CN103602628A - 人参培养细胞染色体分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及的是人参培养细胞染色体分离方法，这种人参培养细胞染色体分离方法如下，一、人参悬浮细胞预处理和酶解去除细胞壁细胞膜，将相对饱满的细胞用质量百分比为0.1%秋水仙素处理16h，用MS培养基洗涤后称10克，放入100ml裂解液中，解离人参悬浮细胞的细胞壁和细胞质膜12h；二、人参悬浮细胞细胞核纯化，过滤，自然沉降得到上清液，吸取上清液进行蔗糖密度梯度离心，2000×g离心浓缩细胞核，低温保存；三、人参悬浮细胞染色体纯化，收集细胞核破除核膜，低渗与溶膜，蔗糖密度梯度离心收集染色体，500×g离心下60min，大量染色体都集中在质量百分比为25%蔗糖界面上，收集这个界面4000×g离心浓缩染色体，低温保存。本发明分离纯化染色体的速度较快。
Description
一、技术领域
本发明涉及的是生命科学技术领域中对染色体分离的方法，具体涉及的是人参培养细胞染色体分离方法。
二、背景技术
21世纪，将是生物业和信息业主导的世界，人类解码生命又上了一个新的高度，这将是一个人类靠近生命本质的时代。而对染色体的研究是生物业必不可少的环节，大量人参染色体的制备方法至今尚未见报道，快速获得大量结构完整不含细胞质和细胞核、单个较纯的人参细胞染色体是许多研究工作的基础，如染色体的电镜结构分析、染色体结构蛋白的生化分析及初步纯化、制备整条染色体探针池、基因定位、基因克隆、文库构建及利用特定染色体进行远缘杂交实现种质资源创新等。用流式细胞分类仪分选染色体，虽然纯度较高，但是分离纯化染色体的速度较慢，耗时较长。由于需要大量人参染色体而满足不同层次研究工作的需要，能使用相对简单快捷的方法获得大量的完整的人参染色体已成当务之急。
三、发明内容
本发明的目的是提供人参培养细胞染色体分离方法，这种人参培养细胞染色体分离方法用于解决目前分离纯化染色体的方法速度较慢，耗时较长的问题
本发明采用的技术方案是：这种人参培养细胞染色体分离方法如下，
一、人参悬浮细胞预处理和酶解去除细胞壁细胞膜：
选择生长周期里11-13天内颜色呈淡黄色的人参悬浮细胞，把细胞抽滤后，放在MS培养基里悬浮，自然沉降1-2分钟，除去细胞中的小的空核及白色絮状物质，挑出相对饱满的细胞用质量百分比为0.1%秋水仙素处理16h，用MS培养基洗涤后称10克，放入100ml裂解液中，35℃下50rpm的摇床上解离人参悬浮细胞的细胞壁和细胞质膜12h；
二、人参悬浮细胞细胞核纯化：
过滤：将步骤一得到的酶解液在10×g -20×g 离心3min，吸取上清液在300目附加两层薄棉纸的滤网上抽滤；
自然沉降：收集滤液在4℃冰箱中自然沉降5h，去中层滤液，得到上清液；
蔗糖密度梯度离心：吸取上清液进行蔗糖密度梯度离心。蔗糖梯度设置为：最底层是质量百分比为40%的蔗糖溶液1ml，向上依次铺上质量百分比为35%、30%和25%的蔗糖溶液各1ml。将上清液置于最上面，500×g离心下30min-60min，大量细胞核都集中在质量百分比为30%蔗糖界面上，收集这个界面2000×g离心浓缩细胞核，低温保存。
三、人参悬浮细胞染色体纯化：
低渗与溶膜：收集细胞核用0.75M 1，6己二醇破除核膜，将收集到的细胞核用75mmol/L氯化钾4℃低渗10min，1000rpm离心10min，沉淀悬于0.75mol/L 1,6-己二醇的GCW缓冲溶液（pH4.0）中，37℃水浴10min,接着冰上30min,再用7号针头10ml注射器推挤；
蔗糖密度梯度离心收集染色体：将染色体溶液进行蔗糖密度梯度离心，蔗糖梯度设置为：最底层是质量百分比为35%的蔗糖溶液1ml，向上依次铺上质量百分比为30%的蔗糖溶液1ml、质量百分比为25%的蔗糖溶液0.5ml。将染色体溶液置于最上面，500×g离心下60min，大量染色体都集中在质量百分比为25%蔗糖界面上，收集这个界面4000×g离心浓缩染色体，低温保存。
上述方案中裂解液含质量百分比为1%-2%的纤维素酶、质量百分比为0.5%-1%果胶酶、质量百分比为0.5%-1%半纤维素酶、0.4M-0.6M蔗糖、质量百分比为0.5%-1.5%柠檬酸钠、质量百分比为0.5-1%抗坏死血酸、质量百分比为0.1%-0.5%PVP的GCW缓冲液；GCW缓冲液含磷酸二氢钾27mg/L、硝酸钾100mg/L、硫酸镁240mg/L、碘化钾0.2mg/L、硫酸铜0.05mg/L、氯化钙1500mg/L，GCW缓冲液的pH为3.8。
有益效果：
1、本发明建立一种新的能较大量分离人参培养细胞染色体的方法，分离纯化染色体的速度较快。
2、通常人参培养细胞核在纯化过程中，经常出现大量胞间联丝缠绕住细胞核，形成大量絮状沉淀，本发明采用在裂解液里加入柠檬酸钠低速离心结合自然沉降后，利用300目滤网上附加两层薄棉纸过滤，大大减少絮状沉淀。
3、通常在实验过程中，细胞核膜随时间推移破裂地越严重，我们在细胞壁处理中加入了抗坏血酸，利用蔗糖密度梯度能更高、纯、多的提取细胞核且减慢核破裂的速度。
四、附图说明
图1是本发明分散游离的人参悬浮细胞100×；
图2是本发明纯化后的细胞核100×；
图3是本发明纯化后的细胞核400×；
图4是本发明细胞核破裂染色体溢出1000×；
图5是本发明细胞染色体1000×。
五、具体实施方式
结合图1、图2、图3、图4、图5所示，这种人参培养细胞染色体分离方法如下，
首先进行人参悬浮细胞的培养：
MS液体培养基里附加0.5mg/L的NAA，0.5mg/L的6-BA，1mg/L的2.4-D 和30g/L蔗糖培养20天为一周期，每瓶50ml培养基接种2克细胞，以扩大种群，得到足够的量。
然后分离上述培养的人参培养细胞染色体，过程如下：
一、人参悬浮细胞预处理和酶解去除细胞壁细胞膜
选择生长周期里11-13天内颜色呈淡黄色的人参悬浮细胞，把细胞抽滤后，放在MS培养基里悬浮，自然沉降1-2分钟，除去细胞中的小的空核及白色絮状物质，挑出相对饱满的细胞用质量百分比为0.1%的秋水仙素处理16h，用MS培养基洗涤后称10克，放入100ml裂解液中，该裂解液含质量百分比为1%-2%的纤维素酶、质量百分比为0.5%-1%果胶酶、质量百分比为0.5%-1%半纤维素酶、0.4M-0.6M蔗糖、质量百分比为0.5%-1.5%柠檬酸钠、质量百分比为0.5-1%抗坏死血酸、质量百分比为0.1%-0.5%PVP 的GCW缓冲液（pH为3.8），35℃下50rpm的摇床上解离人参悬浮细胞的细胞壁和细胞膜12h。
二、人参悬浮细胞细胞核纯化
过滤：将步骤一得到的酶解液在10×g -20×g 离心3min，吸取上清液在300目附加两层薄棉纸的滤网上抽滤；
自然沉降：收集滤液在4℃冰箱中自然沉降5h，去中层滤液，得到上清；
蔗糖密度梯度离心：吸取上清液进行蔗糖密度梯度离心。蔗糖梯度设置为：最底层是质量百分比为40%的蔗糖溶液1ml，向上依次铺上质量百分比为35%、30%和25%的蔗糖溶液各1ml。将上清液置于最上面，500×g离心下30min-60min，大量细胞核都集中在质量百分比为30%蔗糖界面上，收集这个界面2000×g离心浓缩细胞核，低温保存。
三、人参悬浮细胞染色体纯化
低渗与溶膜：收集细胞核用0.75M 1，6己二醇破除核膜，将收集到的细胞核用75mmol/L氯化钾4℃低渗10min，1000rpm离心10min，沉淀悬于0.75mol/L 1,6-己二醇的GCW缓冲溶液（pH4.0）中，37℃水浴10min,接着冰上30min,再用7号针头10ml注射器推挤；
蔗糖密度梯度离心收集染色体：将染色体溶液进行蔗糖密度梯度离心，蔗糖梯度设置为：最底层是质量百分比为35%的蔗糖溶液1ml，向上依次铺上质量百分比为30%的蔗糖溶液1ml、质量百分比为25%的蔗糖溶液0.5ml。将染色体溶液置于最上面，500×g离心下60min，大量染色体都集中在质量百分比为25%蔗糖界面上，收集这个界面4000×g离心浓缩染色体，低温保存。
Claims (2)
1.一种人参培养细胞染色体分离方法，其特征在于：这种人参培养细胞染色体分离方法如下，
一、人参悬浮细胞预处理和酶解去除细胞壁细胞膜：
选择生长周期里11-13天内颜色呈淡黄色的人参悬浮细胞，把细胞抽滤后，放在MS培养基里悬浮，自然沉降1-2分钟，除去细胞中的小的空核及白色絮状物质，挑出相对饱满的细胞用质量百分比为0.1%秋水仙素处理16h，用MS培养基洗涤后称10克，放入100ml裂解液中，35℃下50rpm的摇床上解离人参悬浮细胞的细胞壁和细胞质膜12h；
二、人参悬浮细胞细胞核纯化：
过滤：将步骤一得到的酶解液在10×g -20×g 离心3min，吸取上清液在300目附加两层薄棉纸的滤网上抽滤；
自然沉降：收集滤液在4℃冰箱中自然沉降5h，去中层滤液，得到上清液；
蔗糖密度梯度离心：吸取上清液进行蔗糖密度梯度离心，蔗糖梯度设置为：最底层是质量百分比为40%的蔗糖溶液1ml，向上依次铺上质量百分比为35%、30%和25%的蔗糖溶液各1ml，将上清液置于最上面，500×g离心下30min-60min，大量细胞核都集中在质量百分比为30%蔗糖界面上，收集这个界面2000×g离心浓缩细胞核，低温保存；
三、人参悬浮细胞染色体纯化：
低渗与溶膜：收集细胞核用0.75M 1，6己二醇破除核膜，将收集到的细胞核用75mmol/L氯化钾4℃低渗10min，1000rpm离心10min，沉淀悬于0.75mol/L 1,6-己二醇的GCW缓冲溶液中，GCW缓冲溶液pH为4.0，37℃水浴10min,接着冰上30min,再用7号针头10ml注射器推挤；
蔗糖密度梯度离心收集染色体：将染色体溶液进行蔗糖密度梯度离心，蔗糖梯度设置为：最底层是质量百分比为35%的蔗糖溶液1ml，向上依次铺上质量百分比为30%的蔗糖溶液1ml、质量百分比为25%的蔗糖溶液0.5ml，将染色体溶液置于最上面，500×g离心下60min，大量染色体都集中在质量百分比为25%蔗糖界面上，收集这个界面4000×g离心浓缩染色体，低温保存。
2.根据权利要求1所述的人参培养细胞染色体分离方法，其特征在于：所述的裂解液含质量百分比为1%-2%的纤维素酶、质量百分比为0.5%-1%果胶酶、质量百分比为0.5%-1%半纤维素酶、0.4M-0.6M蔗糖、质量百分比为0.5%-1.5%柠檬酸钠、质量百分比为0.5-1%抗坏死血酸、质量百分比为0.1%-0.5%PVP的GCW缓冲液；所述的GCW缓冲液含磷酸二氢钾27mg/L、硝酸钾100mg/L、硫酸镁240mg/L、碘化钾0.2mg/L、硫酸铜0.05mg/L、氯化钙1500mg/L，GCW缓冲液的pH为3.8。
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