式
本发明提供了一种巴氏染色液EA50,每1000ml巴氏染色液EA50中,包括以下组分:亮绿0.15g-0.4g,水溶性伊红3g-5g,甲醇200ml-300ml,冰醋酸10ml-50ml,磷钨酸2g-5g,醇溶性伊红0.05g-0.1g,无水乙醇450ml-800ml,其余为纯水。
上述巴氏染色液EA50的制备方法,包括如下步骤:
S1制备试剂甲:称取一定量的亮绿溶于纯水中,混合并搅拌直至充分溶解,使亮绿的浓度为0.03g/ml;
S2制备试剂乙:称取一定量的水溶性伊红溶于纯水中,混合并搅拌直至充分溶解,使水溶性伊红的浓度为0.2g/ml;
S3制备试剂丙:称取一定量的醇溶性伊红溶于无水乙醇中,混合并搅拌直至充分溶解,使醇溶性伊红的浓度为0.008g/ml;
S4制备试剂丁:称取一定量的磷钨酸溶于纯水中,混合并搅拌直至充分溶解,使磷钨酸的浓度为1g/ml;
S5制备试剂戊:量取无水乙醇和纯水,混合均匀,配制成95%的乙醇溶液;
S6将试剂甲5-10毫升和试剂乙10-16毫升混合并搅拌10秒钟;
S7加200-240毫升甲醇,搅拌15秒钟;
S8加入500-800毫升试剂戊,搅拌10秒钟;
S9加入2.5-3.8毫升试剂丁搅拌20秒钟;
S10加入10.0-16.0毫升冰醋酸,搅拌20秒钟;
S11加入5.0-10.0毫升试剂丙,搅拌25秒钟。
在本发明一优选的实施例中,试剂甲的体积为5ml,8ml或10ml。
在本发明一优选的实施例中,试剂乙的体积为10ml,12ml或16ml。
在本发明一优选的实施例中,试剂丙的体积为5ml,8ml或10ml。
在本发明一优选的实施例中,试剂丁的体积为2.5ml,3.0ml或3.8ml。
在本发明一优选的实施例中,试剂甲与试剂丙体积比为1:1,5:8或8:5。进一步地,试剂甲与试剂丙体积比为1:1。
在本发明一优选的实施例中,试剂乙与冰醋酸体积比为1:1,10:12或12:10。进一步地,试剂乙与冰醋酸体积比为1:1。
在本发明一优选的实施例中,甲醇的体积为200ml,220ml或240ml。
在本发明一优选的实施例中,冰醋酸的体积为10ml,12ml或16ml。
下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍,以使更好的理解本发明,但是下述实施例并不限制本发明范围。
实施例1
本实施例提供一种巴氏染色液EA50,其制备方法包括如下步骤:
S1制备试剂甲:亮绿(淡黄)0.3克、纯水10毫升;混合并搅拌直至充分溶解;
S2制备试剂乙:水溶性伊红3.2克、纯水16毫升;混合并搅拌直至充分溶解;
S3制备试剂丙:醇溶性伊红0.08克、无水乙醇10毫升;混合并搅拌直至充分溶解;
S4制备试剂丁:磷钨酸3.8克、纯水3.8毫升;混合并搅拌直至充分溶解;
S5制备试剂戊:量取无水乙醇和纯水,混合均匀,配制成95%的乙醇溶液750ml;
S6将试剂甲10.0毫升和试剂乙10.0毫升混合搅拌10秒钟;
S7加240毫升甲醇,搅拌15秒钟;
S8加入716.2毫升试剂戊,搅拌10秒钟;
S9加入3.8毫升试剂丁搅拌20秒钟;
S10加入10.0毫升冰醋酸,搅拌20秒钟;
S11加入10.0毫升试剂丙,搅拌25秒钟。
实施例2
本实施例提供一种巴氏染色液EA50,其制备方法包括如下步骤:
S1制备试剂甲:亮绿(淡黄)0.3克、纯水10毫升;混合并搅拌直至充分溶解;
S2制备试剂乙:水溶性伊红3.2克、纯水16毫升;混合并搅拌直至充分溶解;
S3制备试剂丙:醇溶性伊红0.08克、无水乙醇10毫升;混合并搅拌直至充分溶解;
S4制备试剂丁:磷钨酸3.8克、纯水3.8毫升;混合并搅拌直至充分溶解;
S5制备试剂戊:量取无水乙醇和纯水,混合均匀,配制成95%的乙醇溶液750ml;
S6将试剂甲10.0毫升和试剂乙16.0毫升混合搅拌10秒钟;
S7加240毫升甲醇,搅拌15秒钟;
S8加入704.2毫升试剂戊,搅拌10秒钟;
S9加入3.8毫升试剂丁搅拌20秒钟;
S10加入16毫升冰醋酸,搅拌20秒钟;
S11加入10毫升试剂丙,搅拌25秒钟。
实施例3
本实施例提供一种巴氏染色液EA50,其制备方法包括如下步骤:
S1制备试剂甲:亮绿(淡黄)0.3克、纯水10毫升;混合并搅拌直至充分溶解;
S2制备试剂乙:水溶性伊红3.2克、纯水16毫升;混合并搅拌直至充分溶解;
S3制备试剂丙:醇溶性伊红0.08克、无水乙醇10毫升;混合并搅拌直至充分溶解;
S4制备试剂丁:磷钨酸3.8克、纯水3.8毫升;混合并搅拌直至充分溶解;
S5制备试剂戊:量取无水乙醇和纯水,混合均匀,配制成95%的乙醇溶液750ml;
S6将试剂甲5毫升和试剂乙10毫升混合搅拌10秒钟;
S7加240毫升甲醇,搅拌15秒钟;
S8加入721.2毫升试剂戊,搅拌10秒钟;
S9加入3.8毫升试剂丁搅拌20秒钟;
S10加入12毫升冰醋酸,搅拌20秒钟;
S11加入8毫升试剂丙,搅拌25秒钟。
实施例4
本实施例提供一种巴氏染色液EA50,其制备方法包括如下步骤:
S1制备试剂甲:亮绿(淡黄)0.3克、纯水10毫升;混合并搅拌直至充分溶解;
S2制备试剂乙:水溶性伊红3.2克、纯水16毫升;混合并搅拌直至充分溶解;
S3制备试剂丙:醇溶性伊红0.08克、无水乙醇10毫升;混合并搅拌直至充分溶解;
S4制备试剂丁:磷钨酸3.8克、纯水3.8毫升;混合并搅拌直至充分溶解;
S5制备试剂戊:量取无水乙醇和纯水,混合均匀,配制成95%的乙醇溶液750ml;
S6将试剂甲8毫升和试剂乙12毫升混合搅拌10秒钟;
S7加240毫升甲醇,搅拌15秒钟;
S8加入721.2毫升试剂戊,搅拌10秒钟;
S9加入3.8毫升试剂丁搅拌20秒钟;
S10加入10毫升冰醋酸,搅拌20秒钟;
S11加入5毫升试剂丙,搅拌25秒钟。
对比例
本对比例提供一种巴氏染色液EA50,其制备方法包括如下步骤:
S1制备试剂甲:亮绿(淡黄)0.3克、纯水10毫升;混合并搅拌直至充分溶解;
S2制备试剂乙:水溶性伊红0.40克、纯水20毫升;混合并搅拌直至充分溶解;
S3制备试剂丙:无水乙醇950毫升、纯水50毫升;混合均匀;
S4制备试剂丁:碳酸锂0.15克、纯水10毫升;混合均匀;
S5将试剂甲10毫升和试剂乙20毫升混合搅拌10秒钟;
S6加250毫升甲醇,搅拌15秒钟;
S7加入700毫升试剂丙混合溶液,搅拌5秒钟
S8加入1克磷钨酸搅拌20秒钟
S9加入10毫升冰醋酸,搅拌15秒钟;
S10加入5毫升试剂丙,搅拌20秒钟;
S11加入10毫升碳酸锂饱和溶液,搅拌25秒钟。
验证试验
将实施例1-4提供的巴氏染色液EA50进行细胞染色,具体的染色步骤如下:
步骤一,样品加保存液震荡(3min),1150r/min离心3min,弃去上层液后,再次1950r/min离心10min,弃去液体;
步骤二,加1ml缓冲液后用吸管移取转移至反应仓沉降5min;
步骤三,沉降之后,用冲洗液冲洗2遍,再用缓冲液浸泡3s;
步骤三,苏木素染色5min,清水冲洗干净,1%盐酸酒精浸泡1min,清水返蓝20min;
步骤四,EA50染色2min,冲洗液冲洗2遍;
步骤五,封片。
结果如图1-5所示,对比例中细胞质染色偏深,细胞质纹理不够清晰,团状细胞难以分辨;实施例中细胞质染色明显优于对比例,细胞质染色适中,纹理清晰,边界清楚。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述,但其只是作为范例,本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言,任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此,在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改,都应涵盖在本发明的范围内。
Claims (9)
1.一种巴氏染色液EA50,其特征在于,每1000ml巴氏染色液EA50中,包括以下组分:亮绿0.15g-0.4g,水溶性伊红3g-5g,甲醇200ml-300ml,冰醋酸10ml-50ml,磷钨酸2g-5g,醇溶性伊红0.05g-0.1g,无水乙醇450ml-800ml,其余为纯水。
2.一种如权利要求1所述的巴氏染色液EA50的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
S1制备试剂甲:称取一定量的亮绿溶于纯水中,混合并搅拌直至充分溶解,使亮绿的浓度为0.03g/ml;
S2制备试剂乙:称取一定量的水溶性伊红溶于纯水中,混合并搅拌直至充分溶解,使水溶性伊红的浓度为0.2g/ml;
S3制备试剂丙:称取一定量的醇溶性伊红溶于无水乙醇中,混合并搅拌直至充分溶解,使醇溶性伊红的浓度为0.008g/ml;
S4制备试剂丁:称取一定量的磷钨酸溶于纯水中,混合并搅拌直至充分溶解,使磷钨酸的浓度为1g/ml;
S5制备试剂戊:量取无水乙醇和纯水,混合均匀,配制成95%的乙醇溶液;
S6将试剂甲5-10毫升和试剂乙10-16毫升混合并搅拌10秒钟;
S7加200-240毫升甲醇,搅拌15秒钟;
S8加入500-800毫升试剂戊,搅拌10秒钟;
S9加入2.5-3.8毫升试剂丁搅拌20秒钟;
S10加入10.0-16.0毫升冰醋酸,搅拌20秒钟;
S11加入5.0-10.0毫升试剂丙,搅拌25秒钟。
3.根据权利要求2所述的巴氏染色液EA50的制备方法,其特征在于,所述试剂甲的体积为5ml,8ml或10ml。
4.根据权利要求2所述的巴氏染色液EA50的制备方法,其特征在于,所述试剂乙的体积为10ml,12ml或16ml。
5.根据权利要求2所述的巴氏染色液EA50的制备方法,其特征在于,所述试剂丙的体积为5ml,8ml或10ml。
6.根据权利要求2所述的巴氏染色液EA50的制备方法,其特征在于,所述试剂丁的体积为2.5ml,3.0ml或3.8ml。
7.根据权利要求2所述的巴氏染色液EA50的制备方法,其特征在于,所述试剂甲与试剂丙体积比为1:1,5:8或8:5。
8.根据权利要求2所述的巴氏染色液EA50的制备方法,其特征在于,试剂乙与冰醋酸体积比为1:1,10:12或12:10。
9.根据权利要求2所述的巴氏染色液EA50的制备方法,其特征在于,所述甲醇的体积为200ml,220ml或240ml;所述冰醋酸的体积为10ml,12ml或16ml。
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