CN108882691A - 具有增厚的糊粉层的水稻谷粒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有增厚的糊粉层(aleurone)的水稻谷粒(grain)。还提供的是包含至少一个导入的遗传变异的水稻植物，所述遗传变异降低所述植物中至少一个ROS1a基因的活性。本发明的谷粒，或其中的糊粉层，具有改善的营养特性，且因此对于人或动物饲料产品特别有用。

Description

具有增厚的糊粉层的水稻谷粒
发明领域
本发明涉及具有增厚的糊粉层(aleurone)的水稻谷粒(grain)。还提供的是包含至少一个遗传变异的水稻植物，所述遗传变异降低所述植物中至少一个ROS1a基因的活性。本发明的谷粒，或其中的糊粉层，具有改善的营养特性，且因此对于人或动物饲料产品特别有用。
发明背景
世界范围内，谷物谷粒例如小麦、水稻、玉米以及较小范围的大麦、燕麦和黑麦是人类从所述谷粒的淀粉含量中摄取热量的主要来源。谷物谷粒对于提供其它营养成分例如蛋白质、维生素、矿物质和膳食纤维也是重要的。谷粒的不同部分对于这些营养成分的贡献不同。淀粉储存于谷物谷粒的淀粉质胚乳中，而其它营养成分更集中于胚和麸皮(Buri etal.,2004)。然而，在用于食物前，麸皮经常被去除，尤其是在水稻中，其然后作为白米食用。
谷物谷粒发育自母本和父本配子体之间的双受精事件。来自花粉管的两个精细胞之一和卵融合产生发育成胚的合子，而另一精细胞和雌配子体的二倍体中央细胞融合产生初生胚乳核，其发育成遗传学三倍体的胚乳。因此，包括糊粉层的胚乳是三倍体，具有两个拷贝的母本单倍体基因组和一个拷贝的父本单倍体基因组。在双子叶种子中，胚乳被发育中的胚消耗，而在单子叶植物例如水稻中，胚乳保留以构成成熟谷粒的主体。
谷物的成熟胚乳具有四种特性不同的细胞类型，即淀粉质胚乳，特征在于其淀粉粒和储存蛋白的丰富含量；表皮样糊粉层，其最经常是一层细胞厚，围绕大部分的淀粉质胚乳；位于种子基部在主要母本维管结构上的转移细胞；以及围绕胚的一层细胞，其在谷粒发育早期形成胚的衬层而在后期将仅仅围绕连接胚和淀粉质胚乳的胚柄(Becraft et al.,2001a)。胚在淀粉质胚乳内的腔中形成。谷物糊粉层组织因此包含谷物谷粒中胚乳的最外层，并围绕淀粉质胚乳和部分的胚。
糊粉层细胞在它们的形态学、生物化学组成和基因表达谱上不同于淀粉质胚乳细胞(Becraft and Yi,2011)。糊粉层细胞一般富含油和蛋白质并分泌酶使得在种子萌发期间可以动员胚乳储备。每个糊粉层细胞被包在纤维状细胞壁内，所述纤维状细胞壁比胚乳细胞壁厚且主要由不同比例的并且是高度自发荧光的阿拉伯木聚糖(arabinoxylan)和β葡聚糖组成。糊粉层是谷物胚乳中唯一有时候由花青苷类着色的层。
谷物糊粉层在小麦和野生型玉米中厚仅仅一个细胞层(Buttrose 1963；Walbot,1994)，在水稻胚乳的背侧区域大部分是一个但最多三个细胞层(Hoshikawa,1993)，而在野生型大麦中是三个细胞层(Jones,1969)。在正常胚乳中，糊粉层是极度规则的且细胞分裂的模式高度有组织。野生型成熟糊粉层细胞切面几乎是立方形，具有稠密的细胞质，包括颗粒、小液泡和包涵体，所述包涵体由蛋白质、脂质和植酸钙镁组成或由蛋白质加碳水化合物组成。在成熟谷物谷粒中，糊粉层是唯一仍然活着的胚乳组织，尽管是处于休眠、干燥形式。在吸胀后，胚产生赤霉素，其诱导糊粉层合成淀粉酶和其它水解酶，释放至淀粉质胚乳来降解储存化合物以形成糖和氨基酸，用于胚早期生长成幼苗。
谷物谷粒中糊粉层发育的调控已经由Becraft和Yi(2011)进行综述。多水平的遗传调控控制糊粉层细胞的命运、分化和组织，且许多基因参与这些过程，其中仅仅鉴别了所述基因中的一些。例如，玉米defective kernal1(dek1)功能缺失突变体没有糊粉层，表明野生型Dek1多肽是外细胞层专化成糊粉层所需的(Becraft et al.,2002)。Dek1多肽是大的膜整合蛋白，具有21个跨膜结构域和一个含有活性钙蛋白酶(calpain)的胞质结构域。玉米中的另一个基因，CRINKLY4(Cr4)编码受体激酶，其功能是糊粉层命运的正调节物，而cr4突变体具有减少的糊粉层(Becraft et al.,2001b)。
文献已有报道在谷物谷粒突变体中增厚的糊粉层的若干例子，然而由于多效性效应或农艺和生产问题，没有一个被证明是有用的。
Shen et al.(2003)报道鉴别玉米supernumary aleurone layers1(sal1)基因中的突变体,在不同突变体中具有2-3层或多达7层的糊粉层细胞，而不是正常的单层。SAL1多肽被鉴别为E类液泡分选蛋白。纯合sal1-1突变体谷粒具有无法萌发的缺陷胚，且具有大大减少的淀粉质胚乳。对sal1-2等位基因纯合的较不完全的突变体显示2个细胞层的糊粉层。然而，突变体植物仅仅生长至野生型的30％的高度，具有减少的根质量并且结实差(Shenet al.2003)。这些植物在农艺上无用。
Yi et al.(2011)报道在玉米中鉴别到thick aleurone1(thk1)突变体。突变体籽粒显示多层的糊粉层。然而，突变体籽粒缺乏良好发育的胚且在播种时不萌发。野生型Thk1基因编码Thk1多肽，其作用于玉米种糊粉层发育所需的Dek1多肽下游(Becraft et al.,2002)。
通过其对叶形态的作用而鉴别到玉米extra cell layer(Xcl)基因突变体。其产生双糊粉层以及多层的叶表皮(Kessler et al.,2002)。Xcl突变是半显性突变，其在玉米中破坏细胞分裂和分化模式，产生厚及窄的具有不正常的带光泽外观的叶片。
disorgal1和disorgal2(dil1和dil2)基因的玉米突变体显示糊粉层具有可变的层数，细胞具有不规则形状和大小(Lid et al.,2004)。然而，纯合的dil1和dil2突变体谷粒由于减少的淀粉积累是皱缩的，且成熟的突变体谷粒萌发率低且不发育成能存活的植物。
在大麦中，elo2突变体类似地显示无组织的细胞和糊粉层的不规则，其由异常的平周细胞分裂造成(Lewis et al.,2009)。所述植物还显示叶表皮增加的细胞层，在表皮上具有突起和扭曲的细胞。重要的是，纯合的突变体植物是矮化的，产生的谷粒重比野生型低60％，对于谷粒生产无用。
在水稻中，控制种子贮藏蛋白表达的两种转录因子也影响糊粉层细胞命运(Kawakatsu et al.,2009)。通过编码水稻醇溶蛋白盒结合因子(RPBF)多肽(其是DOF锌指转录因子类)的基因的共抑制构建体降低表达导致散发的多层糊粉层，其由大的、无序的细胞组成。种子贮藏蛋白表达和积累也有显著减少，并且淀粉和脂质以实质降低的水平积累。玉米Dek1、CR4和SAL1基因的水稻同源物的表达也被降低，显示RPBF和RISBZ1因子与那些基因在相同的调控途径操作。
DNA的去甲基化
在植物科学的一个完全不同方面，现在概述DNA的去甲基化。植物对核DNA中一些胞嘧啶核苷酸在嘧啶环的碳5处甲基化，形成5-甲基胞嘧啶(5-meC)。甲基化的胞嘧啶可以在三种上下文中的任一种中发生，即CG、CHG(其中H＝A、C或T)和CHH甲基化，各自由不同的甲基转移酶催化。至少在拟南芥(Arabidopsis thaliana)以及可能在大多数植物包括水稻中(Zemach et al.,2010)，CG甲基化是由甲基转移酶1(Met1)家族催化，CHG甲基化是由染色质甲基化酶(Chromomethylase)家族中的甲基化酶催化，且CHH甲基化通过结构域重排甲基化酶(Domains Rear-ranged Methylases)(DRM)使用小RNA作为向导序列催化的RNA介导的反应发生(Law and Jacobsen,2010)。胞嘧啶甲基化，其仅仅在全部胞嘧啶的一小部分发生，最经常发生于异染色质DNA和富含重复DNA和转座子的区域，抑制它们的活性。其也发生于核DNA的转录区域，包括在基因的启动子区域，并因此参与控制许多基因的表达。
DNA的胞嘧啶甲基化通过去甲基化是可逆的，其可以通过DNA复制被动地发生或者通过去甲基化酶的活性主动地发生。植物中DNA主动去甲基化的一个途径是通过碱基切除修复(BER)途径，其使用DNA糖基化酶。这些酶从双链DNA主链去除5-meC，然后在无碱基位点通过β-和δ消除反应切割DNA主链(裂解酶活性)。通过DNA聚合酶活性插入未甲基化胞嘧啶核苷酸完成修复。
在拟南芥基因组中有4种5-meC DNA糖基化酶/裂解酶，称为Demeter(DME)、Demeter-like 2(DML2)、Demeter-like 3(DML3)和Repressor of Silencing(ROS1)。遗传学和生物化学分析显示全部四种功能都是DNA去甲基化酶(Gong et al.,2002；Agius etal.,2006；Morales-Ruiz et al.,2006)，DME主要在卵细胞和胚乳起作用而其它在其它组织起作用。其它植物类似地显示去甲基化酶的多样性(Zemach et al.,2010)。
存在对具有增厚的糊粉层的水稻谷粒的需要，所述谷粒来自表型正常及农艺学有用的植物特别是水稻植物。
发明概述
在一方面，本发明提供水稻植物的谷粒，所述谷粒包含糊粉层、淀粉质胚乳、编码ROS1a多肽的ROS1a基因和(i)一或多个遗传变异，与相应野生型谷物植物相比，其各自降低所述植物中至少一个ROS1a基因的活性，和/或(ii)相比于来自相应野生型谷粒的糊粉层，所述糊粉层是增厚的。
在一实施方式中，所述ROS1a多肽具有DNA糖基化酶活性。在一实施方式中，述ROS1a多肽具有这样的DNA糖基化酶活性水平，其是相应野生型ROS1a多肽和/或具有SEQ IDNO:2所示氨基酸序列的ROS1a多肽的DNA糖基化酶活性水平的2％至约60％。
在另一实施方式中，所述ROS1a多肽是相应野生型ROS1a多肽的变体，它们的氨基酸序列是不同的。在一优选实施方式中，所述水稻谷粒包含ROS1a(Ta2)变体多肽，其具有SEQ ID NO:1提供的氨基酸序列，所述多肽是野生型ROS1a多肽的变体，所述野生型ROS1a多肽的氨基酸序列提供于SEQ ID NO:2。
在一实施方式中，与相应野生型谷粒中的ROS1a多肽水平相比，所述谷粒中具有2％至约60％的ROS1a多肽水平。
在一实施方式中，所述增厚的糊粉层包含至少2层、至少3层、至少4层、或至少5层细胞，约3层、约4层、约5层或约6层细胞，或2-8层、2-7层、2-6层或2-5层细胞。在一实施方式中，所述谷粒来自水稻植物且所述增厚的糊粉层包含5-8、5-7、5-6或2-5层细胞。在一实施方式中，与野生型水稻谷粒的糊粉层相比，所述糊粉层厚度增加大约100％，或大约150％或大约200，或大约250％。
所述遗传变异，优选导入的遗传变异，其降低所述植物中至少一个ROS1a基因的活性，可以是降低或破坏水稻谷粒中野生型水平的ROS1a多肽产生的任何遗传操作。示例性的此类遗传变异包括，但不必限于，
(a)编码与野生型ROS1a多肽(SEQ ID NO:2)相比具有降低的DNA糖基化酶活性的突变体ROS1a多肽的ROS1a基因；
(b)ROS1a基因，其表达时产生降低水平的野生型ROS1a多肽，例如其包含剪接位点突变，所述剪接位点突变导致相对于cDNA序列提供于SEQ ID NO:8的野生型ROS1a基因，所述ROS1a基因降低水平的表达，或者所述ROS1a基因在其启动子包含突变，导致所述ROS1a基因相对于野生型ROS1a基因降低的表达；
(c)外源核酸构建体，其编码降低所述水稻植物中ROS1a基因表达的多核苷酸，其中所述核酸构建体包含可操作地连接于启动子的编码所述多核苷酸的DNA区域，所述启动子至少在开花至开花后7天的时间内的时间点在所述水稻植物的发育中的谷粒中表达，和
(d)ROS1a基因，其在蛋白编码区包含过早翻译终止密码子，使得所述基因编码，但可能产生或可能不产生，相对于野生型ROS1a多肽截短的多肽。
在一优选实施方式中，所述水稻谷粒包含(i)糊粉层，(ii)淀粉质胚乳，(iii)包含遗传变异的ROS1a基因，相对于野生型ROS1a基因，所述遗传变异在水稻植物中降低所述ROS1a基因的活性，其中所述包含遗传变异的ROS1a基因编码相对于SEQ ID No:2的变体ROS1a多肽，且其中所述糊粉层相对于来自相应野生型水稻谷粒的糊粉层是增厚的。在一实施方式中，所述ROS1a基因中的遗传变异是导入的遗传变异。在一优选实施方式中，所述变体ROS1a多肽与SEQ ID NO:2提供的序列在氨基酸序列上的不同至少在于一个或多个氨基酸的插入或缺失或相对于SEQ ID NO:2的氨基酸取代。在一甚至更优选的实施方式中，所述变体ROS1a多肽与SEQ ID NO:2提供的序列在氨基酸序列上的不同至少在于一个或多个氨基酸的插入或在于相对于SEQ ID NO:2的单氨基酸取代，例如，表3中所列的氨基酸取代之一。所述水稻谷粒可以被处理使得其不再能够萌发，例如，其被煮过，或者其可以不处理使得其能够萌发和生长并由此提供本发明的水稻植物。在一最优选的实施方式中，所述水稻谷粒的糊粉层是着色的，例如，所述水稻谷粒是如本文所定义的黑米。
在另一优选实施方式中，所述水稻谷粒包含(i)糊粉层，(ii)淀粉质胚乳，(iii)包含遗传变异的ROS1a基因，相对于野生型ROS1a基因，所述遗传变异在水稻植物中降低所述ROS1a基因的活性，其中所述包含遗传变异的ROS1a基因编码氨基酸序列与野生型ROS1a多肽例如SEQ ID No:2相同的ROS1a多肽，其中相对于野生型ROS1a基因，所述ROS1a基因在水稻植物中以降低的水平表达，其中所述糊粉层与来自相应野生型水稻谷粒的糊粉层相比是增厚的。在一实施方式中，所述ROS1a基因中的遗传变异是导入的遗传变异，其导致所述ROS1a基因以降低的水平表达。在一实施方式中，所述遗传变异选自(i)剪接位点突变，所述剪接位点突变导致相对于cDNA序列提供于SEQ ID NO:8的野生型ROS1a基因，所述ROS1a基因降低水平的表达，(ii)ROS1a基因启动子突变，其导致所述ROS1a基因相对于野生型ROS1a基因降低的表达，和(iii)外源核酸分子，优选地整合进所述水稻植物的核基因组中，其编码在水稻植物中降低ROS1a基因表达的RNA多核苷酸。所述水稻谷粒可以被处理使得其不再能够萌发，例如，其被煮过，或者其可以不处理使得其能够萌发和生长并由此产生本发明的水稻植物。在一最优选的实施方式中，所述水稻谷粒的糊粉层是着色的，例如，所述水稻谷粒是如本文所定义的黑米。
在一实施方式中，所述水稻植物在其发育中的谷粒中具有这样的DNA糖基化酶活性水平，其是相应的野生型发育中的谷粒中DNA糖基化酶活性水平的2％至约60％。在一优选实施方式中，所述水稻植物在其发育中的谷粒中具有这样的DNA糖基化酶活性水平，其是相应的野生型发育中的谷粒中DNA糖基化酶活性水平的2％至50％，或2％至40％，或2％至30％，或2％至20％。
在一实施方式中，所述水稻植物中的至少一个ROS1a基因的活性在发育中的谷粒的糊粉层、果皮、珠心突起、子房、种皮和淀粉质胚乳中的一或多种或全部被降低。
在一实施方式中，ROS1a基因的活性至少在开花至开花后7天的时间内的时间点和/或在开花前的卵细胞中被降低。在一实施方式中，所述外源核酸分子可以可操作地与启动子连接，所述启动子至少在开花至开花后7天的时间内的时间点表达，使得所编码的RNA多核苷酸在该时间期间在水稻植物中降低所述ROS1a基因的表达。
在一实施方式中，所述水稻植物是雄性和雌性可育的。
在一实施方式中，所述水稻植物显示延迟的谷粒成熟。在一实施方式中，所述谷粒成熟相对于野生型水稻植物被延迟2-10天或2-15天。
在一实施方案中，当与相应的野生型谷粒相比时，所述谷粒包含以下的一或多种或全部，各自基于重量，
i)更高的矿物质含量，优选所述矿物质含量是锌、铁、钾、镁、磷和硫中的一或多种或全部的含量，
ii)更高的抗氧化剂含量，
iii)更高的植酸盐含量，
iv)维生素B3、B6和B9中的一或多种或全部的更高含量，
v)更高的膳食性纤维含量和/或不溶性纤维含量，
vi)相对于相应野生型谷粒的淀粉含量，以重量计约90％至约100％的淀粉含量；
vii)更高的蔗糖含量，
viii)更高的单糖含量，和
ix)相对于相应野生型谷粒的脂质含量，以重量计约90％至约100％的脂质含量。在一实施方式中，所述组分的含量相对于野生型水稻谷粒中的相应含量被增加10-50％或优选10-100％。
在一实施方式中，所述谷粒包含胚。
在一实施方式中，所述谷粒是全谷粒或破碎的谷粒。
在一实施方式中，所述谷粒被加工使得其不再能够萌发，优选通过热处理加工。例如，所述谷粒被用水在100℃煮至少5分钟。在一实施方式中，所述谷粒是破碎的谷粒或经研磨的谷粒。
在一可选实施方式中，相对于相应野生型谷粒的萌发率，所述谷粒具有约70％-约100％的萌发率。也就是，至少100个谷粒的集合相对于野生型具有70-100％的平均萌发率。当所述谷粒萌发并生长，就产生本发明的水稻植物。
在一实施方式中，所述谷粒包含编码具有DNA糖基化酶活性的ROS1a多肽的ROS1a基因，优选在所述谷粒的糊粉层、种皮和淀粉质胚乳的一或多种中，其中所述具有DNA糖基化酶活性的ROS1a多肽优选是突变体ROS1a多肽。
在另一实施方式中，所述谷粒包含突变体ROS1a多肽，其在所述水稻植物表达时，与相应野生型ROS1a多肽相比具有降低的DNA糖基化酶活性，优选其中所述突变体ROS1a多肽包含一或多个氨基酸取代、缺失或插入，与相应野生型ROS1a多肽相比，所述一或多个氨基酸取代、缺失或插入降低DNA糖基化酶活性。所述突变体ROS1a多肽可以没有DNA糖基化酶活性，条件是所述谷粒包含另一具有DNA糖基化酶活性的ROS1a多肽。例如，所述ROS1a基因通过可变剪接可以编码两种ROS1a多肽，其中之一具有DNA糖基化酶活性而另一种没有。在一优选实施方式中，所述突变体ROS1a多肽相对于野生型ROS1a多肽具有七个氨基酸的插入，例如所述突变体ROS1a多肽的氨基酸序列提供于SEQ ID NO:1。
在另一实施方式中，与相应野生型谷粒相比，所述谷粒具有降低的ROS1a多肽总量，优选在所述谷粒的糊粉层、种皮和淀粉质胚乳的一或多种中被降低，条件是所述谷粒包含编码具有DNA糖基化酶活性的ROS1a多肽的ROS1a基因。ROS1a多肽总量也可以在所述水稻植物的花粉中被降低。
在另一实施方式中，所述遗传变异，优选导入的遗传变异是外源核酸构建体，其编码降低所述水稻植物中ROS1a基因表达的多核苷酸，优选地在所述水稻植物中至少在开花至开花后7天的时间内的时间点被降低，条件是所述谷粒包含至少一个编码具有DNA糖基化酶活性的ROS1a多肽的ROS1a基因。
在一实施方式中，所述谷粒在其外层或多个外层着色，例如所述谷粒是所述水稻植物的褐色谷粒或黑色谷粒，所述谷粒包含(i)具有至少2个细胞层或2-7个细胞层的厚度的糊粉层，和(ii)编码包含一或多个氨基酸取代、插入或缺失的ROS1a多肽的突变体ROS1a基因，与相应野生型水稻ROS1a多肽相比，所述一或多个氨基酸取代、插入或缺失降低DNA糖基化酶活性，所述降低的DNA糖基化酶活性在所述水稻植物中至少在开花至开花后7天的时间内的时间点出现，条件是至少在开花至开花后7天的时间内的时间点，与野生型水稻植物相比，所述水稻植物在发育中的谷粒中具有2％至约60％的DNA糖基化酶活性水平。
在一实施方式中，所述谷粒在其外层或多个外层着色，例如所述谷粒是水稻植物的褐色谷粒或黑色谷粒，所述谷粒包含(i)具有至少2个细胞层或2-7个细胞层的厚度的糊粉层，和(ii)编码降低所述水稻植物中ROS1a基因表达的多核苷酸的外源核酸构建体，其中所述外源核酸构建体包含可操作地连接于启动子的编码所述多核苷酸的DNA区域，所述启动子至少在开花至开花后7天的时间内的时间点在所述水稻植物的发育中的谷粒中表达，使得至少在开花至开花后7天的时间内的时间点，与野生型水稻植物相比，所述水稻植物在发育中的谷粒中具有2％至约60％的DNA糖基化酶活性水平。在一优选实施方式中，所述启动子是除组成型启动子之外的启动子，例如，在发育中的种子的胚乳中表达的启动子。在一最优选的实施方式中，所述启动子是LTP启动子。
在另一实施方式中，所述ROS1a多肽包含与SEQ ID NO:2具有至少95％相同性的氨基酸序列，或所述ROS1a多肽包含与SEQ ID NO:2具有至少95％相同性、至少97.5％相同性、或至少99％相同性的氨基酸序列且所述序列与相应的野生型ROS1a多肽的氨基酸序列不同。
在一实施方式中，所述ROS1a多肽以下基序中的一个或多个或全部：DHGSIDLEWLR(SEQ ID NO:44)、GLGLKSVECVRLLTLHH(SEQ ID NO:45)、AFPVDTNVGRI(SEQ ID NO:46)、VRLGWVPLQPLPESLQLHLLE(SEQ ID NO:47)、ELHYQMITFGKVFCTKSKPNCN(SEQ ID NO:48)和HFASAFASARLALP(SEQ ID NO:49)。
本发明还提供水稻谷粒的群体，所述水稻谷粒各自包含相同的遗传变异、相同的ROS1a基因、相同的ROS1a多肽和/或具有相同的如上面实施方式所描述的特征。也就是，所述群体在遗传学和/或表型上是均一的。这样的水稻谷粒的群体可以获得自或衍生自单一祖先水稻植物或谷粒，例如，可以从祖先植物或谷粒衍生至少2代、至少3代或至少4代。
本发明人已经鉴别到具有降低的DNA糖基化酶活性的变体ROS1a多肽。因此，在另一方面，本发明提供了纯化的和/或重组的ROS1a多肽，其氨基酸序列与相应的野生型ROS1a多肽的氨基酸序列不同，且当与相应野生型ROS1a多肽相比时，其具有降低的DNA糖基化酶活性，优选没有DNA糖基化酶活性。
在一实施方式中，所述纯化的和/或重组的ROS1a多肽包含与SEQ ID NO:2具有至少95％相同性、至少97.5％相同性、或至少99％相同性的氨基酸序列。
在另一方面，本发明提供分离的和/或外源的多核苷酸，其编码本发明的ROS1a多肽。
在另一方面，本发明提供分离的和/或外源的多核苷酸，其当存在于水稻植物中时，降低ROS1a基因的表达。
本领域技术人员完全了解不同类型的能够用于降低靶基因表达的多核苷酸，以及如何能够设计这些多核苷酸。实例包括但不限于，反义多核苷酸、有义多核苷酸、催化性多核苷酸、微RNA、双链RNA(dsRNA)分子或其经加工的RNA产物。
在一实施方式中，所述多核苷酸是dsRNA分子或其经加工的RNA产物，其包含至少19个连续的核苷酸，其与SEQ ID NO:7或8(其中胸腺嘧啶(T)是尿嘧啶(U))的互补序列至少95％相同，或与编码氨基酸序列提供于SEQ ID NO:1或2的多肽的mRNA的互补序列至少95％相同。
在另一实施方式中，所述dsRNA分子是微RNA(miRNA)前体和/或其中所述其经加工的RNA产物是miRNA。
在一实施方式中，所述多核苷酸用于至少在开花至开花后7天的时间内的时间点降低水稻植物发育中的谷粒中的ROS1a基因表达。
在另一方面，本发明提供编码本发明的多核苷酸的核酸构建体和/或载体，其中所述核酸构建体或载体包含可操作地连接于启动子的编码所述多核苷酸的DNA区域，所述启动子至少在开花至开花后7天的时间内的时间点在水稻植物的发育中的谷粒中表达。
在另一方面，本发明提供重组细胞，其包含本发明的外源多核苷酸，或本发明的核酸构建体和/或载体。
在一实施方式中，所述细胞是水稻植物细胞例如水稻谷粒优选水稻糊粉层的细胞。
在一实施方式中，所述外源多核苷酸、核酸构建体或载体被整合进所述细胞的基因组，优选整合进核基因组。
还提供的是水稻植物的细胞，其包含编码ROS1a多肽的ROS1a基因以及遗传变异，优选导入的遗传变异，与相应野生型细胞相比，所述遗传变异降低所述细胞中至少一个ROS1a基因的活性。
在一实施方式中，所述细胞是糊粉层细胞、果皮细胞、珠心突起细胞、子房细胞、种皮细胞或淀粉质胚乳细胞。
在另一方面，本发明提供水稻植物或水稻植物的群体，其产生本发明的谷粒、本发明的多肽、本发明的多核苷酸、本发明的核酸构建体和/或载体和/或其包含本发明的细胞。在一实施方式中，所述水稻植物各自
还提供的是在田间生长的至少100株或至少1000株本发明的水稻植物的群体。在一优选实施方式中，所述田间的水稻植物大部分(>50％)是，优选全部是本发明的水稻植物。在一最优选的实施方式中，所述至少100株或至少1000株水稻植物在遗传学上和/或表型上是相同的，例如包含相同的遗传变异。
在另一方面，本发明提供了产生本发明的细胞的方法，所述方法包括将本发明的外源多核苷酸，或本发明的核酸构建体和/或载体导入至细胞，优选水稻细胞的步骤。
在另一方面，本发明提供产生本发明的水稻植物或来自其的转基因谷粒的方法，所述方法包括以下步骤
i)向水稻细胞导入本发明的外源多核苷酸，或本发明的核酸构建体和/或载体，
ii)从获得自步骤i)的细胞获得转基因水稻植物，所述转基因水稻植物对所述外源多核苷酸、核酸构建体或载体或其部分而言是转基因的，和
iii)任选地从步骤ii)的植物收获谷粒，所述谷粒对所述外源多核苷酸、核酸构建体或载体而言是转基因的，和
iv)任选地从所述转基因谷粒产生一或多代的转基因后代植物，所述后代植物对所述外源多核苷酸、核酸构建体或载体而言是转基因的，
由此产生所述水稻植物或转基因谷粒。
在另一方面，本发明提供产生本发明的水稻植物或来自其的谷粒的方法，所述方法包括以下步骤
i)向水稻细胞导入内源ROS1a基因的突变，使得所述突变的ROS1a基因编码本发明的ROS1a多肽，或不编码ROS1a多肽，
ii)从获得自步骤i)的细胞获得水稻植物，所述水稻植物包含所述内源ROS1a基因的突变，和
iii)任选地从步骤ii)的植物收获谷粒，所述谷粒包含所述内源ROS1a基因的突变，和
iv)任选地从所述谷粒产生一或多代的后代植物，所述后代植物包含所述内源ROS1a基因的突变，
由此产生所述水稻植物或谷粒。
在一实施方式中，所述水稻植物或谷粒包含至少一个编码具有DNA糖基化酶活性的ROS1a多肽的ROS1a基因。
在另一方面，本发明提供选择本发明的水稻植物或水稻谷粒的方法，所述方法包括以下步骤
i)针对本发明的谷粒的产生或针对ROS1a基因中突变的存在或本发明的水稻谷粒的存在，筛选水稻植物或谷粒的群体，所属水稻植物或谷粒各自获得自祖先水稻细胞、谷粒或植物的诱变处理，和
ii)从步骤i)的群体选择水稻植物，其产生本发明的谷粒或其包含突变体ROS1a基因，或选择步骤i)的水稻谷粒，其是本发明的水稻谷粒。
由此选择所述水稻植物或谷粒。
所述方法还包括从所选择的水稻植物产生一或多个后代植物或谷粒或至少两代后代植物，和/或从后代植物收获谷粒的步骤。优选地，所述后代植物对所述遗传变异是纯合的。
在另一方面，本发明提供选择本发明的水稻植物的方法，所述方法包括以下步骤
i)从水稻谷粒产生一或多个后代植物，所述水稻谷粒衍生自两种亲本水稻植物的杂交，
ii)针对本发明的谷粒的产生来筛选步骤i)的所述一或多个后代植物，和
iii)选择产生所述谷粒的后代植物，
由此选择所述水稻植物。在优选实施方式中，所述水稻谷粒是黑米谷粒。
在一实施方式中，筛选步骤i)或ii)包含以下一或多项或全部：
i)针对所述遗传变异对包含来自后代植物的DNA的样品进行分析，
ii)分析获得自后代植物的谷粒的糊粉层的厚度，和
iii)分析所述谷粒或其部分的营养含量。
优选地，所述遗传变异是导入的遗传变异。
在一实施方式中，步骤iii)包含以下一或多项或全部：
i)选择对所述遗传变异是纯合的后代植物，其中与相应野生型水稻植物相比，所述遗传变异降低所述水稻植物中的DNA糖基化酶活性，
ii)选择后代植物，与相应野生型谷粒相比，所述后代植物的谷粒具有增加的糊粉层厚度，
iii)选择后代植物，与相应野生型谷粒或其部分相比，所述后代植物的谷粒或其部分具有改变的营养含量。
在进一步的实施方式中，所述方法还包括：
i)使两种亲本水稻植物杂交，优选其中所述亲本水稻植物中的一种产生本发明的谷粒，或
ii)使来自步骤i)的一或多个后代植物与基因型和不产生本发明的谷粒的第一亲本水稻植物相同的植物回交足够次数，以产生具有所述第一亲本水稻植物大部分基因型但产生本发明的谷粒的植物，和
iii)选择产生本发明的谷粒的后代植物。
还提供的是使用本发明的方法产生的水稻植物和水稻谷粒以及来自其的产品。
还提供的是本发明的外源多核苷酸或本发明的核酸构建体和/或载体用于产生重组细胞、转基因水稻植物或转基因谷粒的用途。
在一实施方式中，所述用途是用于产生本发明的水稻谷粒。
在另一方面，本发明提供鉴别产生本发明的谷粒的水稻植物的方法，所述方法包括以下步骤
i)从水稻植物获得核酸样品，和
ii)针对存在或不存在遗传变异对所述样品进行筛选，与相应野生型水稻植物相比，所述遗传变异降低所述植物中至少一个ROS1a基因的活性。
在一实施方式中，所述遗传变异是以下之一或两者：
a)表达多核苷酸的核酸构建体，或由其编码的多核苷酸，其当存在于水稻植物中时降低ROS1a基因的表达，和
b)基因，或由其编码的mRNA，其表达具有降低的ROS1a多肽活性的突变体ROS1a多肽。
在一实施方式中，存在所述遗传变异表明所述植物的谷粒与相应缺少所述遗传变异的植物相比具有增厚的糊粉层。
在仍另一方面，本发明提供鉴别产生本发明的谷粒的水稻植物的方法，所述方法包括以下步骤
i)从水稻植物获得谷粒，和
ii)针对以下一或多项筛选所述谷粒或其部分
a)增厚的糊粉层，
b)所述谷粒中ROS1a多肽的量和/或活性，和
c)所述谷粒中由ROS1a基因编码的mRNA的量。
在一实施方式中，所述方法鉴别本发明的水稻植物。
在另一方面，本发明提供产生水稻植物部分优选谷粒的方法，所述方法包括，
a)生长本发明的水稻植物或在田间的至少100株这样的水稻植物，和
b)从所述水稻植物收获所述水稻植物部分。
在另一方面，本发明提供从谷粒产生面粉(flour)、麸(bran)、粗面粉(wholemeal)、麦芽(malt)、淀粉或油的方法，所述方法包括：
a)获得本发明的谷粒，和
b)加工所述谷粒以产生所述面粉、麸、粗面粉、麦芽、淀粉或油。
在另一方面，本发明提供从本发明的谷粒或本发明的水稻植物，或从所述谷粒或水稻植物的一部分产生的产品。
在一实施方式中，所述产品包含所述ROS1a基因、所述遗传变异(优选导入的遗传变异)、所述外源核酸构建体和所述增厚的糊粉层中的一或多种或全部。
在一实施方式中，所述部分是水稻麸。
在一实施方式中，所述产品是食物成分、饮料成分、食物产品或饮料产品。实例包括但不限于，
i)所述食物成分或饮料成分选自粗面粉、面粉、麸、淀粉、麦芽和油，
ii)所述食物产品选自：经发酵的或未经发酵的面包、通心粉(pasta)、面条、动物饲料、早餐谷物(breakfast cereals)、零食(snack food)、饼(cake)、糕点(pastry)和含有基于面粉的酱的食物，或
iii)所述饮料产品是包装饮料或含乙醇的饮料。
在另一方面，本发明提供制备本发明的食物或饮料成分的方法，所述方法包括加工本发明的谷粒或来自所述谷粒的麸、面粉、粗面粉、麦芽、淀粉或油以产生所述食物或饮料成分。
在另一方面，本发明提供制备本发明的食物或饮料产品的方法，所述方法包括将本发明的谷粒或来自所述谷粒的麸、面粉、粗面粉、麦芽、淀粉或油和另一食物或饮料成分混合。优选地，用于所述方法的谷粒、麸、面粉、粗面粉、麦芽、淀粉或油的重量以重量计是所述食物产品的至少10％。
还提供的是本发明的谷粒或其部分、本发明的水稻植物或其部分用作动物饲料或食物的用途，或用来产生用于动物消耗的饲料或用于人消耗的食物的用途。
在另一方面，本发明提供了组合物，其包含本发明的多肽、本发明的多核苷酸、本发明的核酸构建体和/或载体或本发明的细胞当中的一或多种，以及一或多种可接受的载体。
除非另外具体指明，本文的任何实施方式根据情况作适当变动应当可应用于任何其他实施方式。
本发明的范围不受本文描述的具体实施方式的限制，所述具体实施方式仅仅是出于示例的目的。显然，功能性等同的产物、组合物和方法属于本发明的范围，如本文所描述一样。
在本说明书全文，除非另外具体指明或上下文另有要求，提及单一步骤，物质组成、步骤组和物质组成组应该认为涵盖一和多个(即，一或多个)这些步骤、物质组成、步骤组或物质组成组。
在下文通过如下非限制性实施例并参考附图描述本发明。
附图简述
图1.ta2基因图位克隆的示意图。每条线底下的数字显示定位群体中的重组体的数目，其显示标记和ta2基因之间的重组。第三条线上的实心条显示水稻基因组上的编码区域。第四条线上的实心条显示基因中的蛋白编码区域；间隔的线代表内含子(内含子1在5'UTR内而在此不显示)。星号显示ta2突变在内含子14的位置，位于参照水稻基因组序列的位置Chr1:6451738处。
图2.cDNA的核苷酸序列，所述cDNA对应于获得自野生型(WT)和ta2基因型的发育中的谷粒的mRNA。野生型和两个ta2序列中的短横线表示不存在核苷酸。ta2mRNA中大多数具有21个核苷酸插入。野生型序列是SEQ ID NO:10，突变体序列是SEQ ID NO:11。
图3.从对应于获得自野生型和ta2发育中的谷粒的mRNA的cDNA预测的氨基酸序列，野生型(上面的氨基酸序列，SEQ ID NO:12)和ta2(下面序列，SEQ ID NO:13)。WT序列中的短横线表示不存在对应于ta2多肽中的7个氨基酸插入(CSNVMRQ；SEQ ID NO:14)的氨基酸。序列下的星号表示在那些位置处野生型和突变体多肽存在相同氨基酸。
图4.拟南芥DME(NM001085058.1)、拟南芥ROS1a(NM129207.4)和水稻ROS1a同源物的氨基酸序列比对。比对下的星号代表在全部三种多肽中保守的氨基酸位置。冒号代表完全保守的氨基酸变化，而单一的点代表部分保守的氨基酸变化。
图5.拟南芥ROS1a(NM129207.4)和水稻ROS1a同源物的氨基酸序列比对。比对下的星号代表在全部三种多肽中保守的氨基酸位置。冒号代表完全保守的氨基酸变化，而单一的点代表部分保守的氨基酸变化。
图6.显示水稻TA2基因在多种组织中的相对表达的实时RT-PCR结果。
序列表说明
SEQ ID NO:1–水稻ROS1a突变体(Ta2)多肽。
SEQ ID NO:2–野生型水稻ROS1a多肽。
SEQ ID NO:3–野生型水稻ROS1b多肽。
SEQ ID NO:4–野生型水稻ROS1c多肽。
SEQ ID NO:5–野生型水稻ROS1d多肽。
SEQ ID NO:6–拟南芥DEMETER多肽。
SEQ ID NO:7–编码水稻ROS1a突变体(Ta2)多肽的全长cDNA。开放读框跨越核苷酸341至6220。
SEQ ID NO:8–编码水稻ROS1a多肽的全长cDNA。开放读框跨越核苷酸341至6199。
SEQ ID NO:9–水稻ROS1a基因。启动子和5’UTR：核苷酸1-4726，翻译起始密码子ATG 4727-4729；翻译终止密码子TAG 15867-15869；从15870-16484的3’-UTR，从16485-16885的所述基因的下游。内含子的核苷酸位置为：内含子1，7494-7724；2，7816-7909；3，9426-9571；4，9652-10452；5，10538-10628；6，10721-10795；7，10865-10951；8，10989-11069；9，11153-11834；10，12282-12385；11，12423-12508；12，12567-12650；13，12791-13017；14，13084-13201；15，13317-14668；16，14708-15732.-11006。该序列包括3'端并不形成该基因一部分的401个核苷酸。
SEQ ID NO:10–在图2提供的部分野生型水稻ROS1a cDNA序列。
SEQ ID NO:11–在图2提供的部分突变体(Ta2)水稻ROS1a cDNA序列。
SEQ ID NO:12–在图3提供的部分野生型水稻ROS1a蛋白序列。
SEQ ID NO:13–在图3提供的部分突变体(Ta2)水稻ROS1a蛋白序列。
SEQ ID NO:14–与野生型(SEQ ID NO:2)相比，ROS1a突变体(Ta2)多肽的额外的氨基酸。
SEQ ID NO 15至43–寡核苷酸引物。
SEQ ID NO 44至49-野生型水稻ROS1a多肽的糖基化酶结构域内高度保守的氨基酸基序。
SEQ ID NO:50–拟南芥ROS1a多肽。
发明详述
通用技术和定义
除非另外特别指明，本文使用的全部技术和科学术语将被认为具有与本领域(例如细胞培养、分子遗传学、植物分子生物学、蛋白质化学和生物化学领域)的普通技术人员通常所理解的相同的含义。
除非另外指明，本发明中所采用的重组蛋白、细胞培养和免疫学技术是本领域技术人员公知的标准程序。这样的技术在来源于以下的文献到处被描述和解释,例如J.Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning,John Wiley and Sons(1984)、J.Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarbourLaboratory Press(1989)、T.A.Brown(editor),Essential Molecular Biology:APractical Approach,Volumes 1and 2,IRL Press(1991)、D.M.Glover and B.D.Hames(editors),DNA Cloning:A Practical Approach,Volumes 1-4,IRL Press(1995and1996)以及F.M.Ausubel et al.(editors),Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience(1988,包括直到目前的全部更新)、EdHarlow and David Lane(editors)Antibodies:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbour Laboratory,(1988)、以及J.E.Coligan et al.(editors)Current Protocols inImmunology,John Wiley&Sons(包括直到目前的全部更新)。
术语“和/或”，例如“X和/或Y”，应当理解为指“X和Y”或“X或Y”，且应当被认为是给两种含义或两种含义之一均提供明确支持。
如本文所用，术语“约”，除非有相反指明，指的是指定值的+/-10％，更优选+/-5％，更优选+/-2％，甚至更优选+/-1％。术语“约”包括准确的指定值。
本说明书通篇词语“包含(comprise)”，或其变形如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”，将理解为意味着包括所陈述的元素、整数或步骤，或元素、整数或步骤的组，但不排除任何其它元素、整数或步骤，或元素、整数或步骤的组。
选择的定义
术语“糊粉”和“糊粉层”在本文中可互换使用。糊粉层是水稻谷粒胚乳的最外层，区别于内部的淀粉质胚乳，且围绕淀粉质胚乳和部分的胚。构成糊粉层的细胞因此是胚乳(谷粒的淀粉质组分)的最外的细胞。尽管其技术上是胚乳的一部分，有时候称作外周胚乳，糊粉层从实际观点被认为是麸的一部分，由于其和麸的果皮和种皮层一起被去除。不像淀粉质胚乳的细胞，糊粉层细胞在谷粒成熟保持活着。糊粉层是水稻谷粒营养价值的重要部分，其包含矿物质、维生素例如A和B族维生素，植物素(phytochemical)和纤维。
本发明的实施方式涉及“细胞层”的数目范围，至少部分是因为在本发明的谷粒的任一横切点，在所述横切内的任意单一点处或横切面之间观察到的细胞的层在一定程度会有变化。更具体而言，具有例如七层细胞的糊粉层可能没有七层围绕整个内部淀粉质胚乳，但有七层围绕所述内部淀粉质胚乳的至少一半。
术语“增厚的”当用于涉及本发明的谷粒的糊粉层时，是当比较本发明的谷粒与相应的野生型谷粒时使用的相对性术语。当与相应的野生型谷粒比较时，本发明的谷粒的糊粉层具有增加的细胞数目和/或增加的细胞层数。由此糊粉层厚度增加，如以μm测量的。在一实施方式中，所述厚度被增加至少50％，优选至少100％，且可以增加多达500％或600％，各百分比是相对于相应的野生型谷粒的糊粉层的厚度，且理解各百分比为沿着所述谷粒腹侧且优选沿着整个谷粒的平均增加。在一实施方式中，糊粉层的厚度跨越所述谷粒整个横切面测定。在一实施方式中，糊粉层的厚度通过至少对所述谷粒的腹侧的分析来测定。在另一实施方式中，与其中糊粉层通常具有规律朝向的矩形细胞的相应野生型谷粒相比，本发明的谷粒的增厚的糊粉层包含不同大小和不规则朝向的细胞。
多肽
如本文所用，术语“ROS1多肽”指的是DNA糖基化酶相关分子的蛋白家族成员，其与SEQ ID No:1-5的氨基酸序列相关，相关在于它们与SEQ ID No:1-5所示的氨基酸序列的一或多个具有至少95％的相同性。ROS1多肽包括野生型水稻的ROS1a、ROS1b、ROS1c和ROS1d多肽，包括天然发生的变体和其突变体形式。ROS1多肽包括在野生型水稻植物中发现的这样的多肽以及其人工产生或天然发现(例如在籼稻和粳稻水稻植物中发现的)的变体，且具有或不具有DNA糖基化酶活性，包括具有一些DNA糖基化酶活性但水平与相应野生型ROS1多肽相比降低的ROS1多肽。野生型水稻植物的ROS1多肽的实例具有SEQ ID NO:2-5之一所示氨基酸序列的那些，以及具有与SEQ ID NO:2-5所示氨基酸序列中的一或多个至少95％、至少97％、或优选至少99％相同的氨基酸序列且天然发现的变体多肽。如本文所用，ROS1多肽并不包括Demeter(DME)多肽，其是相关的DNA糖基化酶家族，与SEQ ID NO:1-5在氨基酸序列上的相同性远小于95％。
如本文所用，“ROS1a多肽”指的是DNA糖基化酶相关分子，其氨基酸序列与SEQ IDNO:2至少95％相同，优选地与SEQ ID NO:2至少97％相同或更优选地至少99％相同。ROS1a多肽包括在野生型水稻植物中发现的多肽以及其人工产生或天然发现的变体，且具有或不具有DNA糖基化酶活性，条件是它们与SEQ ID NO:2具有要求的氨基酸序列相同性水平。例如，其序列提供为SEQ ID NO:1的ROS1a多肽被认为不具有DNA糖基化酶活性，其仍然是本文所定义的ROS1a多肽。在一优选实施方式中，所述ROS1a多肽具有一些DNA糖基化酶活性但水平与相应野生型ROS1a多肽相比降低，所述野生型ROS1a多肽的氨基酸序列提供为SEQ IDNO:2。例如，表3列出被认为具有降低的DNA糖基化酶活性的ROS1a突变体多肽。
本领域技术人员能够容易地使用已知的技术将ROS1a多肽与其他结构相关蛋白例如其他ROS1多肽，尤其是ROS1b、ROS1c和ROS1d多肽区分开，例如使用计算机系统发生分析或蛋白比对。ROS1a多肽因此可以单独基于结构特征被鉴别为ROS1a多肽。例如，见本文的图4和5。本发明的ROS1a多肽可以具有或可以不具有DNA糖基化酶活性，或可以具有与野生型ROS1a多肽相比降低的DNA糖基化酶活性，所述野生型ROS1a多肽例如具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
如本文所用，术语“其序列不同于相应的野生型ROS1a多肽的氨基酸序列”或类似语段，是比较性术语，其中本发明的ROS1a多肽的氨基酸序列不同于其衍生自的和/或最紧密相关的天然存在的蛋白的氨基酸序列。在一实施方式中，所述ROS1a多肽的氨基酸序列相对于相应的野生型氨基酸序列具有一个或多个插入、缺失或氨基酸取代(或这些的组合)。所述ROS1a多肽相对于相应的野生型ROS1a多肽可以具有2个、3个、4个、5个或6-10个氨基酸取代。在一优选实施方式中，所述ROS1a多肽相对于相应的野生型多肽仅仅具有单一插入、单一缺失或单一氨基酸取代。在该语境中，“单一插入”和“单一缺失”包括其中多个(如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多)邻接的氨基酸分别被插入或缺失，且“相应的野生型多肽”指的是所述变体衍生自的野生型多肽和/或所述变体最紧密相关的天然多肽。所述ROS1a多肽可以是截短的ROS1a多肽，其可以由例如相对于其衍生自的野生型ROS1a基因，在蛋白开放读框中包含未成熟翻译终止密码子的ROS1a基因编码，或所述ROS1a多肽可以是全长的，即和相应的野生型ROS1a多肽具有相同数目的氨基酸残基。天然存在的(野生型)ROS1a多肽的实例是氨基酸序列示于SEQ ID NO:2的多肽，而仅仅具有单一插入、缺失或氨基酸取代的变体ROS1a多肽的实例在SEQ ID NO:1和表3给出。
如本文所用，术语“DNA糖基化酶活性”指的是参与碱基切除修复的酶(分类于EC号EC 3.2.2)。所述酶一般也具有DNA裂解酶活性，其中DNA碱基被切除且主链DNA链被切割。在一实施方式中，如本发明上下文所用“DNA糖基化酶活性”涉及主动去甲基化，其中5-甲基胞嘧啶残基被切除并被未甲基化的胞嘧啶替换。在一优选实施方式中，具有DNA糖基化酶活性的本发明的ROS1a多肽具有至少五个可鉴别的基序。一个是螺旋-发夹-螺旋(HhH)基序(例如SEQ ID NO:2的氨基酸1491-1515或同源氨基酸序列)。另一个是甘氨酸/脯氨酸富含基序，其接着是保守的天冬氨酸(GPD)，以及四个保守的半胱氨酸残基(在SEQ ID NO:2的氨基酸1582-1598的区域)以容纳[4Fe-4S]簇。还有一个赖氨酸富含基序(例如SEQ ID NO:2中氨基酸87-139或同源氨基酸序列)。不像HhH DNA糖基化酶超家族成员的其它成员，ROS1a多肽家族成员在中央糖基化酶结构域的侧翼含有两个额外的保守结构域(结构域A和B)。在水稻ROS1a多肽(SEQ ID NO:2)中，结构域A出现在氨基酸859-965，糖基化酶结构域出现在氨基酸1403-1616，而结构域B出现在氨基酸1659-1933。结构域A在氨基酸882-892含有重复的混合电荷簇。DNA糖基化酶活性可以使用本领域已知的标准技术测量，例如描述于实施例8。
野生型水稻ROS1a多肽的糖基化酶结构域内的高度保守的氨基酸基序包括DHGSIDLEWLR(SEQ ID NO:44，SEQ ID NO:2中氨基酸1467-1477)、GLGLKSVECVRLLTLHH(SEQID NO:45，SEQ ID NO:2中氨基酸1493-1509)、AFPVDTNVGRI(SEQ ID NO:46，SEQ ID NO:2中氨基酸1511-1521)、VRLGWVPLQPLPESLQLHLLE(SEQ ID NO:47，SEQ ID No:2中氨基酸1523-1543)、ELHYQMITFGKVFCTKSKPNCN(SEQ ID NO:48，SEQ ID NO:2中氨基酸1569-1590)和HFASAFASARLALP(SEQ ID NO:49，SEQ ID NO:2中氨基酸1600-1613)。这些基序中可以存在或者不存在一个或两个氨基酸取代。通过比对野生型水稻ROS1a(SEQ ID No:2)和来自拟南芥的DME多肽(SEQ ID NO:6)和/或拟南芥ROS1a多肽(见图4和5)可以容易地鉴别其他保守的氨基酸。关于鉴别保守氨基酸的进一步的指导可以获得自Kapazoglou et al.(2012)。
如本文所用，术语“与相应野生型ROS1a多肽相比其降低DNA糖基化酶活性”，“与相应野生型ROS1a多肽相比其具有降低的DNA糖基化酶活性，优选无DNA糖基化酶活性”，或类似语句，是相对性术语，其中变体/突变体ROS1a多肽的DNA糖基化酶活性低于其衍生自和/或最紧密相关的天然存在的蛋白。例如，如本领域技术人员将理解的，本文所描述的水稻Ta2突变体(SEQ ID NO:1)，当与相应野生型水稻ROS1a多肽(SEQ ID NO:2)相比时，具有降低的DNA糖基化酶活性。具有降低的DNA糖基化酶活性的ROS1a多肽的其他实例包含对应于表3中描述的氨基酸的突变/变异，其赋予增厚的糊粉层表型，例如用另一氨基酸如苯丙氨酸取代对应于SEQ ID NO:2的氨基酸编号156的氨基酸位置处的丝氨酸，用另一氨基酸如苯丙氨酸取代对应于SEQ ID NO:2的氨基酸编号214的氨基酸位置处的丝氨酸，用另一氨基酸如天冬酰胺取代对应于SEQ ID NO:2的氨基酸编号1413的氨基酸位置处的丝氨酸，用另一氨基酸如缬氨酸取代对应于SEQ ID NO:2的氨基酸编号441的氨基酸位置处的丙氨酸，用另一氨基酸如苯丙氨酸取代对应于SEQ ID NO:2的氨基酸编号1357的氨基酸位置处的丝氨酸，用另一氨基酸如丝氨酸取代对应于SEQ ID NO:2的氨基酸编号501的氨基酸位置处的赖氨酸，和用另一氨基酸如赖氨酸取代对应于SEQ ID NO:2的氨基酸编号482的氨基酸位置处的精氨酸。在一特别优选的实施方式中，所述谷粒具有至少一些DNA糖基化酶活性，优选一些ROS1a DNA糖基化酶活性，因为证据提示在卵细胞中和种子发育早期缺失DNA糖基化酶活性对于水稻植物是致死的。在一实施方式中，与来自相应的缺乏在谷粒中降低DNA糖基化酶活性的遗传变异(优选导入的遗传变异)的等基因植物的谷粒相比，所述谷粒具有约30％-98％，或约40％-98％，或约40％-90％，或约40-85％，或约40％-80％的较少DNA糖基化酶活性。
通过“基本上纯化的多肽”或“纯化的多肽”，我们指的是通常已经和其在天然状态时伴随的脂质、核酸、其它肽和其它污染分子分开的多肽。优选地，所述基本上纯化的多肽至少90％不含其天然伴随的其它组分。在一实施方式中，本发明的多肽具有不同于天然存在的ROS1a多肽的氨基酸序列，即，是如上文定义的氨基酸序列变体。
本发明的谷粒、植物和宿主细胞可以包含编码本发明的多肽的外源多核苷酸。在这些例子中，所述谷粒、植物和细胞产生重组多肽。术语“重组的”在多肽语境下指的是当由细胞产生时由外源多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸通过重组DNA或RNA技术如转化被导入至所述细胞或祖先细胞。一般而言，所述细胞包含非内源基因，所述非内源基因导致待产生的所述多肽的改变的量。在一实施方式中，“重组多肽”是由外源(重组的)多核苷酸在植物细胞中表达制造的多肽。
术语“多肽”和“蛋白”一般可互换使用。
多肽的％相同性通过GAP(Needleman and Wunsch,1970)分析(GCG程序)使用缺口创建罚分＝5，和缺口延伸罚分＝0.3来确定。询问序列至少长1000个氨基酸，而GAP分析在至少1000个氨基酸的区域比对两个序列。更优选地，询问序列至少长1,250个氨基酸，而GAP分析在至少1,250个氨基酸的区域比对两个序列。更优选地，询问序列至少长1,500个氨基酸，而GAP分析在至少1,500个氨基酸的区域比对两个序列。甚至更优选地，GAP分析在它们的整个长度比对两个序列，对于ROS1a多肽是大约1800至2100个氨基酸残基。
对于限定的多肽，将理解高于上文提供的那些％相同性数字将涵盖优选的实施方式。因此，如果适用，根据最小％相同性数字，优选所述多肽包含与相关指定SEQ ID NO至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，更优选至少99％，更优选至少99.1％，更优选至少99.2％，更优选至少99.3％，更优选至少99.4％，更优选至少99.5％，更优选至少99.6％，更优选至少99.7％，更优选至少99.8％，和甚至更优选至少99.9％相同。
如本文所用，语句“在对应于氨基酸编号的位置处”或其变形指的是与周围氨基酸相比较的氨基酸的位置。就这一点而言,在一些实施方式中本发明的多肽可以具有缺失或取代突变，其改变氨基酸在与例如SEQ ID NO:2比对时的相对位置。确定两种紧密相关的蛋白之间的相应氨基酸位置完全在本领域技术人员的能力范围内。
本发明的多肽的氨基酸序列突变体可以通过向本发明的核酸导入合适的核苷酸改变来制备，或者通过所需多肽的体外合成制备。这样的突变体包括，例如，氨基酸序列内的残基缺失、插入或取代。可以进行缺失、插入和取代的组合以达到最终构建体，条件是所述最终肽产物具有所需的特性。优选的氨基酸序列突变体相对于参考野生型多肽具有仅仅一个、两个、三个、四个或少于10个氨基酸改变。与相应的野生型天然存在的ROS1a多肽相比，本发明的突变体多肽具有降低的“ROS1a多肽活性”，所述野生型天然存在的ROS1a多肽例如包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽。
突变体(改变的)多肽可以使用本领域已知的任何技术制备，例如，使用定向进化或理性设计策略(见下文)。衍生自突变的/改变的DNA的产物可以使用本文描述的技术容易地筛选以确定当与包含提供为SEQ ID NO:2的氨基酸序列的ROS1a多肽中的一种或多种或全部相比较时，它们是否具有降低的ROS1a多肽活性，例如降低的DNA糖基化酶活性。例如，所述方法可以包括产生表达所述突变的/改变的DNA的转基因植物和确定i)所述突变的/改变的DNA对糊粉层厚度的影响和ii)ROS1a基因是否已经被突变/改变。
在设计氨基酸序列突变体中，突变位点的位置和突变的性质将取决于待修饰的特性。用于突变的位点可以个别地或成系列地修饰，例如通过(1)用非保守氨基酸选择取代，(2)缺失靶残基，或(3)在定位位点邻近插入另外的残基。
氨基酸序列缺失通常范围为约1-15个残基，更优选约1-10个残基以及典型地约1-5个连续残基。
取代突变体在多肽分子中有至少一个氨基酸残基被去除且不同的残基被插入其位置。如果不期望保留某一活性，或者要降低某一活性，优选进行非保守取代，尤其是在相关蛋白家族中高度保守的氨基酸位置处。保守氨基酸取代的实例示于表1，因此非保守取代将是表1没显示的那些。
在一实施方式中，与天然存在的多肽相比，突变体/变体多肽具有一个或两个或三个或四个氨基酸改变。在一优选实施方式中，所述改变位于本文提供的不同ROS1a多肽之间高度保守的一或多个基序内，特别是位于已知的保守结构结构域内。如本领域技术人员将明白，可以合理地预测当在细胞中表达时，这样的改变改变所述多肽的活性。
基于和紧密相关的酶，特别是DNA糖基化酶的比较，本发明的多肽的一级氨基酸序列可以用来设计其变体/突变体。如本领域技术人员将理解，在紧密相关的蛋白中高度保守的残基比较不保守的残基更可能被改变，特别是用非保守取代，且活性降低(见上文)。
表1.保守取代
还包括在本发明的范围内的是本发明的多肽，其在合成后被不同地修饰，如，通过细胞中的翻译后修饰，例如通过磷酸化，其可能调节它的活性。
多核苷酸和基因
本发明涉及多种多核苷酸。如本文所用，“多核苷酸”或“核酸”或“核酸分子”指的是核苷酸的聚合物，其可以是DNA或RNA，且包括基因组DNA、mRNA、cRNA、dsRNA和cDNA。其可以是细胞、基因组或合成来源(例如在自动化合成仪上制备)的DNA或RNA，且可以与碳水化合物、脂质、蛋白或其他材料组合，用荧光或其他基团标记，或附着于固体支持物上以实现本文定义的特定活性，或包含自然界没有发现的，本领域技术人员公知的一个或多个修饰的核苷酸。所述聚合物可以是单链的，基本上双链的或部分双链的。碱基配对如本文所用指的是核苷酸之间的标准碱基配对，包括G:U碱基配对。“互补”指的是两个多核苷酸能够沿着它们长度的一部分或者沿着一个或两个的全长碱基配对(杂交)。“杂交的多核苷酸”指的是多核苷酸实际上与其互补物碱基配对。术语“多核苷酸”在本文和术语“核酸”可互换使用。本发明的优选的多核苷酸编码本发明的多肽。
通过“分离的多核苷酸”我们指的是通常已经与其在天然状态下所伴随的或连接的多核苷酸序列分开的多核苷酸，如果该多核苷酸是在自然界发现的。优选地，所述分离的多核苷酸至少90％不含其天然伴随的其它组分，如果它是在自然界发现的。优选地所述多核苷酸不是天然存在的，例如是以自然界没有发现的方式通过共价连接两个较短的多核苷酸序列(嵌合多核苷酸)。
本发明涉及基因活性的降低以及嵌合基因的构建和用途。如本文所用，术语“基因”包括任何脱氧核糖核苷酸序列，其包括蛋白编码区或其在细胞中转录但不翻译，以及伴随的非编码和调控区域。这样的伴随区域一般位于编码区或转录区邻近，在5’和3’端，每侧距离约2kb。就这点而言，所述基因可以包括天然伴随给定基因的控制信号如启动子、增强子、终止信号和/或多腺苷酸化信号，或异源控制信号，在异源控制信号的情况下所述基因被称作“嵌合基因”。位于编码区5’且存在于mRNA上的序列被称作5’非翻译序列。位于编码区3’或下游且存在于mRNA上的序列被称作3’非翻译序列。术语“基因”涵盖基因的cDNA和基因组形式两者。
“等位基因”指的是细胞、个体植物内或群体内遗传序列的一种特定形式，在基因序列内的至少一个，且频繁地多于一个的变体位点的序列中，该特定形式与相同基因的其它形式不同。在不同等位基因之间不同的这些变体位点处的序列称作“变异”或“多态性”。“多态性”如本文所用指的是植物不同物种、栽培种、株系或个体的本发明的遗传基因座处的等位基因之间的核苷酸序列的变异。“多态性位置”是所述基因的序列内在所述序列差异发生处的预选择的核苷酸位置。在一些情况中，遗传多态性导致所述基因编码的多肽内的氨基酸序列变异，且因此多态性位置可以导致将氨基酸序列中的多态性定位于所述多肽序列中的预定位置处。在其它例子中，多态性位置可以在基因的非多肽编码区域中，例如在启动子区域中且由此可以影响基因的表达水平。典型的多态性是缺失、插入或取代。这些可以包括单个核苷酸(单核苷酸多态性或SNP)或两个或更多个核苷酸。
如本文所用，“突变”是在植物或其部分中产生表型改变的多态性。如本领域已知的，一些多态性是沉默的，例如蛋白编码区中由于遗传密码的冗余而不改变所编码多肽的氨基酸序列的单核苷酸改变。二倍体植物一般具有单一基因的一个或两个不同等位基因，但如果基因的两个拷贝是相同的则仅仅具有一个，即，所述植物对于该等位基因是纯合的。多倍体植物通常具有任何特定基因的多于一个的同源物。例如，多倍体小麦具有三个亚基因组(通常称作基因组)，称为A、B和D基因组，因此对其大部分基因具有三个同源物，A、B和D基因组各一个。
术语“编码ROS1a多肽的ROS1a基因”或“ROS1a基因”如本文所用指的是编码本文所定义的ROS1a多肽的核苷酸序列。所述ROS1a基因可以是内源的天然存在的基因，或者包含如本文所定义的遗传变异(优选导入的遗传变异)。在本发明的谷粒中编码ROS1a多肽的ROS1a基因可以具有内含子或可以不具有内含子。在一个实例中，本发明的谷粒来自水稻且ROS1a基因的至少一个等位基因编码与来自相应野生型水稻植物的ROS1a多肽(例如其包含提供于SEQ ID NO:2的氨基酸序列)相比具有降低的DNA糖基化酶活性的ROS1a多肽。这样的具有降低的DNA糖基化酶活性的ROS1a多肽的实例是水稻Ta2突变体(SEQ ID NO:1)。
如本文所用，语句“ROS1a基因的失活”或“ROS1a基因的表达降低”或其变形指的是降低(部分地)，或完全阻止编码功能性ROS1a多肽的基因表达的任何遗传变异。这样的遗传变异包括在所述基因启动子区域的突变，其降低待转录基因的转录，例如通过使用基因编辑来从ROS1a基因缺失或取代核苷酸，或内含子剪接突变，其改变形成mRNA的剪接的量或位置。
含有转录区域的基因的基因组形式或克隆可以被称作“内含子”或“间插区域”或“间插序列”的非编码区域(其相对于基因的外显子可以是同源的或异源的)间断。如本文所用“内含子”是基因的片段，其被转录为初级RNA转录物的一部分但不存在于成熟mRNA分子中。内含子从核或初级转录物中被去除或“剪掉”；内含子因此不存在于信使RNA(mRNA)中。如本文所用“外显子”指的是对应于RNA序列的DNA区域，其存在于成熟mRNA或成熟的RNA分子(其中RNA分子不翻译的情况)中。在翻译期间，mRNA功能为指定初生多肽中的氨基酸的序列或顺序。术语“基因”包括编码本文描述的本发明的蛋白的全部或部分的合成或融合分子，以及上述任一个的互补核苷酸序列。基因可以被导入合适的载体用于在细胞中的染色体外维持，或优选地，用于整合进宿主基因组。
如本文所用，“嵌合基因”指的是包含共价连接的序列的任何基因，所述共价连接的序列没有发现在自然界中被连接。一般而言，嵌合基因包含没有在自然界发现在一起的调控和转录或蛋白编码序列。因此，嵌合基因可以包含衍生自不同来源的调控序列和编码序列，或衍生自相同来源但以不同于在自然界中发现的方式排列的调控序列和编码序列。在一实施方式中，ROS1a的蛋白编码区域与对所述ROS1a基因为异源的启动子或多腺苷酸化/终止子区域可操作地连接，由此形成嵌合基因。在一可选实施方式中，编码在水稻植物谷粒中存在时下调谷粒中ROS1a多肽的产生和/或活性的多核苷酸的基因与对所述多核苷酸为异源的启动子或多腺苷酸化/终止子区域可操作地连接，由此形成嵌合基因。
如本文所用术语“内源”指的是在与正在研究的植物处于相同发育阶段的未修饰的植物中正常存在或产生的物质。“内源基因”指的是在生物体基因组中其天然位置的天然基因。如本文所用，“重组核酸分子”、“重组多核苷酸”或其变形因此指的是已经通过重组DNA技术构建或修饰的核酸分子。术语“外来多核苷酸”、“外源多核苷酸”或“异源多核苷酸”等指的是通过实验操作导入进细胞的基因组的任何核酸。
外来或外源基因可以是被插入进非天然生物体的基因，导入进天然宿主内新位置的天然基因，或嵌合基因。“转基因”是已经通过转化程序导入进基因组中的基因。术语“遗传学修饰”包括通过转化或转导将基因导入细胞中，在细胞中突变基因以及对已经完成这些行为的细胞或生物体或它们的后代中的基因的调控进行改变或调节。
此外，在多核苷酸(核酸)语境中的术语“外源”指的是多核苷酸存在于天然并不包含该多核苷酸的细胞中。所述细胞可以是包含导致所编码多肽的产生的量改变的非内源多核苷酸(例如增加外源多肽表达的外源多核苷酸)的细胞，或者是其天然状态下不产生所述多肽的细胞。本发明的多肽的增加的产生本文也称作“过表达”。本发明的外源多核苷酸包括没有和其存在的转基因(重组)细胞或无细胞表达系统的其他组分分开的多核苷酸，以及在这样的细胞或无细胞系统产生的随后纯化掉至少一些其它组分的多核苷酸。所述外源多核苷酸(核酸)可以是天然存在的核苷酸的连续延伸(stretch)，或包含被连接以形成单个多核苷酸的来自不同来源(天然存在的和/或合成的)的两个或更多个核苷酸连续延伸。一般而言，这样的嵌合多核苷酸包含至少一个编码本发明的多肽的开放读框，其与适于驱动所述开放读框在感兴趣的细胞中转录的启动子可操作地连接。
多核苷酸的％相同性通过GAP(Needleman and Wunsch,1970)分析(GCG程序)使用缺口创建罚分＝5，和缺口延伸罚分＝0.3来确定。询问序列至少长3,000个核苷酸，而GAP分析在至少3,000个核苷酸的区域比对两个序列。甚至更优选地，询问序列至少长3,750个核苷酸而GAP分析在至少3,750个核苷酸的区域比对两个序列。甚至更优选地，询问序列至少长4,500个核苷酸而GAP分析在至少4,500个核苷酸的区域比对两个序列。甚至更优选地，GAP分析在它们的整个长度比对两个序列。
对于限定的多核苷酸，将理解高于上文提供的那些％相同性数字将涵盖优选的实施方式。因此，如果适用，根据最小％相同性数字，优选所述多核苷酸包含与相关指定SEQID NO至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，更优选至少99％，更优选至少99.1％，更优选至少99.2％，更优选至少99.3％，更优选至少99.4％，更优选至少99.5％，更优选至少99.6％，更优选至少99.7％，更优选至少99.8％，和甚至更优选至少99.9％相同。
本发明还涉及寡核苷酸的用途，例如用于筛选本发明的多核苷酸或编码本发明的多肽的多核苷酸的方法中。如本文所用，“寡核苷酸”是至多长50个核苷酸的多核苷酸。这样的寡核苷酸的最小大小是寡核苷酸和本发明的核酸分子上的互补序列之间形成稳定杂交所需的大小。它们可以是RNA、DNA或两者的组合或衍生物。寡核苷酸一般是10-30个核苷酸的相对短的单链分子，通常长15-25个核苷酸。当用作探针或在扩增反应中用作引物时，这样的寡核苷酸的最小大小是所述寡核苷酸与靶核酸分子上的互补序列形成稳定杂交所需的大小。优选地，所述寡核苷酸长至少15个核苷酸，更优选至少18个核苷酸，更优选至少19个核苷酸，更优选至少20个核苷酸甚至更优选至少25个核苷酸。用作探针的本发明的寡核苷酸一般与标记缀合，例如放射性同位素、酶、生物素、荧光分子或化学发光分子。
本发明包括这样的寡核苷酸，其能够被用作例如探针来鉴别核酸分子，或用作引物来产生核酸分子。探针和/或引物可以用于从其它物种克隆本发明的多核苷酸的同源物。此外，本领域已知的杂交技术也可以用于在基因组或cDNA文库筛选这样的同源物。
本发明的多核苷酸和寡核苷酸包括在严格条件下与SEQ ID NO:1或2的序列中的一或多个杂交的那些。如本文所用，严格条件是(1)采用低离子强度和高温洗涤，例如，0.015M NaCl/0.0015M柠檬酸钠/0.1％NaDodSO4，在50℃；(2)在杂交期间采用变性剂例如甲酰胺，例如，具有0.1％牛血清白蛋白的50％(vol/vol)甲酰胺、0.1％Ficoll、0.1％聚乙烯吡咯烷酮、具有750mM NaCl的pH 6.5的50mM磷酸钠缓冲液、75mM柠檬酸钠在42℃；或(3)采用50％甲酰胺，5xSSC(0.75M NaCl,0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 6.8)、0.1％焦磷酸钠、5x Denhardt’s溶液、超声处理的鲑精DNA(50g/ml)、0.1％SDS和10％右旋糖酐，在0.2x SSC和0.1％SDS中42℃。
与天然存在的分子相比，本发明的多核苷酸可以具有一个或多个突变，其是核苷酸残基的缺失、插入或取代。突变体可以是天然存在(也就是说，分离自天然来源)的或合成的(例如，通过在所述核酸上进行定点诱变)。本发明的多核苷酸或寡核苷酸的变体包括水稻基因组的不同大小的分子和/或能够与水稻基因组杂交的分子，其接近本文定义的参考多核苷酸或寡核苷酸分子，优选内源ROS1a基因。例如，变体可以包含额外的核苷酸(例如1、2、3、4个或更多)或较少核苷酸，只要它们仍然和靶区域杂交。此外，少数核苷酸可以被取代而不影响所述寡核苷酸与靶区域杂交的能力。此外，可以容易地设计变体，其杂交至植物基因组中本文定义的特定寡核苷酸所杂交的区域附近(例如50个核苷酸内)。具体而言，这包括多核苷酸，其编码相同的多肽或氨基酸序列但由于遗传密码子的冗余性而在核苷酸序列上不同。术语“多核苷酸变体”和“变体”还包括天然存在的等位基因变体。
遗传变异
如本文所用，术语“遗传变异”指的是谷粒的一或多个细胞，优选发育中的谷粒的糊粉层、果皮、珠心突起、子房、种皮或淀粉质胚乳中的一种或多种或全部中的细胞，或本发明的植物或其部分的细胞，其具有可以人工导入的或可以在水稻植物中天然存在的(例如，杂交以产生本发明的植物)遗传变异。
如本文所用，术语“一或多个导入的遗传变异”指的是谷粒的一或多个细胞，优选发育中的谷粒的糊粉层、果皮、珠心突起、子房、种皮或淀粉质胚乳中的一种或多种或全部中的细胞，或本发明的植物或其部分的细胞，其具有人工导入的遗传变异。在一优选实施方式中，所述谷粒或所述植物或其部分的每个细胞均包含所述导入的遗传变异。如本领域技术人员将理解，有许多类型的可以制备的遗传变异，例如但不限于，编码降低ROS1a基因表达的外源多核苷酸(例如dsRNA分子或微RNA)的核酸构建体；编码外源多核苷酸的核酸构建体，所述外源多核苷酸编码氨基酸序列不同于相应野生型ROS1a多肽的氨基酸序列的ROS1a多肽，且所述ROS1a多肽与相应野生型ROS1a多肽相比具有降低的(优选有一些但可以没有)DNA糖基化酶活性；通过基因编辑操作基因组以降低内源ROS1a基因的活性；以及使用TILLING来导入突变并选择产生具有降低的ROS1a多肽DNA糖基化酶活性的谷粒的植物。
如本文所用，术语“降低至少一个ROS1a基因的活性”，由于其涉及“一或多个遗传变异”或“一或多个导入的遗传变异”，指的是所述遗传变异导致与相应野生型水稻植物相比，所述基因表达的ROS1a多肽的量或活性的降低。在一实施方式中，所述谷粒包含具有至少一些DNA糖基化酶活性的ROS1a多肽。
在一实施方式中，所述遗传变异并不下调非ROS1a多肽的DNA糖基化酶活性。例如，所述遗传变异并不使本发明的水稻植物中ROS1b、ROS1c和ROS1d多肽各自的DNA糖基化酶活性降低超过10％或30％。可选地，所述遗传变异使ROS1b、ROS1c和ROS1d多肽中的至少一种的DNA糖基化酶活性降低至少30％。
RNA干扰
RNA干扰(RNAi)特别可用于特异性降低基因表达，如果该基因编码蛋白，其导致特定蛋白降低的产生。尽管不希望受理论限制，Waterhouse et al.(1998)已提供dsRNA(双链体RNA)可用于降低蛋白产生的机制的模型。该技术基于存在这样的dsRNA分子，其含有与感兴趣的基因的mRNA或其一部分基本上相同的序列。方便地，所述dsRNA在重组载体或宿主细胞中产生自单一启动子，其中有义和反义序列通过一不相关序列侧接，使得所述有义和反义序列杂交形成dsRNA分子而所述不相关序列形成环结构。合适的dsRNA分子的设计和产生完全在本领域技术人员的能力范围内,尤其是考虑到Waterhouse et al.(1998)、Smith etal.(2000)、WO 99/32619、WO 99/53050、WO 99/49029和WO 01/34815。
在一实例中，导入DNA，其指导合成与ROS1a基因具有同源性的至少部分双链RNA产物。所述DNA因此包含有义和反义序列两者，其当转录成RNA时，能够杂交形成双链RNA区。在本发明的一实施方式中，所述有义和反义序列由包含内含子的间隔物区分开，所述内含子当转录成RNA时被剪切掉。已经显示该设置导致更高的基因沉默效率(Smith et al.,2000)。双链区可以包含一个或两个RNA分子，转录自一个或两个DNA区域。双链分子的存在被认为触发来自内源系统的响应，其破坏所述双链RNA以及也破坏来自靶基因的同源RNA转录物，有效地降低或消除靶基因的活性。
杂交的有义和反义序列的长度各自应当为至少19个连续的核苷酸，优选至少30个或至少50个连续的核苷酸，更优选地，至少100个或至少200个连续的核苷酸。一般而言，使用相应于靶基因mRNA区域的100-1000个核苷酸的序列。可以使用相应于整个基因转录物的全长序列。有义序列与靶向的转录物的相同性程度(以及因此也是反义序列与靶转录物的互补序列的相同性)应当为至少85％、至少90％或95-100％，优选与靶向的序列相同。所述RNA分子当然可以包含不相关序列，其功能为稳定所述分子。所述RNA分子可以在RNA聚合酶II或RNA聚合酶III启动子控制下表达。后者的实例是tRNA或snRNA启动子。
优选的小干扰RNA(“siRNA”)分子包含与靶mRNA的约19-25个连续核苷酸相同的核苷酸序列。优选地，所述siRNA序列开始于双核苷酸AA，包含约30-70％的GC含量(优选30-60％，更优选40-60％以及更优选约45-55％)，且与其要导入的生物体的基因组中除了靶之外的任何核苷酸序列不具有高的百分比相同性，如通过标准BLAST搜索确定。
对于本发明有用的dsRNA可以使用常规方法容易地产生。
微RNA
微RNA(microRNA，缩写为miRNA)是长度通常为19-25个核苷酸(在植物中通常为约20-24个核苷酸)的非编码RNA分子，其衍生自形成不完美茎-环结构的较大的前体。miRNA一般与表达待降低的靶mRNA的一区域完全互补，但不需要完全互补。
miRNA结合至靶信使RNA转录物(mRNA)上的互补序列，通常导致转录抑制或靶降解和基因沉默。如本领域公知，可以基于天然miRNA设计人工miRNA(amiRNA)用于降低任何感兴趣基因的表达。
在植物细胞中，据信miRNA前体分子大部分在核中加工。pri-miRAN(含有一或多个局部双链或“发夹”区域以及mRNA通常的5’“帽”和多聚腺苷酸尾巴)被加工为较短的miRNA前体分子，所述miRNA前体分子也包括茎-环或回-叠结构且被称作“pre-miRNA”。在植物中，pre-miRNA被不同的DICER-样(DCL)酶切割，产生miRNA:miRNA*双链体。在运输出核之前，这些双链体被甲基化。
在细胞质中，来自miRNA:miRNA双链体的miRNA链被选择性地并入活性RNA-诱导的沉默复合物(RISC)用于靶识别。RISC-复合物含有一个特定亚组的Argonaute蛋白，其执行序列特异性基因抑制(见例如，Millar and Waterhouse,2005；Pasquinelli et al.,2005；Almeida and Allshire,2005)。
对于本发明有用的微RNA可以使用常规方法容易地产生。例如，ROS1a amiRNA(人工微RNA)构建体的设计可以基于Fahim et al.(2012)描述的通用方法。可以使用WMD3软件(www.wmd3.weigelworld.org/)鉴别ROS1a中合适的amiRNA靶。所述amiRNA靶根据以下四个标准进行选择：1)相对的5’不稳定性，通过使用5’-末端处富含AT而在3’-末端处富含GC的序列；2)在第1位的U和在切割位点(在第10位和11位之间)处的A；3)在第1至9位和第13位至21位分别最大1个和4个错配；和4)当amiRNA和靶RNA杂交是具有小于-30kcal mol-1的预测的自由能(ΔG)(Ossowski et.al.,2008)。对于基因特异性的表达降低，在这样的区域选择候选amiRNA序列，其在比对OsROS1a的全部同源物时显示最低的同源性，因此降低脱靶降低ROS1同源物和部分同源物的表达的可能。水稻miR395(Guddeti et al.,2005；Jones-Rhoades and Bartel,2004；Kawashima et al.,2009)可以选择为用于插入amiRNA序列的amiRNA主链。为了设计和制备构建体，miR395中的五个内源miRNA靶被用于TA2敲低的五个amiRNA靶替换。
共抑制
基因能够抑制相关内源基因和/或已经存在于基因组中的转基因的表达，该现象称为同源性-依赖型基因沉默。大部分的同源性依赖型基因沉默的例子分为两类-作用于转基因的转录水平的那些，以及转录后作用的那些。
转录后同源性依赖型基因沉默(即，共抑制)描述了转基因植物中转基因和相关内源的或病毒基因的表达的丧失。共表达经常但不总是在转基因转录物丰富时发生，且其通常被认为是在mRNA加工、定位和/或降解水平上被触发。存在若干模型解释共抑制如何工作(见Taylor,1997)。
共抑制涉及以针对用于其表达的启动子的有义方向向植物导入额外拷贝的基因或其片段。所述有义片段的大小、其与靶基因区域的对应性以及其与靶基因的序列相同性程度可以由本领域技术人员确定。在一些例子中，所述额外拷贝的基因序列干扰靶植物基因的表达。实施共抑制的方法参考WO 97/20936和EP 0465572。
反义多核苷酸
术语“反义多核苷酸”应当被认为意思为与编码内源多肽的特定mRNA分子至少一部分互补的且能够感染转录后事件例如mRNA翻译的DNA或RNA分子。反义方法的使用时本领域公知的(see for example,G.Hartmann and S.Endres,Manual of AntisenseMethodology,Kluwer(1999))。反义技术在植物中的使用已经由Bourque(1995)and Senior(1998)综述。Bourque(1995)列出了如何在植物系统中利用反义序列作为基因失活的方法的大量实例。Bourque还表示获得任何酶活的100％抑制可能是不必要的，因为部分抑制将更可能在所述系统中导致可测量的改变。Senior(1998)表示反义方法现在是十分良好建立的用于操作基因表达的技术。
在一实施方式中，反义多核苷酸在生理学条件下杂交，即是，所述反义多核苷酸(其是完全或部分单链)至少能够在细胞中正常条件下与编码内源ROS1a多肽的mRNA形成双链多核苷酸。
反义分子可以包括对应于结构基因的序列或影响对基因表达或剪接事件的控制的序列。例如，所述反义序列可以对应于内源基因的靶向的编码序列，或5’-非翻译序列(UTR)或3’-UTR或这些的组合。其可以与内含子序列部分互补，内含子序列在转录期间或之后会被剪切掉，优选地仅仅与靶基因的外显子序列互补。鉴于UTR通常更高的多样性，靶向这些区域提供基因抑制的更高的特异性。
反义序列的长度应当为至少19个连续的核苷酸，优选至少30个或至少50个核苷酸，且更优选地，至少100个、200个、500个或1000个核苷酸。可以使用与整个基因转录物互补的全长序列。长度最优选是100-2000个核苷酸。反义序列与靶向的转录物的相同性程度应当为至少90％且更优选95-100％，一般是100％相同。所述反义RNA分子当然可以包含不相关序列，其功能为稳定所述分子。
使用位点特异性核酸酶的基因组编辑
基因组编辑使用工程化的核酸酶，其包含与非特异性DNA切割模块融合的序列特异性DNA结合结构域。这些嵌合的核酸酶使得可以进行高效和精准遗传修饰，通过诱导靶向的DNA双链缺口，刺激细胞内源细胞DNA修复机制以修复所诱导的缺口。这样的机制包括。例如，易错非同源末端连接(NHEJ)和同源性指导的修复(HDR)。
在存在具有延伸的同源臂的供体质粒时，HDR能够导致导入单个或多个转基因以校正或替换现在的基因。在不存在供体质粒时，NHEJ介导的修复对靶产生小的插入或缺失突变，其导致基因断裂。
本发明的方法中有用的工程化核酸酶包括锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子-样(TAL)效应物核酸酶(TALEN)和CRISPR-Cas9类型位点特异性核酸酶。
一般而言，核酸酶编码基因通过质粒DNA、病毒载体或体外转录的mRNA递送至细胞。使用荧光替代物报告载体(fluorescent surrogate reporter vector)也允许富集ZFN-、TALEN-或CRISPR修饰的细胞。
复杂基因组经常含有多拷贝的预目标DNA靶相同或高度同源的序列，可能导致脱靶活性和细胞毒性。为解决该问题，基于结构(Miller et al.,2007；Szczepek et al.,2007)和基于选择(Doyon et al.,2011；Guo et al.,2010)的方法可以用来产生改良的ZFN和TALEN异二聚体，其具有优化的切割特异性和降低的毒性。
根据本发明的一优选实施方式，为了通过ZFN靶向遗传重组或突变，必须自宿主DNA中鉴别出两个9bp的锌指DNA识别序列。这些识别位点可以是彼此颠倒的方向并且由大约6bp的DNA分开。然后通过设计和产生特异性地在靶基因组结合DNA的锌指组合，然后将所述锌指连接至DNA切割结构域来生成ZFN。
转录激活因子-样(TAL)效应物核酸酶(TALEN)包含TAL效应物DNA结合结构域和核酸内切酶结构域。
TAL效应物是植物致病细菌的蛋白，其被所述病原体注射进植物细胞，其中它们转移进核并作为转录因子来启动特定植物基因。TAL效应物的一级氨基酸序列指定其结合的核苷酸序列。因此，可以预测TAL效应物的靶位点，且出于结合特定核苷酸序列的目的，可以工程化并产生TAL效应物。
与TAL效应物编码核酸序列融合的是编码核酸酶或核酸酶一部分的序列，一般是II型限制性内切核酸酶如FokI的非特异性切割结构域(Kim et al.,1996)。其他有用的内切核酸酶可以包括，例如，HhaI、HindIII、Nod、BbvCI、EcoRI、BglI、和AlwI。可以利用一些内切核酸酶(如，FokI)仅仅作为二聚体起作用的事实来增强TAL效应物的靶特异性。例如，在一些例子中，每个FokI单体可以与识别不同DNA靶序列的TAL效应物序列融合，且仅仅当两个识别位点紧密相邻时，失活的单体靠在一起产生功能性酶。通过要求DNA结合来激活核酸酶，可以产生高度位点特异性的限制性酶。
序列特异性TALEN可以识别细胞中预先选定的靶核苷酸序列内的特定序列。因此，在一些实施方式中，可以针对核酸酶识别位点扫描靶核苷酸序列，且基于靶序列可以选择具体的核酸酶。在另外的例子中，TALEN可以被工程化为靶向特定的细胞序列。
核酸构建体
本发明包括含有本发明的多核苷酸或可用于本发明的多核苷酸的核酸构建体，以及含有这些的载体和宿主细胞，产生和使用它们的方法，以及其用途。
本发明涉及可操作地连接(conected)或连接(linked)的元件。“可操作地连接(operably connected)”或“可操作地连接(operably linked)”等指的是多核苷酸以功能关系的连接。一般而言，可操作地连接的核酸序列是连续地连接的，且如果需要拼接两个蛋白编码区，则连续且符合读框地连接。当RNA聚合酶将两个编码序列转录成单一RNA，如果翻译则然后翻译成具有来自两个编码序列的氨基酸的单一多肽，则编码序列可操作地连接于另一编码序列。编码序列不必相互连续，只要所表达的序列最终被加工产生所需的蛋白。
如本文所用，术语“顺式作用序列”、“顺式作用元件”或“顺式调控区域”或“调控区域”或类似术语应当被认为是意指核苷酸的任何序列，其当相对于可表达的遗传序列合适地放置或连接，能够调控(至少部分地)所述遗传序列的表达。本领域技术人员将明白顺式调控区域可以能够在转录或转录后水平上激活、沉默、增强、抑制或者改变基因序列的表达水平和/或细胞类型特异性和/或发育特异性。在本发明的一优选实施方式中，所述顺式作用序列是激活子序列，其增强或刺激可表达的遗传序列的表达。
将启动子或增强子元件可操作地连接至可转录多核苷酸指的是将所述可转录多核苷酸(如蛋白编码多核苷酸或其他转录物)置于启动子的调节控制下，启动子然后控制该多核苷酸的转录。在异源启动子/结构基因组合的构建中，通常优选将启动子或其变体置于离所述可转录多核苷酸的转录起始位点一段距离，所述距离大约与该启动子和其在天然设定下控制的蛋白编码区域(即该启动子所衍生自的基因)之间的距离相同。如本领域已知，该距离可以做出一些变化而不丧失功能。类似地，调控序列元件(如，操纵子、增强子等)相对于待置于其控制下的可转录多核苷酸的优选位置通过所述元件在其天然设定(即其所衍生自的基因)中的位置来定义。
如本文所用，“启动子”或“启动子序列”指的是基因的一个区域，通常在RNA编码区域的上游(5’)，其在感兴趣的细胞中控制转录的起始和水平。“启动子”包括经典基因组基因的转录调控序列，例如TATA盒和CCAAT盒序列，以及响应于发育和/或环境刺激或以组织特异性或细胞类型特异性的方式改变基因表达的额外的调控元件(即上游激活序列、增强子和沉默子)。启动子通常但不一定(如一些PolIII启动子)被置于其调控表达的结构基因的上游。此外，所述包含启动子的调控元件通常置于基因的转录起始位点2kb内。启动子可以含有额外的特定调控元件，位于起始位点更远端以进一步增强在细胞中的表达，和/或改变其可操作连接的结构基因的表达时间和诱导性。
“组成型启动子”指的是这样的启动子，其指导可操作地连接的可转录序列在生物体如植物的许多组织或全部组织中表达。如本文所用，术语组成型并不一定表示基因在全部细胞类型中以相同水平表达，而是所述基因在广范围的细胞类型中表达，不过经常可检测到一些水平差异。“选择性表达”如本文所用指的是差不多专门地在例如植物的特定器官(例如，胚乳、胚、叶、果实、块茎或根)表达。在一优选实施方式中，启动子选择性地或优先地在植物(优选水稻植物)的谷粒中表达。选择性表达因此与组成型表达相反，组成型表达指的是在植物经历的大多数或全部条件下在植物的许多或全部组织中表达。
选择性表达也可以导致基因表达的产物被分隔于特定植物组织、器官或发育阶段。分隔于特定的亚细胞位置例如质体、胞质溶胶、液泡或周质空间可以通过在基因产物的结构中包含合适的信号来实现，例如，信号肽，用于运输进所需的细胞区室，或者在半自主细胞器(质体和线粒体)的情况下，通过将转基因和合适的调控序列直接整合进所述细胞器基因组。
“组织特异性启动子”或“器官特异性启动子”这样的启动子，相对于例如植物中的许多其他组织或器官(优选如果不是全部则大部分其他组织或器官)，其优先地在一种组织或器官表达。一般而言，所述启动子在特定组织或器官中以比其它组织或器官高10倍的水平表达。
适合用于本发明的种子特异性启动子是油菜芸苔素基因启动子(US 5,608,152)、蚕豆(Vicia faba)USP启动子(Baumlein et al.,1991)、拟南芥油质蛋白启动子(WO 98/45461)、菜豆(Phaseolus vulgaris)菜豆球蛋白启动子(US 5,504,200)、芸苔(Brassica)Bce4启动子(WO 91/13980)或豆球蛋白B4启动子(Baumlein et al.,1992)，以及导致在水稻等中的种子特异性表达的启动子。特别合适的启动子是大麦LPT2或LPT1基因启动子(WO95/15389和WO 95/23230)或描述于WO 99/16890的启动子(来自大麦醇溶蛋白基因的启动子)。其它启动子包括Broun et al.(1998)、Potenza et al.(2004)、US 20070192902和US20030159173描述的那些。在一实施方式中，所述种子特异性启动子优先地在种子的限定部分例如胚乳，优选发育中的糊粉层中表达。在另一实施方式中，所述种子特异性启动子在种子萌发后不表达或仅仅以低水平表达。
在一实施方式中，所述启动子至少在开花和开花后7天的时间内的时间点是有活性的，或在整个该时期期间是有活性的。这样的启动子的实例是ROS1a基因启动子。
在一实施方式中，所述可操作地连接于降低ROS1a基因表达的外源多核苷酸的启动子不是高MW麦谷蛋白启动子。
本发明考虑的启动子可以对于待转化的宿主植物是天然的，或者可以衍生自替代来源，其中所述区域在宿主植物中是有功能的。其它来源包括农杆菌T-DNA基因，例如用于胭脂碱、章鱼碱(octapine)、甘露碱生物合成的基因的启动子，或者其它冠瘿碱启动子，组织特异性启动子(见例如，US 5,459,252和WO 91/13992)；来自病毒(包括宿主特异性病毒)的启动子，或部分或全部合成启动子。本领域公知许多在单子叶和双子叶植物中有功能的启动子(见例如，Greve,1983；Salomon et al.,1984；Garfinkel et al.,1983；Barker etal.,1983)；包括分离自植物和病毒的启动子如花椰菜花叶病毒启动子(CaMV 35S,19S)。用于评价启动子活性的非限制性方法公开于Medberry et al.(1992和1993),Sambrook etal.(1989,同上)和US 5,164,316。
可选地或额外地，所述启动子可以是诱导型启动子或发育调节的启动子，器能够驱动导入的多核苷酸在例如植物的合适发育阶段表达。其它可采用的顺式作用序列包括转录和/或翻译增强子。增强子区域是本领域技术人员熟知的，且可包括ATG翻译起始密码子和邻近序列。当被包含时，所述起始密码子应当与涉及外来或外源多核苷酸的编码序列符合读框以确保整个序列的翻译(如果其是待翻译)。可以从转录起始区域的来源或从外来或外源多核苷酸提供翻译起始区域。所述序列还可以衍生自选为驱动转录的启动子的来源，且可以被特别地修饰以便增加mRNA的翻译。
本发明的核酸构建体可以包含约50至1000个核苷酸碱基对的3’非翻译序列，其可以包括转录终止序列。3’非翻译序列可以含有转录终止信号，其可包含或可不包含多腺苷酸化信号以及能够影响mRNA加工的其它调控信号。多腺苷酸化信号作用为向mRNA前体的3’末端添加多腺苷酸束。多腺苷酸化信号通常识别为与规范形式5’AATAAA-3’存在同源性，尽管变异不常见。不包括多腺苷酸化信号的转录终止序列包括PolI或PolIII RNA聚合酶的终止子，其包含连续的四个或更多个胸苷。合适的3’非翻译序列的实例是来自根癌土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的章鱼碱合酶(ocs)基因或胭脂碱合酶(nos)基因的含有多腺苷酸化信号的3’转录的非翻译区(Bevan et al.,1983)。合适的3’非翻译序列也可以衍生自植物基因，例如核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(ssRUBISCO)基因，不过也可以使用本领域技术人员已知的其它3’元件。
由于插入于转录起始位点和编码序列起点之间的DNA序列，即非翻译5’前导序列(5’UTR)，能够影响基因表达(如果其被转录和翻译)，也可以采用特定的前导序列。合适的前导序列包括含有选择为指导外来或内源DNA序列的最优表达的序列的那些。例如，这样的前导序列包括优选的共有序列，其能够增加或维持mRNA稳定性且防止不合适的翻译起始，例如描述于Joshi(1987)。
载体
本发明包括用于操作或转移遗传构建体的载体的用途。“嵌合载体”是指核酸序列可以插入或克隆进去的核酸分子，优选DNA分子，其例如衍生自质粒、噬菌体或植物病毒。载体优选地是双链DNA且含有一或多个唯一的限制性位点且可以能够在限定的宿主细胞包括靶细胞或组织或其祖先细胞或组织中自主复制，或者能够整合进限定的宿主的基因组中使得克隆的序列能够复制。因此，载体可以是自主复制型载体，即以染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如线性的或闭环质粒，染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可含有确保自我复制的任何工具。可选地，所述载体可以是这样的载体，当导入细胞时，其被整合进受体细胞的基因组并且和其被整合进的染色体一起复制。载体系统可以包含单一载体或质粒，两种或更多种载体或质粒(其一起含有待转入宿主细胞的总DNA)，或转座子。载体的选择一般取决于载体和所述载体待导入的细胞的相容性。载体还可以包括选择标记例如抗生素抗性基因、除草剂抗性基因或其它能用来选择合适的转化体的基因。这样的基因的实例是本领域技术人员熟知的。
本发明的核酸构建体可以被导入至载体例如质粒中。质粒载体一般包括额外的核酸序列使得表达盒可以在原核细胞和真核细胞中容易选择、扩增和转化，例如pUC-衍生的载体、pSK-衍生的载体、pGEM-衍生的载体、pSP-衍生的载体、pBS-衍生的载体、或含有一或多个T-DNA区域的双元载体。额外的核酸序列包括允许载体自主复制的复制原点；选择标记基因，优选编码抗生素或除草剂抗性；独特的多克隆位点，提供多个位点以插入核酸序列或核酸构建体中编码的基因；和增强原核和真核(特别是植物)细胞转化的序列。
“标记基因”是指赋予表达所述标记基因的细胞不同表型且因此允许这样转化的细胞和不含有所述标记的细胞区分开的基因。选择标记基因赋予这样的性状，使得因此能够基于对选择剂(例如除草剂、抗生素、放射性标记、热或其它伤害未转化的细胞的处理)的抗性而进行“选择”。选择标记基因(或报告基因)赋予这样的性状，使得能够通过观察或测试，即通过“筛选”而进行鉴别(例如未转化的细胞中不存在的β-半乳糖苷酶、荧光素酶、GFP或其它酶活性)。标记基因和感兴趣的核苷酸序列不必是连接的。
为了有利于鉴别转化体，作为外来或外源多核苷酸或除了外来或外源多核苷酸之外，期望核酸构建体包含可选择的或可筛选的标记基因。标记的实际选择不是关键的，只要其与选择的植物细胞组合是有功能的(即，选择性的)。标记基因和感兴趣的外来或外源多核苷酸不一定是连接的，因为未连接的基因的共转化(例如描述于US 4,399,216)也是植物转化中有效的方法。
细菌选择标记的实例是赋予抗生素抗性的标记，例如氨苄青霉素、红霉素、氯霉素或四环素抗性，优选卡那霉素抗性。用于植物转化的选择的示例性选择标记包括但不限于hyg基因，其编码潮霉素B抗性；新霉素磷酸转移酶(nptII)基因，其赋予对卡那霉素、巴龙霉素、G418的抗性；来自鼠肝的谷胱甘肽-S-转移酶基因，赋予对谷胱甘肽衍生的除草剂(例如描述于EP 256223)的抗性；谷氨酰胺合成酶基因，过表达时赋予对谷氨酰胺合成酶抑制剂(例如草丁膦,描述于WO 87/05327)的抗性；来自Streptomyces viridochromogenes的乙酰转移酶基因,赋予对选择剂草丁膦的抗性,例如描述于EP 275957；编码5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的基因，赋予对N-膦酰甲基甘氨酸的耐受性，例如描述于Hincheeet al.(1988)；bar基因，赋予对双丙氨磷的抗性，例如描述于WO91/02071；腈水解酶基因例如来自臭鼻杆菌(Klebsiella ozaenae)的bxn，其赋予对溴苯腈的抗性(Stalker et al.,1988)；二氢叶酸还原酶(DHFR)基因，赋予对氨甲蝶呤的抗性(Thillet et al.,1988)；突变体乙酰乳酸合酶基因(ALS)，其赋予对咪唑啉酮、磺酰脲或ALS-抑制性化学品的抗性(EP154,204)；突变的氨基苯甲酸酯合酶基因，赋予对5-甲基色氨酸的抗性；或茅草枯脱卤素酶基因，赋予对除草剂的抗性。
优选的可筛选标记包括但不限于编码β-葡糖苷酸酶(GUS)的uidA基因，其已知多种生色底物；编码生色底物已知的β-半乳糖苷酶基因；水母荧光素(aequorin)基因(Prasher et al.,1985)，其可用于钙敏感的生物荧光检测；绿色荧光蛋白基因(Niedz etal.,1995)或其衍生物；萤光素酶(luc)基因(Ow et al.,1986)，其允许生物荧光检测；以及其它本领域已知的可筛选标记。本说明书所用的“报告分子”是指这样的分子，通过其化学性质，提供分析学可鉴别的信号，其有利于通过参考蛋白产物测定启动子活性。
优选地，核酸构建体被稳定地并入进例如本发明的植物或细胞的基因组。因此，所述核酸包含允许所述分子被并入进基因组的合适的元件，或所述构建体被置于合适的载体中，所述载体能够被并入植物细胞的染色体。
本发明的一实施方式包括重组载体，其包括至少一个本发明的多核苷酸分子，所述多核苷酸分子被插入进任何能将核酸分子递送进宿主细胞的载体。这样的载体含有异源核酸序列，其是并不天然地发现与本发明的核酸分子邻近的核酸序列，且优选地衍生自除了所述核酸分子衍生自的物种之外的物种。所述载体可以是RNA或DNA，是原核的或真核的，且典型地是病毒或质粒。
许多适于稳定转染植物细胞或适于建立转基因植物的载体已经描述于例如Pouwels et al.,Cloning Vectors:A Laboratory Manual,1985,supp.1987；Weissbachand Weissbach,Methods for Plant Molecular Biology,Academic Press,1989；和Gelvin et al.,Plant Molecular Biology Manual,Kluwer Academic Publishers,1990。一般而言，植物表达载体包括，例如，在5’和3’调控序列的转录控制下的一或多个克隆的植物基因和显性选择标记。这样的植物表达载体还可含有启动子调控区域(如控制诱导型或组成型表达、环境调节或发育调节表达、或细胞或组织特异性表达的调控区域)、转录起始位点、核糖体结合位点、RNA加工信号、转录终止位点、和/或多腺苷酸化信号。
ROS1a多肽的水平可以通过降低水稻植物中编码所述蛋白的基因的表达水平来调节，导致增加的糊粉层厚度。基因的表达水平可以通过改变每细胞的拷贝数来调节，例如通过导入合成的遗传构建体，所述构建体包含编码序列和与其可操作连接且在细胞中有功能的转录控制元件。可以选择和筛选那些具有良好的转基因表达水平和/或特异性的多种转化体，其产生于转基因整合位点附近的内源序列的影响。转基因表达的良好水平和模式是导致增加的糊粉层厚度的水平和模式。可选地，可以针对具有增加的糊粉层厚度的个体株系选择来自育种程序的经诱变的种子群体或植物群体。
重组细胞
本发明的另一实施方式包括重组细胞，其包含用本发明的一或多个重组分子转化的宿主细胞，或其后代细胞。将核酸分子转化进细胞可以通过任何方法实现，通过所述方法能够将核酸分子插入细胞。转化技术包括但不限于，转染、电穿孔、显微注射、脂转染、吸附和原生质体融合。重组细胞可以保持单细胞或可以生长成组织、器官或多细胞生物体。本发明的经转化的核酸分子可以保持在染色体外，或能够以保留它们被表达的能力的方式整合进转化的(即重组的)细胞的染色体的一或多个位点。优选的宿主细胞是植物细胞，更优选水稻细胞。
具有遗传变异的植物
本文用作名词的术语“植物”意指完整植物并且意指植物界的任何成员，但用作形容词时指的是存在于、获得自、衍生自或涉及植物的任何物质，例如，植物器官(如叶、茎、根、花)、单细胞(如花粉)、种子、植物细胞等。根和枝条(shoot)从其出现的小植株和萌发的种子也包括在“植物”的含义内。术语“植物部分”如本文所用指的是一或多个植物组织或器官，其获得自植物且其包含植物的基因组DNA。植物部分包括营养性结构(例如叶、茎)、根、花器官/结构、种子(包括胚、子叶和种皮)、植物组织(例如维管组织、基本组织等)、细胞和它们的后代。如本文所用，“植物细胞”指的是获得自植物或在植物中的细胞，且包括原生质体或衍生自植物的其它细胞、产配子细胞以及再生成完整植物的细胞。植物细胞可以是培养中的细胞。“植物组织”是指植物中的或获得自植物的(外植体)分化的组织，或衍生自未成熟或成熟的胚、种子、根、枝条、果实、块茎、花粉、肿瘤组织(如冠瘿瘤)以及多种形式的培养中的植物细胞的聚集物(如愈伤)的未分化组织。种子中的或来自种子的示例性植物组织为子叶、胚和胚轴。本发明因此包括植物和植物部分和包含这些的产品。
术语“谷粒”和“种子”在本文中可互换使用。“谷粒”根据上下文可以指植物中成熟的谷粒，植物中发育中的谷粒，收获的谷粒，或指加工(如研磨或抛光)后其中大部分谷粒保持完整的谷粒，或指吸胀或萌发后的谷粒。成熟的谷粒通常具有少于约18-20％的水分含量。在一实施方式中，本发明的发育中的谷粒为授粉后至少约10天(DAP)。在一实施方式中，本发明的发育中的谷粒至少包括开花和开花后七天之间的谷粒。
本文所用“转基因植物”指的是具有本文所限定的一或多个遗传变异的植物，例如含有在相同物种、品种或栽培种的野生型植物中没有发现的核酸构建体。也就是，转基因植物(经转化的植物)含有它们在转化之前不含的遗传材料(转基因)。所述转基因可以包括获得自或衍生自植物细胞、或另一种植物细胞、或非植物来源的遗传序列或合成的序列。一般而言，所述转基因已经通过人工操作被导入进植物，例如通过转化，但是如本领域技术人员所承认，也可以使用任何方法。所述遗传材料优选地稳定整合进植物的基因组。所导入的遗传材料可以包含相同物种天然存在的序列，但以重排的顺序或以元件的不同排列(例如反义序列。含有这样的序列的植物以“转基因植物”包括在本文。
“非转基因植物”是没有通过重组DNA技术导入遗传材料而遗传修饰的植物。
如本文所用，“野生型”指的是没有根据本发明进行修饰的细胞、组织、谷粒或植物。野生型细胞、组织或植物用作对照以比较外源核酸的表达水平或和如本文描述修饰的细胞、组织、谷粒或植物比较性状修饰的程度和性质。
如本文所用，术语“相应的野生型”水稻植物或谷粒或类似语句，指的是这样的水稻植物或谷粒，其包含本发明的水稻植物或谷粒的至少50％、更优选至少75％、更优选至少95％、更优选至少97％、更优选至少99％及甚至更优选99.5％的基因型，但是不包含所述一或多个遗传变异(例如导入的遗传变异)和/或增厚的糊粉层，所述一或多个遗传变异各自在植物或谷粒中降低ROS1a基因的活性。在一实施方式中，本发明的水稻谷粒或植物相对于野生型水稻谷粒或植物，除了所述一或多个遗传变异(如导入的遗传变异)外是等基因的。优选地，所述相应的野生型植物或谷粒与本发明的植物/谷粒的祖先属于/来自相同的栽培种或品种，或是缺乏所述一或多个遗传变异和/或不具有增厚的糊粉层的姊妹植物株系，经常称作“分离子(segregant)”。在一实施方式中，本发明的水稻植物或谷粒具有这样的基因型，其与水稻栽培种中花11(ZH11)的基因型相同性小于50％。ZH11自从1986年就已经商购可得。
如本发明上下文所定义的转基因植物包括已经用重组技术遗传修饰的水稻植物的后代，其中所述后代包含感兴趣的基因。这样的后代可以通过初代转基因植物的自交获得或通过这样的植物和另一种水稻植物杂交获得。这通常是为了在期望的植物或植物器官中调节至少一种本文定义的蛋白的产生。转基因植物部分包括全部部分以及所述植物包含所述转基因的细胞，例如，培养的组织、愈伤和原生质体。
如本文所用，术语“水稻”指的是稻(Oryza)属的任何物种，包括其祖先，以及其通过和其它物种杂交产生的后代。优选地所述植物是商业化栽培的稻属物种，比如水稻(Oryza sativa)的或适于商业化生产谷粒的株系或栽培种或品种。
如本文所用，“褐米(brown rice)”指的是水稻包括麸皮层和胚(胚芽)的整个谷粒，但不包括谷壳，谷壳通常在收获期间已经被去除。也即是，褐米没有被抛光以去除糊粉层和胚。“褐”指的是在麸皮层存在褐色或黄褐色色素。褐米被认为是全谷粒。如本文所用，“白米”(研磨的米)意指已经从其去除麸皮和胚芽的水稻谷粒，即基本上全水稻谷粒的淀粉质胚乳。水稻谷粒的这些分类均可以有短、中等或长谷粒形式。与白米相比，褐米具有较高含量的蛋白质、矿物质和维生素以及在其蛋白质含量中较高的赖氨酸含量。
如本文所用，“着色米(pigmented rice)”包括黑米和红米，其各自在糊粉层含有色素，例如原花青素类(单宁类)。着色米比非着色米具有更高的核黄素含量，但具有类似的硫胺素(thimine)含量。“黑米”由于花青苷类而具有黑色或几乎黑色的麸皮层，且可以在煮了之后变成深紫色。“紫米”(也已知为“禁米”)是黑米的短谷粒变体，且包括在本文定义的黑米中。其在未煮状态是紫色，而煮了是深紫色。“红米”含有多种花青苷类，其给出麸皮红/褐红的颜色,包括矢车菊素-3-葡糖苷(菊色素)和芍药花青素-3-葡糖苷(oxycoccicy-anin)。
这些类型的水稻谷粒各自可以被处理以防止萌发，例如通过煮(沸腾)或通过干燥加热。褐米和着色米一般煮20-40分钟，取决于期望的结构，而白米一般煮12-18分钟。煮或加热降低水稻谷粒中抗营养因子例如胰蛋白酶抑制剂、水稻巯基蛋白酶抑制剂(oryzacystatin)和血凝素(凝集素)的水平，其通过变性这些蛋白，但是不降低植酸盐的含量。如本领域已知的，水稻谷粒在煮之前可以在水中浸泡，或者慢煮更长时间。水稻谷粒还可以被破碎、煮半熟(parboiled)或热稳定化。水稻麸可以被蒸汽处理以稳定它，例如在100℃约6分钟。
在一实施方式中，本发明的谷粒与相应的野生型谷粒相比具有延迟的谷粒成熟。延迟的成熟可以通过使用结实率(％)测定，结实率必须计算谷粒成熟期之前植物中被种子填充的小花的百分比。
在一实施方式中，本发明的谷粒与相应的野生型谷粒相比具有增加的萌发能力。例如，在生长室中无湿度控制在28℃，12h光/12h暗循环下，所述谷粒具有相应的野生型谷粒约70％至约80％，或约75％，优选70％至100％的萌发能力。如本文所用，术语“萌发”定义为根穿过种皮可视地出现的时候。
在一实施方式中，本发明的植物相对于野生型亲本品种(例如包含SEQ ID No:2所示氨基酸序列的ROS1a多肽的等基因植物)具有正常植物高、育性(雄性和雌性)、谷粒大小和千粒重中的一或多种或全部。在一实施方式中，本发明的谷粒能够产生具有以下一或多种或全部的植物：相对于野生型亲本品种的正常植物高、育性(雄性和雌性)、谷粒大小和千粒重。如本文所用，术语“正常”可通过测量与本发明的植物在相同条件下生长的野生型亲本品种的相同性状来确定。在一实施方式中，为了是正常的，本发明的植物与野生型亲本品种相比具有所限定特征的水平/数目等的+/-10％，更优选+/-5％，更优选+/-2.5％，甚至更优选+/-1％。
转基因植物，如本发明上下文所定义包括植物(以及所述植物的部分和细胞)和它们的后代，其已经使用重组技术遗传修饰以在期望的植物或植物器官中导致产生至少一种本发明的多肽。转基因植物可以使用本领域已知的技术产生，例如一般描述于A.Slater etal.,Plant Biotechnology-The Genetic Manipulation of Plants,Oxford UniversityPress(2003)和P.Christou and H.Klee,Handbook of Plant Biotechnology,John Wileyand Sons(2004)的那些。
在一优选实施方式中，所述转基因植物对于各个或每个已经被导入的基因或核酸构建体(转基因)是纯合的，使得它们的后代不对期望的表型分离。所述转基因植物还可以对所导入的转基因是杂合的，例如，从杂交种子生长而来的F1后代。这样的植物可以提供例如本领域公知的优势如杂种优势。
在一实施方式中，选择本发明的水稻植物的方法还包括针对至少一个“其它遗传标记”分析来自所述植物的DNA样品。如本文所用，所述“其它遗传标记”可以是与植物的期望性状连锁的任何分子。这样的标记是本领域技术人员熟知的且包括与决定性状的基因连锁的分子标记，所述性状例如疾病抗性、产量、植物形态、谷粒质量、休眠性状、谷粒颜色、种子中赤霉酸含量、植物高、花颜色等。这样的基因的实例是Rht基因，其决定半矮化生长习性并因此决定倒伏抗性。
已经描述了四种直接递送基因进细胞的一般方法：(1)化学方法(Graham et al.,1973)；(2)物理方法如显微注射(Capecchi,1980)；电穿孔(见例如，WO 87/06614，US 5,472,869、5,384,253，WO 92/09696和WO 93/21335)；以及基因枪(见例如，US 4,945,050和US 5,141,131)；(3)病毒载体(Clapp,1993；Lu et al.,1993；Eglitis et al.,1988)；和(4)受体介导的机制(Curiel et al.,1992；Wagner et al.,1992)。
可以使用的加速方法包括，例如微粒轰击等。用于递送转化核酸分子进植物细胞的方法的一个实例是微粒轰击。该方法由Yang et al.,Particle BombardmentTechnology for Gene Transfer,Oxford Press,Oxford,England(1994)综述。非生物学颗粒(微粒)可以用核酸包被并通过推进力递送进细胞。示例性的颗粒包括包含钨、金、铂等的那些。除了是可重复地转化单子叶植物的有效手段，微粒轰击的特别优势是无需分离原生质体或对农杆菌感染的易感性。适于本发明使用的颗粒递送系统是氦气加速PDS-1000/He枪，可从Bio-Rad Laboratories获得。为了轰击，可以将未成熟胚或衍生的靶细胞如来自未成熟胚的盾片或愈伤排列在固体培养基上。
在另一可选实施方式中，可以稳定地转化质体。公开用于高等植物中质体转化的方法包括颗粒枪递送含选择标记的DNA并将所述DNA通过同源重组靶向至质体基因组(US5,451,513,US 5,545,818,US 5,877,402,US 5,932479,和WO 99/05265。
农杆菌介导的转移是用于将基因导入植物细胞的广泛适用的系统，因为DNA可以导入至完整植物组织，由此避免需要从原生质体再生完整植物。使用农杆菌介导的植物整合载体来将DNA导入植物细胞是本领域公知的(见例如US 5,177,010、US 5,104,310、US 5,004,863、US 5,159,135)。此外，T-DNA的整合是相对精确的方法，导致很少重排。待转移的DNA区域由边界序列限定，而中间的DNA通常被插入至植物基因组。
使用农杆菌转化方法形成的转基因一般在一个染色体含有单一遗传基因座。这样的转基因植物可以称作为对于添加的基因是半合子的。更优选的是对所添加的结构基因是纯合的转基因植物；即，含有两个添加的基因的转基因植物，染色体对的每个染色体上的相同基因座处一个基因。纯合的转基因植物可以通过使含有单个添加基因的独立分离的转基因植物性交配(自交)，萌发所产生种子中的一些并针对感兴趣的基因分析获得的植物。
其它细胞转化方法也可以使用，且包括但不限于通过直接转移DNA进花粉，通过直接注射DNA进植物的繁殖器官，或通过直接注射DNA进未成熟胚的细胞随后再水化干燥的胚来将DNA导入至植物。
从单植物原生质体转化体或从不同的转化外植体再生、发育和栽培植物是本领域公知的(Weissbach et al.,Methods for Plant Molecular Biology,Academic Press,San Diego,(1988))。该再生和生长过程一般包括以下步骤：选择转化的细胞，培养那些个体化细胞通过通常的胚发育阶段通过生根小植株阶段。转基因胚和种子类似地再生。获得的转基因生根苗然后种植于合适的植物生长介质如土壤。
含有外来的、外源基因的植物的发育和再生是本领域公知的。优选地，再生的植物自交以提供纯合的转基因植物。或者，获得自再生植物的花粉与农艺学重要的品系的种子生长(seed-grown)植物杂交。反过来，来自这些重要品系的植物的花粉用于授粉再生的植物。使用本领域技术人员熟知的方法栽培含有期望的外源核酸的本发明的转基因植物。
为了确认转基因在转基因细胞和植物的存在，可以使用本领域技术人员已知的方法进行聚合酶链反应(PCR)或Southern印迹分析。可以以多种途径中的任一种检测转基因的表达产物，取决于产物的性质，包括Western印迹和酶测定。定量蛋白表达和检测在不同植物组织的复制的一种特别有用的方式是使用报告基因，例如GUS。一旦获得了转基因植物，它们可以被种植以产生具有期望表型的植物组织或部分。可以收获所述植物组织或植物部分，和/或收集种子。所述种子可以作为生长具有符合期望特性的组织或部分的额外植物的来源
标记辅助选择
标记辅助选择是经典育种程序中当和轮回亲本回交时所需的选择杂合植物的公认方法。每一回交世代的植物群体将对于通常以1:1比例存在于回交群体的感兴趣的基因是杂合的，而分子标记能够用于区分所述基因的两个等位基因。通过从例如幼苗提取DNA并用特定标记测试渗入的期望性状，进行用于进一步回交的植物的早期选择，同时精力和资源集中于较少的植物。为了进一步加速回交程序，可以从未成熟种子(开花后25天)切下胚并在无菌条件下在营养培养基上生长，而不是允许种子完全成熟。该方法，称为“胚拯救”，结合在三叶期提取DNA以及分析改变ROS1a活性并赋予植物增加的糊粉层厚度的至少一个遗传变异，允许快速选择携带期望性状的植物，所述植物可以在温室或田间养成至成熟，用于进一步与轮回亲本回交。
在本发明的所述方法中可以使用本领域已知的任何分子生物学技术。这样的方法包括但不限于，核酸扩增的使用、核酸测序、核酸和合适地标记的探针杂交、单链构象分析(SSCA)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)、异双链体分析(HET)、化学切割分析(CCM)、催化性核酸切割和它们的组合(见例如，Lemieux,2000；Langridge et al.,2001)。本发明好包括使用分子标记技术检测与改变ROS1a活性并赋予所述植物增加的糊粉层厚度的(例如)ROS1a基因的等位基因连锁的多态性。这样的方法包括检测或分析限制新片段长度多态性(RFLP)、RAPD、扩增片段长度多态性(AFLP)和微卫星(简单序列重复，SSR)多态性。紧密连锁的标记可以容易地通过本领域公知的方法获得，例如混合分离子分析(bulked segregantanalysis)，如Langridge et al.(2001)所综述。
在一实施方式中，用于标记辅助选择的连锁基因座与编码本发明的多肽的基因至少在1cM、或0.5cM、或0.1cM或0.01cM以内。
“聚合酶链反应”(PCR)是这样的反应，其中使用由上游和下游引物组成的“引物对”或“引物组”，以及聚合催化剂例如DNA聚合酶(典型是热稳定聚合酶)制备靶多核苷酸的复制拷贝。PCR的方法是本领域已知的，并且在“PCR”(M.J.McPherson and S.GMoller(editors),BIOS Scientific Publishers Ltd,Oxford,(2000))中教导。可以在从分离自植物细胞的mRNA反转录获得的cDNA上进行PCR，所述植物细胞表达ROS1a基因或基于其所述植物具有增加的糊粉层厚度的等位基因。然而，如果在分离自植物的基因组DNA上进行PCR将通常更容易。
引物是这样的寡核苷酸序列，其能够以序列特异性方式与靶序列杂交且在PCR中被延伸。扩增子或PCR产物或PCR片段或扩增产物是包含所述引物和新合成的靶序列拷贝的延伸产物。多重PCR体系含有多组引物，导致同时产生多于一种扩增子。引物可以与靶序列完美配对或者它们可以含有内部错配碱基，其可以导致在特定靶序列导入限制性酶或催化性核酸的识别/切割位点。引物还可以含有额外的序列和/或含有修饰的或标记的核苷酸以利于捕获或检测扩增子。DNA热变性、引物退火至它们的互补序列、以及聚合酶对退火的引物的延伸的重复循环导致靶序列的指数扩增。术语靶或靶序列或模板指的是被扩增的核酸序列。
核酸序列直接测序的方法是本领域技术人员公知的并可以例如在Ausubel etal.(同上)和Sambrook et al.(同上)中找到。可以使用任何合适的方法进行测序，例如，双脱氧测序、化学测序或其变形。直接测序具有测定特定序列中任意碱基对中的变异的优势。
TILLING
本发明的植物可以使用已知为TILLING(定向诱导基因组局部突变，TargetingInduced Local Lesions IN Genomes)的方法产生。在第一步，通过用化学诱变剂处理种子(或花粉)在植物群体中诱导导入的突变例如新的单碱基对改变，然后推动植物至其中突变将稳定遗传的一代。提取DNA，储存来自所述群体的所有成员的种子以产生可以随时间重复获得的源。
对于TILLING法，PCR引物设计为特异性扩增感兴趣的单个基因。如果靶是基因家族的成员或是多态性基因组的一部分，特异性尤其重要。然后，可以使用染料标记的引物从多个个体合并的DNA扩增PCR产物。这些PCR产物被变性并重新退火以允许形成错配的碱基对。错配，或异双链体，代表天然存在的单核苷酸多态性(SNP)(即来自所述群体的若干植物很可能携带相同多态性)和诱导的SNP(即仅仅罕有的个体植物很可能显示所述突变)。在异双链体形成后，使用识别和切割错配的DNA的内切核酸酶例如CelI是发现TILLING群体内的新SNP的关键。
使用该方法，可以筛选数千的植物以鉴别在任何基因或基因组特定区域具有单碱基改变以及小插入或缺失(1-30bp)的任何个体。被测定的基因组片段在任何地方大小可以是0.3至1.6kb。在8倍合并、1.4kb片段(扣除SNP检测由于噪音而有问题的片段末端)和96泳道每测定，该组合允许每单次测定筛选多达百万的基因组DNA碱基对，使得TILLING为高通量技术。
TILLING进一步描述于Slade and Knauf(2005)和Henikoff et al.(2004)。
除了允许有效检测突变外，高通量TILLING技术对于检测天然多态性也是理想的。因此，通过与已知序列形成异双链体查询未知的同源DNA显示多态性位点的数目和位置。鉴别到核苷酸改变和小插入和缺失，包括至少一些重复数目多态性。这已经被称为Ecotilling(Comai et al.,2004)。
记录各SNP其几个核苷酸内的大概位置。因此，可以基于其迁移率存档各单倍型。用增加相对小的努力使用用于错配-切割测定的相同的扩增DNA的等分部分，能够获得序列数据。通过其与多态性的接近程度选择用于单个反应的左或右测序引物。测序仪软件进行多重比对并发现碱基改变，其在各例子中确认凝胶条带。
相比当前用于大多SNP发现的方法全测序，Ecotilling可以更便宜地进行。可以筛选含有阵列化的生态型DNA的平板，而不是来自经诱变植物的DNA的合并。因为检测在凝胶上以接近碱基对分辨率进行且泳道见背景模式均一，具有相同大小的条带可以匹配，因此在单一步骤发现并对SNP基因分型。以该方式，SNP的最终测序是简单和高效的，用于筛选的同一PCR产物可以进行DNA测序使得更是如此。
谷粒加工
由于增厚的糊粉层，本发明的水稻谷粒，和来自其的面粉和麸，具有改善的营养含量。分离的糊粉层组织应含有低水平的淀粉和果皮，并代表谷粒对人类营养生理学有益的物质的主要部分。例如，与相应的野生型谷粒和/或由其产生的面粉相比，本发明的谷粒和/或由其产生的面粉包含以下的一或多种，各自以重量计：
i)更高的矿物质含量，例如高至少约20％或至少约25％，优选所述矿物质含量是锌(例如高至少约10％或至少约15％)、铁(例如高至少约10％或至少约15％)、钾(例如高至少约20％或至少约25％)、镁(例如高至少约18％或至少约22％)、磷(例如高至少约17％或至少约21％)和硫(例如高至少约5％或至少约8％)中一种或多种或全部的含量，
ii)更高的抗氧化剂含量例如多至少约25％，或至少约35％的总酚类化合物，和/或多至少约60％，或至少约70％的亲水性抗氧化剂，
iii)更高的植酸盐含量，例如高至少约10％或至少约15％，
iv)维生素B3、B6和B9中的一或多种或全部的更高含量，
v)更高的膳食性纤维含量和/或可溶性纤维含量(例如高至少约150％，或至少约180％的总纤维)，
vi)相对于相应野生型谷粒的淀粉含量，以重量计约90％至约100％的淀粉含量，
vii)更高的蔗糖含量，
viii)更高的单糖含量(例如阿拉伯糖、木糖、半乳糖、葡萄糖含量)，比如高至少约1.5倍或至少约2倍，
ix)更高的脂肪含量，例如高至少约20％，至少约30％或至少约50％，或约50％，
x)类似的氮水平。
谷粒的这些营养成分各自可以使用常规技术测定，例如实施例1和5中概要的。
在一实施方式中，本发明的水稻谷粒和/或从其产生的面粉包含以下的一或多种或全部，各自按重量计：
i)与相应野生型谷粒/面粉相比多至少约20％、至少约30％或至少约50％,或约50％的脂肪，
ii)至少约11mg/g或至少约12mg/g的总植酸盐，
iii)与获得自相应野生型谷粒的面粉相比，获得自所述谷粒的面粉中多至少约20％或至少约25％的矿物质含量，
iv)至少约14mg/kg或至少约15mg/kg的总锌，
v)至少约13mg/kg或至少约13.5mg/kg的总铁，
vi)与相应野生型谷粒/面粉相比多至少约150％、或至少约180％的总纤维
vii)相对于相应野生型谷粒/面粉的淀粉含量，以重量计约90％至约100％的淀粉含量，
viii)与相应野生型谷粒/面粉相比，高至少约1.5倍或至少约2倍的单糖含量(例如阿拉伯糖、木糖、半乳糖、葡萄糖含量)，比如高至少约1.5倍或至少约2倍，
ix)与相应野生型谷粒/面粉相比，多至少约25％、或至少约35％的总酚类化合物，和/或多至少约60％，或至少约70％的亲水性抗氧化剂。
在一实施方式中，与相应野生型谷粒相比，所述谷粒在其总淀粉含量中包含增加比例的直链淀粉。产生这样的谷粒的方法例如描述于WO 2002/037955、WO 2003/094600、WO2005/040381、WO 2005/001098、WO 2011/011833和WO 2012/103594。
在一实施方式中，与相应野生型谷粒相比，本发明的谷粒在其总脂肪酸含量中包含增加比例的油酸和/或降低比例的棕榈酸。产生这样的谷粒的方法例如描述于WO 2008/006171和WO 2013/159149。
本发明的谷粒/种子，或本发明的其它植物部分，能够使用本领域已知的任何技术加工产生食物成分、食物或非食物产品。
如本文所用，“其它食物或饮料成分”指的是适于动物消耗的任何物质，优选适于人消耗的任何物质，当提供为食物或饮料的一部分的时候。实例包括但不限于，来自其它植物物种的谷粒、糖等，但排除水。
在一实施方式中，所述产品是全谷粒面粉，例如超细研磨全谷粒面粉，或约100％从所述谷粒制备的面粉。所述全谷粒面粉包括精制的面粉组分(精制面粉或精制面粉)和粗制级分(超细研磨的粗制级分)。
精制面粉可以是例如通过研磨和筛选净化的谷粒制备。精制面粉的颗粒大小描述为面粉中不少于98％通过具有不大于那些称为“212测微计(U.S.Wire 70)”的纺织物的开口的织物。粗制级分包括麸和胚芽的至少之一。例如，所述胚芽是在谷粒核(kernel)内发现的胚性植物。所述胚芽包括脂质、纤维、维生素、蛋白质、矿物质和植物素，例如黄酮类。麸包括若干细胞层且具有显著量的脂质、纤维、维生素、蛋白质、矿物质和植物素，例如黄酮类。此外，所述粗制级分可以包括糊粉层，其也包含脂质、纤维、维生素、蛋白质、矿物质和植物素，例如黄酮类。所述糊粉层，当技术上认为是胚乳的一部分，与麸展现许多相同的特性并因此一般在研磨过程和麸和胚芽一起去除。糊粉层含有蛋白质、维生素和植物素，例如阿魏酸。
此外，所述粗制级分可以和精制面粉组分混合。所述粗制级分可以和精制面粉组分混合以形成全谷粒面粉，因此提供与精制面粉相比具有增加的营养价值、纤维含量和抗氧化能力的全谷粒面粉。例如，所述粗制级分或全谷粒面粉可以不同的量使用来在烘焙商品、零食产品和食物产品中替换精制的或全谷粒面粉。本发明的全谷粒面粉(即超细研磨的全谷粒面粉)还可以直接卖给消费者用于他们的自制烘焙产品。在一示例性实施方式中，所述全谷粒面粉的颗粒谱使得所述全谷粒面粉重量计的98％的颗粒小于212测微计。
在另一实施方式中，在所述全谷粒面粉和/或粗制级分内发现的酶是灭活的以稳定化所述全谷粒面粉和/或粗制级分。稳定化是这样的工艺，其使用蒸汽、热、辐射或其它处理来灭活在麸和胚芽层中发现的酶。已经被稳定化的面粉保留其烹饪特性并具有更长的货架期。
在另外的实施方式中，所述全谷粒面粉、所述粗制级分或所述精制面粉可以是食物产品的组分且可以用于产生食物产品。例如，所述食物产品可以是圈饼、软饼、面包、小面包、新月形面包、饺子、英国松饼、松饼、披塔面包、速制糕饼、冷藏/冷冻的生面团产品、生面团、烘焙的豆类、墨西哥玉米煎饼(burrito)、辣椒、玉米面豆卷(taco)、tamale、玉蜀黍饼(tortilla)、馅饼(pot pie)、即食谷物、即食餐、填料、可微波餐食、布朗尼、蛋糕、奶酪蛋糕、咖啡蛋糕、曲奇、甜点、油酥糕点(pastry)、甜圈、糖棒、馅饼壳、馅饼填料、婴儿食品、烘焙混合物、糊、拌粉、肉汁混合物、肉混合剂、肉替代品、佐料混合物、汤混合物、肉汁、面粉糊、沙拉装饰、汤、酸乳酪、面条、意大利面、拉面、炒面、冰淇淋包裹物、冰淇淋棒、冰淇淋锥、夹心冰淇淋、薄脆饼干、碎面包片(crouton)、甜甜圈、蛋卷、挤压式零食、水果和谷物棒、可微波的零食产品、营养棒、烙饼、平价烘焙产品、椒盐卷饼(pretzel)、布丁、基于格兰诺拉麦片的产品、零食片、零食、零食混合物、华夫、披萨皮、动物食物或宠物食物。
在可选的实施方式中，所述全谷粒面粉、所述粗制级分或所述精制面粉可以是营养补充剂的组分。例如，所述营养补充剂可以是被添加至饮食中的产品，其含有一或多种额外的营养成分，一般包括维生素、矿物质、草药、氨基酸、酶、抗氧化剂、草药、香料、益生菌、提取物、益生元和纤维。本发明的全谷粒面粉、粗制级分或精制面粉包括维生素、矿物质、氨基酸、酶和纤维。例如，所述粗制级分含有浓缩量的膳食性纤维以及其它必须营养，例如B族维生素、硒、铬、镁、锰、和抗氧化剂，其对健康饮食是必需的。例如，22克的本发明的粗制级分输送一个个体33％的每日推荐消耗纤维。所述营养补充剂可以包括任何已知的营养成分，其将有助于个体的整体健康，实例包括但不限于维生素、矿物质、其它纤维组分、脂肪酸、抗氧化剂、氨基酸、肽、蛋白质、叶黄素、核糖、Ω-3脂肪酸和/或其它营养成分。所述补充剂可以如下形式(但不限于)输送：即时混合饮料、即饮饮料、营养棒、华夫、曲奇、薄脆饼干、凝胶枪(gel shot)、胶囊、咀嚼物、可咀嚼片和丸剂。一个实施方式以奶昔饮料或麦芽类饮料的形式输送纤维补充剂，该实施方式可能对于儿童纤维补充剂是特别有吸引力的。
在另外的实施方式，可以使用研磨过程来制备多谷粒面粉或多谷粒粗制级分。例如，来自一种类型谷粒的麸和胚芽可以被研磨并和另一种谷物的研磨的胚乳或全谷粒谷物面粉混合。可选地，来自一种类型谷粒的麸和胚芽可以被研磨并和另一种谷粒的研磨的胚乳或全谷粒面粉混合。考虑本发明涵盖混合一或多种谷粒的麸、胚芽、胚乳核全谷粒面粉的一或多种的任何组合。该多谷粒方法可以用于制备定制面粉并合并多种类型的谷物谷粒的质量和营养含量来制备一种面粉。
考虑本发明的全谷粒面粉、粗制级分和/或谷粒产品可以通过本领域已知的研磨方法产生。示例性的实施方式涉及在单一蒸汽中研磨谷粒而不将谷粒的胚乳、麸和胚芽分开至单独的蒸汽。净化的和缓和的谷粒被输送至第一通道磨床，例如锤磨机、辊磨机、针磨机、冲击式碾磨机、盘磨机、气流磨、凹口研磨机等。在研磨后，所述谷粒被排出并输送至筛粉机。此外，考虑本发明的全谷粒面粉、粗制级分和/或谷粒产品可以通过多种其它方法被修改或增强，例如：发酵、速溶化、挤压、包囊化、烧烤、焙烧等。
实施例
实施例1.一般性材料和方法
通过用苏丹红溶液染色观察糊粉层
通过将1g的苏丹红IV添加至50ml的聚乙二醇溶液(平均分子量400,Sigma,Cat.No.202398)，在90℃孵育1小时并和等体积90％甘油混合制备染色溶液。在去除各谷粒的果实包被物(内稃和外稃)后，成熟水稻谷粒在蒸馏水中孵育5小时，然后使用刀片横向或纵向切片。切片在苏丹红溶液中在室温染色24至72小时。切片然后在室温用Lugol染色溶液反染20min(Sigma,32922)，在解剖显微镜(Sreenivasulu,2010)下观察。
用依文思蓝染色糊粉层
通过将0.1g的依文思蓝(Sigma,E2129)溶解于100ml蒸馏水而制备依文思蓝染色溶液。在去除各谷粒的果实包被物(内稃和外稃)后，成熟水稻谷粒用刀片横向切片。切片在蒸馏水中室温孵育30min，加入染色液并置于室温2min。然后丢弃染色溶液，切片用蒸馏水洗涤两次并在解剖显微镜下观察。
水稻胚乳的光学显微镜观察
水稻谷粒在福尔马林-醋酸-乙醇(FAA)溶液(60％乙醇，5％冰醋酸和2％甲醛)，脱气1小时，在含70％、80％、95％的乙醇溶液系列及然后100％乙醇脱水，用LR白树脂(Electron Microscopy Sciences,14380)浸润并在60℃聚合24小时。用Leica UC7切片机完成切片机切片。切片在室温用0.1％甲苯胺蓝溶液(Sigma,T3260)染色2min，然后用蒸馏水洗涤两次并通过光学显微镜检查。或者，切片在室温用0.01％Calcofluor white溶液(Sigma,18909)染色2min并通过光学显微镜检查。
用PAS和考马斯蓝染色
载玻片上经固定的切片在预热的0.4％高碘酸(Sigma,375810)在57℃下孵育30min，然后在蒸馏水中漂洗3次。加入希夫试剂(Sigma,3952016)，载玻片在室温孵育15min，然后在蒸馏水中漂洗3次。切片然后在1％考马斯蓝(R-250)ThermoScientific,20278)中在室温孵育2min，并在蒸馏水中漂洗3次。使用含有30％、50％、60％、75％、85％、95％至100％乙醇的醇溶液系列各2min，实现切片的脱水，随后在50％二甲苯和100％二甲苯溶液(Sigma,534056)中各2min使各载玻片变清楚。然后用快速硬化封片介质(Fluka,03989)对盖玻片进行封固，并且在光学显微镜下观察切片。
DNA提取和PCR条件
使用两种方法从植物叶子样品提取DNA：提供较不纯的DNA的快速DNA提取方法和更广泛的用于更纯DNA的DNA提取方法，修改自Huang(2009)。在第一种方法中，将4颗直径2mm的玻璃珠(Sigma,273627)、1-2mg的水稻叶组织和150μl的提取缓冲液(10mM Tris,pH9.5,0.5mM EDTA,100mM KCl)添加至96孔PCR板的个孔中。然后密封该板并使用Mini-Beadbeater-96混合器(GlenMills,1001)对混合物均质1min。在3000rpm离心5min后，所提取的含DNA上清液用于PCR反应。
在第二种方法中，两颗直径2mm的玻璃珠和0.2g的叶子置于1.5ml的Eppendorf管并在液氮冷却10min。样品然后在Mini-Beadbeater-96均质1min，然后向各管加入600μlDNA提取缓冲液(2％SDS,0.4M NaCl,2mM EDTA,10mM Tris-HCl,pH8.0)并且混合物在65℃孵育一小时。在冷却混合物后，加入450μl的6M NaCl，混合并于12000rpm离心20min。各上清液转移至新管且使用等体积的2-丙醇于-20℃一小时沉淀DNA。通过在4℃以2400rpm离心20min回收DNA，且沉淀物用75％乙醇洗涤两次。沉淀物在室温空气干燥，且各自重悬于600μl含10ng/ul RNAse(ThermoScientific,EN0201))的蒸馏水并用于PCR反应。
PCR反应使用5μl的2xPCR缓冲液，其含有Taq聚合酶(ThermoScientific,K0171)、5’和3’寡核苷酸引物和1μl的DNA样品，总体积10μl。使用35个循环的94℃ 30sec，55℃30sec和72℃ 30sec进行扩增。扩增产物使用3％琼脂糖凝胶通过凝胶电泳进行分析。对照PCR反应使用来自纯合体中花11(ZH11)(野生型粳稻)、纯合体NJ6(野生型籼稻)和ZH11与NJ6的混合物的DNA制备物。
对于ta2等位基因的遗传定位，对遗传标记的PCR扩增使用以下引物对(5'至3'序列)：INDEL 127(染色体1上的6,343,260位)，正向引物TGAGTAGTTGCGTTGTTCT(SEQ ID NO:15)，反向引物TCTTAGTGAGCCGTTTCT(SEQ ID NO:16)；INDEL 129(染色体上的6,560,681位)，正向引物CCTTCTGTGCTATGGGTT(SEQ ID NO:17)，反向引物CATGCCAAGACACCACTT(SEQID NO:18)；INDEL 128(染色体1上的6,470,027位)，正向引物TGGCTTTGGAAACGGTAG(SEQ IDNO:19)，反向引物TTTAGAGGGATGTGCGTCA(SEQ ID NO:20)；INDEL 149(染色体上的6,427,144位)，正向引物AAACAACGATCCAGCAAA(SEQ ID NO:21)，反向引物TTGGCACCGTATTACTTTC(SEQ ID NO:22)。
TILLING测定
用于TILLING测定的引物具有核苷酸序列：
TA2-1F:ACGCATTCTTCATTGACTGTATGT(SEQ ID NO:23)
TA2-1R:GCCCTTTCAATACAATGACTAGGT(SEQ ID NO:24)
TA2-2F:GAACATTTGAATCATGTTCCTCAC(SEQ ID NO:25)
TA2-2R:ACTATCCTTTGATGCAAGTTCTCC(SEQ ID NO:26)
TA2-3F:GTTGGAAGAGCAGTTAAAGCAAAT(SEQ ID NO:27)
TA2-3R:CTTCGGCAGTGAAATTTAGTAACA(SEQ ID NO:28)
TA2-4F:TACAGAACTTCTACGAATGCAGGA(SEQ ID NO:29)
TA2-4R:GCAACATGAATTGCTAAAGATGAG(SEQ ID NO:30)
使用ExTaq以以下反应条件进行PCR扩增:95℃ 2min；8个循环的94℃ 20s，68℃30s(每循环下降1℃)，和72℃每1kb扩增子长度60s，随后是35个循环的94℃ 20s，60℃30s，和72℃每1kb扩增子长度60s，和在72℃ 5min的最终扩增。将来自野生型和测试样品的PCR产物混合并进行完全变性-缓慢退火程序以形成异源双链体，条件如下：99℃ 10min进行变性，随后70个循环的递减，从70℃开始，每循环20s，每循环降低0.3℃，然后保持于15℃以重新退火所述变性的PCR产物以形成异源双链体。退火的PCR产物的CelI消化在15μL反应混合物中进行，混合物中含有CelI缓冲液(10mM HEPES,pH 7.5,10mM KCl,10mM MgSO4,0.002％Triton X-100,和0.2μg/mL b牛血清白蛋白(BSA),4μL的PCR产物，以及如果PCR产物由ExTaq聚合则1单位CelI(10单位/μL)，或如果PCR产物由KOD聚合则20单位CelI)，45℃15min，之后添加3μL的0.5M EDTA(pH 8.0)以终止反应。或者,消化在15-μL反应混合物中进行,所述混合物含有4μL的PCR产物和MBN缓冲液(20mM Bis-Tris,pH 6.5,10mM MgSO4,0.2mM ZnSO4,0.002％Triton X-100,和0.2μg/mL BSA)中的2单位的绿豆核酸酶(MBN,10单位/μL,Cat.No.M0250S；New England Biolabs,USA)，60℃ 30min，之后添加2μL的0.2％SDS以终止反应。
96孔PCR板中的CelI-消化的PCR产物用去离子水稀释至100μL，且在AdvanCETMFS96仪器(Advanced Analytical Technologies,USA)在9kV进行毛细管电泳，30s预运行，15s用于注射1ng/μL分子量标记75和15kb或50和3kb dsDNA(Fermentas,Canada)，45s用于样品注射，和40min样品分离。使用用于毛细管电泳的PROSize软件(Advanced Analytical Technologies,USA)获得凝胶图像并进行分析。
DNA糖基化酶(DME)酶测定
Demeter(DME)是对5-甲基胞嘧啶底物具有活性的双功能DNA糖基化酶/裂解酶。植物在三种序列环境中具有5-甲基胞嘧啶：CpG、CpNpG和CpNpN，且DME对这些序列环境中的每种的5-甲基胞嘧啶具有活性。在体外进行的酶测定中，检测甲基化胞嘧啶5'侧的磷酸二酯键的裂解，产生δ消除产物。在凝胶电泳前用强碱(NaOH)处理DNA反应产物确认在预测位置处的δ消除过程。
在酶测定中用作底物的合成寡核苷酸如下合成，核苷酸修饰在括号中指明：
MEA-1.6F,5’-CTATACCTCCTCAACTCCGGTCACCGTCTCCGGCG(SEQ ID NO:31)
MEA-1.6F18meC,5’-CTATACCTCCTCAACTC(5-meC)GGTCACCGTCTCCGGCG(SEQ ID NO:32)
MEA-1.6F17meC,5’-CTATACCTCCTCAACT(5-meC)CGGTCACCGTCTCCGGCG(SEQ ID NO:33)
MEA-1.6F22meC,5’-CTATACCTCCTCAACTCCGGT(5-meC)ACCGTCTCCGGCG(SEQ ID NO:34)
MEA-1.6F18AP,5’-CTATACCTCCTCAACTC(abasic)GGTCACCGTCTCCGGCG(SEQ ID NO:35)
MEA-1.6F17AP,5’-CTATACCTCCTCAACT(abasic)CGGTCACCGTCTCCGGCG(SEQ ID NO:36)
MEA-1.6F15AP,5’-CTATACCTCCTCAA(abasic)TCCGGTCACCGTCTCCGGCG(SEQ ID NO:37)
MEA-1；6F12AP,5’-CTATACCTCCT(abasic)AACTCCGGTCACCGTCTCCGGCG(SEQ ID NO:38)
MEA-1.6F18T,5’-CTATACCTCCTCAACTCTGGTCACCGTCTCCGGCG(SEQ ID NO:39)
MEA-1.6R,5’-CGCCGGAGACGGTGACCGGAGTTGAGGAGGTATAG(SEQ ID NO:40)
MEA-1.6R17meC,5’-CGCCGGAGACGGTGAC(5-meC)GGAGTTGAGGAGGTATAG(SEQ ID NO:41).
20pmol的各寡核苷酸在50μL反应中使用20单位的T4多核苷酸激酶在30μCi的(γ-32P)-ATP(6000Ci/mmol,Perkin Elmer Life Sciences)存在时在37℃下1hr进行末端标记。各经标记的寡核苷酸使用Qiaquick Nucleotide Removal Kit(Qiagen)如说明书所描述进行纯化。经标记的寡核苷酸在10mMTris-HCl(pH 8.0)、1mM EDTA和0.1M NaCl中退火至合适的互补寡核苷酸。各混合物加热至100℃ 10min，然后缓慢地过夜冷却至室温。使用MspI或HpaII限制性内切核酸酶消化随后凝胶电泳以确定退火效率。仅仅使用大于90％双链的底物进行糖基化酶活性测定。
5’-标记的寡核苷酸底物(13.3nM)和DME蛋白(250nM)在具有40mM HEPES-KOH(pH8.0)、0.1M KCl、0.1mM EDTA、0.5mM二硫苏糖醇和200mg/ml BSA的15ml反应中在37°孵育1hr。用15ml的95％甲酰胺、20mM EDTA、0.05％溴酚蓝、0.05％二甲苯蓝FF终止反应且反应物煮沸5min。为了诱导消除，添加终浓度0.1M的NaOH并且煮沸反应物7min。产物在含7.5M尿素和1xTBE的15％聚丙烯酰胺凝胶上分级。用Hoefer SQ3凝胶设备在1000V 4hr完成电泳。凝胶在-80℃曝光于Kodak BioMax MR胶片。
分析方法
谷粒、食物成分和食物样品中的常规成分(Proximates)和其它主要成分使用标准方法测定，例如如下面所描述。
谷粒含水量根据(Association of Official Analytical Chemists)AOACMethod 925.10测量。简言之，谷粒样品(～2g)在烘箱中130℃ 1小时干燥至恒重。
根据AOAC Method 923.03测量含灰量。用于水分测定的样品在马弗炉中520℃灰化15h。
谷粒、食物成分和食物样品的蛋白含量。
根据AOAC Method 992.23测量蛋白含量。简言之，使用自动氮分析仪(ElementarRapid N cube,Elementar Analysensysteme GmbH,Hanau,Germany)通过Dumas燃烧法分析总氮。通过氮含量乘以6.25估算谷粒或食物样品的蛋白含量(g/100g)。
糖、淀粉和其它多糖
总淀粉含量根据使用McCleary et al.(1997)的酶促方法的AOAC Method 996.11进行测量。
根据AOAC Method 982.14测量糖含量。简言之，用含水乙醇(80％乙醇)萃取简单糖类然后使用聚胺-结合的聚合凝胶柱通过HPLC定量，使用乙腈:水(75:25v/v)作为流动相以及蒸发光散射检测仪。
总中性非淀粉多糖(NNSP)通过稍微修改的Theander et al.(1995)的气相层析方法进行测量，其包括用1M硫酸水解2h然后离心。
果聚糖(果糖-寡糖)通过AOAC Method 999.03详细描述的方法进行分析。简言之，将果糖-寡糖萃取至水中然后用蔗糖酶/麦芽糖酶/转化酶混合物消化。获得的游离糖然后用硼氢化钠还原并用果聚糖酶(fructanose)消化成果糖/葡萄糖。所释放的果糖/葡萄糖使用对羟基苯甲酸酰肼(PAHBAH)测量。
纤维含量
总膳食纤维(TDF)根据AOAC Method 985.29测量而可溶性和不可溶性纤维(SIF)根据AOAC Method 991.43测量。简言之，TDF通过Prosky et al.(1985)的重量分析技术测定，如AOAC Method 985.29所详细描述，而SIF通过AOAC 991.43中的重量分析技术测定。
总脂质
5g面粉样品和1％Clarase 40000(Southern Biological,MC23.31)在45℃孵育一小时。通过多次萃取从所述样品将脂质萃取进氯仿/甲醇中。在离心进行相分离后，去除氯仿/甲醇级分并在101℃干燥30min以回收脂质。剩下的残余物的质量代表样品中的总脂质(AOAC Method 983.23)。
脂质的脂肪酸谱
根据AOAC Method 983.23从磨好的面粉将脂质萃取进氯仿。含有脂质的氯仿级分的一部分在加入等分部分的七-癸酸作为内部标准后在氮气流下蒸发。残余物悬浮于干甲醇中的1％硫酸并将混合物50℃加热16h。混合物用水稀释并用己烷萃取两次。合并的己烷溶液装载至Florisil小柱上，所述柱用己烷洗涤，且然后用己烷中的10％乙醚洗脱脂肪酸甲基酯。洗脱物蒸发至干燥，残余物溶解于异辛烷中以注射至GC上。脂肪酸甲基酯针对标准脂肪酸混合物进行定量。GC条件：柱SGE BPX70 30m x 0.32mm x 0.25um；注射0.5μL；注射器250℃；15:1拆分；流速1.723ml/min恒定流速；烘箱150℃ 0.5min，10℃/min至180℃，1.5℃/min至220℃，30℃/min至260℃(总运行时间33min)；检测器FID于280℃。
抗氧化剂活性(ORAC-H)
亲水性抗氧化剂活性(ORAC-H)遵循Huang(2002a和2002b)并如Wolbang et al.(2010)所描述修改的方法进行测定。如下对样品进行亲脂性抗氧化剂随后是亲水性抗氧化剂萃取：称取3份100mg样品至2ml微型管中。然后加入1mL己烷:二氯甲烷(50:50)并剧烈混合2min，并且在10℃以13000rpm离心2min。上清液转移至玻璃小瓶中，沉淀物用另外2mL的己烷:二氯甲烷混合物再萃取。然后重复混合和离心步骤，并且将上清液转移至同一玻璃小瓶中。在温和氮气流下蒸发所述沉淀物的残余溶剂。然后加入1mL的丙酮:水:醋酸混合物(70:29.5:0.5)并剧烈混合2min。混合物然后如前一样离心并且上清液用于ORAC-H平板测定。根据需要用磷酸缓冲液稀释样品。计算曲线(AUC)下的面积并与Trolox标准的AUC值比较。ORAC值报告为uMTrolox当量/g样品。
酚类
总酚含量以及游离、缀合和结合状态的酚类在根据Li et al.(2008)描述并略微修改的方法萃取后进行测定。简言之，通过在玻璃小瓶(8ml容量)中超声处理10min萃取进2mL 80％甲醇后，测定100mg样品的游离酚类。上清液转移至第二个玻璃小瓶中并重复残余物的萃取。合并的上清液在氮气中蒸发至干燥。添加2mL醋酸(2％)以调节pH至大约2，然后加入3mL乙酸乙酯并摇动2min萃取酚类。小瓶在10℃以2000xg离心5min。将上清液转移至干净的玻璃小瓶并再重复萃取两次。合并的上清液在氮气中37℃蒸发。残余物溶解于2mL80％甲醇并冷冻。
对于初始80％甲醇萃取，缀合的酚类的样品如对游离酚类测定一样处理。此时，向玻璃小瓶中的蒸发的上清液添加2.5mL(2M)氢氧化钠和磁棒，然后用氮气填充小瓶并加盖密封。然后小瓶搅拌混合并110℃加热1h。样品在冰上冷却，之后用3mL乙酸乙酯通过摇动2min萃取。小瓶在10℃以2000xg离心5min。丢弃上清液并用12M HCL将pH调节至大约2。如对游离酚类所描述的，使用3x3mL等分的乙酸乙酯萃取酚类。合并上清液并在氮气中37℃蒸发至干燥，且残余物吸收于2mL 80％甲醇并冷冻。
从游离酚类甲醇萃取后的残余物测量结合的酚类。向所述残余物加入2.5mL(2M)氢氧化钠和磁棒，然后用氮气填充小瓶并加盖密封。然后小瓶搅拌混合并110℃加热1h。样品在冰上冷却，之后用3mL乙酸乙酯通过摇动2min萃取。小瓶在10℃以2000xg离心5min。丢弃上清液并用12M HCL将pH调节至大约2。如对游离酚类所描述的，使用3x3mL等分的乙酸乙酯萃取酚类。合并上清液并在氮气中37℃蒸发至干燥，且残余物吸收于2mL 80％甲醇并冷冻。
使用100mg样品，通过在水解前加入200uL 80％甲醇湿润样品测定总酚类。加入2.5mL(2M)氢氧化钠和磁棒，然后用氮气填充小瓶并加盖密封。然后小瓶搅拌混合并110℃加热1h。样品在冰上冷却，之后用3mL乙酸乙酯通过摇动2min萃取。小瓶在10℃以2000xg离心5min。丢弃上清液并用12M HCL将pH调节至大约2。如对游离酚类所描述的，使用3x3mL等分的乙酸乙酯萃取酚类。合并上清液并在氮气中37℃蒸发至干燥，且残余物吸收于4mL80％甲醇并冷冻。
使用用于测定酚类的Folin Ciocalteu’s测定法对处理的/萃取的样品中的酚类的量进行测量。使用0、1.56、3.13、6.25、12.5和25μg/mL的没食子酸标准品制备标准曲线。1mL的标准品添加至4mL玻璃管。对于测试样品，100μL等分的充分混合的样品添加至4mL玻璃管中的900μL水中。然后将100mL的Folin Ciocalteu’s试剂添加至各管，立即涡旋。2min后加入700μL碳酸氢钠溶液(1M)，然后通过涡旋混合。各溶液室温在黑暗中孵育1h，然后在765nm读取吸光度。结果表达为μg没食子酸当量/g样品。
植酸盐
面粉样品的植酸盐含量的测定基于Harland和Oberleas的方法，如AOAC OfficialMethods of Analysis(1990)中所描述。简言之，称量0.5g谷物面粉样品并用2.4％HCl使用转轮(30rpm)室温萃取1小时。混合物然后以2000xg离心10分钟，且上清液用milli-Q水萃取并稀释20倍。将阴离子交换柱(500mg Agilent Technologies)置于真空歧管中并根据制造商说明调整以适于使用。稀释的上清液然后装载于柱上并且通过用0.05M HCl洗涤去除非植酸盐物质。然后用2M HCl洗脱植酸盐。收集的洗脱液使用加热块消化。冷却样品并用milli-Q水补足体积至10mL。磷水平通过分光光度计使用钼酸盐、硫酸着色法在640nm读取吸光度进行测定。使用下式计算植酸盐：
植酸盐(mg/g)＝P conc*V1*V2/(1000*样品重*0.282)
其中P conc是由分光光度法测定的磷的浓度(μg/mL)，V1是最终溶液的体积，V2是所萃取的植酸盐溶液的体积，以及0.282是磷至植酸盐的转换系数。
总矿物含量估计
样品的总矿物含量通过使用AOAC Methods 923.03和930.22的灰分测定进行测量。大约2g的面粉在540℃加热15小时，然后称量灰分残余物的质量。0.5g的粗面粉样品使用使用管块消化用8M硝酸在140℃消化8小时。然后使用电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES)根据Zarcinas(1983a和1983b)分析锌、铁、钾、镁、磷和硫含量。
矿物质在CSIRO,Urrbrae,Adelaide South Australia，在Waite AnalyticalService(University of Adelaide,Waite,South Australia)以及在Dairy TechnicalServices(DTS,North Melbourne,Victoria.)进行分析。在用硝酸溶液(CISRO)或稀硝酸和过氧化氢(DTS)消化后通过电感耦合等离子体-光学发射光谱法(ICP-OES)，或者在用硝酸/高氯酸溶液消化后通过电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES)测定元素。
维生素
维生素B1(烟酸)、B3(吡哆辛)和总叶酸分析由DTS以及National MeasurementInstitute(NMI)进行。通过AOAC Methods 13th Ed(1980)43.045，根据Lahey,et al.(1999进行烟酸测量。根据Mann et al.(2001)测量吡哆辛(pyridoxine)。该方法包括将磷酸化和游离的维生素B6形式柱前转换成吡哆辛(吡哆醇)。使用酸性磷酸酶来去磷酸化，随后用乙醛酸在Fe2+存在下进行脱氨以将吡哆胺转化为吡哆醛。吡哆醛然后由硼氢化钠还原成吡哆辛。
根据VitaFast叶酸试剂盒使用制造商说明或根据AOAC方法2004.05测量叶酸。
实施例2.分离和表征厚糊粉层(ta)突变体
建立和栽培经诱变的水稻群体
来自野生型水稻栽培种中花11(ZH11)的大约8000个谷粒通过用60mM乙基甲磺酸(EMS)使用标准条件处理进行诱变。经诱变的谷粒在田里播种并栽培所获得的植物以产生M1谷粒。收获M1谷粒，然后播种于田里以产生M1植物。从1327株个体M1植物收获8925个穗。从这些植物中，筛选了36420个M2谷粒，包括每穗的至少4个谷粒。
通过半谷粒染色筛选突变体
去除M2水稻谷粒的果实包被物(内稃和外稃)。36420个谷粒每个横向切成两半。含胚的一半保存于96孔板用于随后的萌发，而没有胚的每个半谷粒用依文思蓝染色并在解剖显微镜下观察以检测相对于野生型具有增厚的糊粉层的突变体谷粒。染色基于这样的原理，即依文思蓝只能够穿透和染色非活细胞例如淀粉质胚乳的细胞，而在活的糊粉层中观察不到颜色改变。从初始依文思蓝染色和组织学分析，观察到显示糊粉层厚度显著增加的个体谷粒以及显示种子腹侧糊粉层显著增厚的谷粒。其它谷粒显示糊粉层厚度的增加但是程度较小。特别针对糊粉层厚度检查各种子腹侧未染色区域。也观察到在谷粒背面糊粉层厚度增加的变体。仅仅具有横跨整个横切面的糊粉层厚度显著增加的变体被选择用于进一步分析。
选择与野生型半谷粒相比，具有更厚的依文思蓝未染色区域的半谷粒。在所检查的36240个谷粒中，鉴别并选择出具有糊粉层厚度差异的219个谷粒(0.60％)。这些获得自140株个体M1植物的162个穗，并因此大部分代表独立突变体。如下所描述，鉴别并进一步表征一个具体的突变体谷粒，其具有命名为厚糊粉层2(thick-aleurone 2)(ta2)的突变。相应的野生型基因因此命名为Ta2；该命名用于本文。
为了维持可能的突变体系，各相应的具胚半谷粒在用1％Bacto琼脂(Bacto,214030)固化的含半强度MS盐的培养基(Murashige and Skoog,1962)上萌发，并在25℃在光照强度1500～2000Lux，16h光/8h暗周期下培养。在2-4叶期将小植株转移至土壤，且获得的植物生长至成熟。在相应具胚半谷粒萌发和培养后，115个种子(52.5％)长大，产生成熟和可育植物。
鉴别、选择并进一步分子显示很少或没有一般农业性状缺陷的候选突变体植物，例如那些相对于野生型亲本品种具有正常植物高度、育性(雄性和雌性育性)、谷粒大小和谷粒千粒重且显示糊粉层增厚性状稳定遗传的植物。其中，选择并详细分析命名为ta2的突变体，其显示更极端的多糊粉层表型，具有6至7个细胞层。如预期的，野生型谷粒显示一个细胞层的糊粉层。
ta2突变体谷粒的组织学分析
针对授粉后天数(DAP)从1至30天的形态学变化研究并比较来自野生型ZH11和ta2突变体植物的发育中谷粒。水稻谷粒的成熟阶段可认为具有三个时期：乳熟期(milkgrainstage)、蜡熟期(dough grain stage)和完熟期(mature grain stage)。在蜡熟期，野生型穗中的谷粒颜色开始从绿色变成黄色，随后是连接茎和颖果的泡状组织(vesiculartissue)的逐渐破坏。显微镜检查水稻谷粒的横切片也显示ta2突变体谷粒中垩白(不透明性)程度的增加。ta2突变体穗在颜色改变上被延迟。然后使用扫描电子显微镜(SEM)研究淀粉质胚乳的中间部分的淀粉颗粒组织结构。在野生型谷粒中，淀粉颗粒被紧密包装并显示平滑表面和规则形状，而在ta2谷粒中，观察到较松散包装的不规则形状的淀粉颗粒。总之，在具有ta2突变的植物和谷粒中观察到至少三个改变：谷粒成熟的延迟，谷粒垩白程度的增加和淀粉颗粒结构的增加。
6、7、8、9、10、12、15、18、21、24、27和30DAP的发育中的突变体和野生型谷粒用依文思蓝染色并通过光学显微镜检查糊粉层。直到10DAP没有观察到野生型和ta2突变体谷粒之间发育中糊粉层厚度的显著差异。在10DAP之后，ta2突变体的糊粉层比野生型谷粒中的更厚，并且在大约20DAP差异达到最大。这些结果与那些来自苏丹红染色的一致。
通过切片(1μm)、染色和光学显微镜术进一步检查野生型和ta2突变体谷粒(30DAP)的组织学差异。在用0.1％甲苯胺蓝(其将核酸染蓝，将多糖染紫)染色后，在野生型糊粉层观察到单层的大的、规则朝向的矩形细胞。相反，ta2突变体谷粒切片具有6-8个细胞层的糊粉层，所述细胞具有不同大小和不规则朝向。这些观察表明ta2谷粒中增厚的糊粉层主要是由细胞层数的增加导致而不是个体糊粉层细胞的增大。
进一步用0.01％的Calcoflour White(荧光细胞壁染料)染色，显示野生型和ta2突变体谷粒之间没有细胞壁厚度的差异。对于野生型和ta2谷粒两者，糊粉层细胞的细胞壁厚于淀粉质胚乳中的细胞壁。
ta2突变体植物和谷粒农艺特性的分析
在田间与野生型(ZH11)植物回交三代产生BC3F3代，由此去除可能有诱变处理引起的额外的不相关突变，之后针对一些农艺性状分析ta2突变体植物。与野生型植物和谷粒相比，ta2突变体植物和谷粒在植物高度、谷粒千粒重、谷粒大小(长度、宽度和厚度)以及颖果形态上没有显著不同(表2)。相反，野生型植物显示98.9％的结实率而ta2突变体植物显示73.4％的降低的结实率。结实率计算为截止完熟期所述植物中由种子填充的颖花的百分比。此外，在生长室中28℃在12h光/12h暗周期无湿度调节下培养时，相比于野生型谷粒的97.3％，ta2突变体谷粒显示75.1％的降低的萌发能力。萌发定义为胚根可见地穿过种皮出现。
实施例3.ta2突变体的遗传分析
基于生长中的植物中糊粉层和胚乳组织的母体来源，进行两种遗传实验以测定厚糊粉层表型是母体决定的。首先，进行母本ta2(突变体)植物和父本野生型植物之间的测交，获得F2代谷粒。在F2谷粒中，49.4％(n＝634)显示增厚糊粉层表型，其显著偏离孟德尔遗传学显性基因在F2群体中预测的3:1(野生型:突变体)比率。其次，进行ta2植物和野生型植物之间的反交。全部F1种子(100％；n＝589)显示增厚糊粉层表型，而在使用野生型作为母本植物的反交中，全部F1种子(n＝197)导致野生型表型。这些杂交显示糊粉层表型由母本植物基因型决定。
表2.野生型(ZH11)和ta2突变体植物农艺性状的比较
ZH11 ta2
植物高(cm) 103.7(±3.24) 112.2(±6.05)
结实率(％) 98.9(±3.41) 73.41(±3.41)
种子千粒重(g) 22.73(±0.17) 22.07(±0.33)
种子长度(mm) 7.46(±0.26) 7.55(±0.27)
种子宽度(mm) 3.27(±0.12) 3.15(±0.10)
种子厚度(mm) 2.35(±0.10) 2.27(±0.11)
为了确立该母体效应是由配子体基因型还是孢子体基因型决定，获得自纯合Ta2/Ta2和纯合ta2/ta2植物杂交的F1杂合Ta2/ta2植物用于和ta2纯合(ta2/ta2)或野生型植物反交。在模板杂合体和父本野生型的反交中，47.3％(n＝188)的F1谷粒显示ta2突变体表型，而在母本ta2植物和父本杂合体的反交中，99.3％(n＝425)的F1个体显示ta2突变体表型。从这些结果可以得出结论，TA2基因通过配子体、母体遗传模式赋予所述表型。
根据上面的遗传分析，根据配子体母体遗传模式可以提出ta2遗传模型。当母本配子体的基因型是ta2，胚乳的表型是突变体ta2(增厚的糊粉层)且独立于父本基因型。因此，厚糊粉层表型只是由三倍体淀粉质胚乳和糊粉层发育期间的母本配子体基因型决定，使得母本杂合体导致50％的后代具有厚糊粉层表型，独立于父本基因型，且母本ta2/ta2纯合体导致100％的后代具有厚糊粉层表型。需要进一步的实验测试TA2的配子体母体效应是否由于三倍体胚乳中存在额外拷贝的母体基因或是否由于母本配子体的基因印记效应抑制父本TA2基因的表达。
实施例4.通过遗传作图和序列分析鉴别Ta2基因
鉴别和使用SSR和INDEL标记进行基因定位
对于基因定位，从在ZH11(粳稻品种)遗传背景中含ta2突变的植物和籼稻品种NJ6的遗传杂交产生F2群体植物。为了鉴别在ZH11和NJ6具有多态性并能够用于基因定位的遗传标记，对来自纯合体ZH11植物、纯合体NJ6植物的叶DNA和所述DNA的1:1混合物进行一组PCR实验。通过凝胶电泳分析PCR产物使得可以比较ZH11、NJ6和混合物的产物而鉴别多态性标记。只有当用单独的ZH11和NJ6DNA扩增显示离散的和不同的扩增产物而混合DNA显示两种产物的组合时，选择引物对用于基因定位。由此选择出124个引物对，包括54个插入-缺失多态性(INDEL)和70个短序列重复(SSR)多态性。这些遗传标记沿着水稻基因组以大约3-4Mbp的间隔分布并给出良好的覆盖度用于基因定位。
对于ta2等位基因的遗传作图，来自F2群体的143柱植物用所述124个多态性标记进行评估(score)。定位群体中个体F2植物对糊粉层表型的纯合性通过对获得自各F2植物的F3后代谷粒的表型分型而仔细评价。如实施例1所描述提取叶DNA。如实施例1所描述进行PCR扩增，且产物通过3％琼脂糖凝胶电泳分离。从结果可以得出结论，ta2基因座位于染色体1上的标记INDEL127和INDEL129之间(图1，最上面的线)，其来自对应于大约217kb的物理距离的水稻基因组序列。
用该标记对筛选另外的5000株F2植物。鉴别和选择显示在INDEL127和INDEL129之间的重组的362个个体。当这些重组植物被表型分型时，ta2基因座由此被定为至INDEL149和INDEL 128标记之间的42.8kb的区域(图1，第二条线)。
为了获得ta2突变体植物中该区域的核苷酸序列并将其与野生型序列比较而由此鉴别相应于ta2的突变，设计了所述基因组区域侧翼的序列并进行DNA测序。基因组DNA序列的比较鉴别出该测序区域中的两个单核苷酸多态性(SNP)，两者均在注释为LOC_01g11900的基因中。第一个是单核苷酸G(野生型)至A(ta2)多态性，在核苷酸位置Chr1:6451738处，参考粳稻品种的水稻基因组序列，位于染色体1上的基因LOC_01g11900的外显子14和外显子15之间的内含子14中(图1中的星号)。第二个多态性是G(野生型)至A(ta2)取代，在位置Chr1:6452308处，其位于染色体1中的基因LOC_01g11900的外显子15和16之间的内含子区域(内含子15)。
提取RNA，反转录并测序对应于ta2等位基因的cDNA后，观察到在Chr1:6451738处的第一个G至A多态性与外显子14和外显子15之间的21bp插入(图2)相关，对应于在预测的氨基酸序列中七个氨基酸的符合读框的插入(图3)。相反，对于相应于基因座Chr1:6452308位置处的第二个多态性的外显子15和16之间的突变，没有cDNA序列的改变。从这些结果得出结论，内含子14中的第一个多态性是该谷粒中的改变原因，即ta2突变。该结论在下面实施例中证实。还得到结论，该突变导致ta2基因的RNA转录物相对于野生型Ta2基因的剪接模式的改变，由此引起ta2表型。从具有所述21个核苷酸插入的cDNA数目与缺少该插入的cDNA数目的比率，估计来自ta2(突变体)基因的RNA转录物的80％在新产生的剪接位点被剪接。假设具有该7个氨基酸插入的突变体多肽是失活的，得出结论是所述突变体ta2基因相对于野生型保留大约20％的活性。
水稻基因组染色体1中位置LOC_01g11900的基因已经被注释为水稻ROS1a基因(OsROS1a)，编码双功能DNA糖基化酶/裂解酶的拟南芥(Arabidopsis thaliana)Demeter基因(AtDME)的同源物。拟南芥DMA酶充当DNA脱甲基酶，降低DNA中C残基的甲基化。因此，Ta2基因和OsROS1a基因是同义的并且是拟南芥DME基因的同源物。
水稻ROS1a基因的核苷酸序列适于SEQ ID NO:9，包括4726个核苷酸的启动子和5-UTR(非翻译区)，包括16个内含子的从核苷酸4727-15869的蛋白编码区，和615个核苷酸的3’UTR。16个内含子的核苷酸位置在SEQ ID NO:16的图例中提供。SEQ ID NO:9还在其3’端包括401个核苷酸的下游区域，其并不被认为是OsROS1基因的一部分。对应于野生型OsROS1基因的cDNA的核苷酸序列提供于SEQ ID NO:8，且所编码的1952个氨基酸的多肽提供为SEQID NO:2。
水稻具有四个ROS1基因，其编码命名为OsROS1a、OsROS1b(LOC_Os02g29230)、OsROS1c(LOC_Os05g3735)和OsROS1d(LOC_Os05g37410)的多肽。水稻还具有两个其它Demeter同源物，被认为是编码DNA糖基化酶，即Demeter-样-2(DML2)和Demeter-样-3(DML3)。
野生型水稻TA2多肽中的结构特征的描述
在发现水稻TA2基因与OsROS1a相同后，检查了OsTA2(OsROS1)多肽氨基酸序列。鉴别到若干典型的DNA糖基化酶结构特征。ROS1a蛋白的糖基化酶结构域具有至少三个经鉴别的基序，其足够保守而可以识别：螺旋-发夹-螺旋(HhH)基序(由例如OsTA2中氨基酸1491-1515代表)，甘氨酸/脯氨酸-富含基序接着保守的天冬氨酸(GPD)，和四个保守的半胱氨酸残基(例如在氨基酸1582-1598的区域)以保持[4Fe-4S]簇的位置。还有赖氨酸-富含结构域(例如由OsTA2中的氨基酸87-139代表)。不像HhH DNA糖基化酶超家族的其他成员，ROS1家族成员含有中央糖基化酶结构域侧翼的两个额外的保守结构域(结构域A和B)(Mok etal.,2010)。在水稻TA2多肽(SEQ ID NO:2)，结构域A存在于氨基酸859-965，糖基化酶结构域存在于氨基酸1403-1616，而结构域B存在于氨基酸1659-1933。结构域A在韩计算882-892处含有重复的混合-电荷簇。已报道AtDMA的保守DNA糖基化酶结构域和侧翼的结构域A和B对于DNA糖基化酶/裂解酶酶促活性是必要的和足够的，如由诱变分析所显示(Mok et al.,2010)。
实施例5.分析ta2突变体谷粒的营养组分
为了测量突变体谷粒的组成，尤其是重要的营养组分，ZH11和ta2植物在田间在相同时间且在相同条件下生长。从收获自所述植物的谷粒制备全谷粒面粉样品并用于组成分析。面粉常规(proximate)分析的结果(重复测量的均值)在表2中给出。
表2.水稻谷粒的组成分析(g/100g谷粒)
常规分析表明ta2突变体面粉中总脂肪含量大约50％的增加。总氮分析显示ta2突变体和野生型谷粒之间在蛋白水平没有显著改变。灰分测定，其测量干燥的面粉样品燃烧后剩余物质的量，表明ta2谷粒相对于野生型26％的增加。总纤维水平在ta2谷粒中增加大约200％。相对于野生型，淀粉含量在ta2谷粒中减少8.6％。这些数据表明ta2突变体中糊粉层厚度的增加引起糊粉层富含的营养例如脂质、矿物质和纤维水平的增加而不改变种子的大小。为了更详细了解这些和其它改变，如下进行更详尽的分析。
矿物质
为了测量矿物质含量，使用ICP-AES，其组合了电感耦合等离子体(ICP)和原子发射光谱(AES)技术。这是测量矿物质含量的标准方法，在单一分析中提供大量元素的灵敏的和高通量的定量。从该分析获得数据显示突变体谷粒的锌和铁水平相对于野生型谷粒基于重量增加大约15％。锌水平从13.9mg/kg增加至16.0mg/kg，而铁从12.4mg/kg增加至14.2mg/kg。
也观察到钾、镁、磷和硫的增加，分别增加大约28％、23％、22％和9％。这些结果与ta2谷粒中灰分含量增加(其主要测量矿物质)相一致。
抗氧化剂
抗氧化剂这样的生物分子，其能够在动物组织中对抗氧化作用的负面效应，因此保护免受氧化胁迫-相关疾病例如炎症、心血管疾病、癌症和老化相关疾病(Huang,2005)。
获得自ta2突变体和野生型水稻谷粒的面粉中的抗氧化能力通过实施例1所描述的氧自由基吸收能力(ORAC)测定进行测量。在ORAC测定中，抗氧化能力由内源自由基清除生物分子和可氧化分子荧光探针荧光素之间的针对由AAPH(2,2’-偶氮(2-脒基-丙烷)二氢氯化物)产生的合成游离自由基的竞争动力学代表。通过比较所述谷粒的动力学曲线(AUC)(代表分子探针荧光素的荧光降解动力学)和用Trolox标准品产生的AUC下的面积计算所述能力。定量抗氧化能力的替代方法是通过使用Folin-Ciocalteau试剂(FCR)；这通过测量食物样品中的总酚类化合物的还原能力代表抗氧化能力。FCR测定相对地简单、便利和可再现。然而，更耗时间的ORAC测定测量更加生物学相关的活性。由于抗氧化剂包括广泛的多酚、还原剂和亲核物质，通过FCR和ORAC两者测量可以提供更好的覆盖度和对总抗氧化能力更全面的了解。如Prior(2005)所报道，FCR测定和ORAC测量的结果通常是一致的。
FCR和ORAC测定均显示来自ta2突变体的全谷粒面粉相对于野生型ZH11全谷粒面粉的增加的抗氧化能力。FCR显示ta2突变体中总酚类化合物大约35％的增加。来自ta2突变体的面粉中的亲水性抗氧化剂含量也有83％的增加。
植酸盐
当生长于有足够磷的环境下时，水稻谷粒中大约70％的总磷含量是植酸盐或植酸(myo-肌醇-1,2,3,4,5,6-六磷酸)的形式。膳食性植酸盐还可能作为强抗氧化剂对健康具有有益作用(Schlemmer,2009)。总植酸盐分析显示与野生型相比，ta2中植酸盐含量大约19％的增加，从大约10.8mg/g增加至大约12.7mg/g。
B族维生素
ta2面粉中的维生素B3、B6和B9的水平分别比野生型面粉中的那些高大约19％、63％和58％。当测定重复四个重复时，平均增加分别为大约20％、33％和38％。已知糊粉层比胚乳更富含维生素B3、B6和B9(Calhoun,1960)，因此认为ta突变体谷粒中糊粉层厚度的增加决定了维生素B3、B6和B9含量的增加。
膳食性纤维
如实施例1所描述测量的总膳食性纤维，如所观察的，增加大约70％。不溶性纤维增加大约55％。
碳水化合物
ta2谷粒的淀粉含量基于重量有9％的减少。相反，突变体谷粒中蔗糖水平增加2.5倍，且单糖(阿拉伯糖、木糖、半乳糖、葡萄糖)相对于野生型增加31％至118％。
结论
营养分析显示从田间生长的ta2谷粒产生的全谷粒面粉，相对于野生型，大部分的糊粉层富含的营养物显著增加，包括大量营养物如脂质和纤维，微量营养物如矿物质(铁、锌、钾、镁、磷、硫)，B族维生素如B3、B6和B9，抗氧化剂和糊粉层相关的生物分子如酚类化合物和植酸盐。游离蔗糖和单糖也有实质增加。伴随这些营养物和微量营养物的增加的是ta2突变体中淀粉含量(相对百分比)的小量减少。
实施例6.筛选Ta2基因中额外的突变体等位基因
通过实施例所描述的TILLING测定筛选ZH11遗传背景的水稻植物的经诱变群里(实施例2)以鉴别Ta2基因中另外的多态性，使得可以测试它们的增厚糊粉层表型。基本上如Jiang et al.(2013)所描述，该方法使用经标记的野生型RNA和候选突变体RNA的异源双链体,通过内切酶CelI进行消化。首先选择TA2基因的5'区域进行筛选，但可以选择该基因的任何区域。
通过TILLING测定在Ta2基因的5'区域鉴别出多个单核苷酸多态性。如同第一个ta2突变体，针对增厚的糊粉层和其它谷粒表型检查来自具有所述多态性的植物的谷粒。一些谷粒显示增厚的糊粉层。选择显示突变体表型的那些谷粒并从其获得后代植物。测定各自Ta2基因的核苷酸序列，确认存在所述突变。鉴别在各突变体的Ta2基因中的改变的核苷酸。另外的三个厚糊粉层突变体也被测序。也鉴别出其他含有多态性但不显示增厚糊粉层的谷粒并保留用于比较。所鉴别的突变体和其它多态性株系，以及他们的糊粉层表型总结于表3。具有增厚的糊粉层的突变体显示为：++，大大地增厚的糊粉层；+，弱增厚的糊粉层；-，未改变的糊粉层表型。显然获得了许多种突变和表型结果。
野生型ZH11谷粒中的糊粉层显示一个细胞层的厚度。相反在具体突变体中，包含V441A突变的突变体谷粒中的糊粉层在背侧增厚，包含大约5-6个细胞层。突变体S1357F谷粒中的糊粉层厚度为大约4-5个细胞层且所述谷粒皱缩，而突变体R482K谷粒的糊粉层为2-3个细胞层厚且所述谷粒不皱缩。突变体S214F谷粒中的糊粉层含有2-4个细胞层且所述谷粒皱缩，如来自突变体S156F和S1413N的谷粒一样。相反，K501S谷粒的糊粉层具有2-3个细胞层并且其谷粒不皱缩。因此，容易地获得了Ta2基因中的多种突变体和表型。
表3.水稻Ta2基因中鉴别到的突变
在具有Ta2基因中的多态性的60个新鉴别的株系，19个在预测的索泰产物中具有氨基酸变化(取代)。其中，至少7个显示增厚的糊粉层表型。S1413N和D1425N突变位于糖基化酶结构域；其它鉴别的突变位于糖基化酶结构域之外。除了最初的剪接位点变体突变体之外，全部所鉴别的突变时氨基酸取代。没有一个是缺失或终止密码子，使得本发明人的结论为OsROS1中的无效突变可能是致死的。已报道在拟南芥中，母体dme突变导致败育种子(Choi et al.,2002and 2004)。在水稻中，ros1a母体无效等位基因的存在导致早起胚乳发育失败而不管父本基因型如何(Ono et al.,2012)。
TA2(OsROS1a)基因中10个新的独立突变体等位基因(各自在谷粒中具有增厚的糊粉层)的恢复最终表明该基因中的所述突变导致了所述厚糊粉层表型。此外，这些新的突变全部位于该基因与第一个的ta2突变不同的区域，表明该基因可以沿着全长基因的不同位置被改变以实现厚糊粉层表型。
若干来自显示厚糊粉层的所述突变体的ta2基因被克隆且编码的多肽被表达并测试DNA糖基化酶/裂解酶活性。这确认了所述多肽与野生型多肽相比具有降低的DNA糖基化酶/裂解酶活性。
实施例7.ta2突变体的互补分析
为了加强Ta2(OsROS1a)基因中的突变负责增厚的糊粉层和相关表型的结论，通过将所述基因的野生型拷贝通过转化导入至所述突变体株系进行互补实验。为了构建用于互补实验的转化质粒，从野生型水稻基因组分离包括Ta2基因的16882个核苷酸DNA片段(核苷酸序列提供于SEQ ID NO:9)。该片段按顺序含有，被认为是含有该基因启动子的4726-bp上游序列，包括全部内含子的整个OsTA2蛋白编码区，615个核苷酸的3’-UTR和401-bp下游区域。其使用一系列的寡核苷酸引物从ZH11基因组DNA扩增，组装，且然后用KpnI和SalI消化饼连接至二元载体pCAMBIA1300。该载体还含有潮霉素抗性基因作为选择标记基因。用于转化的质粒和对照质粒(空载体)各自导入根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA105中并用于通过Nishimura et al.(2006)描述的方法转化水稻受体细胞。从用野生型Ta2基因的转化中再生出总共32株T0转基因植物。将这些植物转移至土壤并在生长室中生长至成熟。使用PCR测试潮霉素抗性基因的存在时，鉴别并选择出20个携带所述潮霉素基因的转化体株系。将这些生长至成熟并从各植物收获谷粒(T1种子)。如通过PCR测定所证明的，这些植物的每一株含有来自载体的含所述野生型Ta2基因的T-DNA。
收获自这些植物的谷粒通过用依文思蓝染色检查它们的糊粉层表型。至少三株转化的植物产生具有像野生型的正常糊粉层的谷粒，表明所导入的基因的阳性表达且因此互补ta2突变。这最终证明Ta2基因中的突变导致所述突变体表型。
Ta2基因以下称作ROS1a基因；这些术语可互换。
实施例8.重组表达的TA2和ta2蛋白的体外酶活性测定
如上实施例4所述，水稻中的Ta2基因和OsROS1a基因相同，其与拟南芥命名为Demeter的DNA脱甲基酶/糖基化酶(DME；Gehring et al.,2006)同源。DME打破半甲基化DNA底物中5-甲基胞嘧啶的3'侧的磷酸二酯键。
因此重组表达的水稻Ta2和ta2蛋白的酶活性测试通过测量其对经标记的半甲基化DNA底物的活性进行，生成在变性聚丙烯酰胺凝胶上迁移至预测的β消除产物位置处的末端标记的DNA底物，如Gehring et al(2006)所述。
为了重组表达和纯化Ta2和ta2多肽，来自野生型和突变体ta2植物的全长ROS1acDNA在PCR反应中用作模板，使用寡核苷酸JH021(5’-TTAATCTAGAATGCAGAGCATTATGGACTCG-3’；SEQ ID NO:42)和JH017(5’-CGGTCGACTTAGGTTTTGTTGTTCTTCAATTTGC-3’；SEQ ID NO:43)，其分别向所扩增的DNA片段添加XbaI和SalI限制性位点。PCR产物用XbaI和SalI消化并克隆进pMAL-c2x载体(NEB)以产生c2x-ROS1a遗传构建体。将所述遗传构建体转化至大肠杆菌Rosetta细胞(Novagen)。为产生所述多肽，经转化的细胞于28℃在补充0.2％葡萄糖、100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL氯霉素的LB中生长直至达到0.4的OD600。ROS1a-Mal融合蛋白表达用10μM的IPTG在18℃诱导1hr。培养物在4℃以6500rpm离心15min，且沉淀物重悬于30mL的4℃柱缓冲液(20mM Tris-HCl,pH 7.4,200mM NaCl,1mM EDTA)。使用BransonSonifier 250以设定为4的输出功率在冰上超声处理所述细胞两分钟。裂解物在4℃以9500rpm离心25min，且收集上清液并进行重力柱纯化。通过直链淀粉树脂遵循制造商方案(New England Biolabs)纯化ROS1a-Mal融合蛋白。洗脱的蛋白在Slide-A-Lyzer透析盒(10,000MWCO；Pierce)针对50％甘油4℃透析过夜。使用蛋白测定试剂盒(Bio-RadLaboratories)通过Bradford法测定蛋白浓度，且将蛋白储存于-20℃直到进一步使用。
如实施例1所述(Gehring et al.,2006)，测定ROS1a-Mal融合蛋白针对半甲基化双链DNA底物的DNA糖基化酶活性。
作为对照，当ROS1a和未甲基化DNA寡核苷酸孵育时或当半甲基化DNA底物在不存在酶情况下孵育时，没有检测到裂解酶活性或共价捕获(covalent trapping)。
实施例9.ROS1a基因在水稻中的同源物
编码介导DNA去甲基化的DNA糖基化酶的植物基因已经主要在拟南芥中表征(Chanet al.,2005；Law and Jacobsen,2010；Zhu,2009)。它们包括Demeter(DME,Choi et al.,2002；Gehring et al.,2006)、ROS1(Gong et al.,2002；Agius et al.,2006),Demeter-样2(DML2)和Demeter-样3基因(DML3,Choi et al.,2002；Ortega-Galisteo et al.,2008)。这些基因(和编码多肽)中最大的，DME，主要在受精前在雌配子体的同二倍体(homodiploid)中央细胞中强表达，其(包括在胚乳中)促进母体等位基因特异性全局甲基化和印记基因表达。相反，ROS1、DML2和DML3在营养组织中表达(Gong et al.,2002；Penterman et al.,2007)。相比于ROS1，DML2和DML3基因的表达水平低(Mathieu et al.,2007)。此外，ros1、dml2和dml3中的纯合突变没有产生明显的形态学表型而母体dme突变导致败育种子，即胚胎致死，且不传递给后代(Choi et al.,2002and 2004)。尽管它们表达水平低，ROS1、DML2和DML3多肽仍然起DNA糖基化酶/裂解酶的功能(Gong et al.,2002；Morales-Ruiz et al.,2006；Penterman et al.,2007)。从该数据，将无法预期ROS1突变导致增厚的糊粉层表型。
系统进化分析揭示水稻基因组编码6个用于胞嘧啶去甲基化的假定DNA糖基化酶，包括四个似乎属于ROS1直系同源物(OsROS1a、OsROS1b、OsROS1c、OsROS1d)和两个明显的DML3直系同源物(Zemach et al.,2010)。鉴别到OsROS1a中的无效突变但并不从含有所述突变的雄性或雌性植物传递到后代，推测是因为ROS1a野生型DNA糖基化酶对于雄性和雌性配子体发育军事不可或缺的(Ono et al.,2012)。本发明人没有发现OsROS1a中部分突变的任何发表的报道。
DNA糖基化酶结构域中三个鉴别到的基序，即螺旋-发夹-螺旋(HhH)基序、甘氨酸/脯氨酸-富含基序接着保守的天冬氨酸(GPD)、和四个保守的半胱氨酸(实施例4)存在于Demeter家族的每个成员中。所述糖基化酶结构域结构也在人8-羟鸟嘌呤DNA糖基化酶(hOGG1)、大肠杆菌腺嘌呤DNA糖基化酶(MutY)和核酸内切酶III(Endo III)中发现(Bruneret al.2000；Guan et al.1998；Mok et al.,2010)。不像HhH DNA糖基化酶超家族的其他成员，DME-家族成员含有中央糖基化酶结构域侧翼的两个额外的保守结构域(结构域A和结构域B)(Mok et al.,2010)。
所述同源基因的蛋白编码区域的核苷酸序列通过ClustalW(www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)进行比对。水稻ROS1a蛋白编码区域与其它物种中同源基因相应区域的序列相同性程度示于表4。
本发明人从这些分析得出结论是水稻具有多个ROS1基因同源物但没有DME基因。在水稻中，如同拟南芥，在序列相同性程度上，ROS1可以清楚地与其同一物种中的同源物DML1和DML3区别开。
表4.与水稻OsROS1a或TaROS1a-5B的编码区域的核苷酸序列相同性
基因 登录号 与OsROS1a的相同性
OsROS1a LOC_Os01g11900 100％
OsROS1b LOC_Os02g29230 41.7％
OsROS1c LOC_Os05g37350 42.0％
OsROS1d LOC_Os05g37410 41.9％
OsDML3a LOC_Os02g29380 34.9％
OsDML3b LOC_Os04g28860 33.2％
AtDME NM001085058.1 40.6％
AtROS1 NM129207.4 41.5％
AtDML2 NM111836.5 39.2％
AtDML3 NM119567.3 40.4％
实施例10.在水稻和小麦中表达ROS1a基因
进行实验分析TA2基因在不同水稻组织中的表达，包括发育中谷粒的部分。在第一个实验中，通过原位杂交如Brewer et al.(2006)所描述检测水稻组织切片中的TA2mRNA。简言之，不同的水稻组织在真空浸润后在FAA固定剂中4℃固定8h，使用逐级乙醇系列随后二甲苯系列脱水，并包埋在Paraplast Plus(Sigma-Aldrich)中。切片机切片(8μm)被封装在Probe-On Plus显微镜载玻片(Fisher)上。
从杂交信号得出结论是，TA2在水稻的果皮、种皮和糊粉层组织以及在淀粉质胚乳中表达，但不在维管束中表达。
使用实时反转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定不同植物组织中的相对表达水平。出乎意料地，结果表明最高表达在花粉，然后是花药、年轻穗和糊粉层组织(图6)。据认为OsROS1a在花药中的特异性表达可能参与抑制雄配子体中的转座子。在拟南芥三细胞花粉中，活性DNA去甲基化对维持营养性细胞核转座子的基础表达是重要的，从而产生siRNA以增强雄配子(即两个精子细胞)中转座子的RNA依赖性DNA甲基化(RdDM)(Zhu,2009；Zhu etal.,2007)。
ROS1a在发育中的种子中的表达增加至开花后10天，此后开始下降。在淀粉质胚乳和糊粉层组织中均观察到强表达。种子发育中的早表达模式与增厚糊粉层的形成一致，先于种子发育期间胚乳的细胞化。本发明人的结论是ROS1a在开花当天至开花(授粉)后7天(0-7DAP)的时期内的表达降低对厚糊粉层的形成是关键的。
实施例11.水稻中基因甲基化模式
为了确定全部水稻基因全体地在ta2突变体植物相对于野生型TA2植物的甲基化模式，从胚乳和胚分离DNA并用亚硫酸氢盐(其和非甲基化胞嘧啶反应)处理，随后进行Illumina测序。胚乳在10DAP分离自ta2和野生型(ZH11)植物的发育中的水稻谷粒，而胚分离自谷粒发育相同时期的野生型植物。对于亚硫酸氢盐处理后的测序，合成定制的Illumina连接物，其中胞嘧啶用5-甲基胞嘧啶置换，使得所述连接物在亚硫酸氢盐转化中被保留。合成末端配对(PE)的连接物，其允许每个分子从两端被测序，因此有利于随后比对至基因组脚手架序列。分离来自从野生型和ta2植物各自切下的胚乳以及来自野生型的胚的大约0.5-1μg基因组DNA。所分离的DNA制备物通过超声处理剪切至100-500bp的片段。遵循Illumina方案将所述连接物连接至经剪切的片段。然后使用Qiagen EpiTect试剂盒用将非甲基化胞嘧啶(C)转化为尿嘧啶(U)的亚硫酸氢钠处理所述DNA两次，使用PfuTurboCxDNA聚合酶(Stratagene)(耐受模板链中的尿嘧啶的校正性酶)通过18个循环的PCR扩增。该PCR扩增产生在各末端具有不同连接物的DNA片段文库，从而“正向”Illumina测序引物从“原始”基因组衍生链产生核苷酸序列(其中C对应于甲基化C，而T对应于非甲基化的C，如果基因组序列存在C)，而“反向”Illumina测序引物从互补链产生核苷酸序列(其中G对应于相对链上甲基化的C，而A对应于非甲基化的C，如果基因组序列存在C)。
获得自ta2胚乳的DNA中的CG和CHG甲基化程度大于获得自对照ZH11胚乳的DNA的程度，表明TA2(OsROS1a)中的突变减少水稻胚乳中的去甲基化过程，而ta2胚乳中的CHH甲基化程度与野生型ZH11胚乳中的无显著不同。
实施例12进一步分析ta2突变体谷粒中营养成分
进行进一步分析以测量与相应野生型谷粒(ZH11)相比的突变体谷粒的营养成分，其在田间生长于相同时间和相同条件下。从收获组植物的谷粒制备的全谷粒面粉样品并用于如实施例5所描述的组分分析。生长于澳大利亚的谷粒的面粉的常规分析结果给出于表5。生长于中国的谷粒的结果给出于表6。
常规分析显示ta2突变体面粉中总脂质含量约50％的增加。总氮分析显示ta2突变体和野生型谷粒在中国在蛋白质水平上的显著变化，但在澳大利亚不是，其可能是由于不同的氮肥方案。在ta2突变体中，总纤维水平增加约66％或91％。ta2谷粒中淀粉含量相对于野生型降低9％。这些结果确认ta2突变体中糊粉层厚度的增加导致糊粉层富含的营养乳脂质、矿物质和纤维的水平显著增加，而不改变种子大小。即使两种生长环境中的绝对数字不同，ta2谷粒中的相对增加是合理地一致的。
表5.ros1a突变体水稻谷粒(澳大利亚)与野生型相比的组成
表6.ros1a突变体水稻谷粒(中国)与野生型相比的组成
组分 特定组分 ZH11 ta2 ％改变
蛋白质 总蛋白质 12.38 14.12 14.05
氨基酸 天冬酰胺 1.16 1.53 31.90
苏氨酸 0.45 0.54 20.00
丝氨酸 0.64 0.73 14.06
谷氨酰胺 2.29 2.40 4.80
甘氨酸 0.59 0.76 28.81
丙氨酸 0.71 0.84 18.31
半胱氨酸 0.26 0.30 15.38
缬氨酸 0.72 0.79 9.72
甲硫氨酸 0.22 0.22 0.00
异亮氨酸 0.50 0.53 6.00
亮氨酸 1.02 1.05 2.94
酪氨酸 0.59 0.58 -1.69
苯丙氨酸 0.66 0.69 4.55
组氨酸 0.43 0.54 25.58
赖氨酸 0.43 0.60 39.53
精氨酸 1.14 1.39 21.93
脯氨酸 0.52 0.59 13.46
淀粉 直链淀粉 9.80 5.14 -47.55
矿物质 硒(Se) 0.03 0.03 8.78
钙 167.89 231.39 37.82
Fe 15.24 17.76 16.54
Zn 28.68 41.37 44.25
抗氧化剂 总黄酮类 0.06 0.08 33.33
纤维 总膳食性纤维 3.26 6.23 91.10
维生素 维生素A 1.53 5.52 260.78
维生素E 0.47 1.00 112.77
维生素B1 0.50 0.57 12.97
维生素B2 0.04 0.08 116.67
本领域技术人员将理解，不背离概括描述的本发明的精神和范围，可以对在具体实施方式中所示的本发明进行多种变化和/或修改。因此，所述实施方式在全部方面都应被认为是示例性的而不是限制性的。
本申请要求2015年11月18日提交的AU2015904754的优先权，其全部内容以其整体通过引用并入本文。
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<400> 1
Met Gln Asp Phe Gly Gln Trp Leu Pro Gln Ser Gln Thr Thr Ala Asp
1 5 10 15
Leu Tyr Phe Ser Ser Ile Pro Ile Pro Ser Gln Phe Asp Thr Ser Ile
20 25 30
Glu Thr Gln Thr Arg Thr Ser Ala Val Val Ser Ser Glu Lys Glu Ser
35 40 45
Ala Asn Ser Phe Val Pro His Asn Gly Thr Gly Leu Val Glu Arg Ile
50 55 60
Ser Asn Asp Ala Gly Leu Thr Glu Val Val Gly Ser Ser Ala Gly Pro
65 70 75 80
Thr Glu Cys Ile Asp Leu Asn Lys Thr Pro Ala Arg Lys Pro Lys Lys
85 90 95
Lys Lys His Arg Pro Lys Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro Ser Lys Thr
100 105 110
Pro Lys Ser Ala Thr Pro Ile Pro Ser Thr Glu Lys Val Glu Lys Pro
115 120 125
Ser Gly Lys Arg Lys Tyr Val Arg Lys Lys Thr Ser Pro Gly Gln Pro
130 135 140
Pro Ala Glu Gln Ala Ala Ser Ser His Cys Arg Ser Glu Leu Lys Ser
145 150 155 160
Val Lys Arg Ser Leu Asp Phe Gly Gly Glu Val Leu Gln Glu Ser Thr
165 170 175
Gln Ser Gly Ser Gln Val Pro Val Ala Glu Ile Cys Thr Gly Pro Lys
180 185 190
Arg Gln Ser Ile Pro Ser Thr Ile Gln Arg Asp Ser Gln Ser Gln Leu
195 200 205
Ala Cys His Val Val Ser Ser Thr Ser Ser Ile His Thr Ser Ala Ser
210 215 220
Gln Met Val Asn Ala His Leu Phe Pro Pro Asp Asn Met Pro Asn Gly
225 230 235 240
Val Leu Leu Asp Leu Asn Asn Ser Thr Ser Gln Leu Gln Asn Glu His
245 250 255
Ala Lys Phe Val Asp Ser Pro Ala Arg Leu Phe Gly Ser Arg Ile Arg
260 265 270
Gln Thr Ser Gly Lys Asn Ser Leu Leu Glu Ile Tyr Ala Gly Met Ser
275 280 285
Asp Arg Asn Val Pro Asp Leu Asn Ser Ser Ile Ser Gln Thr His Ser
290 295 300
Met Ser Thr Asp Phe Ala Gln Tyr Leu Leu Ser Ser Ser Gln Ala Ser
305 310 315 320
Val Arg Glu Thr Gln Met Ala Asn Gln Met Leu Asn Gly His Arg Met
325 330 335
Pro Glu Asn Pro Ile Thr Pro Ser His Cys Ile Glu Arg Ala Ala Leu
340 345 350
Lys Glu His Leu Asn His Val Pro His Ala Lys Ala Ala Val Met Asn
355 360 365
Gly Gln Met Pro His Ser Tyr Arg Leu Ala Gln Asn Pro Ile Leu Pro
370 375 380
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Leu Asp Pro Arg Arg Glu Ser Asn Ala Ser Ser Gly Ser Trp Ile Ser
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Leu Gly Val Asn Phe Asn Gln Gln Asn Asn Gly Trp Ala Ser Ala Gly
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Ala Ala Asp Ala Ala Ser Ser His Ala Pro Tyr Phe Ser Glu Pro His
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Lys Arg Met Arg Thr Ala Tyr Leu Asn Asn Tyr Pro Asn Gly Val Val
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Asn Val Ala Ser Ala Ile Asn Ser Asn Val Phe Thr Leu Ala Asp Ala
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Ile Pro Asp Glu Ile Pro Glu Asn Leu Val Val Pro Ala Trp His Thr
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His Asn Glu Arg Ser Gly Leu Ile Thr Thr Lys Gln Asn Lys Lys Asp
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Leu Asp Leu Asn Tyr Ser Asn Thr Asn Gly Phe Gln Met Tyr Cys Ser
545 550 555 560
Ala Ser Leu Leu Pro Glu Met Asp Ser Thr Lys Gly Arg Met Thr Lys
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Val Ser Lys Met Asp Lys Asn Gln Lys Arg His Tyr Gly Gly Glu Ser
580 585 590
Ser Leu Ala Gly Thr Gln Ser Ser Ile Ile Met Arg Thr Ala Ala Glu
595 600 605
Met Leu Ala Val Tyr Gln Ala Cys Gly Ile Lys Lys Lys Arg Ser Ala
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Asn Arg Phe Ser Ser Glu Thr Ile Phe Ser Gly Gly Phe Asn Gly Leu
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<210> 6
<211> 1987
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 6
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1985
<210> 7
<211> 6835
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Full length cDNA encoding rice ROS1a mutant (Ta2) polypeptide
<400> 7
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aatttcatgt tggctggtga cacttgtctc actcattatt tggtatattt tgactaaatg 120
caacgtgttg gtgctcggta gtttatattt gtttttacgc attcttcatt gactgtatgt 180
atttgatgtt gataccctgg gctgtcttat tttataggtg gatgctggga ggccacatag 240
gaggcctgtg tgatccaagt gtgctgctcc tgagttgaaa ttgcatagcc atatagcaac 300
tactggtgta aacttgagag atgaagtagt gaaaggaaat atgcaggatt ttggacaatg 360
gctgcctcaa tctcagacca ctgccgatct atatttctcc agtattccaa taccatcaca 420
gttcgatact tccatagaga cgcagactag aacttctgca gttgtatcgt cagagaaaga 480
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caagacacca gcacggaaac ccaagaagaa aaagcacagg ccaaaggtgc taaaggacga 660
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accatctgga aagagaaaat atgtccgcaa gaagacatct ccaggccaac ctcctgcaga 780
acaggcagct agctcacact gcagatctga gctgaagtca gttaaacgaa gtttggactt 840
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gttggcttgc cacgtggttt ctagcaccag ctcaattcac acttcagcta gtcagatggt 1020
taatgcacat ttgtttcctc ctgataacat gccaaatgga gtattgcttg acctcaataa 1080
ttctactagt cagttacaaa acgaacatgc taaatttgtg gacagtccgg cacgtctttt 1140
tggttccaga ataagacaga catcaggtaa aaattctttg ctagaaatct atgctggcat 1200
gtcagataga aatgtacctg atctcaacag ttcaatcagt cagacgcata gcatgtctac 1260
tgattttgct caatacttgc tttcatcctc acaagcttct gtaagggaaa cacaaatggc 1320
caatcagatg cttaatggtc ataggatgcc agaaaatcca attacaccta gtcattgtat 1380
tgaaagggct gcattgaagg aacatttgaa tcatgttcct cacgcaaaag ccgcagtgat 1440
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cagctggcgt atgtgtgagg gagatatttg aaagttggca aaattacata aaccatccca 2100
tacccccatt ttgttataga agcccaccca ccgaacacta ccagaccgag attgctctct 2160
tcatggatag ttggttatgc ccatattctt caaatatgac accaaattta gtgttagggg 2220
caaaattgca taaacaaagt tgatatggta ctatgcgaat ctacgttgaa aaaaatggac 2280
cgaatcagct actcactttg tgttgggtgg gtagggtttt tattttaaca aaatggatta 2340
tcaagtggaa tttcaaaaca aaatgactat gcaactccat tccaatttat catattgttc 2400
atgtgcgcaa catcgatggt gggagtggag tcactcagtc tggactctgt agtggagtta 2460
cttggtcacg tactcacatg acatatcttc aaatggatag ctgattcggc ctgtttcttt 2520
aaatgtgata acaaataaag tgtcaaggca aaatagccta tgccaattca ctgtgaatcc 2580
acgtcgaaag aaataagcca aattagccac tcacatgtat tggttgggtg ggcttttaac 2640
aaaacaaacc tcaaaacaaa atgattgagt gactccactc cattttatca tattattcac 2700
gtgcaaggca gcggtggtga gagtgggggc cactcaatct ggactctaga gtagagttac 2760
tcagtcacat gagttattgt taaatgggta gttaatttgg cctatttctt caaatgcgac 2820
aacaaataaa gtgtcaaggc aaaaaaaaac ataaagcata tcttgctgca aatccacgtc 2880
aaaagaaaat aagccaaatt agctacgtat gcgcattgtt tgtgtggggg ttttcaacaa 2940
aatgggttat cgtgtggatc tcaaaacaaa atgactcaga gtaactccgc tctattttat 3000
cacattattc acgtgtaagg cagcgatgga gagagtgaac tatagtaaag ttactcagtc 3060
gcacactctt aaatgaatag ttgattccac ccatttctta aaatgtaaca acaaacaaag 3120
tgcccaggca aaaatacaca aacccaaatt agctacttat gtttattagt taggtgagtt 3180
ttacaacaaa ataatatatc atacgaaatc ccaaaacaaa atggctgagc gactccgttc 3240
tattttatca cattattcac gtgtcggaca gcgacggcgg ggcagtgaag tcactcagtc 3300
tggactctct gaagtggagt tactactcac gtgacgttac tttttttggg aagtgtgtgc 3360
gctgcgatca gaagtagcca agcgtgcgcg aaatagcatt cccgacgctc acctcccctc 3420
cccccctccc cccgcatcgt tttctctcac tctcctttcc tcacttttcc tctctctgac 3480
cgaatctctc ccactcctct ctactcctct caaccctagc tcgcctctac cctctctgct 3540
catcgggcgg cgcaggggaa ggaaggcggc gtccggctgc gcggagcccg gcgagggagg 3600
aggcggcgtc aggggggacc ggcgcgggag ggcggcgttc ggcgttcggc gcggggggcg 3660
gcggcgtccg gccgactgcg gcggcggcta gatccggcga aagaggctgc atcagcgccg 3720
attccccgac tccccaaccc tcaaacggta gcgaggtata ctcggttgtt ttcccctcag 3780
gtctcaggct gatcagacgc cgcactgccg atttccccct cgggcgagcc atcggagcgg 3840
gggccgttgg ctcccaaagc agacgcgaga attcactgaa attaccgcgc catcttatct 3900
ccgcaagttg aagaatataa ttcgggcgca gtaattttta gtgaattcat gtgtctacta 3960
ctacatatgt ctgcttggga gccaaccgcg tttcgatggc tcgcctgagg ggaaatcggc 4020
gggaggcgtt tggtcagctt tgctggtagt ggggggaatt tcacctaatg attgaatgat 4080
gggatatgct gggtaaagga aggtatggtt attttatatt atctagaaga gggtaaaaaa 4140
gggagatggt cctttggggg ctgtttgtct tgtttacatg ggtttaggaa atattgctta 4200
aatggatata aagttgaaaa atgtacttga gggaagttgt aggtgcacgt ggggtcccac 4260
aatttttctt cactagtgca cctttagtta tatatttttt gcgcaagagg acaaaggcgc 4320
tccgtgtaat tttgagtaag ggccggcggg atatttattt gtgtaaagga cctagccaag 4380
aaaagcatga tagtgcatat gtatcctttc tttttctttt cttttgtttt cataactgtc 4440
ttacagaatt tcatgttggc tggtgacact tgtctcactc attatttggt atattttgac 4500
taaatgcaac gtgttggtgc tcggtagttt atatttgttt ttacgcattc ttcattgact 4560
gtatgtattt gatgttgata ccctgggctg tcttatttta taggtggatg ctgggaggcc 4620
acataggagg cctgtgtgat ccaagtgtgc tgctcctgag ttgaaattgc atagccatat 4680
agcaactact ggtgtaaact tgagagatga agtagtgaaa ggaaatatgc aggattttgg 4740
acaatggctg cctcaatctc agaccactgc cgatctatat ttctccagta ttccaatacc 4800
atcacagttc gatacttcca tagagacgca gactagaact tctgcagttg tatcgtcaga 4860
gaaagaatct gctaattcgt tcgtccctca taatggtact gggcttgttg aacgcattag 4920
caatgatgct gggctaactg aagtagttgg aagtagtgct ggaccaactg aatgtattga 4980
cttgaacaag acaccagcac ggaaacccaa gaagaaaaag cacaggccaa aggtgctaaa 5040
ggacgataaa ccatcgaaga cacctaaatc tgctactcca ataccttcaa cagaaaaggt 5100
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tgcagaacag gcagctagct cacactgcag atctgagctg aagtcagtta aacgaagttt 5220
ggactttggt ggagaagtac tgcaagagag tacacaatct ggatctcaag ttccggtggc 5280
agaaatatgt actggtccca agcgtcaatc aataccttct accatccaaa gagattcgca 5340
aagccagttg gcttgccacg tggtttctag caccagctca attcacactt cagctagtca 5400
gatggttaat gcacatttgt ttcctcctga taacatgcca aatggagtat tgcttgacct 5460
caataattct actagtcagt tacaaaacga acatgctaaa tttgtggaca gtccggcacg 5520
tctttttggt tccagaataa gacagacatc aggtaaaaat tctttgctag aaatctatgc 5580
tggcatgtca gatagaaatg tacctgatct caacagttca atcagtcaga cgcatagcat 5640
gtctactgat tttgctcaat acttgctttc atcctcacaa gcttctgtaa gggaaacaca 5700
aatggccaat cagatgctta atggtcatag gatgccagaa aatccaatta cacctagtca 5760
ttgtattgaa agggctgcat tgaaggaaca tttgaatcat gttcctcacg caaaagccgc 5820
agtgatgaat ggccaaatgc cccatagtta caggttggcg caaaatccca tcctacctcc 5880
aaatcatatt gaagggtatc aagtgatgga aaatttgagt gaacttgtca cgacaaatga 5940
ctatctaact gctagtcctt tcagtcaaac tggagctgca aataggcagc ataatattgg 6000
tgactccatg catatacatg cattggatcc tagaagagag agtaatgctt caagtggttc 6060
ttggatatca ttaggtgtga actttaacca acaaaataat ggatgggcat ctgcaggtgc 6120
tgccgatgct gcgagctcac atgccccata tttttcagaa cctcacaaaa gaatgaggac 6180
agcttatctt aacaattatc caaatggagt cgtgggacat ttttctacct catctacgga 6240
tttgtcaaat aatgagaatg aaaatgtggc ctcagcaatc aactcaaacg tttttaccct 6300
tgctgatgca caaagattga tagcccgtga gaaatcacga gcttcccaaa gaatgatcag 6360
ttttagatca tctaaaaatg atatggttaa cagatcagaa atggtccatc aacatggcag 6420
acctgctccg catggctctg catgcaggga gtctattgaa gtacctgaca aacagttcgg 6480
gctcatgaca gaagaactca cacaattacc tagtatgcca aataacccac aaagggaaaa 6540
atatattccg caaactggaa gttgccaact tcagtctttg gaacatgaca tggttaaagg 6600
gcataacttg gcaggtgaat tgcataagca agtaacttca cctcaagttg ttattcagag 6660
caatttctgt gttacccctc ctgatgtgct cggcagaaga accagtgggg agcatttaag 6720
aacccttata gctccaacac atgcatcgac atgtaaggac actctgaaag ctttaagttg 6780
tcaactggag agttctagag acattattag gcctcctgtc aatcctatag ggccatcctc 6840
tgccgatgtt ccaagaactg ataaccatca agtcaaggtt tctgaagaaa ccgttacagc 6900
caaactccct gagaagcgaa aagtaggacg tcccagaaaa gagttaaaac ctggtgagaa 6960
accaaaacct agaggccgtc caaggaaggg aaaagttgtt ggtggagaac ttgcatcaaa 7020
ggatagtcac actaatccat tgcaaaatga gagtacttca tgttcttatg gtccttatgc 7080
aggggaggct tctgttggaa gagcagttaa agcaaataga gttggagaaa acatttctgg 7140
agctatggta tccctactgg attctttaga tattgttatt caaaagataa aggtcttgga 7200
cataaacaaa tcagaagacc ctgtgacagc tgaacctcat ggtgctcttg tcccttacaa 7260
tggagaattt ggtcctattg ttccttttga ggggaaagtg aaaagaaaac gctctcgagc 7320
caaagtggat cttgaccctg taactgcttt aatgtggaag ttactaatgg gaccagatat 7380
gagtgattgt gctgaaggta tggataagga taaagagaaa tggctaaatg aagaaagaaa 7440
aatattccaa gggcgtgttg attcatttat tgctcgaatg catctagttc aaggtatttc 7500
tatcatttta aaattgtttt cctaacatga acatgatggc ttccatcttg tgattgctgc 7560
cctcacatta gtgaatggtc tcaaatcttc aatatttact gtgtacccaa atcctatttc 7620
ttcatcccaa tatattcatg tttgtactcg tactgtccca ttagacttgc attgtgctgt 7680
gaagatcaac acctttactt ttaggattac ctctatgttt gcaggagatc ggcgtttttc 7740
tccttggaaa ggatcagttg tagattctgt agtgggagta tttcttacac agaatgtttc 7800
ggaccatctt tccaggtgaa taatgcctag agcctatttg aaaactgtga cttgacttgc 7860
attgtgaggt tatgttgttt ttctgtctga ctatttcctt ttttttcagc tctgcattta 7920
tggctcttgc tgcaaaattt cctgtaaagc cagaagcctc tgaaaaaccc gcaaatgtga 7980
tgtttcatac aatttcagaa aatggtgatt gttctgggtt gtttggtaat tctgtcaagc 8040
tacagggtga gatccttgtt caggaggcca gcaacacagc agcctctttt atcacaaccg 8100
aggataagga aggaagtaac agtgtggaat tgcttggaag ttcttttggg gatggagtgg 8160
atggtgcagc aggagtttat tctaatattt atgagaatct gccagctaga ctgcatgcta 8220
ctaggcgtcc agtcgttcaa actggaaacg ctgtcgaagc ggaagatggg tcactggagg 8280
gtgttgtttc atcagaaaac tccactattt catctcaaaa ttcatcagat tatctatttc 8340
acatgtctga tcatatgttt tcgagcatgt tactaaattt cactgccgaa gacattggca 8400
gcagaaatat gcccaaagca acaagaacca catatacaga acttctacga atgcaggagc 8460
tgaagaacaa gtctaatgaa accattgaat catcagagta tcatggggtt ccagtctcat 8520
gtagtaacaa cattcaagtg ctcaatggaa tacaaaatat cggcagtaaa catcagcctt 8580
tacattcctc tatttcatat caccagactg gccaagttca cctcccagac atagtacatg 8640
cgagtgattt ggagcaatca gtatacactg gccttaatag agtgcttgat tctaatgtta 8700
cacaaaccag ttattatcct tcacctcatc ctggaattgc ctgtaacaat gaaacacaaa 8760
aggctgactc tttaagcaac atgttatatg gtatagatag atcagataag actacttccc 8820
tgtctgagcc tacaccaaga atcgataact gttttcaacc attaagttca gagaaaatgt 8880
catttgctag ggaacagtcc tcttctgaaa attatctttc aaggaatgaa gctgaagctg 8940
catttgttaa acagcatgga acatcaaatg tgcaaggtga taatactgtc aggacagagc 9000
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cttcccccaa agttccagtc gatggatcaa aagcaaagag gccaagagtt ggggctggta 9240
aaaagaaaac atatgattgg gatatgttga gaaaagaagt tctttacagt catggtaata 9300
aagaaagatc ccagaatgct aaggactcaa ttgattggga aacaataaga caagcagagg 9360
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taaaagtaag tatggcataa aacagtttac attgaaagtt gacataactc tagtcatatg 9480
tgcatgcatg ctattccata tagatttgct tatttgttgg aattccaagt tttggatcaa 9540
ccatactcat ctttagcaat tcatgttgca ggacttccta aaccgattgg tgagagacca 9600
tgggagcatc gatcttgagt ggttgcgcta tgtcgattca gataaagcga agtaagctaa 9660
ctaaatttat tttgagcaaa cattcataat gcaattggcc cttgggcatt ctataatttg 9720
tcattttgac ctctgcattg cttagcaatg acaattggat gtagtgagca tgggtaataa 9780
tgtaagcaat gacaattgga tgtagtgggc atggttaata attgaacatg tctgtgtttg 9840
cgggataata atgcctatca cctgtgagcc tgtgacatgc aaaccttgaa cgttgaacct 9900
tgaaccccct acctcgcact gtgtgctctc aaccaactga gcaagtgagg gaccttgttg 9960
tatggaaaaa ataattttaa ataacccttg attcaaccaa agcttcataa aagaatatat 10020
tttctattat tcatttgaac cagcggttga accagtgaac cgatggtctt gctggtccgg 10080
atttaataat aactatggct agaacagatt agagcaccga atacttgcgc gatgctaaat 10140
atttcaatgg ggacacacct gctcgtgtgt tgcatcaact acctaagcca cacaggcatg 10200
gcaatcaaat cagcttgccc atgtaacatc aactatctga tcgcgagaag gccggagctc 10260
tcacttgatg tttgtcattc aaaaaatagt tattcaccaa tgcaatgtca agctcccgta 10320
aagaccatga atgtagttta tccttctttg atcaagtttt tatttatatt aaagtgttta 10380
ccaatgtaat cctacattat ttgtacctgg tttttacata taaatacatt gtaccttttg 10440
tgtttcttcc agggactatc tcttaagcat tagaggactt ggacttaaaa gtgttgagtg 10500
tgtgcgtctt ttgacactcc atcacatggc ttttcctgta tgtttccttt cacaaataat 10560
tttcaagaat cttcgtttct ttatttctgg agaagtggag attttatctg tatctgttga 10620
tgatgtaggt ggatacaaat gttggtagaa tatgtgtgag gcttggatgg gtgccacttc 10680
agcccctacc cgagtctctt cagttgcacc tgttggagat gtaagtatct taaatccact 10740
ggttggcttc actaatgctg gagagtgata ggagtttgat catctgctat tgaaggtatc 10800
caatgctgga gaacatacag aaatacctct ggccgaggtt atgcaagctt gatcaacgga 10860
cattgtgagt tttagaaatg cagttaaaaa ctatatatat aagagcatgt cattatctga 10920
gagtgtataa caggttcttg atgatatgta ggtatgagct tcactatcaa atgataactt 10980
ttggaaaggt atgagacaac aactttgata aagtgaattc aacccaatta ctgtgttttg 11040
atggaccatc tgtgttactt tccttctagg tattttgtac aaaaagtaag cccaattgca 11100
acgcatgccc aatgagagct gagtgcaagc actttgcaag tgcatttgcc aggtaattct 11160
caagatgtac atattttata tacattctgt gaaatcacgg tgatgattgt taggtatgaa 11220
caattggctg agatcccccc cctcccccct cccatccttt tcctggtcct acaagttctc 11280
ctaggctaat ttaactggtg cataccacat ttatgttatt ttgatacatc aaagattatg 11340
tttgtggttg tgaggctata ttagtgtgtt gtatgtaact cagttttgca attgtagttt 11400
tagttagaac acgttgttct ctacatttta ataaatactt tttgactgga catcaatgac 11460
tggtgtattt ccgatataaa aaggttgatt gttgccgagg gatttcaatt cggtccgaat 11520
aggttcgaca aatgcagtgg gcctattagt ttaagagtga aagttctatc agctgtttga 11580
ctccactgtg acctttacac tttgtacttt tgaagaaaca gactaacctg ctcatattaa 11640
agtcttggaa tgactccatt gcgaccttta cgctttgtat tttagaagaa acagactaac 11700
ctgttcatat tagagtcttg gaactgtgtg tgtgtgtgtt tttttttttt ttgggggggg 11760
gggggcatgg agatttaatc caacattcct ggatgacctt atattggtaa tgatatggtt 11820
tttttatgat atagtgcaag gctcgctctt cctggacctg aagagaagag tttagttaca 11880
tctggaaccc caatagctgc agaaaccttc caccagacat atataagttc taggcctgta 11940
gtaagtcagc ttgagtggaa ttcaaacacc tgtcaccatg gtatgaacaa tcgccagcca 12000
atcattgagg agccagcaag cccagaacct gaacatgaga cagaagagat gaaagagtgt 12060
gcaatagagg atagttttgt cgatgatcca gaagaaatcc ctactatcaa gcttaatttt 12120
gaggagttta cacagaacct gaagagttat atgcaagcaa ataacattga gattgaagat 12180
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gcaaaaccaa tctcatgaat atttactatt gactatcatg tgttttgctg cattgcttac 12360
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gagtaagttc ataaaacatt atagaattct gtactttcct tatcaccaac tgagaatata 12480
ttgatgctta ttttcttaca atacacagtt caaccaaaga gaaccagatg atccttgccc 12540
atacctactc tctatatgga ccccaggtaa gaagtgcata aacagaacac aatatcatgg 12600
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aagcaataca tgctttagtt gcaacagtat aagagaagcg caggcccaaa aagttcgagg 12780
gacactgctg gtaagtagtt gtttctgtaa catatgctca gttgcccttg gttcaagatg 12840
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tgcatcagca ccatatgtct acgctcctga cccaacatgc aaccaatgca attgagggtt 14100
ggctctgata caattactaa tgtcctatat ccaaaacaac tataggccta tgaccaaaca 14160
taattaataa cctcgcttgc gcttttgtcc tcacttgctc catgtaaaag ggttaacccg 14220
aggttactat gttaggaata gctgggttta tgaaacggtt caactctcaa ctcctcatat 14280
agcactaatt catgtattgc tgtcagcagt gatttgagtt ccagatcatg ctcataagat 14340
aggaccaaat tgtccttact atctactccc tccgtcccaa aatataaggt atttccggtc 14400
aaaatatctt atattttggg atggagggag tactatacta cggacccacc accaaatagt 14460
gccgcagaag agagagagag agagagaaga gggggtgggg gtgggggtgt atgggtgaaa 14520
taagaatagt gccaagtatt tgccaacaaa tgaggcggtc aaatgtgtca catcaattgg 14580
gaagtatgtc agatcaactg aaaatttgat tgggaaatta ttattcatgc aacaaagctg 14640
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tggagaggta atcatttttt tttgtatgta cgttttggtt tccataacaa agagagatga 14760
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ccatttcagc tgatagctac tctccagtca aaatatttgc catctctatt gaacttttca 14940
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ggtataggac aataaaatca tgggaagtat ttattttcat caccaatcta ctcatataat 15060
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gttctgctcc aggaagagat gatgaatagg ccatctggaa aaccagaaag gaaataaaga 15900
ggaggtacat atgatctgcc agaagatcac tgacctgaaa tggatcgctg accaataagt 15960
tgccgtaggc aattcaatta tttctggcca tatacatctg ctgaaagtta tgaactccag 16020
ccactgacga attcgtggtg ctggtattct tcggcaacat gatccatcat acagattcta 16080
tgcttggttg ttgcaagcaa ttcttatgcg gtgacagttg ctgctgatag ggagaaaagg 16140
catgtccggc ggctcagcgg ctctaactgt actttcatat gagtggaacc gattgttgta 16200
catgtgaaaa gtttgccatt caaaatggtc attcatgttg ttaggtcatt catgtagtcg 16260
atgtcaaatt aatcatcaat tatttgattt gattcattca caagtttaat tggctctaga 16320
tacttgtgag ctgcaggcca gcaatgtcat aatgtatgtc gggaaaaggt agatataaat 16380
cgtcagcatt tacctgaaat acccttcctc tgtccataaa tacaagggat tttgggttgt 16440
taagcgtatt ttaagttcga tatgaaaatt actttgatgt tccgaagggc ttattttgtc 16500
ttgggttgtt tagcatgtca taaggttgat attaaattac tttcatgccc ttaggagttt 16560
tggaaagttg acgcttaaca gatgcgacta gcagtaagca ataaatgtct agatggattg 16620
agaaagtagt atttcttccg tctcaaaata ttgctataag ctctgtttgt tagggttcta 16680
acttctaaat tactttagaa gttaggtata tagtgaagtt gtggaactat ttaaatatag 16740
ttatatctct ctagtttatt ttttatttta tgagagcact tcaattcatt ccactctttt 16800
tttttttgga attgaaatca tttggttgtg cttcagttct agaaaatgtg gagctagagt 16860
tgaagacgtg ttaaacgggt cctta 16885
<210> 10
<211> 35
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 10
caatgaggta tttgctgatc atgactcaag ccgga 35
<210> 11
<211> 56
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 11
caatgagtgt tcaaatgtta tgcggcaggt atttgctgat catgactcaa gccgga 56
<210> 12
<211> 152
<212> PRT
<213> Oryza sativa
<400> 12
Cys Asn Ser Gln Glu Asn Gly Glu Leu Cys Ala Ser Asn Thr Cys Phe
1 5 10 15
Ser Cys Asn Ser Ile Arg Glu Ala Gln Ala Gln Lys Val Arg Gly Thr
20 25 30
Leu Leu Ile Pro Cys Arg Thr Ala Met Arg Gly Ser Phe Pro Leu Asn
35 40 45
Gly Thr Tyr Phe Gln Val Asn Glu Val Phe Ala Asp His Asp Ser Ser
50 55 60
Arg Asn Pro Ile Asp Val Pro Arg Ser Trp Ile Trp Asn Leu Pro Arg
65 70 75 80
Arg Thr Val Tyr Phe Gly Thr Ser Ile Pro Thr Ile Phe Lys Gly Leu
85 90 95
Thr Thr Glu Glu Ile Gln His Cys Phe Trp Arg Gly Phe Val Cys Val
100 105 110
Arg Gly Phe Asp Arg Thr Ser Arg Ala Pro Arg Pro Leu Tyr Ala Arg
115 120 125
Leu His Phe Pro Ala Ser Lys Ile Thr Arg Asn Lys Lys Ser Ala Gly
130 135 140
Ser Ala Pro Gly Arg Asp Asp Glu
145 150
<210> 13
<211> 159
<212> PRT
<213> Oryza sativa
<400> 13
Cys Asn Ser Gln Glu Asn Gly Glu Leu Cys Ala Ser Asn Thr Cys Phe
1 5 10 15
Ser Cys Asn Ser Ile Arg Glu Ala Gln Ala Gln Lys Val Arg Gly Thr
20 25 30
Leu Leu Ile Pro Cys Arg Thr Ala Met Arg Gly Ser Phe Pro Leu Asn
35 40 45
Gly Thr Tyr Phe Gln Val Asn Glu Cys Ser Asn Val Met Arg Gln Val
50 55 60
Phe Ala Asp His Asp Ser Ser Arg Asn Pro Ile Asp Val Pro Arg Ser
65 70 75 80
Trp Ile Trp Asn Leu Pro Arg Arg Thr Val Tyr Phe Gly Thr Ser Ile
85 90 95
Pro Thr Ile Phe Lys Gly Leu Thr Thr Glu Glu Ile Gln His Cys Phe
100 105 110
Trp Arg Gly Phe Val Cys Val Arg Gly Phe Asp Arg Thr Ser Arg Ala
115 120 125
Pro Arg Pro Leu Tyr Ala Arg Leu His Phe Pro Ala Ser Lys Ile Thr
130 135 140
Arg Asn Lys Lys Ser Ala Gly Ser Ala Pro Gly Arg Asp Asp Glu
145 150 155
<210> 14
<211> 7
<212> PRT
<213> Oryza sativa
<400> 14
Cys Ser Asn Val Met Arg Gln
1 5
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oligonucleotide primer
<400> 15
tgagtagttg cgttgttct 19
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oligonucleotide primer
<400> 16
tcttagtgag ccgtttct 18
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oligonucleotide primer
<400> 17
ccttctgtgc tatgggtt 18
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oligonucleotide primer
<400> 18
catgccaaga caccactt 18
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oligonucleotide primer
<400> 19
tggctttgga aacggtag 18
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oligonucleotide primer
<400> 20
tttagaggga tgtgcgtca 19
<210> 21
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oligonucleotide primer
<400> 21
aaacaacgat ccagcaaa 18
<210> 22
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oligonucleotide primer
<400> 22
ttggcaccgt attactttc 19
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oligonucleotide primer
<400> 23
acgcattctt cattgactgt atgt 24
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oligonucleotide primer
<400> 24
gccctttcaa tacaatgact aggt 24
<210> 25
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oligonucleotide primer
<400> 25
gaacatttga atcatgttcc tcac 24
<210> 26
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oligonucleotide primer
<400> 26
actatccttt gatgcaagtt ctcc 24
<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oligonucleotide primer
<400> 27
gttggaagag cagttaaagc aaat 24
<210> 28
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oligonucleotide primer
<400> 28
cttcggcagt gaaatttagt aaca 24
<210> 29
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oligonucleotide primer
<400> 29
tacagaactt ctacgaatgc agga 24
<210> 30
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oligonucleotide primer
<400> 30
gcaacatgaa ttgctaaaga tgag 24
<210> 31
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oligonucleotide primer
<400> 31
ctatacctcc tcaactccgg tcaccgtctc cggcg 35
<210> 32
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oligonucleotide primer
<220>
<221> C
<222> (18)..(18)
<223> 5-methylcytosine
<400> 32
ctatacctcc tcaactccgg tcaccgtctc cggcg 35
<210> 33
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oligonucleotide primer
<220>
<221> C
<222> (17)..(17)
<223> 5-methylcytosine
<400> 33
ctatacctcc tcaactccgg tcaccgtctc cggcg 35
<210> 34
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oligonucleotide primer
<220>
<221> C
<222> (22)..(22)
<223> 5-methylcytosine
<400> 34
ctatacctcc tcaactccgg tcaccgtctc cggcg 35
<210> 35
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oligonucleotide primer
<220>
<221> g
<222> (18)..(18)
<223> abasic site
<400> 35
ctatacctcc tcaactcggt caccgtctcc ggcg 34
<210> 36
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oligonucleotide primer
<220>
<221> C
<222> (17)..(17)
<223> abasic site
<400> 36
ctatacctcc tcaactcggt caccgtctcc ggcg 34
<210> 37
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oligonucleotide primer
<220>
<221> T
<222> (15)..(15)
<223> abasic site
<400> 37
ctatacctcc tcaatccggt caccgtctcc ggcg 34
<210> 38
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oligonucleotide primer
<220>
<221> A
<222> (12)..(12)
<223> abasic site
<400> 38
ctatacctcc taactccggt caccgtctcc ggcg 34
<210> 39
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oligonucleotide primer
<400> 39
ctatacctcc tcaactctgg tcaccgtctc cggcg 35
<210> 40
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oligonucleotide primer
<400> 40
cgccggagac ggtgaccgga gttgaggagg tatag 35
<210> 41
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oligonucleotide primer
<220>
<221> C
<222> (17)..(17)
<223> 5-methylcytosine
<400> 41
cgccggagac ggtgaccgga gttgaggagg tatag 35
<210> 42
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oligonucleotide primer
<400> 42
ttaatctaga atgcagagca ttatggactc g 31
<210> 43
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oligonucleotide primer
<400> 43
cggtcgactt aggttttgtt gttcttcaat ttgc 34
<210> 44
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Motif
<400> 44
Asp His Gly Ser Ile Asp Leu Glu Trp Leu Arg Asp His Gly Ser Ile
1 5 10 15
Asp Leu Glu Trp Leu Arg
20
<210> 45
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Motif
<400> 45
Gly Leu Gly Leu Lys Ser Val Glu Cys Val Arg Leu Leu Thr Leu His
1 5 10 15
His
<210> 46
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Motif
<400> 46
Ala Phe Pro Val Asp Thr Asn Val Gly Arg Ile
1 5 10
<210> 47
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Motif
<400> 47
Val Arg Leu Gly Trp Val Pro Leu Gln Pro Leu Pro Glu Ser Leu Gln
1 5 10 15
Leu His Leu Leu Glu
20
<210> 48
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Motif
<400> 48
Glu Leu His Tyr Gln Met Ile Thr Phe Gly Lys Val Phe Cys Thr Lys
1 5 10 15
Ser Lys Pro Asn Cys Asn
20
<210> 49
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Motif
<400> 49
His Phe Ala Ser Ala Phe Ala Ser Ala Arg Leu Ala Leu Pro
1 5 10
<210> 50
<211> 1393
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 50
Met Glu Lys Gln Arg Arg Glu Glu Ser Ser Phe Gln Gln Pro Pro Trp
1 5 10 15
Ile Pro Gln Thr Pro Met Lys Pro Phe Ser Pro Ile Cys Pro Tyr Thr
20 25 30
Val Glu Asp Gln Tyr His Ser Ser Gln Leu Glu Glu Arg Arg Phe Val
35 40 45
Gly Asn Lys Asp Met Ser Gly Leu Asp His Leu Ser Phe Gly Asp Leu
50 55 60
Leu Ala Leu Ala Asn Thr Ala Ser Leu Ile Phe Ser Gly Gln Thr Pro
65 70 75 80
Ile Pro Thr Arg Asn Thr Glu Val Met Gln Lys Gly Thr Glu Glu Val
85 90 95
Glu Ser Leu Ser Ser Val Ser Asn Asn Val Ala Glu Gln Ile Leu Lys
100 105 110
Thr Pro Glu Lys Pro Lys Arg Lys Lys His Arg Pro Lys Val Arg Arg
115 120 125
Glu Ala Lys Pro Lys Arg Glu Pro Lys Pro Arg Ala Pro Arg Lys Ser
130 135 140
Val Val Thr Asp Gly Gln Glu Ser Lys Thr Pro Lys Arg Lys Tyr Val
145 150 155 160
Arg Lys Lys Val Glu Val Ser Lys Asp Gln Asp Ala Thr Pro Val Glu
165 170 175
Ser Ser Ala Ala Val Glu Thr Ser Thr Arg Pro Lys Arg Leu Cys Arg
180 185 190
Arg Val Leu Asp Phe Glu Ala Glu Asn Gly Glu Asn Gln Thr Asn Gly
195 200 205
Asp Ile Arg Glu Ala Gly Glu Met Glu Ser Ala Leu Gln Glu Lys Gln
210 215 220
Leu Asp Ser Gly Asn Gln Glu Leu Lys Asp Cys Leu Leu Ser Ala Pro
225 230 235 240
Ser Thr Pro Lys Arg Lys Arg Ser Gln Gly Lys Arg Lys Gly Val Gln
245 250 255
Pro Lys Lys Asn Gly Ser Asn Leu Glu Glu Val Asp Ile Ser Met Ala
260 265 270
Gln Ala Ala Lys Arg Arg Gln Gly Pro Thr Cys Cys Asp Met Asn Leu
275 280 285
Ser Gly Ile Gln Tyr Asp Glu Gln Cys Asp Tyr Gln Lys Met His Trp
290 295 300
Leu Tyr Ser Pro Asn Leu Gln Gln Gly Gly Met Arg Tyr Asp Ala Ile
305 310 315 320
Cys Ser Lys Val Phe Ser Gly Gln Gln His Asn Tyr Val Ser Ala Phe
325 330 335
His Ala Thr Cys Tyr Ser Ser Thr Ser Gln Leu Ser Ala Asn Arg Val
340 345 350
Leu Thr Val Glu Glu Arg Arg Glu Gly Ile Phe Gln Gly Arg Gln Glu
355 360 365
Ser Glu Leu Asn Val Leu Ser Asp Lys Ile Asp Thr Pro Ile Lys Lys
370 375 380
Lys Thr Thr Gly His Ala Arg Phe Arg Asn Leu Ser Ser Met Asn Lys
385 390 395 400
Leu Val Glu Val Pro Glu His Leu Thr Ser Gly Tyr Cys Ser Lys Pro
405 410 415
Gln Gln Asn Asn Lys Ile Leu Val Asp Thr Arg Val Thr Val Ser Lys
420 425 430
Lys Lys Pro Thr Lys Ser Glu Lys Ser Gln Thr Lys Gln Lys Asn Leu
435 440 445
Leu Pro Asn Leu Cys Arg Phe Pro Pro Ser Phe Thr Gly Leu Ser Pro
450 455 460
Asp Glu Leu Trp Lys Arg Arg Asn Ser Ile Glu Thr Ile Ser Glu Leu
465 470 475 480
Leu Arg Leu Leu Asp Ile Asn Arg Glu His Ser Glu Thr Ala Leu Val
485 490 495
Pro Tyr Thr Met Asn Ser Gln Ile Val Leu Phe Gly Gly Gly Ala Gly
500 505 510
Ala Ile Val Pro Val Thr Pro Val Lys Lys Pro Arg Pro Arg Pro Lys
515 520 525
Val Asp Leu Asp Asp Glu Thr Asp Arg Val Trp Lys Leu Leu Leu Glu
530 535 540
Asn Ile Asn Ser Glu Gly Val Asp Gly Ser Asp Glu Gln Lys Ala Lys
545 550 555 560
Trp Trp Glu Glu Glu Arg Asn Val Phe Arg Gly Arg Ala Asp Ser Phe
565 570 575
Ile Ala Arg Met His Leu Val Gln Gly Asp Arg Arg Phe Thr Pro Trp
580 585 590
Lys Gly Ser Val Val Asp Ser Val Val Gly Val Phe Leu Thr Gln Asn
595 600 605
Val Ser Asp His Leu Ser Ser Ser Ala Phe Met Ser Leu Ala Ser Gln
610 615 620
Phe Pro Val Pro Phe Val Pro Ser Ser Asn Phe Asp Ala Gly Thr Ser
625 630 635 640
Ser Met Pro Ser Ile Gln Ile Thr Tyr Leu Asp Ser Glu Glu Thr Met
645 650 655
Ser Ser Pro Pro Asp His Asn His Ser Ser Val Thr Leu Lys Asn Thr
660 665 670
Gln Pro Asp Glu Glu Lys Asp Tyr Val Pro Ser Asn Glu Thr Ser Arg
675 680 685
Ser Ser Ser Glu Ile Ala Ile Ser Ala His Glu Ser Val Asp Lys Thr
690 695 700
Thr Asp Ser Lys Glu Tyr Val Asp Ser Asp Arg Lys Gly Ser Ser Val
705 710 715 720
Glu Val Asp Lys Thr Asp Glu Lys Cys Arg Val Leu Asn Leu Phe Pro
725 730 735
Ser Glu Asp Ser Ala Leu Thr Cys Gln His Ser Met Val Ser Asp Ala
740 745 750
Pro Gln Asn Thr Glu Arg Ala Gly Ser Ser Ser Glu Ile Asp Leu Glu
755 760 765
Gly Glu Tyr Arg Thr Ser Phe Met Lys Leu Leu Gln Gly Val Gln Val
770 775 780
Ser Leu Glu Asp Ser Asn Gln Val Ser Pro Asn Met Ser Pro Gly Asp
785 790 795 800
Cys Ser Ser Glu Ile Lys Gly Phe Gln Ser Met Lys Glu Pro Thr Lys
805 810 815
Ser Ser Val Asp Ser Ser Glu Pro Gly Cys Cys Ser Gln Gln Asp Gly
820 825 830
Asp Val Leu Ser Cys Gln Lys Pro Thr Leu Lys Glu Lys Gly Lys Lys
835 840 845
Val Leu Lys Glu Glu Lys Lys Ala Phe Asp Trp Asp Cys Leu Arg Arg
850 855 860
Glu Ala Gln Ala Arg Ala Gly Ile Arg Glu Lys Thr Arg Ser Thr Met
865 870 875 880
Asp Thr Val Asp Trp Lys Ala Ile Arg Ala Ala Asp Val Lys Glu Val
885 890 895
Ala Glu Thr Ile Lys Ser Arg Gly Met Asn His Lys Leu Ala Glu Arg
900 905 910
Ile Gln Gly Phe Leu Asp Arg Leu Val Asn Asp His Gly Ser Ile Asp
915 920 925
Leu Glu Trp Leu Arg Asp Val Pro Pro Asp Lys Ala Lys Glu Tyr Leu
930 935 940
Leu Ser Phe Asn Gly Leu Gly Leu Lys Ser Val Glu Cys Val Arg Leu
945 950 955 960
Leu Thr Leu His His Leu Ala Phe Pro Val Asp Thr Asn Val Gly Arg
965 970 975
Ile Ala Val Arg Leu Gly Trp Val Pro Leu Gln Pro Leu Pro Glu Ser
980 985 990
Leu Gln Leu His Leu Leu Glu Met Tyr Pro Met Leu Glu Ser Ile Gln
995 1000 1005
Lys Tyr Leu Trp Pro Arg Leu Cys Lys Leu Asp Gln Lys Thr Leu
1010 1015 1020
Tyr Glu Leu His Tyr Gln Met Ile Thr Phe Gly Lys Val Phe Cys
1025 1030 1035
Thr Lys Ser Lys Pro Asn Cys Asn Ala Cys Pro Met Lys Gly Glu
1040 1045 1050
Cys Arg His Phe Ala Ser Ala Phe Ala Ser Ala Arg Leu Ala Leu
1055 1060 1065
Pro Ser Thr Glu Lys Gly Met Gly Thr Pro Asp Lys Asn Pro Leu
1070 1075 1080
Pro Leu His Leu Pro Glu Pro Phe Gln Arg Glu Gln Gly Ser Glu
1085 1090 1095
Val Val Gln His Ser Glu Pro Ala Lys Lys Val Thr Cys Cys Glu
1100 1105 1110
Pro Ile Ile Glu Glu Pro Ala Ser Pro Glu Pro Glu Thr Ala Glu
1115 1120 1125
Val Ser Ile Ala Asp Ile Glu Glu Ala Phe Phe Glu Asp Pro Glu
1130 1135 1140
Glu Ile Pro Thr Ile Arg Leu Asn Met Asp Ala Phe Thr Ser Asn
1145 1150 1155
Leu Lys Lys Ile Met Glu His Asn Lys Glu Leu Gln Asp Gly Asn
1160 1165 1170
Met Ser Ser Ala Leu Val Ala Leu Thr Ala Glu Thr Ala Ser Leu
1175 1180 1185
Pro Met Pro Lys Leu Lys Asn Ile Ser Gln Leu Arg Thr Glu His
1190 1195 1200
Arg Val Tyr Glu Leu Pro Asp Glu His Pro Leu Leu Ala Gln Leu
1205 1210 1215
Glu Lys Arg Glu Pro Asp Asp Pro Cys Ser Tyr Leu Leu Ala Ile
1220 1225 1230
Trp Thr Pro Gly Glu Thr Ala Asp Ser Ile Gln Pro Ser Val Ser
1235 1240 1245
Thr Cys Ile Phe Gln Ala Asn Gly Met Leu Cys Asp Glu Glu Thr
1250 1255 1260
Cys Phe Ser Cys Asn Ser Ile Lys Glu Thr Arg Ser Gln Ile Val
1265 1270 1275
Arg Gly Thr Ile Leu Ile Pro Cys Arg Thr Ala Met Arg Gly Ser
1280 1285 1290
Phe Pro Leu Asn Gly Thr Tyr Phe Gln Val Asn Glu Val Phe Ala
1295 1300 1305
Asp His Ala Ser Ser Leu Asn Pro Ile Asn Val Pro Arg Glu Leu
1310 1315 1320
Ile Trp Glu Leu Pro Arg Arg Thr Val Tyr Phe Gly Thr Ser Val
1325 1330 1335
Pro Thr Ile Phe Lys Gly Leu Ser Thr Glu Lys Ile Gln Ala Cys
1340 1345 1350
Phe Trp Lys Gly Tyr Val Cys Val Arg Gly Phe Asp Arg Lys Thr
1355 1360 1365
Arg Gly Pro Lys Pro Leu Ile Ala Arg Leu His Phe Pro Ala Ser
1370 1375 1380
Lys Leu Lys Gly Gln Gln Ala Asn Leu Ala
1385 1390

Claims (50)

1.水稻植物的谷粒，所述谷粒包含糊粉层、淀粉质胚乳、编码ROS1a多肽的ROS1a基因和(i)一或多个遗传变异，与相应野生型谷物植物相比，其各自降低所述植物中至少一个ROS1a基因的活性，和/或(ii)相比于来自相应野生型谷粒的糊粉层，所述糊粉层是增厚的。
2.权利要求1的谷粒，其进一步的特征为以下的一或多种或全部：
(a)所述ROS1a多肽具有DNA糖基化酶活性；
(b)所述ROS1a多肽是相应野生型ROS1a多肽的变体，其中它们的氨基酸序列是不同的；
(c)所述ROS1a多肽具有这样的DNA糖基化酶活性水平，其是相应野生型ROS1a多肽和/或具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的ROS1a多肽的DNA糖基化酶活性水平的2％至约60％；
(d)与相应野生型谷粒中的ROS1a多肽水平相比，所述谷粒中具有2％至约60％的ROS1a多肽水平；和
(e)所述增厚的糊粉层包含至少2层、至少3层、至少4层、或至少5层细胞，约3层、约4层、约5层或约6层细胞，或2-8层、2-7层、2-6层或2-5层细胞。
3.权利要求1或2的谷粒，其中所述一或多个遗传变异各自独立地是：
(a)编码与野生型ROS1a多肽(SEQ ID NO:2)相比具有降低的DNA糖基化酶活性的突变体ROS1a多肽的ROS1a基因；
(b)ROS1a基因，其表达时产生降低水平的野生型ROS1a多肽，例如其包含剪接位点突变，所述剪接位点突变导致相对于cDNA序列提供于SEQ ID NO:8的野生型ROS1a基因，所述ROS1a基因降低水平的表达，或者所述ROS1a基因在其启动子包含突变，导致所述ROS1a基因相对于野生型ROS1a基因降低的表达；
(c)外源核酸构建体，其编码降低所述水稻植物中ROS1a基因表达的多核苷酸，优选其中所述核酸构建体包含可操作地连接于启动子的编码所述多核苷酸的DNA区域，所述启动子至少在开花至开花后7天的时间内的时间点在所述水稻植物的发育中的谷粒中表达，和
(d)ROS1a基因，其在蛋白编码区包含过早翻译终止密码子，使得所述基因编码相对于野生型ROS1a多肽截短的多肽，
优选地，其中所述遗传变异包含导入的遗传变异。
4.权利要求1-3中任一项的谷粒，其中所述水稻植物特征在于以下的一或多种或全部：
(a)所述水稻植物在其发育中的谷粒中具有这样的DNA糖基化酶活性水平，其是相应的野生型发育中的谷粒中DNA糖基化酶活性水平的2％至约60％；
(b)所述水稻植物中的至少一个ROS1a基因的活性在发育中的谷粒的糊粉层、果皮、珠心突起、子房、种皮和淀粉质胚乳中的一或多种或全部被降低；
(c)ROS1a基因的活性至少在开花至开花后7天的时间内的时间点和/或在开花前的卵细胞中被降低；
(d)所述水稻植物是雄性和雌性可育的；
(e)所述水稻植物显示延迟的谷粒成熟。
5.权利要求1-4中任一项的谷粒，其进一步特征为以下的一或多种：
(a)当与相应的野生型谷粒相比时，所述谷粒包含以下的一或多种或全部，各自基于重量，
i)更高的矿物质含量，优选所述矿物质含量是锌、铁、钾、镁、磷和硫中的一或多种或全部的含量，
ii)更高的抗氧化剂含量，
iii)更高的植酸盐含量，
iv)维生素B3、B6和B9中的一或多种或全部的更高含量，
v)更高的膳食性纤维含量和/或不溶性纤维含量，
vi)相对于相应野生型谷粒的淀粉含量，以重量计约90％至约100％的淀粉含量；
vii)更高的蔗糖含量，
viii)更高的单糖含量，和
ix)相对于相应野生型谷粒的脂质含量，以重量计约90％至约100％的脂质含量；
(b)所述谷粒包含胚；
(c)所述谷粒是全谷粒或破碎的谷粒；
(d)所述谷粒被加工使得其不再能够萌发，优选通过热处理加工；
(e)相对于相应野生型谷粒的萌发率，所述谷粒具有约70％-约100％的萌发率；
(f)与相应野生型谷粒相比，所述谷粒在其总淀粉含量中包含增加比例的直链淀粉；和
(g)与相应野生型谷粒相比，本发明的谷粒在其总脂肪酸含量中包含增加比例的油酸和/或降低比例的棕榈酸。
6.权利要求1-5中任一项的谷粒，其特征为以下的一或多种或全部：
(a)所述谷粒包含编码具有DNA糖基化酶活性的ROS1a多肽的ROS1a基因，优选在所述谷粒的糊粉层、种皮和淀粉质胚乳的一或多种中，其中所述具有DNA糖基化酶活性的ROS1a多肽优选是突变体ROS1a多肽；
(b)所述谷粒包含突变体ROS1a多肽，其在所述水稻植物表达时，与相应野生型ROS1a多肽相比具有降低的DNA糖基化酶活性，优选其中所述突变体ROS1a多肽包含一或多个氨基酸取代、缺失或插入，与相应野生型ROS1a多肽相比，所述一或多个氨基酸取代、缺失或插入降低DNA糖基化酶活性；
(c)与相应野生型谷粒相比，所述谷粒具有降低的ROS1a多肽总量，优选在所述谷粒的糊粉层、种皮和淀粉质胚乳的一或多种中被降低，条件是所述谷粒包含至少一个编码具有DNA糖基化酶活性的ROS1a多肽的ROS1a基因；和
(d)所述遗传变异是外源核酸构建体，其编码降低所述水稻植物中ROS1a基因表达的多核苷酸，优选地在所述水稻植物中至少在开花至开花后7天的时间内的时间点被降低，条件是所述谷粒包含至少一个编码具有DNA糖基化酶活性的ROS1a多肽的ROS1a基因。
7.权利要求1-6中任一项的谷粒，其在它的外层着色。
8.权利要求7的谷粒，其是：
(a所述水稻植物的褐色谷粒或黑色谷粒，所述谷粒包含(i)具有至少2个细胞层或2-7个细胞层的厚度的糊粉层，和(ii)编码包含一或多个氨基酸取代、插入或缺失的ROS1a多肽的突变体ROS1a基因，与相应野生型水稻ROS1a多肽相比，所述一或多个氨基酸取代、插入或缺失降低DNA糖基化酶活性，所述降低的DNA糖基化酶活性在所述水稻植物中至少在开花至开花后7天的时间内的时间点出现，条件是至少在开花至开花后7天的时间内的时间点，与野生型水稻植物相比，所述水稻植物在发育中的谷粒中具有2％至约60％的DNA糖基化酶活性水平；或
(b)水稻植物的褐色谷粒或黑色谷粒，所述谷粒包含(i)具有至少2个细胞层或2-7个细胞层的厚度的糊粉层，和(ii)编码降低所述水稻植物中ROS1a基因表达的多核苷酸的外源核酸构建体，其中所述外源核酸构建体包含可操作地连接于启动子的编码所述多核苷酸的DNA区域，所述启动子至少在开花至开花后7天的时间内的时间点在所述水稻植物的发育中的谷粒中表达，使得至少在开花至开花后7天的时间内的时间点，与野生型水稻植物相比，所述水稻植物在发育中的谷粒中具有2％至约60％的DNA糖基化酶活性水平。
9.权利要求1-8中任一项的谷粒,其中所述ROS1a多肽包含与SEQ ID NO:2具有至少95％相同性的氨基酸序列，或所述ROS1a多肽包含与SEQ ID NO:2具有至少95％相同性的氨基酸序列且所述序列与相应的野生型ROS1a多肽的氨基酸序列不同。
10.纯化的和/或重组的ROS1a多肽，其氨基酸序列与相应的野生型ROS1a多肽的氨基酸序列不同，且当与相应野生型ROS1a多肽相比时，其具有降低的DNA糖基化酶活性，优选没有DNA糖基化酶活性。
11.权利要求10的多肽，其包含具有与SEQ ID NO:2至少95％相同的序列的氨基酸。
12.编码权利要求10或11的ROS1a多肽的分离的和/或外源的多核苷酸。
13.分离的和/或外源的多核苷酸，其当存在于水稻植物中时，降低ROS1a基因的表达。
14.权利要求13的多核苷酸，用于至少在开花至开花后7天的时间内的时间点降低水稻植物发育中的谷粒中的ROS1a基因表达。
15.编码权利要求12-14中任一项的多核苷酸的核酸构建体和/或载体，其中所述核酸构建体或载体包含可操作地连接于启动子的编码所述多核苷酸的DNA区域，所述启动子至少在开花至开花后7天的时间内的时间点在水稻植物的发育中的谷粒中表达。
16.重组细胞，其包含权利要求12-14中任一项的外源多核苷酸或权利要求15的核酸构建体和/或载体。
17.权利要求16的细胞，其中所述外源多核苷酸、核酸构建体或载体被整合进所述细胞的基因组，优选整合进核基因组。
18.水稻植物的细胞，其包含编码ROS1a多肽的ROS1a基因以及遗传变异，与相应野生型细胞相比，所述遗传变异降低所述细胞中至少一个ROS1a基因的活性。
19.权利要求18的细胞，其是糊粉层细胞、果皮细胞、珠心突起细胞、子房细胞、种皮细胞或淀粉质胚乳细胞。
20.权利要求19的细胞，其是糊粉层细胞。
21.水稻植物，其产生权利要求1-9中任一项的谷粒、权利要求10或11的多肽、权利要求12至13中任一项的多核苷酸、权利要求15的核酸构建体和/或载体，和/或其包含权利要求16-20中任一项的细胞。
22.在田间生长的至少100株权利要求21的水稻植物的群体。
23.产生权利要求16-20中任一项的细胞的方法，所述方法包括将权利要求12-14中任一项的外源多核苷酸或权利要求15的核酸构建体和/或载体导入至细胞、优选水稻细胞的步骤。
24.产生权利要求21的水稻植物或来自其的转基因谷粒的方法，所述方法包括以下步骤
i)向水稻细胞导入权利要求12-14中任一项的外源多核苷酸或权利要求15的核酸构建体和/或载体，
ii)从获得自步骤i)的细胞获得转基因水稻植物，所述转基因水稻植物对所述外源多核苷酸、核酸构建体或载体而言是转基因的，和
iii)任选地从步骤ii)的植物收获谷粒，所述谷粒对所述外源多核苷酸、核酸构建体或载体而言是转基因的，和
iv)任选地从所述转基因谷粒产生一或多代的转基因后代植物，所述后代植物对所述外源多核苷酸、核酸构建体或载体而言是转基因的，
由此产生所述水稻植物或转基因谷粒。
25.产生权利要求21的水稻植物或来自其的转基因谷粒的方法，所述方法包括以下步骤
i)向水稻细胞导入内源ROS1a基因的突变,使得所述突变的ROS1a基因编码权利要求9或10定义的的ROS1a多肽，或不编码ROS1a多肽，
ii)从获得自步骤i)的细胞获得水稻植物，所述水稻植物包含所述内源ROS1a基因的突变，和
iii)任选地从步骤ii)的植物收获谷粒，所述谷粒包含所述内源ROS1a基因的突变，和
iv)任选地从所述谷粒产生一或多代的后代植物，所述后代植物包含所述内源ROS1a基因的突变，
由此产生所述水稻植物或谷粒。
26.权利要求25的方法，其中所述水稻植物或谷粒包含至少一个编码具有DNA糖基化酶活性的ROS1a多肽的ROS1a基因。
27.选择权利要求21的水稻植物或权利要求1-9中任一项的水稻谷粒的方法，所述方法包括以下步骤
i)针对权利要求1-9中任一项的谷粒的产生或针对ROS1a基因中突变的存在或权利要求1-9中任一项的水稻谷粒的存在，筛选水稻植物或谷粒的群体，所述水稻植物或谷粒各自获得自祖先水稻细胞、谷粒或植物的诱变处理，和
ii)从步骤i)的群体选择水稻植物，其产生权利要求1-9中任一项的谷粒或其包含突变体ROS1a基因，或选择步骤i)的水稻谷粒，其是权利要求1-9中任一项的水稻谷粒，
由此选择所述水稻植物或谷粒。
28.选择权利要求21的水稻植物的方法，所述方法包括以下步骤
i)从水稻谷粒产生一或多个后代植物，所述水稻谷粒衍生自两种亲本水稻植物的杂交，
ii)针对权利要求1-9中任一项的谷粒的产生来筛选步骤i)的所述一或多个后代植物，和
iii)选择产生所述谷粒的后代植物，
由此选择所述水稻植物。
29.权利要求28的方法，其中步骤ii)包括以下的一或多种或全部：
i)针对所述遗传变异对包含来自后代植物的DNA的样品进行分析，
ii)分析获得自后代植物的谷粒的糊粉层的厚度，和
iii)分析所述谷粒或其部分的营养含量。
30.权利要求28的方法，其中步骤iii)包括以下的一或多种或全部：
i)选择对所述遗传变异是纯合的后代植物，其中与相应野生型水稻植物相比，所述遗传变异降低所述水稻植物中的DNA糖基化酶活性，
ii)选择后代植物，与相应野生型谷粒相比，所述后代植物的谷粒具有增加的糊粉层厚度，
iii)选择后代植物，与相应野生型谷粒或其部分相比，所述后代植物的谷粒或其部分具有改变的营养含量。
31.权利要求28-30中任一项的方法，其还包括
i)使两种亲本水稻植物杂交，优选其中所述亲本水稻植物中的一种产生权利要求1-9中任一项的谷粒，或
ii)使来自步骤i)的一或多个后代植物与基因型和不产生权利要求1-9中任一项的谷粒的第一亲本水稻植物相同的植物回交足够次数，以产生具有所述第一亲本水稻植物大部分基因型但产生权利要求1-9中任一项的谷粒的植物，和
iii)选择产生权利要求1-9中任一项的谷粒的后代植物。
32.使用权利要求27至31中任一项的方法产生的水稻植物。
33.权利要求12-14中任一项的外源多核苷酸或权利要求15的核酸构建体和/或载体用于产生重组细胞、转基因水稻植物或转基因谷粒的用途。
34.权利要求33的用途，其用于产生权利要求1-9中任一项的水稻谷粒。
35.鉴别产生权利要求1-9中任一项的谷粒的水稻植物的方法，所述方法包括以下步骤
i)从水稻植物获得核酸样品，和
ii)针对存在或不存在遗传变异对所述样品进行筛选，与相应野生型水稻植物相比，所述遗传变异降低所述植物中ROS1a基因的活性。
36.权利要求35的方法，其中所述遗传变异是以下之一或两者
a)表达多核苷酸的核酸构建体，或由其编码的多核苷酸，其当存在于水稻植物中时降低ROS1a基因的表达，和
b)基因，或由其编码的mRNA，其表达具有降低的ROS1a多肽活性的突变体ROS1a多肽。
37.权利要求35或36的方法，其中存在所述遗传变异表明所述水稻植物的谷粒与相应缺少所述遗传变异的水稻植物相比具有增厚的糊粉层。
38.鉴别产生权利要求1-9中任一项的谷粒的水稻植物的方法，所述方法包括以下步骤
i)从水稻植物获得谷粒，和
ii)针对以下一或多项筛选所述谷粒或其部分
a)增厚的糊粉层，
b)所述谷粒中ROS1a多肽的量和/或活性，和
c)所述谷粒中由ROS1a基因编码的mRNA的量。
39.权利要求35-38中任一项的方法，其鉴别权利要求21或权利要求31的水稻植物。
40.产生水稻植物部分的方法，所述方法包括，
a)生长权利要求21或32的水稻植物或在田间的至少100株这样的水稻植物，和
b)从一或多株所述水稻植物收获所述水稻植物部分。
41.产生获得自谷粒的水稻面粉、麸、粗面粉、麦芽、淀粉或油的方法，所述方法包括：
(a)获得权利要求1至9中任一项的谷粒，和
b)加工所述谷粒以产生所述面粉、麸、粗面粉、麦芽、淀粉或油。
42.从权利要求1-9中任一项的谷粒或权利要求21或32的水稻植物或从所述谷粒或水稻植物的一部分产生的产品。
43.权利要求42的产品，所述产品包含所述ROS1a基因、所述遗传变异、所述外源核酸构建体和所述增厚的糊粉层中的一或多种或全部。
44.权利要求42或43的产品，其中所述部分是麸。
45.权利要求42-44中任一项的产品，其中所述产品是食物成分、饮料成分、食物产品或饮料产品。
46.权利要求45的产品，其中
i)所述食物成分或饮料成分选自粗面粉、面粉、麸、淀粉、麦芽和油，
ii)所述食物产品选自：经发酵的或未经发酵的面包、通心粉(pasta)、面条、动物饲料、早餐谷物(breakfast cereals)、零食(snack food)、饼(cake)、糕点(pastry)和含有基于面粉的酱的食物，或
iii)所述饮料产品是包装饮料或含乙醇的饮料。
47.制备权利要求45或46的食物或饮料成分的方法，所述方法包括加工权利要求1-9中任一项的谷粒或来自所述谷粒的麸、面粉、粗面粉、麦芽、淀粉或油来产生所述食物或饮料成分。
48.制备权利要求45或46的食物或饮料产品的方法，所述方法包括将权利要求1-9中任一项的谷粒或来自所述谷粒的麸、面粉、粗面粉、麦芽、淀粉或油和其它食物或饮料成分混合。
49.权利要求1-9中任一项的谷粒或其部分、权利要求21或32的水稻植物或其部分用作动物饲料或食物的用途，或用来产生用于动物消耗的饲料或用于人消耗的食物的用途。
50.组合物，其包含权利要求10或11的多肽、权利要求12至14中任一项的多核苷酸、权利要求15的核酸构建体和/或载体，和/或权利要求16-20中任一项的细胞中的一或多种，以及一或多种可接受的载体。
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