CN108949665B - 百合花瓣原生质体的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了百合花瓣原生质体的制备方法，包括步骤：(1)取带有未开放花蕾的百合植株，进行暗处理；(2)取植株的内轮花瓣，清洗、消毒；(3)向花瓣材料中加入酶解溶液，于暗处真空抽提，然后暗处静置酶解数小时，得到含有花瓣原生质体的酶解液；(4)所得酶解液用W5溶液稀释，网筛过滤，所得滤液经低速离心，弃上清，用W5溶液重悬原生质体沉淀，低速离心，弃上清，重复洗一次；用MMG溶液重悬原生质体沉淀。本发明克服了百合花瓣原生质体分离效率低的问题，有效建立了百合花瓣原生质体制备的方法。

Description

百合花瓣原生质体的制备方法
技术领域
本发明涉及植物原生质体制备技术，具体地说，涉及百合花瓣原生质体的制备方法。
背景技术
百合(Lilium spp.)为百合科百合属的多年生球根花卉，是世界著名的观赏花卉。原生质体指的是去除细胞壁的由质膜包被的裸露细胞。原生质体具有细胞全能性，可再生成完整的植株。原生质体的分离作为基因工程的一项基础技术手段，对于百合相关基因功能研究，遗传育种等具有重要意义。
百合作为高度杂合的单子叶植物，原生质体分离培养的难度较大，目前国内外有关百合原生质体制备的研究报道叶较少。Horita通过分离东方百合和铁炮百合的原生质体，以看护培养的方式于2002年首次成功培育初百合体细胞杂交再生植株(Horita M，Morohashi H，Komai F.Regeneration of Flowering Plants From Difficile LilyProtoplasts by Means of a Nurse Culture.Planta[J]，2002，5(215)：880-884)。张宁对岷江百合原生质体制备当中的酶浓度、酶解时间、离心方式、细胞筛目数等参数进行了细致的研究(张宁.百合原生质体分离影响因素的研究[C].园艺学报，2010，37：2188)。在此基础上，近几年对于东方百合、野生百合、食用百合等的原生质体分离与纯化技术都有一定的报道，但其所用材料多集中于愈伤组织或悬浮细胞，对于直接取材于成熟植株的研究较少，直接取材于花瓣的报道更为罕见。
发明内容
本发明的目的是提供一种简单、高效的百合花瓣原生质体的制备方法。
为了实现本发明目的，本发明提供一种百合花瓣原生质体的制备方法，包括以下步骤：
(1)取带有未开放花蕾的百合植株，进行暗处理；
(2)取步骤(1)经暗处理后植株的内轮花瓣，进行清洗、消毒；
(3)向消毒后内轮花瓣材料中加入酶解溶液，于暗处真空抽提，然后于暗处静置酶解数小时，得到含有花瓣原生质体的酶解液；
(4)步骤(3)所得酶解液用W5溶液稀释，然后用网筛过滤，所得滤液经低速离心，弃上清，用W5溶液重悬原生质体沉淀，低速离心，弃上清(在不碰触原生质体沉淀的情况下尽量去除W5溶液)，再用W5溶液重悬原生质体沉淀，低速离心，用MMG溶液重悬原生质体沉淀；
其中，步骤(3)中酶解溶液的活性成分为纤维素酶和离析酶，二者浓度比为1-2：0.2-1，优选2:0.5。
优选地，步骤(1)中黑暗处理24-72h，优选72h。
前述的方法，步骤(2)中所取花瓣为花蕾期、初花期或盛花期的花瓣，优选初花期花瓣。
优选地，步骤(2)中花瓣消毒的具体方法为：用肥皂水浸泡后流水冲洗，然后用70-75％酒精浸泡5min，无菌水冲洗干净，吸干水分。
优选地，步骤(3)中酶解溶液的配方为：1-2％纤维素酶R-10、0.2-1％离析酶R-10、1-2％纤维素酶R-10、0.2-1％离析酶R-10、15-20mmol/L氯化钾、15-20mmol/L 2-(N-吗啉代)乙烷磺酸、15-10mmol/L氯化钙、0.4-0.6mol/L甘露醇和0.1％牛血清蛋白，pH5.7-5.8。以水配制上述酶解溶液后，经0.45μm微孔过滤膜过滤灭菌后使用。
更优选地，酶解溶液的配方为：2％纤维素酶R-10、0.5％离析酶R-10、20mmol/L氯化钾、20mmol/L 2-(N-吗啉代)乙烷磺酸、10mmol/L氯化钙、0.4mol/L甘露醇(作为渗透压调节剂)和0.1％牛血清蛋白，pH5.7-5.8。
优选地，步骤(3)中花瓣酶解时间为8-12h，优选10h。
本发明中W5溶液的配方为：2mmol/L 2-(N-吗啉代)乙烷磺酸、154mmol/L氯化钠、125mmol/L氯化钙、5mmol/L氯化钾，pH5.7-5.8。
MMG溶液的配方为：4mmol/L 2-(N-吗啉代)乙烷磺酸、0.4mol/L甘露醇、15mmol/L氯化镁，pH5.7-5.8。
优选地，步骤(4)中所述网筛为200-250目的尼龙网筛。
优选地，步骤(4)中低速离心条件为：4℃，500-700r/min离心5-6min。
本发明所述百合品种包括但不限于东方百合杂种系‘索邦’(Lilium‘Sorbonne’)。
在本发明的一个具体实施方式中，所述方法包括以下步骤：
1)选取生长状态良好无病虫害、带有未开放花蕾的百合植株，瓶插，室温下暗处理24-72h；
2)取步骤1)经暗处理后植株的内轮花瓣，用清水冲洗，消毒；
3)将消毒后内轮花瓣材料切割成约2-3mm宽的条状，称取1g条状材料浸入10mL酶解溶液中，用真空泵于黑暗处抽提30min，然后在室温，黑暗条件下静置酶解8-12h；
4)步骤3)所得酶解液用等体积的W5溶液稀释，得稀释液；用W5溶液润湿200目的尼龙网筛后，用其过滤上述稀释液，所得滤液以4℃，500-700r/min离心5-6min，弃上清，用10mL预冷的W5溶液重悬原生质体沉淀，500-700r/min离心5-6min，弃上清，再用10mL预冷的W5溶液重悬原生质体沉淀，500-700r/min离心5-6min，最后用MMG溶液重悬原生质体沉淀。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明通过对百合花瓣黑暗预处理，利用纤维素酶、离析酶、不同酶解时间和取材时期等的组合分离纯化百合的原生质体，有效克服了百合原生质体分离效率低、周期长的问题，仅需72h左右即可获得大量有活力的原生质体。建立了百合原生质体制备体系，与对照组相比，可使花瓣原生质体产量提高114％，并保证活力在70％以上。在此基础上，可进行原生质体培养、瞬时转化、细胞融合等操作，对百合基因功能的研究和遗传性状的改良具有重要意义。
本发明以东方百合‘索邦’的花瓣为示例材料，分离纯化原生质体，建立起高效的百合花瓣原生质体制备体系，旨在为百合瞬时转化体系建立和改良遗传性状、分子育种等研究领域提供技术支持。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中花瓣原生质体分离纯化取材部位。
图2为本发明较佳实施例中分离后的花瓣原生质体。
图3为本发明较佳实施例中荧光显微镜下经FDA染色的百合‘索邦’花瓣原生质体。
图4为本发明较佳实施例中黑暗处理后百合花瓣原生质体产量变化。
图5为本发明较佳实施例中百合花瓣原生质体产量与各因素关系。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
以下实施例中使用的酶解溶液的制备如下：纤维素酶R-10、离析酶R-10、20mmol/L氯化钾、20mmol/L 2-(N-吗啉代)乙烷磺酸、10mmol/L氯化钙和0.1％牛血清蛋白，并以0.4mol/L的甘露醇为渗透压调节剂，pH调制5.7，0.45μm微孔过滤膜过滤灭菌后使用。
原生质体漂洗液W5溶液配方为：2mmol/L 2-(N-吗啉代)乙烷磺酸、154mmol/L氯化钠、125mmol/L氯化钙、5mmol/L氯化钾，pH5.7。
MMG重悬液配方为：4mmol/L 2-(N-吗啉代)乙烷磺酸、0.4mol/L甘露醇、15mmol/L氯化镁，pH5.7。
实施例1百合花瓣原生质体的制备方法
本实施例提供百合花瓣原生质体分离与纯化的方法，所述方法包括以下步骤：
1、黑暗预处理：选取状态良好无病虫害的东方百合‘索邦’花蕾(未开放)，剪下并瓶插，室温下进行黑暗处理。本实施例中黑暗处理时间为72h。
2、材料处理：将步骤1所得初开期内轮花被片(即内轮花瓣，见图1)用肥皂水浸泡后流水冲洗，75％酒精浸泡5min，无菌水冲洗干净，吸干水分，待用。
3、酶解处理：将步骤2中所得材料用消毒后的刀片切割成2mm宽的条状，称取1g条，用镊子将其置入10ml酶解溶液中。用真空泵于黑暗中抽提30min。在室温下，黑暗条件中静置酶解数小时。当酶解液变色时轻轻摇晃培养皿促使原生质体释放出来。本实施例酶解溶液中两种酶浓度为：2％纤维素酶R-10、0.5％离析酶R-10，酶解时间为10h。
4、纯化处理：将步骤3所得酶解液用等体积的W5溶液稀释。用W5溶液润湿尼龙网筛，用200目网筛过滤含有花瓣原生质体的酶解液。滤液以4℃，700r/min低速离心6min。弃上清，用10ml冰上预冷的W5溶液轻柔重悬原生质体。将重悬液700r/min低速离心6min。在不碰触原生质体沉淀的情况下尽量去除W5溶液，重复洗一次。以MMG溶液重悬沉淀原生质体。显微镜下观察计数(图2)。
5、原生质体产量鉴定：原生质体产量测定采用简易计数法，测定物镜视野的面积；然后确定合适的悬浮液滴加体积(标准为细胞单层排列，均匀布满盖玻片，边缘没有溢出的细胞及液体，且没有液泡)，用移液枪吸取确定好体积大的悬浮液，重复6次，并数视野下的原生质体个数。最后根据公式计算原生质体的密度。
6、原生质体密度(个/g)＝(1000/合适的滴加悬浮液体积)×(24×24/视野面积)×每个视野下原生质体个数平均值/酶解材料质量
其中，24×24为所用盖玻片的大小，即(24×24)mm2。
7、原生质体活力测定：采用荧光素双醋酸酸(FDA)染色法。将FDA溶于丙酮中，配制成5mg/mL溶液，在4℃保存，取纯化后的原生质体0.5mL，加入12μL FDA溶液，静止5-10min后在荧光显微镜下观察。此时有活力原生质体显黄绿色荧光(图3)，选取5个有代表性视野统计，取平均值。
8、原生质体活力＝(暗视野下发荧光原生质体数/明视野下原生质体数)×100％
实施例2黑暗处理对百合花瓣原生质体制备的影响
针对实施例1方法中的黑暗处理时间，本发明设置5个时间梯度：0、24、36、48、72h。将经过黑暗处理后的材料按实施例1方法进行酶解和纯化。结果表明，花瓣宜黑暗处理的时间为72h(表1)。
表1黑暗处理后百合原生质体产量与活力
Figure BDA0001728136870000041
Figure BDA0001728136870000051
注：不含相同小写字母说明在P＜0.05水平上差异显著。
如表1所示，黑暗处理对百合的花瓣原生质体产量有极显著的影响，随着处理时间的延长，原生质体的产量显著上升(图4)，花瓣在处理72h后原生质体产量达到最大4.82×105个/g，此时，原生质体活力也达到最大值76.99％。黑暗处理最多可使花瓣原生质体产量提升114％左右，综合考虑原生质体产量与活力，百合花瓣原生质体分离的最佳黑暗预处理时长为72h。
实施例3酶浓度配比、酶解时间和取材时期对百合花瓣原生质体制备的影响
针对步骤2和4中取材时期、酶浓度配比和酶解时间，本发明设置4因素3水平的L9(34)正交试验(表2)。纤维素酶浓度水平为1％、1.5％、2％；离析酶浓度设置为0.2％、0.5％、1％；花瓣酶解时间梯度为8h、10h、12h；花瓣取时期分别为花蕾期、初开期、盛开期的花瓣(图1)。根据各组试验条件分别进行酶解，并计数原生质体产量与活力。
由表2的R值可知，四个因素对花瓣原生质体产量的影响顺序为：纤维素酶浓度＞取材时期＞酶解时间＞离析酶浓度。其中，纤维素酶浓度有极显著的影响，2％纤维素酶的产量极显著高于1％纤维素酶，但与1.5％的纤维素酶所得产量无明显差异。此外，取材时期对原生质体产量也有显著影响，初花期的产量要显著高于盛花期，极显著高于蕾期。其他两个因素对原生质体产量影响不显著。根据图5所示结果，花瓣原生质体分离正交试验最佳的组合为A3B2C2D2，即2％纤维素酶+0.5％离析酶+酶解时间10h+初开期的花被片(表2)。
表2 L9(34)百合花瓣原生质体正交实验结果
Figure BDA0001728136870000052
Figure BDA0001728136870000061
注：不含相同小写字母说明在P＜0.05水平上差异显著，不含相同大写字母说明在P＜0.01水平上差异显著。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (1)

1.百合花瓣原生质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)黑暗预处理：选取状态良好无病虫害的未开放的东方百合‘索邦’花蕾，剪下并瓶插，室温下进行黑暗处理72h；
(2)材料处理：将步骤(1)所得初开期内轮花被片用肥皂水浸泡后流水冲洗，75％酒精浸泡5min，无菌水冲洗干净，吸干水分，待用；
(3)酶解处理：将步骤(2)中所得材料用消毒后的刀片切割成2mm宽的条状，称取1g条，用镊子将其置入10ml酶解溶液中；用真空泵于黑暗中抽提30min；在室温下，黑暗条件中静置酶解10h；当酶解液变色时轻轻摇晃培养皿促使原生质体释放出来；
其中，酶解溶液的制备如下：2％纤维素酶R-10、0.5％离析酶R-10、20mmol/L氯化钾、20mmol/L 2-(N-吗啉代)乙烷磺酸、10mmol/L氯化钙和0.1％牛血清蛋白，并以0.4mol/L的甘露醇为渗透压调节剂，pH调至5.7，0.45μm微孔过滤膜过滤灭菌后使用；
(4)纯化处理：将步骤(3)所得酶解液用等体积的W5溶液稀释；用W5溶液润湿尼龙网筛，用200目网筛过滤含有花瓣原生质体的酶解液；滤液以4℃，700r/min低速离心6min；弃上清，用10ml冰上预冷的W5溶液轻柔重悬原生质体；将重悬液700r/min低速离心6min；在不碰触原生质体沉淀的情况下尽量去除W5溶液，重复洗一次；以MMG溶液重悬沉淀原生质体；显微镜下观察计数；
其中，W5溶液的配方为：2mmol/L 2-(N-吗啉代)乙烷磺酸、154mmol/L氯化钠、125mmol/L氯化钙、5mmol/L氯化钾，pH5.7；
MMG溶液的配方为：4mmol/L 2-(N-吗啉代)乙烷磺酸、0.4mol/L甘露醇、15mmol/L氯化镁，pH5.7。
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百合离体授粉与原生质体培养的研究;王晶;《中国学位论文全文数据库》;20070916;全文 *

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