CN111323286B - 一种利用小分子抑制剂sp600125制备染色体标本的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用小分子抑制剂SP600125制备染色体标本的方法，采用SP600125对鱼类或哺乳动物的离体培养细胞或鱼类活体组织进行处理，结合低渗、固定以及制片染色后，即得到染色体标本。该方法制备过程简单、容易控制，制备周期短；SP600125将细胞周期阻断在分裂的早后期，染色体标本分裂相多、染色体结构清晰且形态良好，适用于染色体核型分析、显带技术和染色体原位杂交等研究实践；同时，极大地降低了常规染色体标本制备中使用剧毒性秋水仙素所存在的严重实验安全隐患。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种利用小分子抑制剂SP600125制备染色体标本的方法。
背景技术
染色体标本制备是染色体观察的基础，是细胞遗传学研究的一项基本技术，在生物的进化、遗传变异、育种、个体发育、疾病诊断和治疗发挥了重要的作用。目前常规染色体标本制备一般是采用秋水仙素。秋水仙素可与微管蛋白二聚体结合，破坏纺锤体，使分裂细胞停止于有丝分裂中期。然而秋水仙素会抑制细胞的生长、促进细胞凋亡，并导致细胞死亡。同时，研究表明秋水仙素具有剧毒性(危险类别码：R26/28)，人体吸入或吞咽后极毒，中毒症状与砷中毒类似，而且现阶段还没有能够应用于临床的解毒剂。因此，亟需开发新的染色体标本制备方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种利用低毒性化学小分子试剂SP600125制备染色体标本的新方法。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：
一种利用小分子抑制剂SP600125制备染色体标本的方法，采用SP600125对鱼类或哺乳动物的离体培养细胞或鱼类活体组织进行处理，结合低渗、固定以及制片染色后，即得到良好的染色体标本。
SP600125(C14H8N2O)是蒽吡唑化合物，一种ATP竞争性小分子抑制剂。研究发现，SP600125对哺乳动物胚胎干细胞(ES)的干细胞特性起着重要维持作用，通过SP600125可以显著增加胚胎干细胞的自我更新。细胞体外培养的相关研究发现，培养液中加入低浓度SP600125可以抑制细胞凋亡，提高细胞存活率，并且细胞生存状态明显得到改善。故而目前，作为低毒性小分子抑制剂，SP600125广泛应用于胚胎干细胞的体外培养和诱导多能性干细胞的建立。然而我们研究发现，SP600125还能够通过对P53通路和纺锤体组装检验点的调控使分裂细胞阻断在有丝分裂期。在此基础上，本发明确定了利用SP600125抑制有丝分裂制备染色体标本的可行性，并建立了鱼类/哺乳动物离体培养细胞和鱼类活体肾脏组织的染色体标本制备方法。采用SP600125制备的染色体标本具有分裂相多、染色体结构清晰且形态良好，适用于染色体核型分析、显带技术和染色体原位杂交等研究实践。
上述的方法，优选的，所述采用SP600125对鱼类或哺乳动物的离体培养细胞进行处理的具体操作，包括如下步骤：将离体培养细胞(增殖活跃的继代培养细胞为宜)接种于含细胞培养液的培养皿中，置于恒温箱中传代培养24-36h后，在所述细胞培养液中加入SP600125至终浓度为50-150μM，暗处理培养22-28h后，加入质量浓度为0.20-0.25％的胰酶进行细胞脱壁，直到显微镜下观察有大量细胞变圆后，加入细胞培养液终止消化，然后将细胞轻轻吹打成单细胞悬液，离心，弃上清后获得细胞沉淀。
优选的，所述离体培养细胞的培养条件包括：细胞置于28-37℃、5％CO2的培养箱中培养，鱼类细胞培养温度优选28℃，哺乳动物培养温度优选37℃；细胞培养液为DMEM培养基，其中鱼类优选DMEM培养基含有10vol％的胎牛血清(FBS)、1vol％的丙酮酸钠、1vol％的非必需氨基酸(NEAA)、1vol％的L-谷氨酰胺、0.1vol％的β-巯基乙醇和1vol％的青霉素/链霉素P/S(penicillin/streptomycin)；哺乳动物优选DMEM培养基含有10vol％的胎牛血清(FBS)和1vol％的青霉素/链霉素P/S(penicillin/streptomycin)。
优选的，所述SP600125在使用前先用二甲基亚砜作为溶剂，配至浓度为20mM。
优选的，针对鱼类或哺乳动物的离体培养细胞，所述低渗的具体操作包括如下步骤：在经过所述SP600125处理后得到的细胞沉淀中加入浓度为0.0375-0.075mol/L的KCl溶液，用吸管吹打成单细胞悬液，低渗处理40-60min后加入卡诺氏固定液进行预固定(固定液应视材料多少而定，切忌过多)，所述卡诺氏固定液由甲醇和冰醋酸按3:1体积比配制得到，然后轻轻吹打均匀，离心，弃上清后获得低渗处理细胞沉淀。
优选的，所述KCl溶液在加入所述细胞沉淀中之前，先提前在28-37℃的条件下提前预热，鱼类优选28℃，哺乳动物优选37℃；所述离心的转速为1000-1500r/min，离心时间为5-10min。
上述的方法，优选的，所述采用SP600125对鱼类活体组织进行处理的具体操作，包括如下步骤：对目标鱼按2-2.5μL/g鱼体重的剂量注射植物血球凝集素(PHA)，12-15h后按3-4μL/g鱼体重的剂量再次注射植物血球凝集素，3-5h后注射植物血球凝集素和SP600125，其中植物血球凝集素按1.2-1.5μL/g鱼体重的剂量注射，SP600125按0.8-1μL/g鱼体重的注射；三次注射结束1.5-2h后，解剖取肾脏组织，将经生理盐水清洗后的肾脏组织剪碎，加入生理盐水(少量)并用吸管反复吹打，静置5-10min后取上层细胞悬液进行离心；离心后弃上清，留细胞沉淀。
优选的，注射部位为鱼的胸鳍基部无鳞片凹陷处；所述植物血球凝集素的浓度为4-5mg/mL，SP600125浓度为3mM-8mM；所述生理盐水为质量浓度为0.8-0.9％的氯化钠溶液。
优选的，针对所述鱼类活体组织，所述低渗的具体操作包括如下步骤：在经过所述SP600125处理后得到的细胞沉淀中加入浓度为0.0375-0.075mol/L的KCl溶液，用吸管轻轻吹打成单细胞悬液，将出现的絮状沉淀吸出丢弃；处理1-2h后进行离心；离心后，弃上清，获得低渗处理细胞沉淀；所述离心的转速为1000-1500r/min，离心时间为5-15min。
优选的，所述固定的具体操作，包括如下步骤：在所述低渗处理后得到的低渗处理细胞沉淀中加入卡诺氏固定液，轻轻吹打成单细胞悬液后在4℃条件下固定30min以上，离心，弃上清，保留细胞沉淀，以上固定步骤重复1-4遍，最后加入卡诺氏固定液，吹打细胞沉淀制成细胞悬液；所述离心的转速为1000-1500r/min，离心时间为5-15min。
优选的，所述目标鱼的选择标准为健康、体重适中(100g-200g为宜)。
所述制片染色的具体操作，包括如下步骤：吸取所述固定后得到的细胞悬液悬滴于玻片上，自然干燥或酒精灯上快速干燥，然后用pH为6.8-7.0的PBS(磷酸缓冲液)将吉姆萨母液按9:1体积比稀释(现配现用)后，(在室温下)对玻片上的固定细胞进行染色，30-45min后吸去染液，用水洗后自然干燥，即得到所述的染色体标本。
玻片需提前放入-20℃的冰箱制成冰湿玻片以备用，离体培养细胞和鱼类活体组织的染色体制备中，固定、制片染色的制备步骤相同。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明的方法，利用一种新的低毒性化学小分子试剂SP600125来制备染色体标本，制备过程简单、容易控制，制备周期短；SP600125将细胞周期阻断在分裂的早后期，染色体标本分裂相多、染色体结构清晰且形态良好，适用于染色体核型分析、显带技术和染色体原位杂交等研究实践；同时，极大地降低了常规染色体标本制备中使用剧毒性秋水仙素所存在的严重实验安全隐患。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是实施例1中利用SP600125制备的草鱼尾鳍离体培养细胞(2n＝48)染色体标本图；
图2是实施例2中利用SP600125制备的红鲫尾鳍离体培养细胞(2n＝100)染色体标本图；
图3是实施例3中利用SP600125制备的人肺上皮(Beas-2b)离体培养细胞(2n＝46)染色体标本图；
图4是实施例4中利用SP600125制备的团头鲂(2n＝48)肾脏组织染色体标本图；
图5是实施例5中利用SP600125制备的红鲫(2n＝100)肾脏组织染色体标本图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例1：草鱼离体培养细胞染色体标本的制备
本发明利用SP600125制备离体培养细胞染色体标本的方法，以草鱼尾鳍离体培养细胞作为材料，具体包括以下步骤：
(1)细胞选取：以离体培养的草鱼尾鳍细胞为原材料，选择细胞分裂旺盛，生长状态较好的，待其长满整个培养皿(细胞融合度达到90％)，用质量浓度为0.25％的胰酶消化后分皿(直径6cm)，培养皿中含有细胞培养液，置于28℃、5％CO2恒温箱中进行传代培养，传代后24h时，即可进行染色体制备；鱼类细胞培养液为DMEM培养基，其中含有10vol％的胎牛血清(FBS)、1vol％的丙酮酸钠、1vol％的非必需氨基酸(NEAA)、1vol％的L-谷氨酰胺、0.1vol％的β-巯基乙醇和1vol％的青霉素/链霉素P/S(penicillin/streptomycin)；
(2)前期处理：向上述传代后得到的细胞培养液中加入SP600125(20mM)至终浓度为50μM，正常细胞培养条件下暗处理24h；
(3)细胞收获：吸去细胞培养皿中的培养液，加1mL 0.25％胰酶(质量浓度)消化2-3min，待细胞变圆脱壁，往培养皿中加入1mL细胞培养液终止消化，轻轻吹打成单细胞悬液，并收集至15mL离心管中，离心(1000r/min)10min，弃上清，获得细胞沉淀；
(4)低渗处理和预固定：向上述细胞沉淀中加入提前预热(28℃)的0.0375mol/LKCl溶液4mL，用吸管轻轻吹打成单细胞悬液，放入28℃水浴锅中低渗处理40min，待其低渗完后再加入1mL提前预冷(4℃)的卡诺氏固定液(甲醇:冰醋酸＝3:1，体积比)，吹打均匀，离心(1000r/min)10min，弃上清，获得低渗处理细胞沉淀；
(5)固定：在上述低渗处理细胞沉淀中加入4mL预冷(4℃)的卡诺氏固定液(甲醇:冰醋酸＝3:1，体积比)，混合均匀，放入4℃冰箱固定40min，离心(1000r/min)10min，弃上清，再次加入4mL预冷(4℃)的卡诺氏固定液，吹打均匀并置于4℃冰箱再固定40min，离心(1000r/min)10min，弃上清液，最后加入0.6mL卡诺氏固定液，吹打细胞沉淀制成悬液；
(6)制片：从-20℃冰箱中取干净的冷冻载玻片，玻片成45°角，用200μL移液枪吸取细胞悬液，高空悬滴在冰冻玻片上，小心在酒精灯上烤干载玻片；
(7)染色和镜检：用PH＝6.8的PBS(磷酸缓冲液)将吉姆萨母液按9:1体积比稀释，配成工作液(现配现用)，室温下染色30min后，吸去染液，用自来水轻轻冲洗，自然干燥，再用显微镜观察、拍照，即可得到二倍体草鱼离体培养细胞(2n＝48)染色体标本图(见图1)。
由图1可知，本发明利用SP600125对草鱼尾鳍离体培养细胞进行处理后，染色体标本分裂相多，染色体结构清晰且形态良好，适用于染色体核型分析、显带技术和染色体原位杂交等研究实践。同时，极大地降低了常规染色体标本制备中使用剧毒性秋水仙素所存在的严重实验安全隐患。
实施例2：红鲫离体培养细胞染色体标本的制备
本发明利用SP600125制备离体培养细胞染色体标本的方法，以红鲫尾鳍离体培养细胞作为材料，具体包括以下步骤：
(1)细胞选取：以离体培养的红鲫尾鳍细胞为原材料，选择细胞分裂旺盛，生长状态较好的，待其长满整个培养皿(融合度达到90％)，用质量浓度为0.25％的胰酶消化后分皿(直径6cm)，培养皿中含有细胞培养液(配方同实施例1)，置于28℃、5％CO2恒温箱中进行传代培养，传代后24h时，即可进行染色体制备；
(2)前期处理：向上述传代后得到的细胞培养液中加入SP600125(20mM)至终浓度为100μM，正常细胞培养条件下暗处理24h；
(3)细胞收获：向上述处理的细胞进行终止培养，首先吸掉细胞培养皿中的培养基，加1mL 0.25％胰酶(质量浓度)消化2-3min，待细胞变圆脱壁，往培养皿中加入1mL细胞培养液终止消化，轻轻吹打成单细胞悬液，并收集至15mL离心管中，离心(1000r/min)10min，弃上清，获得细胞沉淀；
(4)低渗处理和预固定：向上述细胞沉淀中加入提前预热(28℃)的0.0375mol/LKCl溶液4mL，用吸管轻轻吹打成单细胞悬液，放入28℃水浴锅中低渗处理40min，待其低渗完后再加入1mL提前预冷(4℃)的卡诺氏固定液(甲醇:冰醋酸＝3:1，体积比)，吹打均匀，离心(1000r/min)10min，弃上清，获得低渗处理细胞沉淀；
(5)固定：在上述低渗处理细胞沉淀中加入4mL预冷(4℃)的卡诺氏固定液(甲醇:冰醋酸＝3:1，体积比)，混合均匀，放入4℃冰箱固定40min，离心(1000r/min)10min，弃上清，再次加入4mL预冷(4℃)的卡诺氏固定液，吹打均匀并置于4℃冰箱再固定40min，离心(1000r/min)10min，弃上清液，最后加入0.6mL卡诺氏固定液，吹打细胞制成悬液；
(6)制片：从-20℃冰箱中取干净的冷冻载玻片，玻片成45°角，用200μL移液枪吸取细胞悬液，高空悬滴在冰冻玻片上，小心在酒精灯上烤干载玻片；
(7)染色和镜检：用PH＝6.8的PBS将吉姆萨母液按9:1体积比稀释，配成工作液(现配现用)，室温下染色30min后，吸去染液，用自来水轻轻冲洗，自然干燥，再用显微镜观察、拍照，即可得到红鲫离体培养细胞(2n＝100)染色体标本图(见图2)。
由图2可知，本发明利用化学小分子SP600125抑制剂对红鲫尾鳍离体培养细胞处理后，染色体标本分裂相多，染色体结构清晰且形态良好，适用于染色体核型分析、显带技术和染色体原位杂交等研究实践。同时，极大地降低了常规染色体标本制备中使用剧毒性秋水仙素所存在的严重实验安全隐患。
实施例3：人肺上皮(Beas-2b)离体培养细胞染色体标本的制备
本发明利用SP600125剂制备离体培养细胞染色体标本的方法，以人肺上皮(Beas-2b)离体培养细胞作为材料，具体包括以下步骤：
(1)细胞选取：以离体培养的人肺上皮细胞为原材料，选择细胞分裂旺盛，生长状态较好的，待其长满整个培养皿(融合度达到90％)，用质量浓度为0.25％的胰酶消化后分皿(直径6cm)，培养皿中含有细胞培养液，置于37℃、5％CO2恒温箱中进行传代培养，传代后24h时，即可进行染色体制备；体外培养液为DMEM培养基，其中含有10vol％的胎牛血清(FBS)和1vol％的青霉素/链霉素；
(2)前期处理：向上述传代后得到的细胞培养液中加入SP600125(20mM)至终浓度为50μM，正常细胞培养条件下暗处理24h；
(3)细胞收获：吸去细胞培养皿中的培养液，加1mL 0.25％胰酶(质量浓度)消化3-5min，待细胞变圆脱壁，往培养皿中加入1mL细胞培养液终止消化，轻轻吹打成单细胞悬液，并收集至15mL离心管中，离心(1000r/min)10min，弃上清，获得细胞沉淀；
(4)低渗处理和预固定：向上述细胞沉淀中加入提前预热(37℃)的0.0375mol/LKCl溶液4mL，用吸管轻轻吹打成单细胞悬液，放入37℃水浴锅中低渗处理40min，待其低渗完后再加入1mL提前预冷(4℃)的卡诺氏固定液(甲醇:冰醋酸＝3:1，体积比)，吹打均匀，离心(1000r/min)10min，弃上清，获得低渗处理细胞沉淀；
(5)固定：在上述低渗处理细胞沉淀中加入4mL预冷(4℃)的卡诺氏固定液(甲醇:冰醋酸＝3:1，体积比)，混合均匀，放入4℃冰箱固定40min，离心(1000r/min)10min，弃上清，再次加入4mL预冷(4℃)的卡诺氏固定液，吹打均匀并置于4℃冰箱再固定50min，离心(1000r/min)10min，弃上清液，最后加入0.8mL卡诺氏固定液，吹打细胞制成悬液；
(6)制片：从-20℃冰箱中取干净的冷冻载玻片，玻片成45°角，用200μL移液枪吸取细胞悬液，高空悬滴在冰冻玻片上，小心在酒精灯上烤干载玻片；
(7)染色和镜检：用PH＝6.8的PBS将吉姆萨母液按9:1体积比稀释，配成工作液(现配现用)，室温下染色30min后，吸去染液，用自来水轻轻冲洗，自然干燥，再用显微镜观察、拍照，即可得到人肺上皮(Beas-2b)离体培养细胞(2n＝46)染色体标本图(见图3)。
由图3可知，本发明利用化学小分子SP600125抑制剂对人肺上皮(Beas-2b)离体培养细胞进行处理后，染色体标本分裂相多，染色体结构清晰且形态良好，适用于染色体核型分析、显带技术和染色体原位杂交等研究实践。同时，极大地降低了常规染色体标本制备中使用剧毒性秋水仙素所存在的严重实验安全隐患。
实施例4：团头鲂活体组织肾脏细胞染色体标本的制备
利用SP600125制备活体组织染色体标本的方法，以团头鲂作为材料，具体包括以下步骤：
(1)实验鱼的选择：选择健康、体重约为200g的团头鲂；
(2)注射PHA和SP600125：实验前1天晚上给鱼注射第一针PHA(4mg/mL)450μL；第二天上午(与第一针相隔12-15h)注射第二针PHA(4mg/mL)630μL；中午(与第二针相隔3-5h)注射第三针PHA(4mg/mL)270μL，注射部位均为鱼的胸鳍基部无鳞片凹陷处倾斜45°，同时在鱼的反面同一地方注射已配好的SP600125溶液(8mM)166μL；SP600125溶液由二甲基亚砜先溶解至20mM浓度后再用超纯水稀释至终浓度8mM备用；
(3)取材：注射SP600125溶液(8mM)2h后，将实验鱼鳃剪破在水中放血10min，将鱼解剖取出完整肾脏放入盛有生理盐水(0.9％NaCl，质量浓度)的培养皿中清洗2遍，然后用吸管吸净生理盐水，用小剪刀将其剪碎至糊状，再将其转移到15mL离心管中加入生理盐水至4mL，并用吸管反复吹打200次，再吸入生理盐水至11mL，混合均匀，静置10min后取上层细胞悬液8mL至另一新的离心管，离心(1500r/min)10min，弃上清，获得细胞沉淀；
(4)低渗：向上述细胞沉淀中加入0.075mol/L KCl溶液4mL，轻吹混匀后再加至10mL，静置1h进行低渗处理，期间每隔10min需要将底部絮状沉淀吸出丢弃，然后将试管放入离心机中(1500r/min，5min)弃上清将沉淀收集起来，获得低渗处理细胞沉淀；
(5)固定：在上述低渗处理细胞沉淀中加入4mL预冷(4℃)的卡诺氏固定液(甲醇:冰醋酸＝3:1)，混合均匀，放入4℃冰箱固定60min，离心(1000r/min)10min，弃上清，此步骤重复三次即可，最后加入4mL预冷(4℃)卡诺氏固定液重悬细胞；
(6)制片：取干净的冷冻载玻片(-20℃)，玻片成45°角，用200μL移液枪吸取细胞悬液，高空悬滴在冰冻玻片上，小心在酒精灯上烤干载玻片；
染色和镜检：用pH＝6.8的PBS将吉姆萨母液按9:1体积比稀释，配成工作液(现配现用)，室温下染色45min后，吸去染液，用自来水轻轻冲洗，自然干燥，再用显微镜观察、拍照，即可得到团头鲂(2n＝48)活体组织肾脏细胞染色体标本图(见图4)。
由图4可知，本发明利用化学小分子SP600125对团头鲂活体组织进行抑制处理，肾脏细胞染色体标本分裂相多，染色体结构清晰且形态良好，适用于染色体核型分析、显带技术和染色体原位杂交等研究实践。同时，极大地降低了常规染色体标本制备中使用剧毒性秋水仙素所存在的严重实验安全隐患。
实施例5：红鲫活体组织肾脏细胞染色体标本的制备
利用SP600125制备活体组织染色体标本的方法，以红鲫作为材料，具体包括以下步骤：
(1)实验鱼的选择：选择健康、体重约100g的红鲫；
(2)注射PHA和SP600125：实验前1天晚上给鱼注射第一针PHA(4mg/mL)208μL；第二天上午(与第一针相隔12-15h)注射第二针PHA(4mg/mL)312μL；中午(与第二针相隔3-5h)注射第三针PHA(4mg/mL)125μL，注射部位均为鱼的胸鳍基部无鳞片凹陷处倾斜45°，同时在鱼的反面同一地方注射已配好的SP600125溶液(5mM)83μL；SP600125溶液由二甲基亚砜先溶解至20mM浓度后再用超纯水稀释至终浓度5mM备用；
(3)取材：注射SP600125溶液(5mM)1.5h后，将实验鱼鳃剪破在水中放血10min，将鱼解剖取出完整肾脏放入盛有生理盐水(0.8％NaCl，质量浓度)的培养皿中清洗2遍，然后用吸管吸净生理盐水，用小剪刀将其剪碎至糊状，再将其转移到15mL离心管中加入生理盐水至4mL，并用吸管反复吹打200次，再吸入生理盐水至11mL，混合均匀，静置10min后取上层细胞悬液8mL至另一新的离心管，离心(1500r/min)5min，弃上清，获得细胞沉淀；
(4)低渗：向上述细胞沉淀中加入0.075mol/L KCl溶液4mL，轻吹混匀后再加至10mL，静置1h进行低渗处理，期间每隔10min需要将底部絮状沉淀吸出丢弃，然后将试管放入离心机中(1500r/min，5min)弃上清将沉淀收集起来，获得低渗处理细胞沉淀；
(5)固定：在上述低渗处理细胞沉淀中加入4mL预冷(4℃)的卡诺氏固定液(甲醇:冰醋酸＝3:1)，混合均匀，放入4℃冰箱固定30min，离心(1000r/min)10min，弃上清，此步骤重复三次即可，最后加入4mL预冷(4℃)卡诺氏固定液重悬细胞；
(6)制片：取干净的冷冻载玻片(-20℃)，玻片成45°角，用200μL移液枪吸取细胞悬液，高空悬滴在冰冻玻片上，小心在酒精灯上烤干载玻片；
(7)染色和镜检：用pH＝6.8的PBS将吉姆萨母液按9:1体积比稀释，配成工作液(现配现用)，室温下染色45min后，吸去染液，用自来水轻轻冲洗，自然干燥，再用显微镜观察、拍照，即可得到二倍体红鲫(2n＝100)活体组织肾脏细胞染色体标本图(见图5)。
由图5可知，本发明利用化学小分子SP600125对红鲫活体组织进行处理，肾脏细胞染色体标本分裂相多，染色体结构清晰且形态良好，适用于染色体核型分析、显带技术和染色体原位杂交等研究实践。同时，极大地降低了常规染色体标本制备中使用剧毒性秋水仙素所存在的严重实验安全隐患。
Claims (3)
1.一种利用小分子抑制剂SP600125制备染色体标本的方法，其特征在于，采用SP600125对鱼类或哺乳动物的离体培养细胞进行处理，结合低渗、固定以及制片染色后，即得到染色体标本；
采用SP600125对鱼类或哺乳动物的离体培养细胞进行处理的具体操作包括如下步骤：将离体培养细胞接种于含细胞培养液的培养皿中，置于恒温箱中传代培养24-36 h后，在所述细胞培养液中加入SP600125至终浓度为50-150µM，暗处理培养22-28 h后，加入质量浓度为0.20-0.25%的胰酶进行细胞脱壁处理，用细胞培养液终止消化后将细胞轻轻吹打成单细胞悬液，离心，弃上清后获得细胞沉淀；所述恒温箱中的培养温度为28-37℃；所述SP600125在使用前先用二甲基亚砜作为溶剂，配至浓度为20 mM；所述离心的转速为1000-1500r/min，离心时间为5-10min；
所述低渗的具体操作包括如下步骤：在经过所述SP600125处理后得到的细胞沉淀中加入浓度为0.0375-0.075mol/L的KCl溶液，用吸管轻轻吹打成单细胞悬液，处理40-60min后加入卡诺氏固定液进行预固定，所述卡诺氏固定液由甲醇和冰醋酸按3:1体积比配制得到，然后轻轻吹打均匀，离心，弃上清后获得低渗处理细胞沉淀；
所述固定的具体操作，包括如下步骤：在所述低渗处理后得到的低渗处理细胞沉淀中加入卡诺氏固定液，轻轻吹打成单细胞悬液后在4℃条件下固定30 min以上，离心，弃上清，保留细胞沉淀，以上固定步骤重复1-4遍，最后加入卡诺氏固定液，吹打细胞沉淀制成细胞悬液；所述离心的转速为1000-1500r/min，离心时间为5-15min；
所述制片染色的具体操作，包括如下步骤：吸取所述固定后得到的细胞悬液悬滴于玻片上，自然干燥，用pH为6.8-7.0的PBS将吉姆萨母液按9:1体积比稀释后，对玻片上的细胞进行染色，30-45min后吸去染液，用水洗后自然干燥，即得到所述的染色体标本。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述KCl溶液在加入所述细胞沉淀中之前，先提前在28-37℃的条件下提前预热；所述离心的转速为1000-1500r/min，离心时间为5-10min。
3.一种利用小分子抑制剂SP600125制备染色体标本的方法，其特征在于，采用SP600125对鱼类活体组织进行处理，结合低渗、固定以及制片染色后，即得到染色体标本；
采用SP600125对鱼类活体组织进行处理的具体操作包括如下步骤：对目标鱼按2-2.5μL/g鱼体重的剂量注射植物血球凝集素，12-15h后按3-4μL/g鱼体重的剂量再次注射植物血球凝集素，3-5h后注射植物血球凝集素和SP600125，其中植物血球凝集素按1.2-1.5μL/g鱼体重的剂量注射，SP600125按0.8-1μL/g鱼体重的注射；三次注射结束1.5-2 h后，解剖取肾脏组织，将经生理盐水清洗后的肾脏组织剪碎，加入生理盐水并用吸管反复吹打，静置5-10min后取上层细胞悬液进行离心；离心后弃上清，留细胞沉淀；注射部位为鱼的胸鳍基部无鳞片凹陷处；所述植物血球凝集素的浓度为4-5mg/mL；所述SP600125的浓度为3mM-8mM；所述生理盐水为质量浓度为0.8-0.9%的氯化钠溶液；
所述低渗的具体操作包括如下步骤：在经过所述SP600125处理后得到的细胞沉淀中加入浓度为0.0375-0.075mol/L的KCl溶液，用吸管轻轻吹打成单细胞悬液，将出现的絮状沉淀吸出丢弃；处理1-2h后进行离心；离心后，弃上清，获得低渗处理细胞沉淀；所述离心的转速为1000-1500r/min，离心时间为5-15min；
所述固定的具体操作，包括如下步骤：在所述低渗处理后得到的低渗处理细胞沉淀中加入卡诺氏固定液，轻轻吹打成单细胞悬液后在4℃条件下固定30 min以上，离心，弃上清，保留细胞沉淀，以上固定步骤重复1-4遍，最后加入卡诺氏固定液，吹打细胞沉淀制成细胞悬液；所述离心的转速为1000-1500r/min，离心时间为5-15min；
所述制片染色的具体操作，包括如下步骤：吸取所述固定后得到的细胞悬液悬滴于玻片上，自然干燥，用pH为6.8-7.0的PBS将吉姆萨母液按9:1体积比稀释后，对玻片上的细胞进行染色，30-45min后吸去染液，用水洗后自然干燥，即得到所述的染色体标本。
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Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2155813A1 (en) * | 1994-08-12 | 1996-02-13 | Eisuke Gotoh | Agents and a method of chromosome preparation using protein phosphatase inhibitors induced premature chromosome condensation |
| CN103091144A (zh) * | 2013-01-29 | 2013-05-08 | 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所 | 一种大鳞鲃鱼肾细胞体内培养制备染色体的方法 |
| CN103267665A (zh) * | 2013-05-22 | 2013-08-28 | 中国海洋大学 | 一种制备鲆鲽鱼类单个胚胎染色体的方法 |
| CN103602628A (zh) * | 2013-12-05 | 2014-02-26 | 黑龙江八一农垦大学 | 人参培养细胞染色体分离方法 |
| CN104109652A (zh) * | 2014-07-04 | 2014-10-22 | 湖南师范大学 | 人工诱导四倍体鲫鱼细胞系及其培养方法和应用 |
| CN106680056A (zh) * | 2016-12-05 | 2017-05-17 | 浙江海洋大学 | 曼氏无针乌贼鳃染色体的制备方法 |
| CN107589002A (zh) * | 2017-09-08 | 2018-01-16 | 杭州市妇产科医院 | 一种诱导多能干细胞染色体的制备方法 |
| CN209432555U (zh) * | 2018-12-27 | 2019-09-24 | 郑州金域临床检验中心有限公司 | 一种染色体制片装置 |
-
2020
- 2020-03-16 CN CN202010181734.XA patent/CN111323286B/zh active Active
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2155813A1 (en) * | 1994-08-12 | 1996-02-13 | Eisuke Gotoh | Agents and a method of chromosome preparation using protein phosphatase inhibitors induced premature chromosome condensation |
| CN103091144A (zh) * | 2013-01-29 | 2013-05-08 | 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所 | 一种大鳞鲃鱼肾细胞体内培养制备染色体的方法 |
| CN103267665A (zh) * | 2013-05-22 | 2013-08-28 | 中国海洋大学 | 一种制备鲆鲽鱼类单个胚胎染色体的方法 |
| CN103602628A (zh) * | 2013-12-05 | 2014-02-26 | 黑龙江八一农垦大学 | 人参培养细胞染色体分离方法 |
| CN104109652A (zh) * | 2014-07-04 | 2014-10-22 | 湖南师范大学 | 人工诱导四倍体鲫鱼细胞系及其培养方法和应用 |
| CN106680056A (zh) * | 2016-12-05 | 2017-05-17 | 浙江海洋大学 | 曼氏无针乌贼鳃染色体的制备方法 |
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Non-Patent Citations (2)
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|---|
| JNK inhibitor SP600125 promotes the formation of polymerized tubulin, leading to G2/M phase arrest, endoreduplication, and delayed apoptosis;Dong-Oh Moon等;《EXPERIMENTAL and MOLECULAR MEDICINE》;20090930;第41卷(第9期);第665-677页 * |
| SP600125 诱导鱼类细胞多倍化的分子机制研究;莫艳秀;《中国博士学位论文全文数据库 农业科技辑》;20200115(第01期);第15-16,29-34页 * |
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