CN108195653A - 一种复染染色试剂盒及制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种复染染色试剂盒及其制备方法和应用，硫堇染色液利用酸解的方法可打断DNA分子链中的嘌呤‑脱氧核糖链，即去嘌呤作用，然后DNA部分区域发生重排，暴漏出醛基，硫堇能与细胞中的醛基反应形成一种醌型化合物，使细胞核DNA染成蓝色；改良后EA50染色液，在常用EA50染色液中添加适量橘黄G染色液，将EA50染色和橘黄G染色两个步骤合二为一，显著节约试剂成本，提高染色效率，可将胞浆染成颜色鲜明的绿色、蓝色、粉色和橙黄色，结构层次清晰，便于观察及诊断。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种病理学诊断中组织学和细胞学标本染色的特殊染色试剂，具体涉及一种复染染色试剂盒及制备方法和应用。
背景技术
本发明的一种复染染色试剂盒，区别于常用的复染试剂盒，可用于病理学诊断中组织学、细胞学染色。
硫堇染色液利用酸解的方法可打断DNA分子链中的嘌呤-脱氧核糖链，即去嘌呤，然后DNA部分区域发生重排，暴漏出醛基，硫堇能与细胞中的醛基反应形成一种醌型化合物，使细胞核DNA染成蓝色。硫堇分子式C14H13N3O2S，结构式如下：
改良后的EA50染色液：在常用EA50染色液中添加适量橘黄G染色液，将EA50染色和橘黄G染色两个步骤合二为一，显著节约试剂成本，提高染色效率。可将胞浆染成颜色鲜明的绿色、蓝色、粉色和橙黄色，结构层次清晰，便于观察及诊断。
发明内容
本发明的目的是提供一种复染染色试剂盒及制备和应用，可用于病理诊断学中组织学和细胞学的特殊染色。
本发明提供了所述一种复染染色试剂盒及制备：
本发明的一种复染染色试剂盒，包括硫堇染色液和改良后EA50染色液；
一种复染染色试剂盒，其特征在于：由硫堇染色液和改良后EA50染色液组成，其中：
硫堇染色液：每1000ml硫堇染色液中包括： 硫堇（硫堇劳氏紫粉末）0.5-3.0g；染料助剂0.5-2g；醇20-80ml；强酸10-15ml；余量为水；
改良后EA50染色液：每1000ml所述EA50染色液中包括：亮绿0.5-0.8g、伊红3-6g、弱酸（20-30ml)、甲醇（220-300ml)、磷钨酸（1-4g），橘黄G（0.002-0.010g），余量为乙醇。
根据权利要求1所述的复染染色试剂盒，其特征在于：
所述染料助剂为亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠中的至少一种；
所述醇为乙醇、甲醇、乙二醇、丙二醇、丙三醇中的至少一种；
所述乙醇为95%乙醇或无水乙醇；
所述弱酸为乙酸、水杨酸和柠檬酸的一种或多种的混合物；
所述伊红为乙酸水溶性伊红或醇溶性伊红；
所述水为蒸馏水、去离子水、纯化水及体外诊断试剂用纯化水。
根据权利要求1-2任一所述的复染染色试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）硫堇染色液的配制:
a） 将水加热至50-70℃，加入硫堇，搅拌50-90min，冷却室温过滤；
b） 加入染料助剂和醇，搅拌均匀；
c） 使用前，加入强酸，搅拌50-90min，搅拌温度控制在20-30℃，注意避光，搅拌结束后直接用于染色；
2）改良后EA50染色液的配制：
a）亮绿：适量的亮绿充分溶解于20ml水中；
b）伊红（水溶性）：适量的伊红充分溶解于40ml水中；伊红（醇溶性）：适量的伊红充分溶解于40ml乙醇中；
c）橘黄G染色液：适量的橘黄溶于100ml水中，制备橘黄G原液；将适量橘黄G原液与乙醇混合，制备橘黄G染色液；
d）将a）和b）混合均匀；加入磷钨酸、甲醇、弱酸、乙醇和橘黄G染色液，搅拌混合均匀。
本发明还提供了一种硫堇伊红染色液的染色方法，包括以下步骤：
1） 病理标本预处理：
2）样本预处理后，可进行手工染色和设备染色：
组织切片染色：二甲苯脱蜡2次，每次2-5分钟；无水乙醇2次，每次2-5分钟；水洗1-3min；固定液40-90分钟，水洗、沥干；分化液30-80分钟，水洗、沥干；硫堇染色液染色40-90分钟，水洗、沥干；95%乙醇40-90s；95%乙醇40-90s；改良后EA50染色3-5min；95%乙醇5-20s；无水乙醇5-20s；二甲苯2次，每次2分钟；脱水、透明、封片；
细胞涂片染色：湿固定完成后，水洗、沥干；固定液40-90分钟，水洗、沥干；分化液30-80分钟，水洗、沥干；硫堇染色液染色40-90分钟，水洗、沥干；70%乙醇40-90s；95%乙醇40-90s；改良后EA50染色3-5min；95%乙醇5-20s；无水乙醇5-20s；晾干后封片。
需要说明的是，采用所述的复染染色试剂盒进行染色时，本领域技术人员可以根据染色情况及染色要求对染色、分化、染色时间进行适当调整。可用于染色样本的类型有石蜡切片、冰冻切片、血液涂片、培养细胞以及体液涂片(如宫颈粘液涂片、胸腔液涂片等)等。
本发明的复染染色试剂盒，所述硫堇伊红染色液与所述改良后EA50染色液共同使用，所述硫堇染色液利用酸解的方法可打断DNA分子链中的嘌呤-脱氧核糖链，即去嘌呤作用，然后DNA部分区域发生重排，暴漏出醛基，硫堇能与细胞中的醛基反应形成一种醌型化合物，使细胞核DNA染成蓝色，假性蓝色染色较少，染色均匀；所述改良后EA50染色液可将胞浆染成颜色鲜明的绿色、蓝色、粉色和橙黄色，结构层次清晰，便于观察及诊断。
附图说明：
图1为本发明复染染色试剂盒应用于组织切片（前列腺）染色示意图；
图2为本发明复染染色试剂盒应用于细胞涂片（宫颈脱落细胞）染色示意图。
具体实施方式：
以下具体实施方式进一步阐明本发明“一种复染染色试剂盒及制备方法和应用”的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、条件、步骤及应用所做的修改或替换，均属于本发明的范围。
实施例一
本发明“一种复染染色试剂盒及制备方法和应用”，用于病理学诊断中人体部位前列腺组织切片染色。包括硫堇染色液和改良后EA50染色液，其中：
每1000ml所述硫堇染色液中包括如下组分：硫堇（硫堇劳氏紫粉末）1.5g；染料助剂1.2g；醇50ml；强酸12ml；余量为水；
每1000ml所述EA50染色液中包括：亮绿0.7g、伊红5g、弱酸（25ml)、甲醇（260ml)、磷钨酸（3g），橘黄G（0.005g），余量为乙醇。
其制备方法：
1）硫堇染色液配制：
a） 将水加热至60℃，加入硫堇，搅拌60min，冷却室温过滤；
b）加入染料助剂和醇，搅拌均匀；
c）加入强酸，搅拌60min，搅拌温度控制在27℃，搅拌结束后直接用于染色；
2）改良后EA50染色液的配制：
a）亮绿：0.7g的亮绿充分溶解于20ml水中；
b）伊红（水溶性）：5g的伊红充分溶解于40ml水中；伊红（醇溶性）：5g的伊红充分溶解于40ml乙醇中；
c）橘黄G染色液：2.5g的橘黄G溶于100ml水中，制备橘黄G原液；将30ml橘黄G原液与乙醇混合，制备橘黄G染色液；
d）将a）和b）混合均匀；加入3g磷钨酸、260ml甲醇、25ml弱酸、653ml乙醇和2ml橘黄G染色液，搅拌混合均匀。
取经上述步骤制得的复染染色试剂盒，对组织切片进行染色操作：
1）组织标本预处理：组织标本预处理：固定、取材、再次固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、烤片；
固定：将临床取到的人体前列腺组织样本，立即投入固定液以尽可能地保存组织细胞的形态结构和抗原性；
取材：按病理诊断的目的和要求，从样本上切取适当大小和数目的组织块，一般厚度以0.2～0.3cm为适，体积不超过2x1.5x0.3cm；
再次固定：取材后将组织块立即投入固定液以尽可能地保存组织细胞的形态结构和抗原性；
脱水：用溶剂去除组织中的水分（脱水机可自动完成脱水、透明与浸蜡过程）；
透明：透明剂代替脱水后组织中的水分；
浸蜡：组织浸入石蜡中；
包埋：石蜡注入包埋托内，后用镊子将浸蜡的组织块从脱水盒中取出，放入包埋托中央，放在小冷台，用镊子轻按组织块，平整之后盖上脱水盒底，再加好石蜡，移至冷冻台上，待冷冻好后，卸下组织蜡块待切；
切片：用切片机制成切片；
烤片：石蜡切片在水域中展平整后用载玻片贴上，晾干后烤片；
2）硫堇改良后EA50染色液染色：将步骤1）得到的组织切片二甲苯脱蜡2次，每次3分钟；无水乙醇2次，每次3分钟；水洗2min；固定液50分钟，水洗、沥干；分化液60分钟，水洗、沥干；硫堇染色液染色70分钟，水洗、沥干；70%乙醇55s；95%乙醇65s；改良后EA50染色液染色4min；95%乙醇15s；无水乙醇15s；二甲苯2次，每次2分钟；脱水、透明、封片。
数字化图像见附图1。
实施例二：
本发明“一种复染染色试剂盒及制备方法和应用”，用于病理学诊断中宫颈脱落细胞涂片染色：包括硫堇染色液和改良后EA50染色液，其中：
每1000ml所述硫堇染色液中包括如下组分：硫堇（硫堇劳氏紫粉末）1.5g；染料助剂1.2g；醇50ml；强酸12ml；余量为水；
每1000ml所述EA50染色液中包括：亮绿0.7g、伊红6g、弱酸（25ml)、甲醇（260ml)、磷钨酸（4g），橘黄G（0.005g），余量为乙醇。
其制备方法：
1）硫堇染色液配制：
a） 将水加热至60℃，加入硫堇，搅拌60min，冷却室温过滤；
b）加入染料助剂和醇，搅拌均匀；
c）加入强酸，搅拌60min，搅拌温度控制在27℃，搅拌结束后直接用于染色；
2）改良后EA50染色液的配制：
a）亮绿：0.7g的亮绿充分溶解于20ml水中；
b）伊红（水溶性）：6g的伊红充分溶解于40ml水中；伊红（醇溶性）：6g的伊红充分溶解于40ml乙醇中；
c）橘黄G染色液：2.5g的橘黄G溶于100ml水中，制备橘黄G原液；将30ml橘黄G原液与乙醇混合，制备橘黄G染色液；
d）将a）和b）混合均匀；加入4g磷钨酸、230ml甲醇、25ml弱酸、683ml乙醇和2ml橘黄G染色液，搅拌混合均匀；
取经上述步骤制得的硫堇伊红染色液，对细胞涂片进行染色操作：
细胞标本预处理：标本振荡、转移、分离、制片、固定：
振荡标本：标本编号振荡5min；
转移：震荡后静置2min以内，转移细胞液到已加入4ml分离液的试管内；
离心去上清液：试管对称放入离心机，梯度离心2次，弃去上清液；
制片：振荡试管，依次添加1ml左右清洁液，震荡，调浓度，震荡，静置2min，转移细胞液到制片仓，静置15min，随后倒出多余细胞液，酒精清洗2次，取下制片仓；
固定：取出玻片放酒精内湿固定30min。
硫堇改良后EA50染色液染色：
将步骤1）得到的细胞涂片进行染色：湿固定完成后，水洗、沥干；固定液60分钟，水洗、沥干；分化液35分钟，水洗、沥干；硫堇染色液染色50分钟，水洗、沥干；70%乙醇60s；95%乙醇50s；改良后EA50染色液3min；95%乙醇10s；无水乙醇10s；晾干后封片。
数字化图像见附图2。
对于本领域的技术人员来说，可以根据本发明的技术方案和构思，上述石蜡切片、冰冻切片、细胞涂片染色的配制和染色步骤和时间可根据具体需要进行调整，而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍应属于本发明创造的保护范围内。
Claims (7)
1.一种复染染色试剂盒，其特征在于：由硫堇染色液和改良后EA50染色液组成，其中：
硫堇染色液：每1000ml硫堇染色液中包括： 硫堇（硫堇劳氏紫粉末）0.5-3.0g；染料助剂0.5-2g；醇20-80ml；强酸10-15ml；余量为水；
改良后EA50染色液：每1000ml所述EA50染色液中包括：亮绿0.5-0.8g、伊红3-6g、弱酸（20-30ml)、甲醇（220-300ml)、磷钨酸（1-4g），橘黄G（0.002-0.010g），余量为乙醇。
2.根据权利要求1所述的复染染色试剂盒，其特征在于：
所述染料助剂为亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠中的至少一种；
所述醇为乙醇、甲醇、乙二醇、丙二醇、丙三醇中的至少一种；
所述乙醇为95%乙醇或无水乙醇；
所述弱酸为乙酸、水杨酸和柠檬酸的一种或多种的混合物；
所述伊红为乙酸水溶性伊红或醇溶性伊红；
所述水为蒸馏水、去离子水、纯化水及体外诊断试剂用纯化水。
3.根据权利要求1-2任一所述的复染染色试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）硫堇染色液的配制:
a） 将水加热至50-70℃，加入硫堇，搅拌50-90min，冷却室温过滤；
b） 加入染料助剂和醇，搅拌均匀；
c） 使用前，加入强酸，搅拌50-90min，搅拌温度控制在20-30℃，注意避光，搅拌结束后直接用于染色；
2）改良后EA50染色液的配制：
a）亮绿：适量的亮绿充分溶解于20ml水中；
b）伊红（水溶性）：适量的伊红充分溶解于40ml水中；伊红（醇溶性）：适量的伊红充分溶解于40ml乙醇中；
c）橘黄G染色液：适量的橘黄溶于100ml水中，制备橘黄G原液；将适量橘黄G原液与乙醇混合，制备橘黄G染色液；
d）将a）和b）混合均匀；加入磷钨酸、甲醇、弱酸、乙醇和橘黄G染色液，搅拌混合均匀；
根据权利要求1-3所述的复染染色试剂盒的染色方法，其特征在于包括如下步骤：
1）病理标本预处理
样本预处理后，可进行手工染色和设备染色：
组织切片染色：二甲苯脱蜡2次，每次2-5分钟；无水乙醇2次，每次2-5分钟；水洗1-3min；固定液40-90分钟，水洗、沥干；分化液30-80分钟，水洗、沥干；硫堇染色液染色40-90分钟，水洗、沥干；95%乙醇40-90s；95%乙醇40-90s；改良后EA50染色3-5min；95%乙醇5-20s；无水乙醇5-20s；二甲苯2次，每次2分钟；脱水、透明、封片。
4.细胞涂片染色：湿固定完成后，水洗、沥干；固定液40-90分钟，水洗、沥干；分化液30-80分钟，水洗、沥干；硫堇染色液染色40-90分钟，水洗、沥干；70%乙醇40-90s；95%乙醇40-90s；改良后EA50染色3-5min；95%乙醇5-20s；无水乙醇5-20s；晾干后封片。
5.根据权利要求1-4所述的复染染色试剂盒及制备方法和应用，其特征在于，所述的复染染色试剂盒用于病理学诊断中组织学和细胞学样本染色，在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、条件、步骤及应用所做的修改或替换，均属于本发明的范围。
6.根据权利要求1-4所述的复染染色试剂盒及应用，其特征在于，所述的复染染色试剂盒可用于显微镜分析、数字化图像分析，提高各种样本处理方法的染色效果。
7.根据权利要求1-4所述的复染染色试剂盒，其特征在于，所述的复染染色试剂盒可用于临床检测试剂、科研试剂及试剂盒。
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