CN107219104A - 一种克氏原螯虾染色体的制备方法 - Google Patents

一种克氏原螯虾染色体的制备方法 Download PDF

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李艳和
石林林
张龙
周小云
王卫民
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Abstract

本本发明属于动物细胞学实验技术领域，具体涉及一种克氏原螯虾染色体的制备方法。其步骤为：用植物血凝素PHA和秋水仙素分别注射处理克氏原螯虾虾体后，取虾的触角腺，置于生理盐水中漂洗，然后将组织剪碎成泥状，通过离心方法获得细胞悬液；用0.75％KCl溶液和固定液‑1分别进行低渗处理和预固定；然后用3:1固定液‑1和固定液‑2分别对细胞进行固定；将预冷的载玻片斜放，用滴管吸取适量的细胞悬液，垂直快而有力的喷到载玻片上，酒精灯火焰上快速烤2‑3s，空气下晾干；用吉姆萨染色液对附有染色体的玻片进行染色；显微镜下观察和拍照。本发明的染色体分散较好，形态可辨，可数的染色体分裂相。

Description

一种克氏原螯虾染色体的制备方法
技术领域
本发明涉及动物细胞实验技术领域，具体涉及一种克氏原螯虾染色体的制备方法。
背景技术
克氏原螯虾(Procambarus clarkii)，隶属于甲壳纲，十足目，螯虾科，原螯虾属，原产于墨西哥北部和美国南部。于1929年左右引入我国，目前该虾已成为我国一种重要的水产养殖动物，为我国的经济作出了一定的贡献。了解该虾的染色体组型特征可以为进一步研究该虾的遗传育种与品种改良以及控制奠定一定的理论基础。
由于克氏原螯虾的染色体形态较小、数目较多，一般的染色体制备方法很难得到分散好、形态清晰可辨的染色体图片，这给克氏原螯虾的组型分析带来一定的困难。已有三篇文献报道了克氏原螯虾的染色体研究情况，其中只有最早的一篇文献给出了该虾染色体的组型分析结果(Murofushi et al.Karyological study of the red swamp crayfishand the Japanese lobster by air-drying method.Proc.Japan Acad.,Ser.B,1984,60(B):306-309)，另两篇文献只给出了染色体分裂相的图片，因染色体形态可辨性差没有进一步给出组型分析结果(朱越雄等，克氏原螯虾染色体研究.水产养殖，1997，3：1-13；2.Radwan et al.Cytogenetic characterization and genetic variations betweenfreshwater crayfish Procambarus clarkii in Egypt.RJPBCS,2014,5(2):1801-1816)。这三篇文献给出的克氏原螯虾染色体数目上存在一定的出入，文献提到的制备染色体的组织多为精巢，而只有当精巢处于生殖发育期才易得到中期分裂相。现有的方法限制了采样的时间。因此，寻找一种更适合该虾染色体的制备方法，且样本采集时间不受季节限制，可为该虾染色体数目的确定及其组型分析等研究奠定基础。
发明内容
本发明的目的是针对克氏原螯虾染色体较小、数量较多、不易得到分散好的染色体分裂中期相、样本采集时间受限制等问题，提供一种染色体分散好，形态可辨且可数的改进的克氏原螯虾染色体的制备方法，本发明涉及的样本采集时间不受季节的限制。
实现本发明的技术方案如下：
一种克氏原螯虾染色体制备方法，包括以下步骤：
(1)前期处理：按照克氏原螯虾虾体重6ug/g的剂量向肌肉内注射植物血凝素(PHA)，间隔12h后按同样剂量注射第二次，间隔3h后按5ug/g克氏原螯虾虾体重的剂量注射1mg/mL的秋水仙素，注射秋水仙素4h后取样；
(2)利用离心法制备细胞：取虾的触角腺组织，置于生理盐水中漂洗，然后放入有500uL生理盐水的1.5mL离心管中，用小剪子将组织剪碎成泥状，全部移入10mL试管，在500r/min下离心3min，离心后取上清液，在1000r/min下离心10min，弃上清液；
(3)低渗、预固定：用滴管将细胞吹散，缓慢加入0.75％KCl溶液至5mL，室温下放置30min后加1mL的固定液-1，在1000r/min下离心10min，弃去上清液，留少许上清液，将细胞吹散；
(4)固定：加入5mL的固定液-1固定1.5h，中间更换3次固定液-1，每次在1000r/min下离心10min，最后一次留少许上清液，将细胞缓慢吹散后，加入适量固定液-2，将细胞混合均匀，30min后制片；
(5)喷片：将预冷的载玻片斜放，用滴管吸取适量的细胞悬液，垂直快而有力的喷到载玻片上，酒精灯火焰上快速烤2-3s后，在空气下干燥；
(6)染色：采用瑞士-姬姆萨染色套组(购自武汉谷歌生物科技有限公司)，该染色套组分A液和B液，按A液和B液体积比为1:2配制)对附着有染色体的玻片进行染色；
(7)在显微镜下观察和拍照；
其中：
步骤(2)中的生理盐水组分为：NaCl 7.5g/L，CaCl2 0.2g/L，KCl 0.2g/L，NaHCO20.02g/L；
步骤(4)中的固定液-1为甲醇和冰醋酸按3:1体积比进行配制；固定液-2为甲醇和冰醋酸按照1:1体积比进行配制。固定液-1和固定液-2现用现配，置于冰上备用。
本发明具有以下优点：
1.本发明采用的是触角腺样本制备细胞，克服了取样的时间限制，一年四季均可以制备染色体，不需要等到克氏原螯虾性腺发育成熟期采样进行制备。
2.本发明采用离心法获得细胞，可以避免制片时因细胞碎屑较多引起的染色体的背景干染。
3.本发明方法得到的染色体分散较好，形态可辨且可数，分裂相背景浅，易于观察，得出的染色体数目准确度高。
4.本发明的方法简便，一般实验室均可以操作。
附图说明
图1：本发明制备的克氏原螯虾成年虾的染色体分裂相图片。
图2：本发明制备的克氏原螯虾青年虾的染色体分裂相图片。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1克氏原螯虾成年虾的染色体的制备
1.试剂配制及相关材料的准备：
(1)生理盐水的配制：
7.5g NaCl；
0.2g CaCl2；
0.2g KCl；
0.02g NaHCO2；
用去离子水定容至1000mL。
(2)植物血凝素(PHA)：浓度2mg/mL，溶剂是灭菌的生理盐水。
(3)秋水仙素：1mg/mL，溶剂是灭菌的生理盐水。
(4)0.75％KCl溶液：将0.75g的KCl溶于100mL灭菌的ddH2O中；
(5)固定液-1：按甲醇和冰醋酸体积比为3:1配制，现用现配，冰上预冷。
(6)固定液-2：按甲醇和冰醋酸体积比为1:1配制，现用现配，冰上预冷。
(7)吉姆萨染液：采用的是瑞士-姬姆萨染色套组(购自武汉谷歌生物科技有限公司，该姬姆萨染色套组分A液B液，按照A液:B液的体比为1:2进行配制，现用现配。
(8)载玻片处理：用洗洁精将载玻片清洗干净，在65℃恒温箱中干燥2h，没有水渍后自然冷却后浸泡于95％酒精中过夜，取出后在超净台内晾干，浆干燥后的载玻片密封起来置于4℃冰箱内贮藏。
2.选取健康无伤、活力好的克氏原螯虾成年虾，体重在35-40g左右；按以下步骤对染色体进行制备：
(1)前期处理：按照6ug/g虾体重向克氏原螯虾成年虾肌肉注射植物血凝素(PHA)，间隔12h后按同样剂量注射第二次，再间隔3h后注射1mg/mL秋水仙素(剂量为5ug/g虾体重)，注射秋水仙素4h后取样；
(2)细胞制备：取克氏原螯虾虾的触角腺，置于生理盐水中漂洗，然后放入有500uL生理盐水的1.5mL离心管中，用小剪子将组织剪碎成泥状，全部移入10mL试管，在500r/min下离心3min，离心后取上清液，在1000r/min下离心10min，弃上清液；
(3)低渗、预固定：用滴管将细胞吹散，缓慢加入0.75％KCl溶液至5mL，室温低渗处理30min后加1mL固定液-1，在1000r/min下离心10min，弃去上清液，留少许上清液，将细胞吹散；
(4)固定：加入5mL的固定液-1固定1.5h，中间更换3次固定液-2，每次1000r/min离心10min，最后一次留少许上清液，将细胞缓慢吹散后，加入适量的固定液-2，将细胞混合均匀，30min后制片；
(5)喷片：将预冷的载玻片斜放，用滴管吸取适量的细胞悬液，垂直快而有力的喷到载玻片上，酒精灯火焰上快速烤两下后(2-3s)，在空气下干燥；
(6)染色：瑞士-姬姆萨染色套组(购自武汉谷歌生物科技有限公司，其中：姬姆萨染色套组分A液和B液，按体积比＝1:2混合)染色5-10min后用蒸馏水冲洗，附着有染色体的玻片凉干后即可观察。
(7)观察：在显微镜的油镜下选择分散良好，形态清晰，数目完整的中期分裂相，进行显微拍照，结果见图1。
实施例2克氏原螯虾青年虾的染色体制备
选取健康无伤、活力好的克氏原螯虾青年虾，体重在15-20g左右。实验试剂配制和相关材料的准备以及实验步骤同实施例1，镜检结果见图2。

Claims (1)

1.一种克氏原螯虾染色体制备方法，其特征包括以下步骤：
(1)前期处理：按克氏原螯虾体重6ug/g的剂量向肌肉内注射植物血凝素(PHA)，间隔12h后按同样剂量注射第二次，间隔3h后按照5ug/g虾体重的剂量注射1mg/mL的秋水仙素，注射秋水仙素4h后取样；
(2)用离心法制备细胞：取克氏原螯虾的触角腺组织，置于生理盐水中漂洗，然后转移到盛有500uL生理盐水的1.5mL离心管中，用小剪子将组织剪碎成泥状，全部移入10mL试管，在500r/min下离心3min，离心后取上清液，在1000r/min下离心10min，弃上清液；
(3)低渗、预固定：用滴管将细胞吹散，缓慢加入0.75％KCl溶液至5mL，室温下放置30min后加1mL的固定液-1，在1000r/min下离心10min，弃去上清液，留少许上清液，将细胞吹散；
(4)固定：加入5mL固定液-1固定1.5h，中间更换3次固定液-1，每次在1000r/min下离心10min，最后一次留少许上清液，将细胞缓慢吹散后，加入适量的固定液-2，将细胞混合均匀，30min后制片；
(5)喷片：将预冷的载玻片斜放，用滴管吸取适量的细胞悬液，垂直快而有力的喷到载玻片上，在酒精灯火焰上快速烤2-3s后，在空气下干燥；
(6)染色：采用瑞士-姬姆萨染色套组，该姬姆萨染色套组分A液和B液，配制时按A液：B液的体积比为1：2进行混合，对附着有染色体的玻片进行染色；
(7)在显微镜下观察和拍照；
其中：
步骤(2)中的生理盐水组分为：NaCl 7.5g/L，CaCl2 0.2g/L，KCl 0.2g/L，NaHCO20.02g/L。
步骤(4)中的固定液-1为甲醇和冰醋酸按3:1体积比配制，固定液-2为甲醇和冰醋酸按1:1体积比进行配制。
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