CN115104524B - 体细胞杂交繁殖不育系和生产杂交种的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物育种领域，具体公开一种通过体细胞杂交繁殖不育系和生产杂交种的方法。本发明用体细胞/菌体浆液取代花粉，在制种体细胞杂交剂的介导下，给母本/不育系授精，以繁殖不育系，生产杂交种，在两系不育系自交繁殖中因雄性不育而面临失败时，将不育系自身茎叶打浆，加入制种体细胞杂交剂给柱头授精而挽救繁殖田。其优势在于，可以将不育系繁殖和制种风险降低至零，制种单产提高30％以上，从而确保粮食安全。

Description

体细胞杂交繁殖不育系和生产杂交种的方法

技术领域

本发明属于植物育种领域，具体涉及一种植物杂交种的生产方法，更具体涉及两系或者三系法制种中的不育系的繁殖和杂交种的生产。

背景技术

目前繁殖不育系和生产杂交种的技术主要有：第一种是三系法，包括不育系的繁殖，即雄性不育系×雄性不育保持系杂交实现雄性不育系的繁殖；制种(即农民种植用杂交种生产)，是将雄性不育系×雄性不育恢复系杂交获得杂交种(F₁)。第二种为两系法，包括不育系的繁殖，其是温度敏感雄性不育系在其可育温度下(如水稻温敏不育系一般在23℃条件下可育)自交繁殖实现温度敏感雄性不育系的繁殖；制种(即农民种植用杂交种生产)，是将温度敏感雄性不育系×雄性不育恢复系杂交获得杂交种(F1)。第三种是人工去雄法，包括去雄，即制种母本在散粉前手工去雄；杂交，即人工辅助下用间种父本与母本杂交，得到杂交种。

上述现有技术存在的问题是：一是，由于只能从与母本同为一个种的品种间选择，即品种间杂交，现有方法的保持系、恢复系(或父本)选择范围很窄，杂交种的优势受到极大限制。但通常情况下，亲缘关系越远，杂种优势越强。二是，由于制种和三系不育系繁殖要求父母本开花期同步，否则会导致制种(或三系不育系繁殖)产量大幅度降低甚至失收。因为父母本的生育进程对气候(主要是温度和光长)的敏感度往往有差异，虽然父母本的播差期经精确计算确定，花期不遇的现象仍时常发生。三是，由于父母本的授受粉均在自然条件下进行，如授粉期遇连阴雨，往往大幅度降低杂交结实率，导致严重减产，甚至绝收。四是，制种和三系不育系繁殖条件下，制种田面积的20-30％是父本，而父本只提供花粉，不繁殖不育系，生产杂交种子，因而降低了制种产量。这些问题大幅度提高了杂交种子成本，更严重限制了杂交种的产量。此外，对于繁殖两系不育系时，常常因生态条件变化，如温度升高或降低而导致雄性不育而减产甚至失收。

虽然早在1972年，植物体细胞杂交就已成功，然而由于体细胞杂交在室内进行，受体数量受到极大限制，更重要的是，由于离开了母体，导致杂交阳性率太低，供后代选择优良个体的群体太小，育成优良品种的概率太低，因而至今鲜有大面积应用于生产的体细胞杂交育成品种。而在体体细胞杂交则可弥补上述居多不足之处。然而在本发明前，未见有关在体体细胞杂交成功的报道。因而目前有性杂交仍然是最常用的植物改良方法。

然而，由于有性杂交不仅要求父母本均为显花植物，而且需要父本的精子。这就不仅使数量及其巨大的微生物不能用于授精，而由于精子获取要么十分困难，要么价格昂贵，大量以动物为父本的杂交受到极大限制，而微生物和动物具有植物所没有又亟需的数量巨大的极其优良的性状。因而，体细胞杂交具有极其重要的植物改良价值。然而，同样未见植物和微生物，植物和动物体细胞杂交成功的报道。

体细胞杂交之所以难以成功，对于植物来说主要是因为植物性器官和体细胞表面存在生殖隔离物质—识别蛋白，即糖蛋白，它就像一把锁，把供体的遗传物质拒之门外。

然而现代科学研究表明，不同生物种类间存在相同基因序列(毛黎，不同植物种类存在相同基因序列，科技日报，2012年4月11日，第1版)。所以，只要父母本染色体相遇，无论来源何处均可以配对或部分配对，即使不能配对，还可以加倍染色体。因此，父母本染色体不能同处一隅，是不同来源的遗传物质间杂交不孕的根本原因。而不同来源的父母本染色体之所以不能同处一隅，是由于植物柱头和体细胞表面存在识别蛋白，即糖蛋白，体细胞上同时存在细胞膜(动物)和糖蛋白或同时存在细胞膜、细胞壁(植物和微生物)和糖蛋白，它们就像一把锁，把不同来源的遗传物质拒之门外。所以只要降解受体和供体外层的糖蛋白，就能使不同来源的遗传物质靠近受体染色体等遗传物质，使不同来源的父母本染色体/遗传物质配对/部分配对/结合，就可获得体细胞杂交种子。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，采用有效措施突破杂交制种瓶颈，实现一系法制种，即在体体细胞杂交制种，使制种风险降低至零，提高制种单产30％以上，降低种子成本30％以上，并极大提高杂种优势。

本发明提供一种体细胞杂交繁殖植物不育系或生产杂交种的方法，其特征在于，用体细胞或菌体液取代花粉，在制种体细胞杂交剂的介导下，给人工去雄制种中的母本，或两系或者三系法制种中的不育系授精，以繁殖不育系或生产杂交种，即制种或繁殖三系不育系时，制种处只种植一个母本，其父本/或三系不育系的保持系来自动物、植物和微生物的生物个体、器官、组织和细胞/菌体，将其打浆后加入与体细胞或菌体体积比为1:0.1-2的制种体细胞杂交剂，搅匀，得到授精液，以体细胞或菌体代替花粉，在制种体细胞杂交剂的介导下，给母本/不育系授精，每一至数天(如两天，三天或四天)1次或每天2次(如上午1次，下午1次)，直至柱头失活；而两系不育系繁殖过程中因生态条件变化导致雄性不育而无法自交或因需要而选择自身体细胞杂交繁殖时，用另外种植的该两系不育系或自身根茎叶等营养器官打浆，按与体细胞或菌体体积比1:0.1-2的比例加入制种体细胞杂交剂搅匀，得到授精液，以体细胞代替花粉，在制种体细胞杂交剂的介导下，给不育系授精，每一至数天(如两天，三天或四天)1次或每天2次(如上午1次，下午1次)，直至柱头失活。

其中，对于三系不育系的繁殖包括如下步骤：

(1)种植三系雄性不育系并种植或繁殖雄性不育保持系(保持系的优选种子数量为不育系的5％-30％)；

(2)不育系开花时取保持系的营养器官/菌体打浆得到体细胞/菌体浆；

(3)按与体细胞/菌体浆体积比1:0.1-2的比例加入制种体细胞杂交剂搅匀，得到体细胞授精液；

(4)用所述授精液给不育系授精；其中所述授精是于不育系开花过程中柱头外露时喷施授精液；

(5)成熟时收获不育系种子实现不育系繁殖；

其中，所述制种体细胞杂交剂含有下述组分：果胶酶、纤维素酶、赤霉素、生长素、激动素、酶解液和复合氨基酸；优选地，所述制种体细胞杂交剂含有下述组分：50-300mg/L果胶酶、100-700mg/L纤维素酶、100-300mg/L赤霉素、10-100mg/L生长素、50-300mg/L激动素、1500-50000μl/L酶解液和1500-50000mg/L复合氨基酸；优选地，所述制种体细胞杂交剂含有下述组分：100-200mg/L果胶酶、300-500mg/L纤维素酶、150-250mg/L赤霉素、40-70mg/L生长素、100-200mg/L激动素、10000-30000μl/L酶解液和10000-30000mg/L复合氨基酸；优选地，所述酶解液为动物糖蛋白酶解法完全糖基分解酶解液。

而生产植物杂交种包括如下步骤：

(1)种植不育系/母本并另处种植/繁殖恢复系/父本(恢复系/母本的优选种子数量为不育系的5％-30％)；

(2)在不育系/母本开花时，将恢复系/父本的营养器官/菌体打浆，按与体细胞/菌体浆体积比1:0.1-2的比例加入制种体细胞杂交剂搅匀，得到授精液并给不育系/母本授精，优选上下午各一次，直至柱头失活；优选的，其中所述授精是于不育系/母本开花过程中雌花外露时进行喷施授精液；

(3)收获成熟的种子作为种植用的杂交一代种子；

所述制种体细胞杂交剂含有下述组分：果胶酶、纤维素酶、赤霉素、生长素、激动素、酶解液和复合氨基酸；优选地，所述制种体细胞杂交剂含有下述组分：50-300mg/L果胶酶、100-700mg/L纤维素酶、100-300mg/L赤霉素、10-300mg/L生长素、50-300mg/L激动素、1500-50000μl/L酶解液和1500-50000mg/L复合氨基酸；优选地，所述制种体细胞杂交剂含有下述组分：200-400mg/L果胶酶、400-600mg/L纤维素酶、100-200mg/L赤霉素、100-200mg/L生长素、150-250mg/L激动素、2000-3000μl/L酶解液和2000-3000mg/L复合氨基酸；更优选所述制种体细胞杂交剂含有下述组分：200mg/L果胶酶、500mg/L纤维素酶、150mg/L赤霉素、155mg/L生长素、200mg/L激动素、2300μl/L酶解液和2500mg/L复合氨基酸；优选地，所述酶解液为动物糖蛋白酶解法完全糖基分解酶解液。

而两系不育系的体细胞杂交繁殖包括如下步骤：

(1)在两系不育系自交繁殖田种植两系雄性不育系，同时另地种植种子数量为繁殖田两系不育系的5％-30％两系不育系，作为不育系自交繁殖田因生态条件变化而雄性不育使繁殖失败而改用自身茎叶的体细胞作为授精液原料；

(2)不育系开花时，如雄性不育，取另地种植的不育系的新鲜茎叶打浆得到体细胞浆；

(3)按与茎叶浆体积比1:0.1-2的比例加入制种体细胞杂交剂搅匀，得到体细胞授精液；

(4)用所述授精液给自交繁殖失败而雄性不育的不育系授精；其中所述授精是于不育系开花过程中柱头外露时喷施授精液；

(5)成熟时收获不育系种子，实现不育系繁殖；

其中，所述制种体细胞杂交剂含有下述组分：果胶酶、纤维素酶、赤霉素、生长素、激动素、酶解液和复合氨基酸；优选地，所述制种体细胞杂交剂含有下述组分：50-300mg/L果胶酶、100-700mg/L纤维素酶、100-300mg/L赤霉素、10-100mg/L生长素、50-300mg/L激动素、1500-50000μl/L酶解液和1500-50000mg/L复合氨基酸；优选地，所述制种体细胞杂交剂含有下述组分：100-200mg/L果胶酶、300-500mg/L纤维素酶、150-250mg/L赤霉素、40-70mg/L生长素、100-200mg/L激动素、10000-30000μl/L酶解液和10000-30000mg/L复合氨基酸；优选地，所述酶解液为动物糖蛋白酶解法完全糖基分解酶解液。其中，优选地，所述酶解液为动物糖蛋白酶解法完全糖基分解酶解液，可以通过商业途径购买获得。其中，复合氨基酸是常规含义的复合氨基酸，例如可以采用CN200610031424.X中描述的方法制备，也可以通过商业途径购买获得。

上述方法中，所述授精的方法为：在母本或不育系开花期进行授精,每一至数天1次或每天2次，直至柱头失活。

优选地，所述植物杂交制种是指栽培植物如水稻、小麦、玉米和辣椒等的杂交制种。

优选地，所述制种体细胞杂交剂含有下述组分：50-300mg/L果胶酶、100-700mg/L纤维素酶、100-300mg/L赤霉素、10-300mg/L生长素、50-300mg/L激动素、1500-50000μl/L酶解液和1500-50000mg/L复合氨基酸；优选地，所述制种体细胞杂交剂含有下述组分：200-400mg/L果胶酶、400-600mg/L纤维素酶、100-200mg/L赤霉素、100-200mg/L生长素、150-250mg/L激动素、2000-3000μl/L酶解液和2000-3000mg/L复合氨基酸；更优选所述制种体细胞杂交剂含有下述组分：200mg/L果胶酶、500mg/L纤维素酶、150mg/L赤霉素、155mg/L生长素、200mg/L激动素、2300μl/L酶解液和2500mg/L复合氨基酸优选地，所述酶解液为动物糖蛋白酶解法完全糖基分解酶解液。

在具体实施方式中，所述两系不育系的杂交繁殖，是在自交繁殖两系不育系时因生态条件变化而雄性不育，使繁殖失败而改自交为异交，用两系不育系的体细胞取代其花粉授精，以挽救不育系繁殖田。

其中，所述植物的生物个体、器官、组织和细胞是指性细胞以外的部分；所述菌体指真菌菌丝或孢子、细菌菌体和病毒DNA或RNA链。

优选地，所述不育系、保持系和恢复系或人工去雄制种父本，来自按申请号202011430912.4和2021101570271的中国发明专利申请通过远缘或超远缘体细胞杂交和有性杂交选育的植物、动物和微生物不育系/母本、保持系、恢复系/父本。

本发明的优势在于，可以将现有杂交种的种子生产由在制种田间种父母本改为仅种植母本，实现一系法制种，使制种风险降低至零，提高制种单产30％以上，降低种子成本30％以上，并极大提高杂种优势。

附图说明

图1桦树茸杂交小麦体细胞杂交喷雾制种。

图2桦树茸体细胞杂交小麦制种田，显示制种成功。

图3界间体细胞杂交小麦—桦树茸杂交小麦(右)及其对照(左)。

图4西瓜体细胞杂交水稻田间长势。

图5西瓜体细胞杂交水稻代谢物韦恩图。其中，每个圈代表一个比较组，圈和圈重叠部分的数字代表比较组之间共有的差异代谢物个数，没有重叠部分的数字代表比较组特有差异代谢物个数。图中FD是西瓜稻，CK是西瓜稻的母本Y两优900。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。

实施例一：体细胞杂交小麦—桦树茸杂交小麦

桦树茸杂交小麦是本实施例以小麦光温敏不育系ES-100为母本，以俄罗斯国宝桦树茸(桦褐孔菌)为父本，在广泛测交的基础上选育出的多功能杂交小麦。桦树茸购自黑龙江省黑河市俄品多商场。

1.小麦光温敏不育系ES-100体细胞杂交繁殖

本实施例采用不育系体细胞浆杂交繁殖法(在实际生产中，也可在根据需要采取)。ES-100于2018年11月26日(不育播期)在广东省湛江市麻章区湖光镇试验基地播种，面积1000m²，用种量11.2kg，同时另外种植100m²该不育系，用种量1.1kg，作为体细胞杂交繁殖的体细胞供体。开花前随机抽取50穗套袋自交，成熟期收回，从中随机抽取30穗计数总小不育系穗数，各小穗基部第1、2小花结实总粒数，按以下公式计算结不育系自交结实率：

不育系自交结实率/％＝基部第1/2小花结实总粒数/总小穗数×2×100％

不育系开花时，将体细胞供体的营养器官打浆，按与体细胞浆体积比1:0.5的比例加入制种体细胞杂交剂搅匀，得到授精液，以体细胞代替花粉，在制种体细胞杂交剂的介导下给其授精，在不育系开花过程有颖壳张开时，每天上下午各喷施一次(图1为喷施现场)，直至柱头失活。所述制种体细胞杂交剂的配方为：200mg/L果胶酶、500mg/L纤维素酶、150mg/L赤霉素、155mg/L生长素、200mg/L激动素、2300μl/L酶解液和2500mg/L复合氨基酸至容器，加蒸馏水定容并搅匀备用。所述复合氨基酸购买自上海哈灵生物科技有限公司的复合氨基酸粉，所述酶解液是动物糖蛋白酶解法完全糖基分解的酶解液(具体购自上海哈灵生物科技有限公司的糖蛋白完全糖基分解试剂盒)。本实施例采成熟期收获不育系种子。不育系套袋自交结实率和体细胞杂交繁殖结实率见表1。

表1小麦光温敏不育系体细胞杂交繁殖结实率(2019-2020,湛江)

2.制种

ES-100于2019年11月19日(不育播期)在广东省湛江市麻章区湖光镇试验基地播种，面积1000m²，用种量11.2kg，开花前桦树茸用姚竞桦树茸繁殖配方(见姚竞.药用真菌桦褐孔菌的驯化条件试验[J].食药用菌，2018.26(2)：99-100.)激活并扩繁，镜检合格后按重量比1：0.5加入制种体细胞杂交剂，配制成桦树茸授精液。桦树茸购自黑龙江省黑河市俄品多商场。所述制种体细胞杂交剂的配方为：200mg/L果胶酶、500mg/L纤维素酶、150mg/L赤霉素、155mg/L生长素、200mg/L激动素、2300μl/L酶解液和2500mg/L复合氨基酸至容器，加蒸馏水定容并搅匀备用。所述复合氨基酸购买自上海哈灵生物科技有限公司的复合氨基酸粉，所述酶解液是动物糖蛋白酶解法完全糖基分解的酶解液，本实施例采用的酶解液具体购自上海哈灵生物科技有限公司的糖蛋白完全糖基分解试剂盒。

不育系开花时，用桦树茸授精液给其授精，即在不育系ES-100开花过程中颖壳张开时，每天上下午各喷施一次，直至柱头失活。授精后的制种田结实状况见图2(为桦树茸体细胞杂交小麦制种田，显示制种成功)。成熟期随机抽取30穗收回调查结实率，方法同不育系套袋自交结实率，同时收获桦树茸杂交小麦种子。不育系套袋自交结实率和体细胞杂交制种结实率见表2。

表2ES-100体细胞杂交制种结实率/2019-2020,湛江

3.桦树茸杂交小麦的产量、品质和抗病性

在广西、黑龙江和广东试验结果表明，桦树茸杂交小麦具有强大的产量、品质和抗性优势。其在湛江表现图3，表3和表4，图3为界间体细胞杂交小麦—桦树茸杂交小麦(右)及其对照(左)。

表3桦树茸杂交小麦的产量和抗病性优势/2019-2020,湛江

表4桦树茸杂交小麦的品质优势/湛江点/2019-2020，湛江

4.桦树茸杂交小麦的若干氨基酸和功能成分含量变化

据武汉迈维生物科技有限公司检测，桦树茸杂交小麦若干氨基酸和功能物质比对照增加317-2000万倍(表5)。

表5桦树茸杂交小麦若干氨基酸和功能物质较对照增加倍数

*注aad为氨基酸及其衍生物。

实施例二：体细胞杂交水稻—西瓜体细胞杂交水稻

西瓜体细胞杂交水稻是本实施例以水稻三系不育系珍汕97A为母本，以东北大西瓜体细胞为父本，在广泛测交的基础上选育出的功能杂交水稻。东北大西瓜种子购自黑龙江省黑河市种子市场，珍汕97A、B系种子引自湖南恒德种业。

1.珍汕97A体细胞杂交繁殖

本实施例采用保持系体细胞浆杂交繁殖法。珍汕97A于2013年2月26日在广东省湛江市麻章区湖光镇试验基地播种，面积600m²，每667m²用种量2.5kg。15d后另外种植50m²珍汕97B，作为体细胞杂交繁殖的体细胞供体。不育系开花前随机抽取50穗套袋自交，成熟期收回，从中随机抽取30穗计数每穗总小花数和结实粒数，按以下公式计算结不育系自交结实率：

不育系自交结实率/％＝结实粒数/总小花数×100％

不育系开花时，将保持系茎叶打浆，按与体细胞浆体积比1:0.5的比例加入制种体细胞杂交剂搅匀，得到授精液，以保持系体细胞代替花粉，在制种体细胞杂交剂的介导下给其授精，即在不育系珍汕97A开花过程中颖壳张开时，每天上下午各喷施1次，直至柱头失活。所述制种体细胞杂交剂的配方为：200mg/L果胶酶、500mg/L纤维素酶、150mg/L赤霉素、155mg/L生长素、200mg/L激动素、2300μl/L酶解液和2500mg/L复合氨基酸至容器，加蒸馏水定容并搅匀备用。所述复合氨基酸购买自上海哈灵生物科技有限公司的复合氨基酸粉，所述酶解液是动物糖蛋白酶解法完全糖基分解的酶解液，本实施例采用的酶解液具体购自上海哈灵生物科技有限公司的糖蛋白完全糖基分解试剂盒。成熟期收获不育系种子。不育系套袋自交结实率和体细胞杂交繁殖结实率见表6。

表6水稻三系不育系珍汕97A体细胞杂交繁殖结实率(2019-2020，湛江)

2.制种

2014年2月15日在广东省湛江市麻章区湖光镇试验基地播种，面积600m²，每667m²用种量2.5kg。30d后播种东北大西瓜，面积20m²，开花当天采西瓜幼嫩茎叶打浆，按重量比1：0.5加入制种体细胞杂交剂，配制成西瓜体细胞授精液，分别于不育系颖壳张开时喷雾授精。制种体细胞杂交剂的配方为：200mg/L果胶酶、500mg/L纤维素酶、150mg/L赤霉素、155mg/L生长素、200mg/L激动素、2300μl/L酶解液和2500mg/L复合氨基酸至容器，加蒸馏水定容并搅匀备用。所述复合氨基酸购买自上海哈灵生物科技有限公司的复合氨基酸粉，所述酶解液是动物糖蛋白酶解法完全糖基分解的酶解液，本实施例采用的酶解液具体购自上海哈灵生物科技有限公司的糖蛋白完全糖基分解试剂盒。每天上下午各1次，直至柱头失活。成熟期随机抽取30穗收回调查结实率，方法同不育系套袋自交结实率，同时收获西瓜体细胞杂交水稻种子。不育系套袋自交结实率和体细胞杂交制种结实率见表7。

表7西瓜稻体细胞杂交制种结实率/2019-2020,湛江

3.西瓜体细胞杂交水稻的产量、品质和抗病性

在广东湛江试种结果表明，西瓜体细胞杂交水稻具有强大的产量、品质和抗性优势(图4，表8)，图4为西瓜体细胞杂交水稻田间长势。

表8西瓜体细胞杂交水稻的产量、品质和抗病性优势(2019-2020，湛江)

4.西瓜体细胞杂交水稻的代谢物变化

1)代谢物数量变化：由武汉迈维生物科技有限公司代谢物种类检测结果(图5)看出，西瓜体细胞杂交水稻中检出了母本中没有的222种代谢物(图5西瓜体细胞杂交水稻代谢物韦恩图)。

2)功能成分变化：据武汉迈维生物科技有限公司代谢物种类检测结果(表9)，西瓜体细胞杂交水稻中氨基酸、酚酸、生物碱和黄酮等主要功能成分比对照(母本)Y两优900增加20万至790.9万倍。

表9西瓜体细胞杂交水稻若干代谢物较对照Y两优900增加倍数

*注：aad为氨基酸及其衍生物。

上述实施例仅为最佳例举，并非对本发明的实施方式的限定。

Claims (10)

1.体细胞杂交繁殖植物不育系或生产杂交种的方法，其特征在于，用体细胞或菌体取代花粉，在制种体细胞杂交剂的介导下，给人工去雄制种中的母本授精，以生产杂交种，或者给两系法制种中的不育系，或者三系法制种中的不育系授精，以繁殖不育系，具体是在生产杂交种或繁殖三系不育系时，制种处只种植一个母本，以体细胞或菌体制备的授精液代替花粉，给母本或不育系授精，每天1次或每天上下午各1次，直至柱头失活；其中，所述授精液由下述方法制备：对来自植物的个体、器官、组织或细胞，或者微生物的菌体进行打浆后，得到的体细胞或菌体，再按体积比为1:0.1-2与制种体细胞杂交剂搅匀得到授精液；其中所述微生物为真菌；

或者两系不育系繁殖过程中因生态条件变化导致雄性不育而无法自交或因需要而选择自身体细胞杂交繁殖时，用另外种植的该两系不育系或自身根茎叶营养器官打浆，按与浆液体积比1:0.1-2的比例加入制种体细胞杂交剂搅匀，得到授精液，给不育系授精，每天1次或每天2次，直至柱头失活；

其中，所述制种体细胞杂交剂含有下述组分：50-300mg/L果胶酶、100-700mg/L 纤维素酶、100-300mg/L赤霉素、10-300mg/L生长素、50 -300mg/L激动素、1500-50000μl/L 酶解液和1500-50000mg/L复合氨基酸；且所述酶解液为动物糖蛋白酶解法完全糖基分解酶解液。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，三系法制种中的不育系的繁殖包括如下步骤：

（1）种植三系雄性不育系并另处种植或繁殖雄性不育保持系，且保持系的种子数量为不育系的5%-30%；

（2）不育系开花时取保持系的营养器官打浆得到体细胞，或者取菌体打浆得到菌体浆；

（3）按与体细胞或菌体浆体积比1:0.1-2的比例加入制种体细胞杂交剂搅匀，得到体细胞授精液；

（4）用所述授精液给不育系授精；其中所述授精是于不育系开花过程中柱头外露时喷施授精液；

（5）成熟时收获不育系种子实现不育系繁殖；

其中，所述制种体细胞杂交剂含有下述组分：100-200mg/L果胶酶、300-500mg/L纤维素酶、150-250mg/L赤霉素、40-70mg/L生长素、100 -200mg/L激动素、10000-30000μl/L 酶解液和10000-30000mg/L复合氨基酸。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，对于三系法制种中生产杂交种包括如下步骤：

（1）种植不育系并另处种植或繁殖恢复系，且恢复系的种子数量为不育系的5%-30%；

（2）在不育系开花时，将恢复系的营养器官打浆得到体细胞，或者取菌体打浆得到菌体浆，按与体细胞或菌体浆体积比1:0.1-2的比例加入制种体细胞杂交剂搅匀，得到授精液并给不育系授精；

（3）收获成熟的种子作为种植用的杂交一代种子；

所述制种体细胞杂交剂含有下述组分： 200-300mg/L果胶酶、400-600mg/L纤维素酶、100-200mg/L赤霉素、100-200mg/L生长素、150 -250mg/L激动素、2000-3000μl/L 酶解液和2000-3000mg/L复合氨基酸。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，对于生产杂交种包括如下步骤：

（1）种植母本并另处种植或繁殖父本，且父本的种子数量为不育系的5%-30%；

（2）在母本开花时，将父本的营养器官打浆得到体细胞，或者取菌体打浆得到菌体浆，按与体细胞或菌体浆体积比1:0.1-2的比例加入制种体细胞杂交剂搅匀，得到授精液并给不育系授精；

（3）收获成熟的种子作为种植用的杂交一代种子；

所述制种体细胞杂交剂含有下述组分： 200-300mg/L果胶酶、400-600mg/L纤维素酶、100-200mg/L赤霉素、100-200mg/L生长素、150 -250mg/L激动素、2000-3000μl/L 酶解液和2000-3000mg/L复合氨基酸。

5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述制种体细胞杂交剂含有下述组分：200mg/L 果胶酶、500mg/L 纤维素酶、150mg/L 赤霉素、155mg/L 生长素、200mg/L激动素、2300μl/L 酶解液和 2500mg/L 复合氨基酸。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，两系法制种的不育系的杂交繁殖包括如下步骤：

（1）在不育系自交繁殖田种植两系雄性不育系，同时另地种植种子数量为繁殖田两系不育系的5%-30%不育系，作为不育系自交繁殖田因生态条件变化而雄性不育使繁殖失败而改用自身茎叶的体细胞作为授精液原料；

（2）不育系开花时，如雄性不育，取另地种植的不育系的新鲜茎叶打浆得到体细胞浆；

（3）按与茎叶浆体积比1:0.1-2的比例加入制种体细胞杂交剂搅匀，得到体细胞授精液；

（4）用所述授精液给自交繁殖失败而雄性不育的不育系授精；其中所述授精是于不育系开花过程中柱头外露时喷施授精液；

（5）成熟时收获不育系种子，实现不育系的繁殖；

其中，所述制种体细胞杂交剂含有下述组分：100-200mg/L果胶酶、300-500mg/L纤维素酶、150-250mg/L赤霉素、40-70mg/L生长素、100-200mg/L激动素、10000-30000μl/L 酶解液和10000-30000mg/L复合氨基酸。

7.如权利要求1所述的方法，所述授精的方法为：在母本或不育系开花期进行授精,每天1次或每天上下午各1次，直至柱头失活。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述生产杂交种的制种是水稻、小麦、玉米和辣椒的杂交制种。

9.如权利要求6所述的方法，所述两系法制中的不育系的杂交繁殖，是在自交繁殖不育系时因生态条件变化而雄性不育，使繁殖失败而改自交为异交，用不育系茎叶的体细胞取代其花粉授精，以挽救不育系繁殖田。

10.如权利要求1至9任一项所述的方法，其特征在于：所述植物的个体、器官、组织或细胞是指性细胞以外的部分；所述菌体指真菌菌丝或真菌孢子。

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