CN106318896A - 一种杉木原生质体的制备及纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种杉木原生质体制备及纯化方法。选取杉木组培苗最上部未分轮的叶片或幼嫩茎段;将叶片或茎段切断,放入酶解液中,抽真空,置于水平摇床上黑暗酶解2‑4h;用孔径70μm的细胞筛将酶解液过滤至离心管中,用原生质体清洗液清洗酶解后的叶片或茎段,用70μm的细胞筛进行过滤,滤液合并至同一离心管中,离心去上清;向沉淀中加入预冷的所述原生质体清洗液清洗原生质体,离心去上清后重复洗一次,收集的沉淀用原生质体重悬液重悬,得到纯化的杉木原生质体。本发明得到杉木叶片原生质体的产量为1.8×106个/g,活力为94%;杉木茎段原生质体的产量为8.9×105个/g,活力为86.5%,获得的原生质体产量大、活力高。
Description
技术领域
本发明属于植物生物技术领域,具体涉及一种杉木原生质体的制备及纯化方法。
背景技术
杉木(Cunninghamia lanceolata)为杉科杉木属乔木,是我国华南地区的重要速生用材树种之一。然而,杉木在遗传转化方面一直没有突破与进展。研究表明,原生质体由于没有细胞壁,可相对容易摄取外源遗传物质,是进行遗传转化的理想受体。
木本植物中,柑橘最先获得原生质体。目前,已有一些木本植物的原生质体分离及纯化获得成功,但绝大多数尚未建立系统、完整、成熟的原生质体分离及纯化技术体系。杉木组培苗叶片或茎段原生质体的分离方法目前尚未有见报道。
发明内容
为了解决上述问题,本发明提供一种杉木原生质体制备及纯化方法,其包括如下步骤:
1)选取杉木组培苗最上部未分轮的叶片或幼嫩茎段;将叶片或茎段切断,放入酶解液中,抽真空,置于水平摇床上黑暗酶解2-4h;
2)用孔径70μm的细胞筛将酶解液过滤至离心管中,用原生质体清洗液清洗酶解后的叶片或茎段,用70μm的细胞筛进行过滤,滤液合并至同一离心管中,离心去上清;向沉淀中加入预冷的所述原生质体清洗液清洗原生质体,离心去上清后再用预冷的所述原生质体清洗液重复洗一次,收集的沉淀用原生质体重悬液重悬,再用70μm细胞筛过滤重悬的沉淀,得到纯化的杉木原生质体。
其中,步骤1)将叶片或茎段优选切成0.5-1.5mm*0.5-1.5mm的小片或小块。
其中,摇床转速优选为100-180rpm。
其中,所述酶解液按如下方式制备:将1.5%纤维素酶,0.4%果胶酶,1%离析酶,0.5M甘露醇,20mM KCl溶于20mM MES,水浴10min,冷却后加入10mM CaCl2,0.1-0.2%BSA。
其中,所述叶片或茎段放入酶解液中抽真空(150mbar),时间为30-60min。
其中,优选酶解温度为25~27℃,优选的酶解时间为2h。
其中,所述原生质体清洗液优选为:150mM NaCl,120mM CaCl2,5mM KCl,2mM MES,pH 5.7。
其中,所述原生质体重悬液优选为:0.5M甘露醇,4mM MES,15mM MgCl2,pH 5.7。
本发明的有益效果是:(1)利用组培苗的叶片或茎段制备原生质体,不需对材料消毒而且材料容易获得;(2)针对杉木叶片的特性建立了相应的酶解体系和处理方法,获得的原生质体产量大、活力高;(3)纯化方法简单、易于操作且可减少细胞碎片等杂质,获得了较高纯度的原生质体;(4)本发明对木本植物提取原生质体具有一定的借鉴意义。
附图说明
图1A为50mm下杉木叶片分离得到的原生质体。
图1B为50mm下杉木叶片经FDA染色后的发绿色荧光的原生质体。
图1C为100mm下杉木叶片分离得到的原生质体。
图1D为100mm下杉木叶片经FDA染色后的发绿色荧光的原生质体。
图2A为50mm下杉木茎段分离得到的原生质体。
图2B为50mm下杉木茎段经FDA染色后的发绿色荧光的原生质体。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
实施例1
本发明涉及一种杉木原生质体的制备及纯化方法,所述方法包括以下步骤:
原生质体的制备
A、选取杉木组培苗最上部未分轮的叶片和幼嫩茎段;
B、用酶解液酶解步骤A中选取的叶片或茎段,抽真空40min,黑暗放入水平摇床上,所述的酶解液为0.5M甘露醇,20mM KCl,20mM MES,水浴10min,冷却后加入10mM CaCl2,0.2%BSA(茎段为0.1%BSA);酶组合及浓度为:1.5%纤维素酶R-10、0.4%果胶酶Y-23、1%离析酶R-10;所述酶解液的pH为5.6-5.8;
C、将步骤B酶解结束后的酶液经70um网筛过滤到离心管中,用3ml预冷的W5溶液清洗酶解后的叶片或茎段,用70um的网筛将酶解液过滤至同一离心管中,300g离心3min,吸去上清;所述预冷的W5溶液,溶质为终浓度150mM NaCl,120mM CaCl2,5mM KCl,2mM MES(pH5.8),置于4℃冰箱;
D、向步骤C中的沉淀再加入3ml预冷的W5洗液清洗原生质体,300g离心3min,移去上清后再用3ml预冷的W5溶液重复洗一次,收集的沉淀用MMG重悬;所述MMG溶液为如下终浓度的物质:0.5M甘露醇,4mM MES(pH 5.7),15mM MgCl2。
E、将步骤D中的细胞悬浮液再用70um网筛过滤,即得到纯化的杉木原生质体。
F、针对步骤B中对酶组合及浓度的筛选,本发明共设置了4个 不同的酶组合,均为将0.17~0.2g叶片或茎段横切放入含0.5M甘露醇的酶解液中,水平摇床上黑暗酶解3h;具体如下:
酶液浓度对原生质体产量和活性的影响:
在原生质体分离过程中,不同浓度的酶组合对原生质体产量和活性都有较大的影响。结果如表1所示,随着酶浓度的增加,原生质体的产量和活性均增加,当纤维素酶、离析酶浓度均为1%,果胶酶浓度增加到0.4%时,原生质体的产量和活性达到最高,之后随着酶浓度的增加,原生质体的产量和活性均降低,而且杂质增多。
表1不同酶组合、杉木不同组培苗材料对原生质体的影响
针对步骤B中的甘露醇浓度,本发明共设置了0.3、0.4、0.5、0.6mol/L共4个浓度的处理。结果表明,综合原生质体产量和活性来看,甘露醇浓度为0.5mol/L时,分离杉木叶片或茎段获得的原生质体最好。具体如下:
本发明设置了0.3、0.4、0.5、0.6mol/L共4个甘露醇浓度的处理,杉木叶片或茎段原生质体均在1.5%纤维素酶R-10+0.4%果胶酶Y-23+1%离析酶R-10的酶液组合下黑暗酶解3h。通过测定分离出原生质体的产量和活力,确定适宜的甘露醇浓度,见表2。
表2不同甘露醇浓度对原生质体的影响
甘露醇浓度对原生质体产量和活性的影响:
甘露醇在酶液中的主要作用是维持渗透压,当酶解液的渗透压与原生质体不能维持等渗时,原生质体会胀裂或者皱缩,适宜的渗透压是获得高产量的必要条件。甘露醇的浓度很大程度上决定了原生质体的产量和活力。
针对步骤B中对叶片(茎段)的不同处理,基于以上筛选出的最优酶组合及甘露醇浓度,酶解时间均为3h。本发明共设置了3个不同处理,即高渗处理(0.7mol/L甘露醇浸泡20-30min)、暗处理(将组培苗黑暗培养2周)和抽真空(150mbar)处理,其中暗处理和抽真空处理设置了不同的时间处理梯度,结果如表3,表明叶片放入酶液后抽真空40min对原生质体分离效果起到明显作用。
表3叶片不同处理对原生质体的影响
抽真空对原生质体产量和活性的影响:
在杉木原生质体分离过程中,由于杉木叶片表皮较厚,酶解液不容易渗入叶片进行细胞壁的酶解,而抽真空是为了使酶液能够充分渗入叶片中,更好、更快的获得原生质体。抽真空开始时,酶液中产生大量气泡,随着抽真空时间的增加,酶液中气泡逐渐减少,当抽真空40min时,酶液不再冒泡,获得的原生质体产量和活性较好;当继续增加抽真空时间,原生质体的产量和活性下降。
针对杉木组培苗不同部位的叶片,再基于步骤A、B中筛选出的最优结果,本发明将组培苗叶片分为上部和下部,其中上部叶片为组培苗最上部未分轮的叶片,其他为下部叶片,酶解时间均为3h,通过测定分离出的原生质体产量、活性及杂质情况,确定最终结果,具体见表4。
表4组培苗不同部位叶片对原生质体质量的影响
针对酶液中BSA浓度,本发明将BSA浓度设置为0.1%、0.2%、0.5%共3个浓度梯度,其他条件均为已筛选出的最优结果,酶解3h后观察原生质体的产量和活性,确定最优的BSA浓度,结果表明:杉木组培苗叶片在0.2%BSA中原生质体产量和活力最高;茎段在0.1%BSA中原生质体产量和活力较高,具体见表5、表6。
表5不同浓度BSA对杉木幼嫩叶片原生质体的影响
表6不同浓度BSA对杉木茎段原生质体的影响
针对步骤B中的酶解时间,本发明共设置了5个酶解时间的处理。结果表明,酶解2h获得的杉木原生质体的产量和活力最高。具体如下:
酶解时间的选择:
本发明设置了1、2、3、4、5h共5个酶解时间。杉木组培苗叶片(茎段)原生质体均在甘露醇浓度0.5M、BSA浓度为0.5%时,1.5%纤维素酶R-10+0.4%果胶酶Y-23+1%离析酶R-10的酶液下进行酶解。通过测定原生质体产量和活性,确定最佳酶解时间。
酶解时间对原生质体的影响:
酶解时间是影响原生质体产量和活性的重要因素之一(表7)。实验结果表明,在酶解前期,原生质体的产量随着酶解时间的增加而逐渐升高,在2h-3h达到最高;超过3h后,原生质体产量随着酶解时间的增加而降低,同时细胞碎片逐渐增多。但酶解3h原生质体的活力比酶解2h的低,因此综合考虑,2h为分离杉木叶片或茎段原生质体的最佳时间。
表7酶解时间对杉木组培苗叶片原生质体的影响
原生质体的纯化
利用上述选择的最优分离体系充分酶解材料后酶解后,酶液用70μm网筛过滤至离心管中,用3ml预冷的W5溶液清洗酶解后的叶片或茎段,用70μm的网筛将酶解液过滤至同一离心管中,300g离心3min,吸去上清;向沉淀中加入3ml预冷的W5洗液清洗原生质体,300g离心3min,移去上清后再用3ml预冷的W5溶液重复洗一次,收集的沉淀用MMG重悬,再用70μm网筛过滤重悬的沉淀,得到纯化的杉木原生质体。
原生质体的计数
用MMG稀释原生质体,取10μl原生质体悬浮液滴加在0.1mm血球计数板上。当原生质体充满计数室后,用荧光显微镜在明场下观察,计算4个大格及中央大格(共5个大格)内的原生质体个数,然后按公式计算原生质体数,每个样品5个重复,最后计算出每克鲜重材料游离得到的原生质体产量(个/g FW)。
原生质体的活力检测
原生质体活力测定用0.01%二乙酸荧光素(FDA)染色,用荧光显微镜统计法绿色荧光的原生质体数和原生质体总数,选取5个有代表性的视野进行统计,取平均值。
原生质体活力=(发绿色荧光的原生质体数/原生质体总数)×100%
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明技术原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种杉木原生质体制备及纯化方法,其特征在于,其包括如下步骤:
1)选取杉木组培苗最上部未分轮的叶片和/或幼嫩茎段;将叶片或茎段切断,放入酶解液中,抽真空,置于水平摇床上黑暗酶解2-4h;
2)用孔径70μm的细胞筛将酶解液过滤至离心管中,用原生质体清洗液清洗酶解后的叶片和/或茎段,用70μm的细胞筛进行过滤,滤液合并至同一离心管中,离心去上清;向沉淀中加入预冷的所述原生质体清洗液清洗原生质体,离心去上清后再用预冷的所述原生质体清洗液重复洗一次,收集的沉淀用原生质体重悬液重悬,再用70μm细胞筛过滤重悬的沉淀,得到纯化的杉木原生质体。
2.根据权利要求1所述的杉木原生质体的制备及纯化方法,其特征在于,步骤1)将叶片或茎段切成0.5-1.5mm*0.5-1.5mm的小片或小块。
3.根据权利要求1所述的杉木原生质体的制备及纯化方法,其特征在于,摇床转速为100-180rpm。
4.根据权利要求1所述的杉木原生质体的制备及纯化方法,其特征在于:所述酶解液按如下方式制备:将1.5%纤维素酶,0.4%果胶酶,1%离析酶,0.5M甘露醇,20mM KCl溶于20mM MES,水浴10min,冷却后加入10mM CaCl2,0.1-0.2%BSA。
5.根据权利要求1所述的杉木原生质体的制备及纯化方法,其特征在于,所述叶片或茎段放入酶解液中抽真空,时间为30-60min。
6.根据权利要求5所述的杉木原生质体的制备及纯化方法,其特征在于,酶解温度为25~27℃,酶解时间为2h。
7.根据权利要求1所述的杉木原生质体的制备及纯化方法,其特征在于:所述原生质体清洗液为:150mM NaCl,120mM CaCl2,5mM KCl,2mM MES,pH 5.7。
8.根据权利要求1所述的杉木原生质体的制备及纯化方法,其特征在于:所述原生质体重悬液为:0.5M甘露醇,4mM MES,15mM MgCl2,pH 5.7。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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PB01 | Publication | ||
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C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
CB03 | Change of inventor or designer information | ||
CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Lin Erpei Inventor after: Tang Jiani Inventor after: Lou Xiongzhen Inventor after: Huang Huahong Inventor after: Tong Zaikang Inventor before: Tang Jiani Inventor before: Lin Erpei Inventor before: Lou Xiongzhen Inventor before: Huang Huahong Inventor before: Tong Zaikang |
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GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |