CN105132354B - 一种芋根江蓠原生质体的提取方法 - Google Patents
一种芋根江蓠原生质体的提取方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了芋根江蓠原生质体制备的方法，其主要是研究了不同工具酶分解海藻组织的效果，建立了芋根江蓠原生质体制备方法，游离出体细胞原生质体。本发明的优点是成功获得了芋根江蓠的原生质，可以应用于遗传转化、体细胞杂交、再生植株诱导、体细胞工程育苗等领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种藻类细胞工程学方法，具体地说是芋根江蓠原生质体制备的方法。
背景技术
原生质体是植物细胞除去细胞壁后裸露的细胞，它可以在人工控制的条件下进行大量快速繁殖，也可以诱导其融合，形成杂种细胞，为体细胞杂交提供实验材料。原生质体的获取一般通过机械破裂法或化学降解的方法对细胞进行处理，将细胞壁去除或溶解，留下有生命力的，被质膜包围的部分。对于原生质体的研究可以追溯到1892年，Klercker将水生植物水剑叶的叶片放到高渗溶液中进行培养，但是在如何制备游离的具有生命活力的原生质体直到1960年才获得突破，诺丁汉大学利用从细菌中分离得到的纤维素酶处理番茄根尖，分离出大量有活力的原生质体，为真正意义上的原生质体制备进行了开创性的研究。
完整的生物质制备包括材料的选择和预处理，组织分解和原生质体初步游离以及原生质体的纯化和活力检测。选择适宜的材料是成功分离原生质体的基础；酶解或机械处理前对于材料的预处理可以提高破壁效率并减少原生质的损伤；合理的酶制剂的选择以及浓度的调节、渗透压调节剂的选择都是提高原生质产量及活性的关键。虽然近年来对于原生质的培养技术取得了迅速的发展，但是还存在原生质体活力不高，培养周期长等问题。
芋根江蓠具有生长快、耐高温的特性，是南方潜在的养殖品种之一。目前，江蓠主要通过营养生殖的方式进行繁殖。苗种的繁育受温度、海水盐度等环境因子的影响极大，极具不稳定性。原生质体具有全能性，在人工控制的条件下可大量快速繁殖，可以缓解苗种的繁育压力。此外，江蓠的细胞壁中含有较厚的胶质物，无法直接进行细胞融合、细胞杂交等遗传操作，利用现有技术中常规的的酶溶解手段获得的原生质体往往活性较低，产量也不理想。
因此对芋根江蓠采用原生质体培养的方法进行改良具有现实的意义，目前国内外公开的资料中未见有专门针对芋根江蓠原生质体制备方面的研究。
CN103114071A公开了一种快速制备坛紫菜原生质体的方法，以坛紫菜藻体为材料，通过控制盐度、光照、温度等环境因素，降低光合作用，加强呼吸作用，阻止其正常生长，迫使其自身营养细胞产生纤维素酶和果胶酶降解细胞壁，细胞壁解离后释放具有生殖力的原生质体。
CN103966154A公开了一种制备长心卡帕藻原生质体的方法，用卡帕藻饲养篮子鱼，然后以其内脏为原料制备混合酶液，进而利用该混合酶液降解长心卡帕藻的细胞壁及其细胞间质组分，从而获取游离的原生质体。
发明内容
本发明的目的是提供芋根江蓠原生质体制备的方法，它能够解决芋根江蓠苗种保种和繁育的问题，可用于生产性育苗。同时，也可将其作为遗传转化研究的实验材料。本发明根据芋根江蓠细胞壁较薄，而胶质较多的特点，调整了藻类分离原生质体的方法，和常规方法相比，增加了利用稀释的酶混合液长时间处理藻体的步骤，经过反复试验，选择了海螺酶和琼脂酶作为预处理的处理剂，本发明人发现，芋根江蓠藻体在稀释过的酶预处理液中，细胞壁缓慢被溶解，胶质物明显减少并出现一定程度的质壁分离，且芋根江蓠的大部分营养细胞转化为游离的生物质体，有利于提高生物质体的产量，同时原生质体的直径没有出现明显的变化，提高了原生质体的质量。
本发明还创造性的提出将经过混合酶预处理液处理过的芋根江蓠在包含有L-蛋氨酸的甘露醇海水溶液中处理，进一步促进原生质体的生长，同时促进细胞质壁分离，提升原生质体的产量和质量；最后在酶解液中进行酶解，可以获得质量和产量都较好的芋根江蓠原生质体。
本发明提供一种芋根江蓠原生质体制备方法，包括以下步骤：
1)将收集到的野生芋根江蓠洗净，去除杂质生物；
2)将清洗过的芋根江蓠粉碎成0.1-1mm的小块；
3)切成小块的芋根江蓠加入混合酶预处理液，在黑暗中酶解，酶解温度为25-30℃，时间为10-15h，其中加入的混合酶预处理液中含有0.1-0.3wt％的海螺酶、0.2-0.3wt％的琼胶酶、5-10wt％的甘露醇，所述预处理液是以无菌海水作为溶液；
4)将经过预处理液处理的芋根江蓠小块放在包含10-15wt％的甘露醇和0.01-0.02wt％的L-蛋氨酸的海水溶液中处理2-3h，进行细胞的质壁分离；
5)将上一步得到的芋根江蓠放入酶解液中浸泡1-3h，酶解温度为30-35℃，得到酶解组织，其中酶解液中含有1-1.5wt％的纤维素酶、2-3wt％的琼胶酶、10-15wt％的山梨醇、3-5wt％的NaCl；
6)将步骤5)得到的酶解组织用200目筛绢过滤细胞混合液，离心收集原生质体。
所述混合酶预处理液中的pH值是6-6.5；所述酶解液中的pH值是5.5-5.8。
所述酶解液酶解芋根江蓠组织为黑暗酶解，温度35℃，分解时间为3个小时。
所述原生质体的产率大于90％，优选大于95％；原生质体直径达到3-10微米，优选直径达到5-10微米。
所述原生质体的产量可以达到3-8×105个原生质体/g鲜藻。
步骤1)中所述清洗是用医用酒精清洗，然后用无菌海水反复冲洗3次，再放在无菌海水中浸泡1-2h。
步骤5)中的醇解液中优选还可以加入吗啉乙基磺酸作为pH值缓冲剂，浓度优选为5-10g/L；加入CaCl2、聚乙烯吡咯烷酮或葡聚糖硫酸钾提高细胞膜的稳定性，浓度优选为1-3g./L。
本发明利用体细胞原生质体直接进行育苗，无须培育芋根江蓠生殖成熟的藻体；体细胞原生质体再生细胞壁转化为体细胞，无须生殖细胞发育的过程，因而育苗周期短。
相对于有性生殖育苗技术，本发明的优点是无须生殖细胞的有性生殖过程，缩短了育苗周期；并且苗种繁育效率高，适合于大规模育苗生产。
本发明可获得不带有细胞壁的体细胞原生质体，因此，可以直接应用于电转化、PEG融合、体细胞杂交等细胞工程学和转基因等研究领域。
原生质体鉴定方法：
采用0.1％的荧光增白剂染色法对所得细胞进行了鉴定，对所得样品进行染色5min，于荧光显微镜下观察，激发光波长为370nm紫外光。有壁细胞会有蓝绿色荧光显示纤维素存在(如图1所示)；原生质体无蓝绿色荧光，其由于叶绿体的存在而发红色荧光，显示无纤维素的存在(如图2所示)。
采用0.5％Evans Blue染色法对原生质体活力染色测定，在玻璃片上滴一滴所得样品，再滴一滴染液，于显微镜下进行观察计数，成活的原生质体呈现亮黄色，死细胞呈深蓝色，如图3所示。
附图说明
图1是未溶解细胞壁的有壁细胞荧光检测图(×20倍)
图2是溶解了细胞壁的原生质体荧光检测图(×20倍)
图3是具有生物活性和不具有生物活性的原生质体对比，其中左侧指示死细胞；.右侧指示活细胞
具体实施方式
下面通过实施例进一步说明本发明
本实施例实验材料为芋根江蓠(Gracilaria blodgettii)。
1.原生质体分离方法
取2克左右芋根江蓠，清洗后将其剪切成成0.1mm左右的小块；切成小块的芋根江蓠加入混合酶预处理液，在黑暗中酶解，酶解温度为25℃，时间为10h，其中加入的混合酶预处理液中含有0.1-0.3wt％的海螺酶、0.2-0.3wt％的琼胶酶、10wt％的甘露醇，所述预处理液是以无菌海水作为溶液；
再将经过预处理液处理的芋根江蓠放在包含15wt％的甘露醇和0.02wt％的L-蛋氨酸的海水溶液中处理2h；将上一步得到的芋根江蓠放入酶解液中浸泡3h，酶解温度为25℃，酶解液中含有1wt％的纤维素酶、2wt％的琼胶酶、15wt％的山梨醇、5wt％的NaCl；
用200目筛绢过滤细胞混合液，除去未消化的细胞、细胞团、碎片；取上清液离心，800rpm离心10min，使单细胞(原生质体)下沉，细胞碎片留在上清液中，弃去上清液，用消毒海水配置1M葡萄糖反复冲洗、离心、弃上清液等过程2-3次，即获得较为纯净的芋根江蓠体细胞原生质体悬液。
对比例1
对比例1采用和实施例基本相同的方法，仅缺少采用混合酶预处理的步骤。取2克左右芋根江蓠，清洗后将其剪切成成0.1mm左右的小块；再将芋根江蓠放在包含15wt％的甘露醇和0.02wt％的L-蛋氨酸的海水溶液中处理2h；将上一步得到的芋根江蓠放入酶解液中浸泡3h，酶解温度为25℃，酶解液中含有1wt％的纤维素酶、2wt％的琼胶酶、15wt％的山梨醇、5wt％的NaCl；
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用血球计数板统计原生质体数量，统计其产量，见表1。
表1不同方法原生质体产量
从表1可以明显看出，采用了稀释的混合酶预处理剂处理后的芋根江蓠有更高的原生质体产量，取得了意料不到的技术效果。
Claims (4)
1.一种芋根江蓠原生质体制备方法，包括以下步骤：
1)将收集到的野生芋根江蓠洗净，去除杂质生物；
2)将清洗过的芋根江蓠粉碎成0.1-1mm的小块；
3)切成小块的芋根江蓠加入混合酶预处理液，在黑暗中酶解，酶解温度为25-30℃，时间为10-15h，其中加入的混合酶预处理液中含有0.1-0.3wt％的海螺酶、0.2-0.3wt％的琼胶酶、5-10wt％的甘露醇，所述预处理液是以无菌海水作为溶液；
4)将经过预处理液处理的芋根江蓠小块放在包含10-15wt％的甘露醇和0.01-0.02wt％的L-蛋氨酸的海水溶液中处理2-3h，进行细胞的质壁分离；
5)将上一步得到的芋根江蓠放入酶解液中浸泡1-3h，酶解温度为30-35℃，得到酶解组织，其中酶解液中含有1-1.5wt％的纤维素酶、2-3wt％的琼胶酶、10-15wt％的山梨醇、3-5wt％的NaCl；
6)将步骤5)得到的酶解组织用200目筛绢过滤细胞混合液，离心收集原生质体；
其中步骤5)中所述酶解液中加入吗啉乙基磺酸作为pH值缓冲剂；加入CaCl2、聚乙烯吡咯烷酮或葡聚糖硫酸钾提高细胞膜的稳定性。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤3)混合酶预处理液的pH值是6-6.5；步骤5)所述酶解液的pH值是5.5-5.8。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤5)酶解液酶解芋根江蓠组织为黑暗酶解，温度35℃，分解时间为3个小时。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤1)中所述清洗是用医用酒精清洗，然后用无菌海水反复冲洗3次，再放在无菌海水中浸泡1-2h。
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