CN102177778A

CN102177778A - 通过增厚糊粉层来提高水稻营养成分含量的方法

Info

Publication number: CN102177778A
Application number: CN2011100909133A
Authority: CN
Inventors: 刘春明; 吴小坝; 龚化勤; 宋秀芬
Original assignee: Institute of Botany of CAS
Current assignee: Institute of Botany of CAS
Priority date: 2011-04-12
Filing date: 2011-04-12
Publication date: 2011-09-14

Abstract

本发明公开了一种通过增厚糊粉层来提高水稻营养成分含量的方法。该培育营养成分含量提高的水稻的方法，包括增厚出发水稻的糊粉层得到营养成分高于所述出发水稻的目的水稻的步骤。本发明选择增厚水稻糊粉层的厚度来选育高营养水稻，解决了目前导入特定外源基因只能改变特定营养成分含量的问题，本发明方法培育出的水稻与野生型相比，种子粒长、粒宽和千粒重都有所增加。其种子中的营养成分如蛋白，锌铁等物质的含量都有明显的增高。

Description

通过增厚糊粉层来提高水稻营养成分含量的方法

技术领域

本发明涉及一种通过增加糊粉层厚度来培育高营养优质作物的遗传工程方法，特别涉及一种通过增厚糊粉层来提高水稻营养成分含量的方法。

背景技术

禾谷类作物特别是水稻，小麦和玉米的胚乳为人类提供了最大的粮食来源。三倍体的胚乳是双受精的产物。以水稻为例，其成熟胚乳由两部分组成：外部的2-3层细胞构成的糊粉层和内部的失去细胞结构的淀粉胚乳。由活细胞构成的糊粉层胚乳像一个口袋一样包裹着内部的经历程序化死亡过程的无生命的淀粉胚乳。淀粉胚乳的主要成分是由长链多糖构成的大分子碳水化合物，为人类提供的主要是能量，蛋白质、脂肪和维生素的含量极少。而糊粉层胚乳则富含各种矿物成分以及维生素、蛋白质、脂类等。

用于高营养水稻育种的技术总的来说有杂交育种、突变育种、组织培养及外源基因导入等方法。在以往的高蛋白育种实践中曾有人尝试辐射诱变育种和常规远源杂交育种等方法，但由于普遍存在高变异株系不丰产、远源杂交不亲和以及后代分离等问题而收效甚微。瑞士的一位学者，采用生物技术，将水仙中的β-胡萝卜素转移到水稻之中，育成了富含维生素A的“金稻”品种(Golden rice)；Goto等成功地将大豆铁蛋白基因转移到水稻，获得铁含量比一般水稻高3倍的水稻；Lucca等也通过转基因途径获得铁含量较高的水稻；Ye等将psy、crytl、lyc等外源基因导入到水稻中取得显著进展。但这些外源基因导入的方法往往只能改变特定营养成分的含量，限制了培育品种的推广应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种培育营养成分含量提高的水稻的方法。

本发明所提供的培育营养成分含量提高的水稻的方法，包括增厚出发水稻(野生型水稻)的糊粉层得到营养成分高于所述出发水稻(野生型水稻)的目的水稻的步骤。

所述营养成分具体可为下述4种成分中的至少一种：蛋白质、锌、铁和脂肪。

其中，可选用常规方法来增厚出发水稻(野生型水稻)的糊粉层，如诱变、转入可使糊粉层增厚的基因。

所述方法中，在所述增厚出发水稻(野生型水稻)的糊粉层后，还包括检测糊粉层厚度，选择与所述出发水稻(野生型水稻)相比糊粉层增厚的水稻，从所述糊粉层增厚的水稻中得到营养成分含量高于所述出发水稻(野生型水稻)的目的水稻的步骤。

所述方法中可采用包括如下步骤的方法选择与所述出发水稻(野生型水稻)相比糊粉层增厚的水稻：将待筛选的种子从中间横切，留取含胚的一半种子以进行繁殖，另一半种子用于检测糊粉层的厚度。

糊粉层的厚度可按照常规方法确定，如用Evans blue染色的方法、用lugo’s碘染色的方法，或用苏丹红染色的方法。

本发明创造性地选择增厚水稻糊粉层的厚度来选育高营养水稻，解决了目前导入特定外源基因只能改变特定营养成分含量的问题，本发明方法培育出的水稻与野生型相比，种子粒长、粒宽和千粒重都有所增加。其种子中的营养成分如蛋白，锌铁等物质的含量都有明显的增高。

下面结合具体实施步骤及案例对本发明做进一步说明。

附图说明

图1为半粒种子筛选法的图示

a为流程图，b为种子切割机，c为切开的半粒种子

图2为用不同方法染色后筛选得到的糊粉层加厚突变体

a为Evans blue染色的方法，b为lugo’s碘染色的方法，c为苏丹红染色的方法d为种子

a、b、c和d中，野生型(左)，ta-1(中)，ta-2(右)。

图3为糊粉层加厚突变体的半薄切片

上图为甲苯胺兰染色，下图为PAS染色，淀粉胚乳(累积红色淀粉粒)与糊粉层(不累积淀粉)清楚可辨。ta-1(中)、ta-2(右)、野生型(左)。

图4为ta-1和ta-2突变体去壳种子的表型

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、利用糊粉层加厚选育营养成分含量提高的水稻

用60mM的甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate，EMS)对8,000粒中花11水稻的种子(野生型，出发水稻)进行了诱变处理，将种子种下，得到1,327株可育的M1植物(诱变第一代)；从M1植株上共收取了8,927个单穗。然后每个单穗中取出10粒种子，用半粒种子筛选的方法进行初步筛选。

其中，诱变方法如下：

将种子用水清洗去灰尘，分成200粒每份，放入500ml蓝盖瓶中，加入100毫升水浸泡，以125rpm振摇过夜。

将水倒掉，加入60mM的EMS溶液(用66mM的磷酸缓冲液，pH7.0配制)，诱变24小时，同样以125rpm振摇。

去除EMS溶液，用100毫升水清洗数分钟，以125rpm振摇。换水清洗3次，每次半小时。之后每5小时清洗1次，最后清洗过夜。清洗过程中始终以125rpm振摇。

次日换水后，将种子转移到湿滤纸上，准备播种。

其中，用半粒种子筛选的方法如图1所示，具体方法如下：

把水稻种子用脱壳机脱壳后，用刀片从中间横切，将含胚的一半种子留存备用(图1中b为切开的水稻种子，左侧为无胚端，右侧为有胚端)。用Evans blue染色的方法，对不含胚的部分进行染色，在体视显微镜下观察胚乳和糊粉层的着色情况。糊粉层细胞因为具有活性而不被染色，淀粉胚乳部分则被染成蓝色(图2中a)。与野生型相比，将不着色部分发生增加的个体挑选出，将其含胚的部分进行萌发培育，既可得到具有糊粉层增厚的个体。用lugo’s碘染色的方法，也可区分糊粉层和淀粉胚乳，淀粉胚乳因为富含淀粉被染成深紫色，而糊粉层细胞则不被染色(图2中b)。此外，用苏丹红染色的方法，糊粉层细胞因为富含脂类物质被染成红色，而淀粉胚乳内脂质含量低则染色极浅(图2中c)。据此找到糊粉层明显比常规野生型品种加厚，并且这种糊粉层加厚的表型可以稳定遗传的水稻材料突变体ta-1，ta-2(图2)。

为了对筛选出的水稻材料的糊粉层加厚情况做进一步仔细观察，水稻种子用FAA固定后，经一系列的脱水后用LR white包埋，切成1μm厚的片子，分别用甲苯胺蓝及PAS染色后于显微镜下观察，进一步筛选出糊粉层与常规野生品种相比有明显加厚的水稻材料。结果如图3所示，野生型中花11的糊粉层只有1-2层细胞，而突变体ta-1有2-6层细胞，突变体ta-2有4-9层细胞，突变体ta-1和ta-2的糊粉层明显加厚。

实施例2、对ta-1及ta-2株系相关产量性状及营养成分测定

将突变体ta-1和ta-2的含胚的另一半种子进行种植。用升汞对半粒带胚种子进行消毒处理，播种在1/2MS培养基上，25℃，光照1,500～2,000lx，16h/d进行培养，待幼苗长出2-3片完全叶后，经过2-3天炼苗后再将幼苗移至土中，30℃昼/20℃夜，光照5,000～10,000lx，12h/d培养至结实。收种(M2代)以进行进一步的分析鉴定。将M2代进行繁殖得到M3代和M4代。

对ta-1及ta-2株系的产量形状和营养成分测定，该株系开花期较野生型晚两周。调查种子的粒长、粒厚、粒宽、千粒重发现ta-1的种子粒长、粒宽和千粒重都有所增加。ta-1及ta-2株系和野生型的外观如图4所示。图4中，右侧的一组为野生型种子，左侧的两组为ta-2的种子，中间的两组为ta-1的种子。突变体ta-1及ta-2与野生型中白垩化种子的比例如表1所示。

将该株系和常规野生型糙米(选饱满的种子)送农业部稻米及制品质量监督检验测试中心检测，其中蛋白质含量按照NY/T 3-1982标准检测，铁的含量按照GB/T5009.90-2003标准检测，锌的含量按照GB/T 5009.14-2003标准检测，脂肪的含量按照GB/T 5009.6-2003标准检测。

结果如表2所示，显示蛋白质含量在ta-1中提高了42.4％，在ta-2中提高32.9％(WT：9.4％，ta-1：12.0％，ta-2：11.3％)；锌含量在ta-1中提高了65.6％，在ta-2中提高16.8％(WT：19.1mg/Kg，ta-1：29.6mg/Kg，ta-2：22.3mg/Kg)；铁含量在ta-1中提高54.7％，在ta-2中提高16.6％(WT：18.7mg/Kg，ta-1：44.0mg/Kg，ta-2：21.8mg/Kg)；脂肪含量在ta-1中提高66％，在ta-2中提高30.6％(WT：2.6％，ta-1：3.7％，ta-2：3.5％)。

表1突变体与野生型中白垩化种子的比例统计

表2突变体与野生型中各项产量形状和品质性状比较

表2中，蛋白质含量和脂肪含量为质量百分含量，表2是M4代大田种植的结果。

实施例3、对ta-1及ta-2株系的稳定性测定

种植并繁殖实施例2所筛选出的ta-1及ta-2株系，分别按上述国家标准检测各营养成分的含量，评价验证水稻材料稳定性，结果表明ta-1及ta-2在温室(种植M3代)及大田种植(种植M4代)出的连续两代材料都具有明显的高营养品质，已得到高营养优质的水稻品种。其中，ta-1株系的M3代蛋白质的质量百分含量是12.1％，锌含量是29.15％，铁含量是是16.55％，脂肪的质量百分含量是是4.45％；ta-1株系的M4代蛋白质的质量百分含量是12％，锌含量是29.6％，铁含量是是44％，脂肪的质量百分含量是是3.7％；ta-2株系的M3代蛋白质的质量百分含量是10.9％，锌含量是27.5％，铁含量是是32.8％，脂肪的质量百分含量是是3.4％；ta-2株系的M4代蛋白质的质量百分含量是11.3％，锌含量是22.3％，铁含量是是21.8％，脂肪的质量百分含量是是3.5％。温室种植的中花11的蛋白质的质量百分含量是8.5％，锌含量是17.6％，铁含量是是10.7％，脂肪的质量百分含量是是2.68％。大田种植的中花11蛋白质的质量百分含量是9.4％，锌含量是19.1％，铁含量是是18.7％，脂肪的质量百分含量是是2.6％。

Claims

1.培育营养成分含量提高的水稻的方法，包括增厚出发水稻的糊粉层得到营养成分高于所述出发水稻的目的水稻的步骤。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述营养成分为下述4种成分中的至少一种：蛋白质、锌、铁和脂肪。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述方法中，在所述增厚出发水稻的糊粉层后，还包括检测糊粉层厚度，选择与所述出发水稻相比糊粉层增厚的水稻，从所述糊粉层增厚的水稻中得到营养成分含量高于所述出发水稻的目的水稻的步骤。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述方法中采用包括如下步骤的方法选择与所述出发水稻相比糊粉层增厚的水稻：将待筛选的种子从中间横切，留取含胚的一半种子以进行繁殖，另一半种子用于检测糊粉层的厚度。