ES2312620T3

ES2312620T3 - Secuencias especificas de la semilla de lino (linum usitatissiumum l.).

Info

Publication number: ES2312620T3
Application number: ES02765152T
Authority: ES
Inventors: Xiao Qiu; Martin Truksa; Zhiyuan Hu
Original assignee: Bioriginal Food and Science Corp
Current assignee: Bioriginal Food and Science Corp
Priority date: 2001-06-06
Filing date: 2002-06-06
Publication date: 2009-03-01
Anticipated expiration: 2022-06-06
Also published as: CA2680376C; CA2448501A1; WO2002102970A3; AU2002329522B2; US7473820B2; EP1423521A2; AU2008203820B8; WO2002102970A2; ATE404672T1; EP1423521B1; AU2008203820A1; CA2680376A1; US20030159174A1; EP2184359B1; AU2008203820B2; US8841512B2; EP2184359A1; CA2448501C; US7193134B2; US20070192902A1

Abstract

Una molécula aislada de ácido nucleico que codifica un polipéptido o un fragmento de este, que tiene la actividad de catalizar la formación de un doble enlace, en donde dicha molécula de ácido nucleico o un fragmento de este comprende: a. la secuencia de nucleótidos como se publica en la SEQ ID NO: 7 o un complemento de esta; b. una secuencia de nucleótidos que es al menos 65% idéntica a la secuencia de nucleótidos total de la SEQ ID NO: 7, o un complemento de esta; c. una secuencia de nucleótidos que comprende un fragmento de al menos 40 nucleótidos consecutivos en longitud de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7, o un complemento de esta; d. una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 50-100 o más nucleótidos en longitud e hibridiza bajo las condiciones rigurosas a un complemento de una molécula de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 7; e. una secuencia de nucleótidos que codifica un fragmento de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 8, en donde el fragmento contiene al menos 15 aminoácidos continuos de la SEQ ID NO: 8, o un complemento de esta; o f. una secuencia de nucleótidos que codifica una variante alélica que ocurre naturalmente de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 8, en donde la molécula de ácido nucleico hibridiza a una molécula de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 7, o un complemento de esta, bajo condiciones rigurosas.

Description

Secuencias específicas de la semilla de lino (Linum usitatissimum L.).

Antecedentes de la invención

Los avances recientes en biología molecular de plantas han hecho posible la ingeniería genética de la mayoría de las especies de cosecha. La tecnología ha sido aplicada para mejorar los rasgos agronómicos, que producen la proteína farmacéutica, y modificando los productos del almacenamiento final.

Las partes esenciales de las técnicas de ingeniería genética de la planta, son promotores que regulan la expresión de genes introducidos recientemente. Los promotores son fragmentos genómicos que son usualmente precedentes de las regiones codificantes de los genes y contienen elementos reguladores reconocidos por los factores de transcripción de las células de la planta. La interacción específica de los elementos reguladores en la región promotor y los factores de transcripción en las células, resulta en el inicio y apagado de la transcripción del gen.

En general, la expresión del gen se monitorea, mediante el mecanismo integral que incluye multi-niveles de los controles integradores, tales como transcripción, tratamiento de ARN, tratamiento de traducción y proteína. Sin embargo, la mayoría de los genes, especialmente genes de tejido específico, principalmente se regulan en el nivel de la transcripción. El control preciso de los genes de tejido específico en el nivel de la transcripción en tiempo y espacio es un pre-requisito de la división celular y la diferenciación celular. Por consiguiente, el aislamiento y la caracterización de la región reguladora de la secuencia arriba de un gen - el promotor son importantes no solamente en la ingeniería genética de los rasgos de la planta, sino también en la comprensión del mecanismo básico de la división y la diferenciación celular, que son la base del crecimiento y el desarrollo de la planta.

Como un cultivo importante de las semillas oleaginosas, el lino es un excelente objetivo para la futura ingeniería genética en los esfuerzos, para mejorar el desempeño agronómico, modificar la composición de los ácidos grasos del aceite de semilla o producir proteínas recombinantes. Lamentablemente, ha habido poco esfuerzo en la identificación de promotores de tejido específico en el lino. En el lino, dos promotores homólogos han sido aislados, mediante la estrategia de clonación por PCR, siendo ambas regiones en el extremo 5' de los genes de la proteína desaturasa (SAD) portadores del acil-estearoil. El patrón de expresión del promotor SAD2 en el lino se puede considerar tan constitutivo como se expresa en la mayoría de los tejidos. SAD1, por otra parte, se expresa solamente en raíces y semillas, pero en niveles significantemente inferiores.

Las porciones de una región promotor que corresponde a una proteína de almacenamiento del lino, también han sido descritas en WO01/16340, sin embargo este promotor del lino es incompleto y se extiende solamente 417 pares de base en longitud.

Resumen de la invención

La identificación de los promotores de tejido específico efectivos, es esencial para la comprensión completa del mecanismo molecular fundamental del proceso de desarrollo. La identificación de los promotores específicos de la semilla dará ocasión a que el proceso de desarrollo sea manipulado y tendrá un impacto en la industria agrícola o de la semilla de lino.

Los actuales inventores han identificado dos tipos de promotores (Conlinin y LuFad3) del lino (Linum usitatissimum) que conducen a niveles altos de la expresión exclusivamente en la etapa media del desarrollo de la semilla. Estos promotores se pueden utilizar para mejorar los rasgos de la semilla, modificar la composición de ácidos grasos del aceite de semilla y la composición del aminoácido de la proteína de almacenamiento de la semilla, y producir compuestos bioactivos en las semillas de la planta.

La invención se describe con el propósito de demostración con los métodos y las secuencias relacionadas con LuFad3.

De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se proporciona una molécula aislada de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una actividad de catalizar la formación de un doble enlace, o un fragmento de este, en donde dicha molécula de ácido nucleico o un fragmento de este comprende:

a. la secuencia de nucleótidos como se publica en la SEQ ID NO: 7 o un complemento de esta;

b. una secuencia de nucleótidos que es al menos 65% idéntica a la secuencia de nucleótidos total de la SEQ ID NO: 7, o un complemento de esta;

c. una secuencia de nucleótidos que comprende un fragmento de al menos 40 nucleótidos consecutivos en longitud de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7, o un complemento de esta;

d. una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 50-100 o más nucleótidos en longitud e hibridiza bajo condiciones rigurosas a un complemento de una molécula de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 7; o

e. una secuencia de nucleótidos que codifica un fragmento de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 8, en donde el fragmento comprende al menos 15 aminoácidos continuos de la SEQ ID NO: 8, o un complemento de esta; o

f. una secuencia de nucleótidos que codifica una variante alélica que ocurre naturalmente de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 8, en donde la molécula de ácido nucleico hibridiza a una molécula de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 7, o un complemento de esta bajo condiciones rigurosas.

La molécula aislada de ácido nucleico del primer aspecto de la invención puede codificar un polipéptido que tiene actividad de catalizar la formación de un doble enlace en la posición 15 del carboxilo terminal de una cadena grasa acil.

De acuerdo con un segundo aspecto de la presente invención, se proporciona un método para producir una célula capaz de generar el ácido \alpha-linoleico, dicho método comprende la introducción en la citada célula de la molécula de ácido nucleico definida anteriormente, en donde la molécula de ácido nucleico codifica una desaturasa que tiene una actividad de catalizar la formación de un doble enlace en la posición 15 del carboxilo terminal de una cadena grasa acil.

De acuerdo con un tercer aspecto de la presente invención, se proporciona un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico como se define anteriormente.

En una modalidad, la invención presenta una molécula aislada de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una actividad de catalizar la formación de un doble enlace. En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico presenta una secuencia de nucleótidos de LuFad3 a partir del género Linum. En otra modalidad, la invención consiste de una secuencia de nucleótidos que es al menos aproximadamente 65% idéntica a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7, o un complemento de esta. En aún otra modalidad, la invención presenta una secuencia de nucleótidos que comprende un fragmento de al menos 40 nucleótidos consecutivos en longitud de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7. No obstante en otra modalidad, la invención presenta una secuencia de nucleótidos que codifica un fragmento de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 8, en donde el fragmento comprende al menos 15 aminoácidos continuos de la SEQ ID NO: 8. En otra modalidad, la invención describe una secuencia de nucleótidos que codifica una variante alélica que ocurre naturalmente de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 8, en donde la molécula de ácido nucleico hibridiza a una molécula de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 7, o un complemento de esta, bajo condiciones rigurosas. En aún otra modalidad, la molécula aislada de ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene una actividad de catalizar la formación de un doble enlace en la posición 15 del carboxilo terminal de una cadena grasa acil.

La invención proporciona un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de una molécula aislada de ácido nucleico descrita anteriormente. La invención también proporciona una célula huésped transformada con el vector descrito anteriormente, incluyendo las que contienen un vector de expresión. En otra modalidad de la invención, se proporciona un método para producir un polipéptido, mediante el cultivo de la célula huésped que contiene dicho vector de expresión en un apropiado medio de cultivo, con el fin de producir el polipéptido. La célula de la invención puede ser, pero no se limita a, una célula de planta.

En otra modalidad de la invención, se proporciona un método para producir una célula capaz de generar el ácido \alpha-linoleico, realizando un método que consiste de la introducción en una célula de la molécula de ácido nucleico descrita anteriormente, en donde la molécula de ácido nucleico codifica una desaturasa que tiene una actividad de catalizar la formación de un doble enlace en la posición 15 del carboxilo terminal de una cadena grasa acil.

Se describe en este punto, un promotor que consiste de una secuencia de nucleótidos aislada a partir del Linum que es capaz de dirigir la expresión del gen en el desarrollo de las semillas del lino. Se describe en este punto, un promotor Conlinin 1 Linum aislado, que consiste de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5, o una porción de esta. Se describe en este punto, un promotor Conlinin 2 Linum aislado, que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 6, o una porción de esta. Se describe en este punto, un vector que comprende el promotor Conlinin Linum Conlinin 1 y/o Conlinin 2 unidos operablemente a un gen heterólogo de interés. Se describe en este punto, un promotor LuFad3 Linum aislado, que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 9 y/o la SEQ ID NO: 10, o una porción de esta. El promotor Lufad3 se puede aislar a partir de la variedad del lino cultivar CDC Normandy y/o cultivar CDC Solin. También se describe, un vector que comprende un promotorLuFad3 Linum unido operablemente a un gen heterólogo de interés.

Se describe en este punto, una secuencia del ácido nucleico aislada, capaz de dirigir la expresión específica de la semilla en una planta, que consiste de un ácido nucleico que comprende los nucleótidos de la SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6. o una secuencia del ácido nucleico que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6, o una secuencia del ácido nucleico que es al menos aproximadamente 60% homóloga a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 6.

Se describe en este punto, una secuencia del ácido nucleico aislada, capaz de dirigir la expresión específica de la semilla en una planta que consiste de un ácido nucleico que comprende los nucleótidos de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10, o una secuencia del ácido nucleico que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10, o una secuencia del ácido nucleico que es al menos aproximadamente 60% homóloga a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10. También se describe un método para la expresión de una secuencia del ácido nucleico de interés, en las semillas del lino que consiste de preparar un ácido nucleico constructor que comprende un promotor específico de la semilla, unido operablemente a un gen de interés, en donde el gen de interés es no-nativo en el promotor específico de la semilla, la introducción del constructor en una célula de la planta del lino, y el crecimiento de dicha célula en una planta madura capaz de colocar la semilla en donde el gen de interés se expresa en la semilla, bajo el control del promotor específico de la semilla.

Breve descripción de las figuras

Figura 1 describe la secuencia de nucleótidos del ADNc Conlinin 1 (SEQ ID NO: 1).

Figura 2 describe la secuencia de la proteína deducida de Conlinin 1 (SEQ ID NO: 2).

Figura 3 describe la secuencia de nucleótidos del ADNc Conlinin 2 (SEQ ID NO: 3).

Figura 4 describe la secuencia de la proteína deducida de Conlinin 2 (SEQ ID NO: 4).

Figura 5 describe una comparación de las secuencias de nucleótidos de Conlinin 1 y Conlinin 2.

Figura 6 describe una comparación de las secuencias de aminoácidos de las proteínas de Conlinin 1 y Conlinin 2.

Figura 7 describe una comparación de la proteína de Conlinin 1 con la proteína de almacenamiento de la Arabidopsis thaliana 2S (At2S2).

Figura 8 describe la secuencia del promotor de Conlinin 1 (SEQ ID NO: 5).

Figura 9 describe la secuencia del promotor de Conlinin 2 (SEQ ID NO: 6).

Figura 10 describe la expresión espacial de Conlinin. A muestra una hibridación Northern blot con la sonda Conlinin 1. B muestra un gel de bromuro de etidio indicando la carga de ARN. El ARN total se aisló de H: hipocótilos, L: hojas, S: tallos, R: raíces, F: flores, y E: embrión a los 20 días después de la floración.

Figura 11 describe la expresión temporal de Conlinin. A muestra una hibridación Northern blot con la sonda Conlinin 1. B muestra un gel de bromuro de etidio indicando la carga de ARN. El ARN total se aisló de las semillas en desarrollo en diferentes etapas (5-40 días después de la floración).

Figura 12 describe un ensayo cuantitativo de la actividad GUS de semillas en desarrollo transgénicas. La actividad GUS se midió como pmol 4-MU/min/\mug de proteína.

Figura 13 describe la distribución de la actividad GUS entre el embrión y el tegumento en tres diferentes etapas de desarrollo. El tegumento se retiró de los embriones y se analizaron por separado. La contribución relativa a la actividad GUS total se expresa como porcentaje del MU total producido en ambas reacciones.

Figura 14 describe la secuencia de nucleótidos de ADNc de LuFad3 del lino (SEQ IS NO: 7).

Figura 15 describe la secuencia de la proteína deducida de LuFad3 del lino (SEQ ID NO: 8).

Figura 16 muestra un análisis por cromatografía de gases de FAMEs (ésteres metílicos de ácidos grasos) aislados de la levadura transformada con el plásmido control y con el plásmido que contiene la longitud total LuFad y crece en la presencia de ácido linoleico exógeno (18:2-9,12).

Figura 17 describe un análisis por GC/MS de FAMEs del nuevo pico en la Figura 16. A, el producto LuFad3. B, estándar del éster metílico del ácido \alpha-linolenico (18:3-9,12,15).

Figura 18 muestra una expresión temporal de LuFad3 en semillas de lino en desarrollo. A describe una hibridación Northern blot con la sonda de ADNc de LuFad3. B describe en gel de bromuro de etidio indicando la carga de ARN. El ARN total se aisló de las semillas en desarrollo en diferentes etapas (10-25 días después de la floración).

Figura 19 describe un análisis Northern blot de LuFad3 en el lino. A muestra una hibridación Northern blot con la sonda LuFad3. B muestra un gel de bromuro de etidio indicando la carga de ARN. El ARN total se aisló de hoja, tallo, raíz y semilla en desarrollo a los 20 DAF.

Figura 20 describe un análisis Southern blot de LuFad3 en el lino. El ADN genómico se aisló de Normandy y Solin, se digirió con BamHI y EcoRI y se exploró con el promotor LuFad3 y las regiones codificantes, respectivamente.

Figura 21 describe la secuencia del promotor de LuFad3 (Normandy) (SEQ ID NO: 9).

Figura 22 describe la secuencia del promotor de LuFad3 (Solin) (SEQ ID NO: 10).

Figura 23 describe la secuencia de nucleótidos de la secuencia genómica de LuFad3 a partir de Normandy (SEQ ID NO: 11).

Figura 24 describe la actividad del promotor del lino en el lino. A muestra la especificidad del tejido y el patrón de la expresión GUS bajo el control del promotor CaMV 35S. B muestra la especificidad del tejido y el patrón de expresión GUS bajo el control del promotor Conlinin del lino. Materiales: embrión y tegumento se diseccionó de la semilla en desarrollo a los 20 días después de la floración, hoja, tallo y raíz.

Figura 25 describe la actividad del promotor del lino en Arabidopsis thaliana. A muestra una tinción GUS positiva del embrión en desarrollo a partir de una planta transgénica. B muestra los resultados negativos de la tinción GUS del embrión en desarrollo de una planta no-transformada.

Figura 26 muestra la actividad del promotor LuFad3 en el lino. A describe la expresión GUS bajo el control del promotor LuFad3 en el embrión en desarrollo. B muestra el embrión control.

Figura 27 describe la actividad del tejido específico del promotor LuFad3 en el lino (tinción GUS). A muestra un embrión a los 15 días después de la floración; B: tegumento; C: Hoja; D: tallo; E: raíz.

Figura 28 describe la actividad del promotor 35S en el lino (tinción GUS). A muestra un embrión a los 15 días después de la floración; B: tegumento; C: Hoja; D: tallo; E: raíz.

Descripción detallada de la invención

Los inventores han identificado una \omega-3 desaturasa (anteriormente \Delta15 desaturasa) LuFad3 y su correspondiente secuencia del promotor. Los promotores descritos se pueden utilizar para mejorar rasgos de la semilla, modificar la composición de ácidos grasos de aceite de semilla y la composición del aminoácido de proteína de almacenamiento de la semilla, y producir los compuestos bioactivos en semillas de la planta. Por consiguiente, la presente invención presenta métodos basándose en el uso de los genes identificados en la actualidad para transformar las plantas de tal forma que las proteínas de la invención se expresan. También se describen métodos basados en el uso de las descritas secuencias del promotor de LuFad3, Conlinin 1, y Conlinin 2 para dirigir la expresión específica de la semilla de un gen de interés.

Como se utiliza aquí, el término "proteínas de almacenamiento 2S" se refiere a las proteínas de almacenamiento de las semillas, las cuales generalmente se clasifican en la base de la solubilidad y tamaño (más específicamente la velocidad de sedimentación, por ejemplo como se define por Svedberg (en Stryer, L., Biochemestry, 2nd ed., W. H. Freeman, New York, page 599). La proteína de almacenamiento 2S de las semillas son albúminas solubles en agua y de esta manera se separan fácilmente de las otras proteínas. Su tamaño pequeño también simplifica su purificación. Varias proteínas de almacenamiento 2S han sido caracterizadas ya sea en la proteína o en los niveles de ADNc (Crouch et al., 1983; Sharief and Li, 1982; Ampe et al., 1986; Altenbach et al., 1987; Ericson et al., 1986; Scofield and Crouch, 1987; Josefsson et al., 1987; y el trabajo descrito en la presente aplicación).

Como se utiliza aquí, el término "enlaces dobles conjugados" es arte reconocido e incluye ácidos grasos conjugados (CFAs) que contienen enlaces dobles conjugados. Por ejemplo, los enlaces dobles conjugados incluyen dos enlaces dobles en las posiciones relativas indicadas por la fórmula -CH=CH-CH=CH-. Los dobles enlaces conjugados forman compuestos aditivos por la saturación de los carbonos 1 y 4, de modo que un doble enlace se produce entre los carbonos 2 y 3.

Como se utiliza aquí, el término "ácidos grasos" es arte reconocido e incluye un hidrocarburo de cadena larga basado en el ácido carboxílico. Los ácidos grasos son componentes de muchos lípidos incluyendo glicéridos. Los ácidos grasos que ocurren naturalmente más comunes, son ácidos monocarboxílicos que tienen un número par de átomos de carbono (16 o 18) y que pueden ser saturados o insaturados. Los ácidos grasos "Insaturados" contienen enlaces dobles cis entre los átomos de carbono. Los ácidos grasos "Poliinsaturados" contienen más que un doble enlace y los enlaces dobles se organizan en un sistema interrumpido de metileno (-CH=CH-CH_{2}-CH=CH-). Los ácidos grasos incluidos por la presente invención incluyen, por ejemplo, ácido linoleico, ácido linolenico, ácido oleico, ácido calendico y ácido palmitoleico.

Los ácidos grasos se describen aquí por un sistema de numeración en el cual el número antes de los dos puntos indica el número de átomos de carbono en el ácido graso, mientras que el número después de los dos puntos, es el número de enlaces dobles que están presentes. En el caso de los ácidos grasos insaturados, este es seguido por un número en paréntesis que indica la posición de los enlaces dobles. Cada número en paréntesis es el átomo de carbono inferior enumerado de los dos conectados por el doble enlace. Por ejemplo, el ácido oleico se puede describir como 18:1(9) y el ácido linoleico se puede describir como 18:2(9, 12) indicando 18 carbonos, un doble enlace en el carbono de los carbonos 9 y 18, dos enlaces dobles en los carbonos 9 y 12, respectivamente.

Como se utiliza aquí, el término "ácidos grasos conjugados" es arte reconocido e incluye ácidos grasos que contienen al menos un conjunto de enlaces dobles conjugados. El proceso para producir ácidos grasos conjugados es arte reconocido e incluye, por ejemplo, un proceso similar a la desaturación, que puede resultar en la introducción de un doble enlace adicional en el existente sustrato de ácido graso.

Como se utiliza aquí, el término "ácido linoleico" es arte reconocido e incluye una molécula de ácido graso poli-insaturado de 18 carbonos (C_{17}H_{29}COOH) que contiene 2 enlaces dobles (18:2(9,12)). El término "ácido linoleico conjugado" (CLA) es un término general para un grupo de isómeros posicionales y geométricos de ácido linoleico que posee enlaces dobles conjugados, en la configuración cis o trans.

Como se utiliza aquí, el término "desaturasa" es arte reconocido e incluye las enzimas que son responsables para la introducción de enlaces dobles conjugados en las cadenas acil. En la presente invención, por ejemplo, la \omega-3 desaturasa (anteriormente \Delta15 desaturasa) a partir del Linum usitatissimum es una desaturasa que puede introducir un doble enlace en la posición 15 del ácido linoleico.

Se describe en este punto, un vector recombinante que incluye secuencias del ácido nucleico que codifica al menos un producto del gen de la planta unido operablemente a un promotor o secuencia del promotor. Los promotores preferidos incluyen promotores de Linum. En un ejemplo, el promotor comprende un promotor Conlinin 1 (SEQ ID NO: 5), o una porción de este. En otro ejemplo, el promotor comprende un promotor Conlinin 2 (SEQ ID NO: 6), o una porción de este.

El promotor puede comprender un promotor LuFad3 (SEQ ID NOs: 9 y 10), o una porción de este.

Se describe en este punto, un vector recombinante que incluye una secuencia de terminación o secuencias de terminación (por ejemplo, la transcripción de secuencias de terminación). El término "secuencias de terminación" incluye secuencias reguladoras que sirven para terminar la transcripción de ARNm. Las secuencias de terminación (o terminadores de la transcripción tándem) además pueden servir para estabilizar el ARNm (por ejemplo, adicionando la estructura al ARNm), por ejemplo, contra las nucleasas.

Se describe en este punto, un vector recombinante que incluye secuencias de resistencia a los antibióticos. El término "secuencias de resistencia a los antibióticos" incluye las secuencias que promueven o confieren la resistencia a los antibióticos en el organismo huésped (por ejemplo, Linum). Las secuencias de resistencia a los antibióticos, se pueden seleccionar del grupo que consiste de secuencias cat (resistencia al cloramfenicol), tet (resistencia a la tetraciclina), secuencias erm (resistencia a la eritromicina), secuencias neo (resistencia a la neomicina) y secuencias spec (resistencia a la spectinomicina). Los vectores recombinantes pueden además incluir secuencias de recombinación homóloga (por ejemplo, secuencias diseñadas para permitir la recombinación del gen de interés en el cromosoma del organismo huésped). Por ejemplo, las secuencias amyE se pueden utilizar como blancos de homología para la recombinación en el cromosoma huésped.

Además será apreciado por alguien de habilidad en el oficio que el diseño de un vector se puede hacer a la medida, dependiendo de tales factores como la opción de célula que se diseñe genéticamente, el nivel de expresión del producto génico deseado, y similares.

Se describe en este punto, una región promotor, o porción de esta, a partir de Conlinin 1, Conlinin 2, y/o LuFad3 (SEQ ID NOs: 5, 6, 9, y/o 10) que se une operablemente a una secuencia no-nativa. Como se utiliza aquí, el término "no-nativa" se refiere a cualquier secuencia del ácido nucleico incluyendo cualquier secuencia de ARN o ADN, que no se asocia normalmente con el promotor específico de la semilla. Esto incluye secuencias heterólogas del ácido nucleico que se obtienen a partir de la misma especie de planta como el promotor pero no se asocian con el promotor en la planta de tipo-salvaje (no-transgénica). Los genes no-nativos incluyen cualquier gen asociado con la biosíntesis de lípidos y/o biosíntesis de ácidos grasos.

El ácido nucleico no-nativo comprende cualquier gen asociado con la biosíntesis de lípidos y/o biosíntesis de ácidos grasos. Ejemplos de los genes implicados en la biosíntesis de ácidos grasos incluyen, pero no se limitan a, conjugasas, \Delta4 desaturasa, \Delta5 desaturasa, y \Delta6 desaturasa. El gen de interés, incluyendo los ejemplos enunciados aquí, puede ser ligado operativamente a un promotor de tal forma que el gen de interés se expresa en las semillas en desarrollo. El gen de interés puede ser "derivado de la planta". El término "derivado de la planta" o "derivado de", por ejemplo una planta, incluye un producto génico que es codificado por un gen de la planta.

La secuencia no-nativa del ácido nucleico cuando se une a un promotor específico de la semilla del lino resulta en un producto de fusión o quimérico. El constructor quimérico se introduce en una célula de la planta del lino para crear una célula transgénica de la planta del lino que resulta en un fenotipo diferente en forma detectable de la célula de la planta del lino o una planta de lino que crece de esta cuando se compara con una célula no-transgénica de planta de lino o la planta de lino que crece de esta. Una secuencia contigua del ácido nucleico idéntica a la secuencia del ácido nucleico del constructor quimérico no está presente en la célula no-transformada de la planta del lino o planta de lino que crece de esta. En este respecto, las secuencias quiméricas del ácido nucleico incluyen aquellas secuencias que contienen un promotor del lino unido a una secuencia del ácido nucleico obtenida de otra especie de la planta o una secuencia del ácido nucleico del lino pero normalmente no asociado con dicho promotor. Las secuencias quiméricas del ácido nucleico como se utilizan aquí, además incluyen secuencias que comprenden un promotor del lino y una secuencia del ácido nucleico que esta normalmente unida al promotor pero adicionalmente que contiene una secuencia no-nativa del ácido nucleico. Por ejemplo, si el promotor es un promotor LuFad3 \omega-3 desaturasa específico de la semilla del lino, las secuencias "no-nativas" con el promotor LuFad3 \omega-3 desaturasa del lino también incluyen una secuencia que comprende una fusión entre el gen LuFad3 \omega-3 desaturasa del lino naturalmente asociado con el promotor \omega-3 desaturasa, y un secuencia codificante de interés que naturalmente no se asocia con el promotor. El término no-nativa también significa que incluye un gen de fusión, que adicionalmente incluye una secuencia de división que separa la secuencia del ácido nucleico que normalmente está unida a la secuencia del promotor y el gen que codifica la proteína de interés.

El término "promotor específico de la semilla", significa que un gen expresado bajo el control del promotor predominantemente, se expresa en semillas de la planta con ninguna expresión o ninguna sustancial expresión, usualmente menor del 5% del nivel total de expresión, en otros tejidos de la planta.

Se describen aquí novedosos promotores específicos de la semilla del lino útiles para la expresión de genes no-nativos en semillas del lino y las semillas de otras especies de la planta. Los promotores se pueden utilizar para modificar por ejemplo la composición de la proteína, aceite, o polisacárido de las semillas.

Las secuencias quiméricas del ácido nucleico se pueden incorporar de una manera conocida en un vector recombinante de expresión. Por consiguiente, también se describe un vector recombinante de expresión que comprende una secuencia quimérica del ácido nucleico apropiado para la expresión en una célula de la semilla.

El término "apropiado para la expresión en una célula de la semilla" significa que los vectores recombinantes de expresión contienen la secuencia de ácidos nucleicos quiméricos de la invención, una región reguladora, y una región de terminación, seleccionadas de la base de la célula de la semilla que se utiliza para la expresión, que se liga operativamente con la secuencia del ácido nucleico que codifica el polipéptido del gen de interés. "ligado de manera operativa" o "unidos operablemente" se entiende que significan que la secuencia del ácido nucleico quimérico que codifica el polipéptido está unida a una secuencia reguladora y a la región de terminación que permite la expresión en la célula de la semilla. Un constructor típico consiste, en la dirección 5' a 3' de una región reguladora completa con un promotor capaz de dirigir la expresión en una planta, un polipéptido que codifica la región, y una región de terminación de la transcripción funcional en las células de la planta. Estos constructores se pueden preparar de acuerdo con metodologías bien conocidas por aquellos de habilidad en el oficio de la biología molecular (ver por ejemplo: Sambrook et al. (1990), Molecular Cloning, 2nd ed. Cold Spring Harbor Press). La preparación de los constructores puede involucrar técnicas tales como restricción de la digestión, ligadura, electroforesis en gel, secuenciación de ADN y PCR. Una amplia variedad de vectores de clonación esta disponible para ejecutar las etapas de clonación necesarias. Especialmente apropiados para este propósito son los vectores de clonación con un sistema de replicación que es funcional en Escherichia coli tales como pBR322, la serie pUC serie M13mp, pACYCl84, pBluescript etc. Las secuencias de ácido nucleico, se pueden introducir en estos vectores y los vectores se pueden utilizar para transformar la E. coli que se puede sembrar en un medio apropiado. Los plásmidos se pueden recuperar de las células bajo el cultivo y la lisis de las células. Los constructores finales se pueden introducir en los vectores de la planta compatibles con la integración en las planta tales como los plásmidos Ti y Ri.

Los métodos para la expresión de genes no-nativos en semillas del lino se pueden practicar utilizando cualquier promotor específico de la semilla del lino y no se limitan al promotor específico de la semilla del lino específica que se describe aquí. El promotor específico de la semilla del lino confiere a la secuencia no-nativa del ácido nucleico al menos una característica fenotípica que es similar o idéntica a una característica fenotípica atribuida a la secuencia nativa del ácido nucleico por el promotor nativo. El término "característica fenotípica" o "fenotipo" como se utiliza aquí se refiere a cualquier propiedad que se puede medir o el efecto conferido por el promotor específico de la semilla del lino a la secuencia del ácido nucleico unida operablemente al promotor específico de la semilla del lino. El registro del tiempo de la expresión en el ciclo de vida de la planta, de la secuencia no-nativa del ácido nucleico es similar o idéntico al registro del tiempo de expresión de la secuencia nativa del ácido nucleico. El nivel de expresión de la secuencia heteróloga del ácido nucleico es similar o idéntico al nivel de expresión de la secuencia nativa del ácido nucleico. Otras características de expresión deseadas conferidas por un promotor específico de la semilla del lino se pueden reconocer por aquellos de habilidad en el oficio y por consiguiente, pueden seleccionar un promotor específico de la semilla del lino.

Los promotores específicos de la semilla del lino, que se pueden utilizar de acuerdo con la presente invención incluyen promotores asociados con la proteína de almacenamiento de la semilla, tales como todas las albúminas y globulinas, incluyendo las proteínas como la vicilina y la legumina, así como los promotores específicos de la semilla no asociados con la proteína de almacenamiento de la semillas, tales como oleosinas. De otro interés particular, son los promotores asociados con el metabolismo de ácidos grasos, tales como la proteína portadora de acilos (ACP), saturasas, desaturasas, y elongasas.

Los promotores de los genes Conlinin y Lufad3 del lino son capaces de controlar la expresión del gen específicamente durante el desarrollo de la semilla.

El promotor específico de la semilla puede ser la secuencia del promotor de LuFad3 (SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10), o una porción de esta.

El promotor específico de la semilla puede ser la secuencia del promotor de Conlinin 1 y/o Conlinin 2 (SEQ ID NO: 5 y/o SEQ ID NO: 6), o una porción de esta. El promotor específico de la semilla puede tener la secuencia de nucleótidos como se describe en la Figura 21 y/o la Figura 22. El promotor específico de la semilla puede tener la secuencia de nucleótidos descrita en la Figura 8 y/o la Figura 9.

Se puede utilizar, una secuencia del promotor que es al menos aproximadamente 60%, preferiblemente cerca del 70%, más preferiblemente cerca del 80%, y aún más preferiblemente cerca del 90% o más idéntica a una secuencia del promotor de los nucleótidos publicados en la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6. SEQ ID NO: 9, y/o SEQ ID NO: 10. Se puede utilizar, una secuencia del promotor, que hibridiza bajo condiciones rigurosas a cualquiera de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6. SEQ ID NO: 9, y/o SEQ ID NO: 10.

El gen de interés que se liga operativamente con el promotor, puede ser cualquier secuencia del ácido nucleico de interés incluyendo cualquier secuencia de ARN o ADN que codifica un péptido o proteína de interés, por ejemplo, una enzima, o una secuencia complementaria a una secuencia genómica, donde la secuencia genómica puede ser al menos una de un marco de lectura abierta, un intrón, una secuencia líder no-codificante, o cualquier secuencia donde la secuencia complementaria inhibirá la transcripción, tratamiento de ARN mensajero, por ejemplo corte y empalme o traducción. La secuencia del ácido nucleico del gen de interés puede ser sintética, naturalmente derivada o una combinación de estas. Además, la secuencia del ácido nucleico de interés podría ser un fragmento de la secuencia natural, por ejemplo basta con incluir el dominio catalítico o una estructura de importancia particular. El gen de interés también podría ser una proteína recombinante. Dependiendo de la naturaleza de la secuencia del ácido nucleico de interés, puede ser deseable sintetizar la secuencia con los codones preferidos de la planta. Los codones preferidos de la planta, se pueden determinar de los codones de frecuencia más alta en las proteínas expresados en mayor cantidad en la especie particular de la planta de interés, y se conocen por alguien de habilidad en el oficio.

El promotor específico de la semilla descrito se puede ligar operativamente al gen de interés, particularmente una desaturasa y/o una conjugasa, de tal forma que el gen de interés, o producto de este, se sobreexpresa y purifica y/o extrae de la semilla. Una célula que contiene el promotor específico de la semilla unido al gen de interés se puede cultivar, en la cual el gen de interés se implica en la biosíntesis de lípidos, y la sobreexpresión de este gen conduce a la producción incrementada en la biosíntesis de ácidos grasos. Por consiguiente, se describe aquí un método para producir una conjugasa o una desaturasa que incluye el cultivo de una célula (por ejemplo, una célula de Saccharomyces cerevisae) bajo condiciones, de tal manera, que se produce una conjugasa o una desaturasa. El término "célula de sobreexpresión" incluye una célula que ha sido manipulada de tal forma, que se sobreexpresa la conjugasa o desaturasa. El término "sobreexpresada" o "sobreexpresión" incluye la expresión de un producto génico a un nivel mayor que aquel expresado antes de la manipulación de la célula o en una célula comparable que no ha sido manipulada. La célula se puede manipular genéticamente (por ejemplo, diseñar genéticamente) para sobreexpresar un nivel de producto génico mayor que aquel expresado antes de la manipulación de la célula o en comparación con una célula que no ha sido manipulada. La manipulación genética puede incluir, pero no se limita a, alteración o modificación de las secuencias reguladoras o sitios asociados con la expresión de un gen particular (por ejemplo, adicionando promotores fuertes, promotores inducibles o promotores múltiples o retirando las secuencias reguladoras de tal forma que la expresión es constitutiva), modificando la ubicación cromosómica de un gen particular, alteración de las secuencias del ácido nucleico adyacente a un gen particular tal como un sitio de enlace de ribosoma, incrementando el número de copias de un gen particular, modificando las proteínas (por ejemplo, proteínas reguladoras, supresores, potenciadores, activadores transcripcionales y similares) implicadas en la transcripción de un gen particular y/o la traducción de un producto génico particular, o cualquier otro medio convencional de desregular la expresión de un gen particular rutinario en el oficio (incluyendo, pero no limitando al uso de moléculas de ácido nucleico antisentido, por ejemplo, para bloquear la expresión de las proteínas represor). La célula puede ser manipulada física o ambientalmente para sobreexpresar un nivel de producto génico mayor que aquel expresado, antes de la manipulación de la célula o en comparación con una célula que no ha sido manipulada. Por ejemplo, una célula se puede tratar con o cultivar en la presencia de un agente conocido o sospechando que incrementa la transcripción de un gen particular y/o la traducción de un producto génico particular de tal forma que la transcripción y/o traducción se mejoran o incrementan.

El término "cultivo" incluye mantenimiento y/o crecimiento de una célula viva de la presente invención (por ejemplo, mantenimiento y/o crecimiento de un cultivo o cepa) de tal forma que pueda desarrollar su función pretendida. En una modalidad, una célula de la invención se cultiva en medio líquido. En otra modalidad, una célula de la invención se cultiva en medio sólido o medio semi-sólido. En una modalidad preferida, una célula de la invención se cultiva en un medio (por ejemplo, un medio líquido, estéril) que comprende nutrientes esenciales o benéficos al mantenimiento y/o crecimiento de la célula (por ejemplo, fuentes de carbono o sustrato de carbono, por ejemplo carbohidrato, hidrocarburos, aceites, grasas, ácidos grasos, ácidos orgánicos, y alcoholes; fuentes de nitrógeno, por ejemplo, peptona, extractos de levadura, extractos de carne, extractos de malta, urea, sulfato de amonio, cloruro de amonio, nitrato de amonio y fosfato de amonio; fuentes de fósforo, por ejemplo, fosfato monopotásico o fosfato di potásico; elementos trazas (por ejemplo, sales metálicas), por ejemplo sales de magnesio (por ejemplo, sulfato de magnesio), sales de cobalto y/o sales de manganeso; así como factores de crecimiento tales como aminoácidos, vitaminas, promotores de crecimiento, y similares).

Preferiblemente, las células de la presente invención se controlan bajo pH controlado. El término "pH controlado" incluye cualquier pH que resulta en la producción del producto deseado (por ejemplo, una conjugasa). En una modalidad las células se controlan a un pH de aproximadamente 7. En otra modalidad, las células se controlan a un pH entre 6.0 y 8.5. El pH deseado se puede mantener por cualquier número de métodos conocidos por aquellos de habilidad en el oficio.

También preferiblemente, las células de la presente invención se controlan bajo aireación controlada. El término "aireación controlada" incluye suficiente aireación (por ejemplo, oxígeno) para resultar en la producción del producto deseado (por ejemplo, una conjugasa de ácido graso). En una modalidad, la aireación se controla, regulando los niveles de oxígeno en el cultivo, por ejemplo, regulando la cantidad de oxígeno disuelto en el medio de cultivo. Preferiblemente, la aireación del cultivo se controla, agitando el cultivo. La agitación se puede proporcionar por una hélice o un equipo de agitación mecánica similar, revolviendo o agitando la fermentación o por varios equipos de bombeo. La aireación se puede además controlar por el paso de aire estéril a través del medio (por ejemplo, a través de la mezcla de fermentación). También preferiblemente, las células de la presente invención se controlan sin exceso de espumación (por ejemplo, vía adición de agentes antiespumantes).

Por otra parte, las células de la presente invención se pueden cultivar bajo temperaturas controladas. El término "temperatura controlada" incluye cualquier temperatura que resulta en la producción del producto deseado. En una modalidad, las temperaturas controladas incluyen temperaturas entre 15ºC y 95ºC. En otra modalidad, las temperaturas controladas incluyen temperaturas entre 15ºC y 70ºC. Las temperaturas preferidas están entre 20ºC y 55ºC, más preferiblemente entre 30ºC y 45ºC.

Las células se pueden cultivar (por ejemplo, sostenido y/o cultivo) en medio líquido y preferiblemente se controlan, ya sea continua o intermitentemente, por métodos de cultivo convencionales tales como cultivo en reposo, cultivo de tubo de ensayo, cultivo en agitación (por ejemplo, cultivo en agitación rotatoria, cultivo en frasco de agitación, etc.), cultivo celular con agitación centrífuga y aireación, o fermentación. En una modalidad preferida, las células se controlan en frascos de agitación. En una modalidad más preferida, las células se controlan en un fermentador (por ejemplo, un proceso de fermentación). Los procesos de fermentación de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, procesos de tipo lote, lote-alimentado y continuo o métodos de fermentación. La frase "proceso tipo lote" o "fermentación tipo lote" se refiere a un sistema cerrado en el cual la composición del medio, nutrientes, aditivos suplementarios y similares, es un grupo en el inicio de la fermentación y no se somete a alteración durante la fermentación, sin embargo, se pueden hacer ensayos para controlar tales factores como pH y concentración del oxígeno para prevenir el exceso de acidificación del medio y/o la muerte celular. La frase "proceso tipo lote-alimentado" o fermentación "lote-alimentado" se refiere a una fermentación tipo lote con la excepción que uno o más sustratos o suplementos se adicionan (por ejemplo, adicionado en incrementos o continuamente) como los progresos de fermentación. La frase "proceso continuo " o "fermentación continua" se refiere a un sistema abierto en el cual un medio de fermentación definido se adiciona continuamente a un fermentador y una cantidad igual del medio utilizado o "condicionado" se retira simultáneamente, preferiblemente para recuperar el producto deseado (por ejemplo, ácido graso conjugado). Una variedad de dichos procesos ha sido desarrollada y son bien conocidos en el oficio.

La frase "cultivo bajo condiciones de tal forma que el ácido graso conjugado se produce" incluye sostenimiento y/o cultivo de células bajo condiciones apropiadas o suficientes (por ejemplo, temperatura, presión, pH, duración, etc.) para obtener la producción de un ácido graso conjugado particular o para obtener producciones deseadas del ácido graso conjugado particular que se produce. Por ejemplo, el cultivo se continúa por un tiempo suficiente para producir la cantidad deseada de ácido graso conjugado. Preferiblemente, el cultivo se continúa por un tiempo suficiente para alcanzar sustancialmente la máxima producción de ácido graso conjugado. En una modalidad, el cultivo se continúa por aproximadamente 12 a 24 horas. En otra modalidad, el cultivo se continúa por aproximadamente 24 a 36 horas, 36 a 48 horas, 48 a 72 horas, 72 a 96 horas, 96 a 120 horas, o más de 120 horas.

El gen de interés, que preferiblemente se implica en la biosíntesis de los ácidos grasos incluyendo desaturasas y conjugasas, se puede ligar de forma operativa a un promotor específico de la semilla y se sobreexpresa en una célula de tal forma que la producción de ácido graso y/o lípido se incrementa en una célula cultivada. En la producción de ácidos grasos conjugados, puede además ser deseable para el cultivo de células de la presente invención en la presencia de sustratos biosintéticos de ácidos grasos suplementarios. El término "sustrato biosintético de ácido graso suplementario" incluye un agente o compuesto que, cuando se pone en contacto con una célula o se incluye en el medio de cultivo de una célula, sirve para mejorar o incrementar la biosíntesis de ácidos grasos conjugados. Los sustratos biosintéticos de ácidos grasos suplementarios de la presente invención se pueden adicionar en la forma de una solución o suspensión concentrada (por ejemplo, en un solvente apropiado tal como agua o solución reguladora) o en la forma de un sólido (por ejemplo, en la forma de un polvo). Por otra parte, los sustratos biosintéticos de ácidos grasos suplementarios se pueden adicionar como una alícuota única, continua o intermitentemente durante un periodo de tiempo dado. El gen de interés, que preferiblemente se implica en la biosíntesis de ácidos grasos (por ejemplo, desaturasas y conjugasas), se puede ligar de forma operativa a un promotor específico de la semilla y se expresa en una planta transgénica.

La metodología de la presente invención puede además incluir una etapa de recuperación del ácido graso conjugado que se produce a través del uso de la invención descrita que comprende un promotor específico de la semilla, ligado operativamente a un gen de interés que es implicado en la biosíntesis de lípidos. El término "recuperación" del ácido graso conjugado incluye extracción, cosecha, aislamiento o purificación del ácido graso conjugado a partir del medio de cultivo. La recuperación del ácido graso conjugado se puede realizar de acuerdo con cualquier metodología convencional de aislamiento o purificación conocida en el oficio incluyendo, pero no limitando a, tratamiento con una resina convencional (por ejemplo, resina de intercambio aniónico o catiónico, resina de adsorción no-iónica, etc.), tratamiento con un adsorbente convencional (por ejemplo, carbón vegetal activado, ácido silícico, silica gel, celulosa, alumina, etc.), alteración o pH, extracción del solvente (por ejemplo, con un solvente convencional tal como alcohol y similares), diálisis, filtración, concentración, cristalización, recristalización, ajuste de pH, liofilización y similares. Por ejemplo, un ácido graso conjugado (por ejemplo, CLA) se puede recuperar a partir del medio de cultivo, primero eliminando las células del cultivo. El medio luego se pasa a través de o sobre una resina de intercambio catiónico para eliminar los cationes y luego a través de o sobre una resina de intercambio aniónico para eliminar aniones inorgánicos y ácidos orgánicos que tiene acidez más intensa que el ácido graso conjugado de interés.

Preferiblemente, un ácido graso conjugado se "extrae", "aísla" o "purifica" de tal forma que la preparación resultante es sustancialmente libre de otros componentes del medio. El lenguaje "sustancialmente libre de otros componentes del medio" incluye preparaciones del ácido graso conjugado en el cual el compuesto se separa a partir de los componentes del medio de cultivo del cual este se produce. En una modalidad, la preparación tiene más de aproximadamente 80% (en peso seco) de ácido graso conjugado (por ejemplo, menos de aproximadamente 20% de otros componentes del medio), más preferiblemente más de aproximadamente 90% de ácido graso conjugado (por ejemplo, menos de aproximadamente 10% de otros componentes del medio), aún más preferiblemente más de aproximadamente 95% de ácido graso conjugado (por ejemplo, menos de aproximadamente 5% de otros componentes del medio), y más preferiblemente más de aproximadamente 98-99% de ácido graso conjugado (por ejemplo, menos de aproximadamente 1-2% de otros componentes del medio. Cuando el ácido graso conjugado se derivatiza a una sal (por ejemplo una sal de ácido calendico), el ácido graso conjugado preferiblemente es además libre de contaminantes químicos asociados con la formación de la sal. Cuando el ácido graso conjugado se derivatiza a un alcohol, el ácido graso conjugado preferiblemente es además libre de contaminantes químicos asociados con la formación del
alcohol.

Se describen aquí las secuencias del promotor Conlinin 1, Conlinin 2, y/o LuFad3, que tienen una secuencia de nucleótidos suficientemente idéntica a la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, y SEQ ID NO: 10, respectivamente. Los polipéptidos aislados de la presente invención tienen una secuencia de aminoácido suficientemente idéntica a la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 8. Como se utiliza aquí, el término "suficientemente idéntica" se refiere a un primer aminoácido o secuencia de nucleótidos que contiene un suficiente o mínimo número de residuos de aminoácidos o nucleótidos idénticos o equivalentes (por ejemplo, un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar) a un segundo aminoácido o secuencia de nucleótidos de tal forma que el primer y segundo aminoácido o las secuencias de nucleótidos comparten dominios o fracciones estructurales comunes y/o una actividad funcional común. Por ejemplo, aminoácido o secuencias de nucleótidos que comparten dominios estructurales comunes que tienen al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más homología o identidad a través de las secuencias de aminoácidos de los dominios y contienen al menos uno y preferiblemente dos dominios o fracciones estructurales, se definen aquí como suficientemente idénticos. Adicionalmente, las secuencias de aminoácidos o de nucleótidos que comparten al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de homología o identidad y comparten una actividad funcional común se definen aquí como suficientemente idénticas.

En una modalidad preferida, el polipéptido LuFad3 tiene una secuencia de aminoácido al menos aproximadamente 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más homóloga o idéntica a la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 8. En aún otra modalidad preferida, el polipéptido LuFad3 se codifica por una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos que hibridiza bajo condiciones de hibridación rigurosas a un complemento de una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7.

Los rangos intermedios a los valores enumerados anteriormente, por ejemplo, las proteínas aisladas que comprenden una secuencia de aminoácido que es aproximadamente 20-60%, 60-70%, 70-80% o 80-90% idéntica a la secuencia de los aminoácidos publicada en la SEQ ID NO: 8 también tienen la intención de ser incluidos por la presente invención. También se describen las secuencias aisladas del promotor de nucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos que es aproximadamente 20-60%, 60-70%, 70-80% o 80-90% idéntica a la secuencia de los nucleótidos, publicada en la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, o SEQ ID NO: 10.

Los valores y rangos incluidos y/o intermedios dentro de los rangos enunciados aquí también tienen la intención de estar dentro del alcance de la presente invención. Por ejemplo, las proteínas aisladas que comprenden una secuencia de aminoácidos que es aproximadamente 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, y 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos, publicada en la SEQ ID NO: 8 tienen la intención de ser incluidos dentro del rango de aproximadamente 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos, publicada en la SEQ ID NO: 8. Adicionalmente las secuencias aisladas del promotor descritas aquí que comprende una secuencia de nucleótidos que es aproximadamente 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, y 99% idéntica a la secuencia de nucleótidos, publicada en la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, o SEQ ID NO: 10 tienen la intención de ser incluidas dentro del rango de aproximadamente 90% idéntica a la secuencia de nucleótidos, publicada en la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, o SEQ ID NO: 10.

Como se utiliza de forma intercambiable aquí, una "actividad de LuFad3," "actividad biológica de LuFad3," "actividad funcional de LuFad3," se refiere a una actividad aplicada por una proteína de LuFad3, polipéptido o molécula de ácido nucleico sobre una célula o tejido sensible a LuFad3, o sobre un sustrato de proteína de LuFad3, como se determina in vivo, o in vitro, de acuerdo con técnicas estándar. En una modalidad, una actividad de LuFad3 es una actividad directa, tal como una asociación con una molécula blanco de LuFad3. Como se utiliza aquí, una "molécula blanco" o "patrón de enlace" es una molécula con la cual una proteína de LuFad3 se une o interactúa en la naturaleza, de tal forma que la función mediada de LuFad3 se logra. En una modalidad ejemplar, una molécula blanco de Lufad3 es una cadena grasa acil. Por ejemplo, la proteína de LuFad3 de la presente invención puede actuar como una desaturasa e introduce un doble enlace en la posición 15 enumerada del carboxilo terminal de una cadena
acil.

Las secuencias de nucleótidos de las regiones aisladas de los promotores Conlinin 1 y Conlinin 2 del lino se muestran en la Figura 8 (SEQ ID NO: 5) y la figura 9 (SEQ ID NO: 6), respectivamente. La secuencia del promotor para Conlinin 1 tiene aproximadamente 1,118 nucleótidos de longitud. La secuencia del promotor para Conlinin 2 tiene aproximadamente 1,014 nucleótidos de longitud. Las secuencias de nucleótidos del promotor aislado LuFad3 del lino, a partir de los tipos Normandy y Solin se muestran en la Figura 21 (SEQ ID NO: 9) y la Figura 22 (SEQ ID NO: 10). El promotor LuFad3 de Normandy tiene aproximadamente 1,104 nucleótidos de longitud, y la secuencia del promotor LuFad3 de Solin tiene aproximadamente 1,104 nucleótidos de longitud. Los promotores Conlinin y LuFad3 son cada uno capaz de controlar la expresión del gen durante el desarrollo de la semilla en el lino.

La secuencia de nucleótidos del ADNc aislado de Conlinin 1 y/o Conlinin 2 del lino y la secuencia de aminoácido pronosticada de los polipéptidos Conlinin 1 y/o Conlinin 2 del lino se muestran en las Figuras 1-4 y en la SEQ ID NOs:1, 2, 3, 4. La secuencia de nucleótidos del ADNc aislada de LuFad3 del lino y la secuencia de aminoácido pronosticada del polipéptido de LuFad3 del lino se muestra en las Figuras 14 y 15 y en la SEQ ID NOs: 7 y 8.

La secuencia de ADNc de Conlinin 1 del lino, que tiene aproximadamente 673 nucleótidos de longitud, codifica un polipéptido que tiene aproximadamente 168 residuos de aminoácidos de longitud. La secuencia de ADNc de Conlinin 2 del lino, que tiene aproximadamente 676 nucleótidos de longitud, codifica un polipéptido que tiene aproximadamente 169 residuos de aminoácidos de longitud. La secuencia genómica de LuFad3 del lino se muestra en la Figura 23 y SEQ ID NO: 11, y tiene aproximadamente 4,575 nucleótidos. La secuencia de ADNc de LuFad3 del lino tiene aproximadamente 1,475 nucleótidos, y codifica un polipéptido que tiene aproximadamente 392 aminoácidos.

Varios aspectos de la invención se describen con más detalle en los siguientes apartados:

I. Moléculas Aisladas del Ácido Nucleico

Un aspecto de la invención pertenece a las moléculas aisladas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos de LuFad3 o porciones activas biológicamente de estos, así como los fragmentos de ácido nucleico suficientes para utilizar como sondas de hibridación para identificar las moléculas de ácido nucleico que codifican LuFad3 (por ejemplo, ARNm de LuFad3) y los fragmentos para utilizar como cebadores de PCR para la amplificación o mutación de moléculas de ácido nucleico de LuFad3. Se describen aquí los ácidos nucleicos aislados que incluyen regiones de promotores de los genes Conlinin y/o LuFad3 (por ejemplo SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, y/o SEQ ID NO: 10). También se describe un promotor Conlinin que tiene al menos 418 nucleótidos de longitud. Como se utiliza aquí, el término "molécula de ácido nucleico" se entiende que incluye moléculas de ADN (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) y moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm) y análogos del ADN o ARN generadas utilizando análogos de nucleótidos. La molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero preferiblemente es ADN bicatenario.

El término "molécula de ácido nucleico aislado" incluye las moléculas de ácido nucleico que se separan de otras moléculas de ácido nucleico que se presentan en la fuente natural del ácido nucleico. Por ejemplo, en relación con el ADN genómico, el término "aislada" incluye moléculas de ácido nucleico que se separan a partir del cromosoma con el cual el ADN genómico naturalmente se asocia. Preferiblemente, un ácido nucleico "aislado" es libre de secuencias que naturalmente flanquean el ácido nucleico (i.e., las secuencias localizadas en los terminales 5' y 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo a partir del cual el ácido nucleico se deriva. Por ejemplo, en varias modalidades, la molécula aislada de ácido nucleico Conlinin 1, Conlinin 2, y/o LuFad3 puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4kb, 3kb, 2kb, 1 kb, 0.5 kb o 0.1 kb de secuencias de nucleótidos que flanquean naturalmente la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico de la célula a partir del cual, el ácido nucleico se deriva. Por otra parte, una molécula "aislada" de ácido nucleico, tal como una molécula de ADNc, puede ser sustancialmente libre de otro material celular, o medio de cultivo cuando se produce por técnicas recombinantes, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente.

Una molécula de ácido nucleico de la presente invención, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7, o una porción de esta, se puede aislar utilizando técnicas de biología molecular estándar y la información de la secuencia proporcionada aquí. Utilizando toda o una porción de la secuencia del ácido nucleico de la SEQ ID NO: 7, como una sonda de hibridación, las moléculas de ácido nucleico LuFad3 se pueden aislar utilizando técnicas de clonación e hibridación estándar (por ejemplo, como se describe en Sambrook, J., Fritsh, E. F., and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Las regiones del promotor para Conlinin 1, Conlinin 2, y/o LuFad3, incluyendo la SEQ ID NO: 5, la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 9, y/o la SEQ ID NO: 10, o las porciones de estas, se pueden aislar utilizando técnicas de biología molecular estándar y los métodos descritos anteriormente.

Por otra parte, una molécula de ácido nucleico abarca toda o una porción de la SEQ ID NO: 7 se puede aislar, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando cebadores de oligonucleótidos sintéticos diseñados, basándose en la secuencia de la SEQ ID NO: 7. Se pueden utilizar métodos similares par aislar toda o una porción de secuencias del promotor que comprenden la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, y/o SEQ ID NO: 10.

Un ácido nucleico de la invención se puede amplificar utilizando el ADNc, el ARNm o alternativamente, el ADN genómico, como una plantilla y los cebadores de oligonucleótido apropiados de acuerdo con técnicas de amplificación de PCR estándar. El ácido nucleico así amplificado se puede clonar en un vector apropiado y caracterizado por un análisis de secuencia de ADN. Adicionalmente, los oligonucleótidos correspondientes a las secuencias de nucleótidos de LuFad3, incluyendo las correspondientes regiones de promotores, se pueden preparar por técnicas sintéticas estándar, por ejemplo, utilizando un sintetizador de ADN atomatizado.

Se describe en este punto, una molécula aislada de ácido nucleico, que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 1. La secuencia de la SEQ ID NO: 1 corresponde al ADNc de Conlinin 1 del lino. Este ADNc comprende las secuencias que codifican el polipéptido de Conlinin 1 del lino, así como las secuencias no traducidas en 5', y secuencias no traducidas en 3'. También se describe la molécula del ácido nucleico, que consiste de la secuencia de nucleótidos, publicada como la SEQ ID NO: 1.

Se describe en este punto, una molécula de ácido nucleico aislada que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 3. La secuencia de la SEQ ID NO: 3 corresponde al ADNc de Conlinin 2 del lino. Este ADNc comprende las secuencias que codifican el polipéptido de Conlinin 2 del lino, así como secuencias no traducidas en 5', y secuencias no traducidas en 3'. También se describe la molécula de ácido nucleico que consiste de la secuencia de nucleótidos, publicada como SEQ ID NO: 3.

En aún otra modalidad, una molécula aislada de ácido nucleico de la invención comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 7. La secuencia de la SEQ ID NO: 7 corresponde al ADNc de LuFad3 del lino. Este ADNc comprende las secuencias que codifican el polipéptido de LuFad3 del lino, así como las secuencias no traducidas en 5', y secuencias no traducidas en 3'. En otra modalidad, la molécula del ácido nucleico consiste de la secuencia de nucleótidos, publicada como SEQ ID NO: 7.

Se describe en este punto, una molécula aislada de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 5. La secuencia de la SEQ ID NO: 5 corresponde al promotor Conlinin 1 del lino. Este promotor comprende aproximadamente 1,11 bases de nucleótidos, e incluye una configuración simétrica de los elementos RY con una caja-G en el centro. El promotor Conlinin 1 es activo en la semilla en desarrollo, y es capaz de controlar la expresión del gen durante el desarrollo de la semilla. En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico consiste de la secuencia de nucleótidos, publicada como SEQ ID NO: 5.

Se describe en este punto, una molécula aislada de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 6. La secuencia de la SEQ ID NO: 6 corresponde al promotor Conlinin 2 del lino. Este promotor comprende aproximadamente 1,014 bases de nucleótidos, e incluye una configuración simétrica de los elementos RY con una caja-G en el centro. El promotor Conlinin 2 es capaz de controlar la expresión del gen de una manera específica de la semilla. También se describe una molécula de ácido nucleico que consiste de la secuencia de nucleótidos, publicada como SEQ ID NO: 6.

Se describe en este punto, una molécula aislada de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 9. La secuencia de la SEQ ID NO: 9 corresponde al promotor Lufad3 del lino a partir de la variedad de lino Normandy. Este promotor comprende aproximadamente 1,104 bases de nucleótido. El LuFad3 (Normandy) es capaz de expresar el gen específico de la semilla, y por consiguiente es capaz de dirigir la expresión del gen específico de la semilla. También se describe una molécula de ácido nucleico que consiste de la secuencia de nucleótidos, publicada como SEQ ID NO: 9.

Se describe en este punto, una molécula aislada de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 10. La secuencia de la SEQ ID NO: 10 corresponde al promotor Lufad3 del lino a partir de la variedad de lino Solin. Este promotor comprende aproximadamente 1,104 bases de nucleótidos. El promotor LuFad3 (Solin) también es capaz de dirigir la expresión del gen específico de la semilla. También se describe una molécula de ácido nucleico que consiste de la secuencia de nucleótidos, publicada como SEQ ID NO: 10.

No obstante en otra modalidad, una molécula aislada de ácido nucleico de la invención comprende una molécula de ácido nucleico que es un complemento de la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 7, o una porción de esta secuencia de nucleótidos. Una molécula de ácido nucleico que es complementaria a la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 7, es una que es suficientemente complementaria a la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 7, de tal forma que puede hibridizar a la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 7, por consiguiente formar un dúplex estable. Una molécula de ácido nucleico que es complementaria a la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, y/o SEQ ID NO: 10, es aquella, que es suficientemente complementaria a la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, y/o SEQ ID NO: 10, de tal forma que puede hibridizar a la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, y/o SEQ ID NO: 10, por consiguiente formar un dúplex estable.

En aún otra modalidad preferida, una molécula aislada de ácido nucleico de la presente invención comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos aproximadamente 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 7 (por ejemplo, en la longitud total de la secuencia de nucleótidos), o una porción de esta secuencia de nucleótidos. En una modalidad, una molécula de ácido nucleico de la presente invención comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos (o no más de) 50-100, 100-250, 250-500, 500-750, 750-1000, 1000-1250, 1250-1500, 1500-1750, 1750-2000, 2000-2250, 2250-2500, 2500-2750, 2750-3000, 3000-3250, 3250-3500 o más nucleótidos de longitud e hibridiza bajo condiciones de hibridación rigurosas a un complemento de una molécula de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 7.

Por otra parte, la molécula de ácido nucleico de la invención puede comprender solamente una porción de la secuencia del ácido nucleico de la SEQ ID NO: 7, por ejemplo, un fragmento que se puede utilizar como una sonda o cebador o un fragmento que codifica una porción de un polipéptido de LuFad3, por ejemplo, una porción activa biológicamente de un polipéptido de LuFad3. Se describe aquí una molécula de ácido nucleico que puede comprender solamente una porción de la secuencia del ácido nucleico de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, y/o SEQ ID NO: 10, por ejemplo, un fragmento que se puede utilizar como una sonda o cebador o un fragmento que codifica una porción de una secuencia del promotor Conlinin 1, Conlinin 2, y/o LuFad3, por ejemplo una porción de un promotor Conlinin 1, Conlinin 2, o LuFad3 que es capaz de dirigir la expresión del gen específico de la semilla. La secuencia de nucleótidos determinada a partir de la clonación del gen o la región del promotor Conlinin 1, Conlinin 2, y/o LuFad3 permite la generación de sondas y cebadores diseñados para utilizar en la identificación y/o clonación de otros miembros de la familia de Conlinin 1, Conlinin 2, y/o LuFad3, así como homólogos de otra especie de Conlinin 1, Conlinin 2, y/o LuFad3. La sonda/cebador usualmente comprende un oligonucleótido sustancialmente puro. La sonda/cebador (por ejemplo, oligonucleótido) usualmente comprende una región de secuencia de nucleótidos que hibridiza bajo condiciones rigurosas con al menos aproximadamente 12 o 15, preferiblemente cerca del 20 o 25, más preferiblemente cerca del 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 75, 80, 85, 90, 95, o 100 o más nucleótidos consecutivos de una secuencia sentido de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, o SEQ ID NO: 7 de una secuencia anti-sentido de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, o SEQ ID NO: 7, o de una variante alélica que ocurre naturalmente o mutante de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, o SEQ ID NO: 7.

Ejemplares sondas o cebadores tienen al menos 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 o más nucleótidos de longitud y/o comprenden nucleótidos consecutivos de una molécula aislada de ácido nucleico descrita aquí. Las sondas basadas en las secuencias de nucleótidos Conlinin 1, Conlinin 2, y/o LuFad3 se pueden utilizar para detectar (por ejemplo, específicamente detectar) transcripciones o secuencias genómicas que codifican los mismos polipéptidos u homólogos. La sonda además puede comprender un grupo marcador unido a esta, por ejemplo, el grupo marcador puede ser un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima, o una enzima co-factor. Se describe en este punto, un grupo de cebadores por ejemplo, cebadores apropiados para utilizar en un PCR, que se puede utilizar para amplificar una región seleccionada de una secuencia Conlinin 1, Conlinin 2, y/o LuFad3, por ejemplo, un dominio, región, sitio u otra secuencia descrita aquí. Los cebadores deberían tener al menos 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o más nucleótidos en longitud. Tales sondas se pueden utilizar como una parte de un kit de prueba de diagnóstico para identificar células o tejidos que expresan equivocadamente un polipéptido de LuFad3, como la medición del nivel de ácido nucleico que codifica a LuFad3 en una muestra de células a partir de un tipo por ejemplo, detección de los niveles de ARNm de LuFad3 o determinar si un gen de LuFad3 genómico ha sido mutado o suprimido.

Un fragmento de ácido nucleico que codifica una "porción activa biológicamente de un polipéptido de LuFad3" se puede preparar, mediante el aislamiento de una porción de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7, que codifica un polipéptido que tiene una actividad biológica de LuFad3, expresando la porción codificada del polipéptido LuFad3 (por ejemplo, por expresión recombinante in vitro) y evaluando la actividad de la porción codificada del polipéptido de LuFad3. En una modalidad ejemplar, la molécula de ácido nucleico tiene al menos 50-100, 100-250, 250-500, 500-750, 750-1000, 1000-1250, 1250-1500, 1500-1750, 1750-2000, 2000-2250, 2250-2500, 2500-2750, 2750-3000, 3000-3250, 3250-3500 o más nucleótidos de longitud y codifica un polipéptido que tiene una actividad de LuFad3 (según se describe aquí).

Se describe en este punto, un fragmento de ácido nucleico o una porción de las secuencias del promotor Conlinin 1, Conlinin 2, o LuFad3 mostrada en la SEQ ID NO: 5, la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 9, y/o la SEQ ID NO: 10. Un fragmento de un promotor es cualquier fragmento que es capaz de controlar expresión del gen que se liga operativamente en una semilla en desarrollo. La molécula de ácido nucleico puede tener al menos 50-100, 100-250, 250-500, 500-750, 750-1000, 1000-1250, 1250-1500, 1500-1750, 1750-2000, 2000-2250, 2250-2500, 2500-2750, 2750-3000, 3000-3250, 3250-3500 o más nucleótidos de longitud y codificar un promotor que tiene actividad del promotor LuFad3 (según se describe aquí). La molécula de ácido nucleico puede tener al menos 50-100, 100-250, 250-500, 500-750, 750-1000, 1000-1250, 1250-1500, 1500-1750, 1750-1850 o más nucleótidos de longitud y codificar un promotor que tiene actividad del promotor Conlinin 1 o Conlinin 2 (según se describe aquí).

La invención adicionalmente abarca las moléculas de ácido nucleico que difieren de la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 7. Tales diferencias se pueden deber a la conveniente degeneración del código genético, lo que da lugar a un ácido nucleico que codifica los mismos polipéptidos de LuFad3 como aquellos codificados por la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 7. En otra modalidad, una molécula aislada del ácido nucleico de la invención tiene una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido que difiere en al menos 1, pero no más de 5, 10, 20, 50 o 100 residuos de aminoácidos de la secuencia de aminoácido mostrada en la SEQ ID NO: 8. En aún otra modalidad, la molécula de ácido nucleico codifica la secuencia de aminoácido de LuFad3 del lino. Si una alineación se necesita para esta comparación, las secuencias deberían estar alineadas para una máxima homología.

Las variantes del ácido nucleico pueden ser de origen natural, tales como variantes alélicas (mismo locus), homólogos (diferente locus), y ortólogos (diferente organismo) o puede no ser de origen natural. Las variantes que no son de origen natural se pueden hacer por técnicas de mutagénesis, incluyendo aquellas aplicadas a los polinucleótidos, células, u organismos. Las variantes pueden contener sustituciones de nucleótidos, deleciones, inversiones e inserciones. La variación puede ocurrir en cualquiera o ambas regiones codificantes y no codificantes. Las variaciones pueden producir ambas sustituciones de aminoácidos conservadoras y no-conservadoras (en comparación con el producto codificado).

Las variantes alélicas resultan, por ejemplo, de los polimorfismos de la secuencia de ADN dentro de una población (por ejemplo, la población lino) que conduce a cambios en las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos de LuFad3. Tal polimorfismo genético en los genes LuFad3 puede existir entre individuos dentro de una población debido a la variación alélica natural. Como se utiliza aquí, los términos "gen" y "gen recombinante" se refieren a moléculas de ácido nucleico que incluyen un marco de lectura abierta que codifica un polipéptido de LuFad3, preferiblemente un polipéptido de LuFad3 de la planta, y pueden además incluir secuencias reguladoras no-codificantes, e intrones.

Por consiguiente, en una modalidad, la invención presenta moléculas aisladas de ácido nucleico que codifican una variante alélica que ocurre naturalmente de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 8, en donde la molécula de ácido nucleico hibridiza a un complemento de una molécula de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 7, por ejemplo, bajo condiciones de hibridación rigurosas.

Las variantes alélicas del LuFad3 del lino incluyen ambos polipéptidos de LuFad3 funcionales y no-funcionales. Las variantes alélicas funcionales son variantes de origen natural de secuencias de aminoácidos de polipéptido LuFad3 del lino, que tienen una actividad de LuFad3, por ejemplo, mantener la capacidad de unir un sustrato de LuFad3 y/o modular la formación de dobles enlaces. Las variantes alélicas funcionales usualmente contendrán solamente sustituciones conservadoras de uno o más aminoácidos de la SEQ ID NO: 8, o sustitución, deleción o inserción de residuos no-críticos en regiones no-críticas del polipéptido.

Las variantes alélicas funcionales son variantes de secuencias de aminoácidos de origen natural del polipéptido LuFad3 del lino que no tiene una actividad de LuFad3, por ejemplo, no tienen la habilidad de introducir un doble enlace en un ácido graso. Las variantes alélicas funcionales usualmente contendrán una sustitución no-conservadora, una deleción, o inserción o truncamiento prematuro de la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 8, o una sustitución, inserción o deleción en residuos críticos o regiones críticas.

Se describen aquí ortólogos no-lino del polipéptido de LuFad3 del lino. Los ortólogos de los polipéptidos de LuFad3 del lino son polipéptidos que se aíslan de los organismos diferentes del lino y posee la misma actividad de LuFad3, por ejemplo, capacidad para introducir enlaces dobles en un ácido graso, como el polipéptido de LuFad3 del lino. Los ortólogos del polipéptido de LuFad3 del lino se pueden identificar fácilmente como que contienen una secuencia de aminoácido que es sustancialmente idéntica a la SEQ ID NO: 8.

Por otra parte, se describen las moléculas de ácido nucleico que codifican otros miembros de la familia LuFad3 y, de esta manera, que tienen una secuencia de nucleótidos que difiere de las secuencias LuFad3 de la SEQ ID NO: 7. Por ejemplo, otro ADNc de LuFad3 se puede identificar, basándose en la secuencia de nucleótidos de LuFad3 del lino. Por otra parte, se describen las moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos de LuFad3 a partir de las diferentes especies, y que, de esta manera, tienen una secuencia de nucleótidos que difiere de la secuencia LuFad3 SEQ ID NO: 7.

Las moléculas de ácido nucleico que corresponde a las variantes alélicas y homólogos naturales de los cADNs de LuFad3 de la invención se pueden aislar basándose en su homología con los ácidos nucleicos de LuFad3 revelados aquí utilizando los cADNs revelados aquí, o una porción de estos, como una sonda de hibridación de acuerdo con técnicas de hibridación estándar bajo condiciones de hibridación rigurosas. Las moléculas de ácido nucleico que corresponden a variantes alélicas naturales y homólogas de los cADNs de LuFad3 de la invención además se pueden aislar mediante un mapa genético con el mismo cromosoma o locus como el gen LuFad3.

Los ortólogos, homólogos y variantes alélicas se pueden identificar utilizando métodos conocidos en el oficio (por ejemplo, por hibridación con una molécula aislada de ácido nucleico de la presente invención, por ejemplo, bajo condiciones de hibridación rigurosas). En una modalidad, una molécula aislada de ácido nucleico de la invención tiene al menos 15, 20, 25, 30 o más nucleótidos de longitud e hibridiza bajo condiciones rigurosas con la molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7. En otra modalidad, el ácido nucleico tiene al menos 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-350, 350-400, 400-450, 450-500, 500-550, 550-600, 600-650, 650-700, 700-750, 750-800, 800-850, 850-900, 900-950, 950-1000, 1000-1050, 1050-1100, 1100-1150, 1150-1200, 1200-1250, 1250-1300, 1300-1350, 1350-1400, 1400-1450, 1450-1500, 1500-1550, 1550-1600, 1600-1650, 1650-1700, 1700-1750, 1750-1800, 1800-1850,1850-1900, 1900-1950,1950-2000, 2000-2500, 2500-3000, 3000-3500 o más nucleótidos de longitud. En otra modalidad, el ácido nucleico tiene al menos 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-350, 350-400, 400-450, 450-500, 500-550, 550-600, 600-650, 650-700, 700-750, 750-800, 800-850, 850-900, 900-950, 950-1000, 1000-1050, 1050-1100, 1100-1150, 1150-1200, 1200-1250, 1250-1300, 1300-1350, 1350-1400, 1400-1450, 1450-1500, 1500-1550, 1550-1600, 1600-1650, 1650-1700, 1700-1750, 1750-1800, 1800-1850 o más nucleótidos de longitud.

Como se utiliza aquí, el término "hibridiza bajo condiciones rigurosas" tiene la intención de describir las condiciones para la hibridación y el lavado bajo las cuales, las secuencias de nucleótidos que son significantemente idénticas u homólogas entre sí permanecen hibridizadas entre sí. Preferiblemente, las condiciones son de tal forma que las secuencias al menos aproximadamente 70%, más preferiblemente al menos aproximadamente 80%, aún más preferiblemente al menos aproximadamente 85% o 90% idénticas entre sí permanecen hibridizadas entre sí. Tales condiciones rigurosas se conocen por aquellos de habilidad en el oficio y se pueden encontrar en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc. (1995), sections 2, 4 y 6. Las condiciones rigurosas adicionales se pueden encontrar en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), chapters 7, 9 y 11. Un ejemplo preferido, no-limitante de condiciones de hibridación rigurosas incluye la hibridación en 4X de cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC), a aproximadamente 65-70ºC (o hibridación en 4X SSC más 50% de formamida a aproximadamente 42-50ºC) seguido por uno o más lavados en 1X SSC, a aproximadamente 65-70ºC. Un ejemplo preferido, no-limitante de altas condiciones de hibridación rigurosas incluye hibridación en 1X SSC, a aproximadamente 65-70ºC (o hibridación en 1X SSC más 50% de formamida a aproximadamente 42-50ºC) seguido por uno o más lavados en 0.3X SSC, a aproximadamente 65-70ºC. Un ejemplo preferido, no-limitante de condiciones de hibridación de severidad reducida incluye la hibridación en 4X SSC, a aproximadamente 50-60ºC (o alternativamente hibridación en 6X SSC más 50% de formamida a aproximadamente 40-45ºC) seguido por uno o más lavados en 2X SSC, a aproximadamente 50-60ºC. Los rangos intermedios a los valores enumerados anteriormente, por ejemplo, a 65-70ºC o a 42-50ºC también tienen la intención de ser incluidos por la presente invención. SSPE (1xSSPE es NaCl 0.15M, NaH_{2}PO_{4} 10mM, y EDTA 1.25mM, pH 7.4) se puede sustituir por SSC (1xSSC es NaCl 0.15M y citrato de sodio 15mM) en la hibridación y soluciones reguladoras de lavado; los lavados se realizaron por 15 minutos cada uno después de que la hibridación se completa. La temperatura de hibridación para híbridos previstos para ser menores de 50 pares de base en longitud, debería ser 5-10ºC menos de la temperatura de fusión del híbrido (T_{m}), donde T_{m} se determina de acuerdo con las siguientes ecuaciones. Para híbridos menores de 18 pares de base en longitud, T_{m} (ºC) = 2 (# de A + T bases) + 4(# de G + C bases). Para híbridos entre 18 y 49 pares de base en longitud, T_{m} (ºC) = 81.5 + 16.6 (log_{10} [Na+]) + 0.41 (%G+C) - (600/N), donde N es el número de bases en el híbrido, y [Na+] es la concentración de iones de sodio en la solución reguladora de hibridación ([Na+] por 1xSSC = 0.165 M). También será reconocido por los practicantes de habilidad, que los reactivos adicionales se pueden adicionar para hibridizar y/o soluciones reguladoras de lavado para disminuir la hibridación no-específica de moléculas de ácido nucleico con las membranas, por ejemplo, membranas de nitrocelulosa o nylon, incluyendo pero no limitando a agentes de bloqueo (por ejemplo, BSA o ADN portador de esperma de arenque o de salmón), detergentes (por ejemplo, SDS), agentes quelantes (por ejemplo, EDTA), Ficoll, PVP y similares. Cuando se utilizan membranas de nylon, en particular, un ejemplo adicional preferido no-limitante de condiciones de hibridación rigurosas es la hibridación en NaH_{2}PO_{4} 0.25-0.5M, 7% de SDS a aproximadamente 65ºC, seguido por uno o más lavados a NaH_{2}PO_{4} 0.02M, 1% de SDS a 65ºC, ver por ejemplo, Church and Gilbert (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1991-1995, (o alternativamente 0.2X SSC, 1% de SDS).

Preferiblemente, una molécula aislada de ácido nucleico de la invención que hibridiza bajo condiciones rigurosas a la secuencia de la SEQ ID NO: 7 y corresponde a una molécula de ácido nucleico que ocurre naturalmente.

También se describe una molécula aislada de ácido nucleico de la invención que hibridiza bajo condiciones rigurosas a la secuencia de la SEQ ID No: 5, SEQ ID NO: 6, o SEQ ID NO: 9, o SEQ ID NO: 10, y corresponde a una molécula de ácido nucleico que ocurre naturalmente. Como se utiliza aquí, una molécula "que ocurre naturalmente" de ácido nucleico se refiere a una molécula de ARN o ADN que tiene una secuencia de nucleótidos que ocurre en la naturaleza (por ejemplo, codifica un polipéptido natural).

Además de las variantes alélicas que ocurren naturalmente de las secuencias de LuFad3 que pueden existir en la población, el artesano de habilidad apreciará adicionalmente que cambios se pueden introducir por mutación en las secuencias de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7, por consiguiente conduciendo a cambios en la secuencia de aminoácido de los polipéptidos codificados de LuFad3, sin la alteración de la capacidad funcional de los polipéptidos de LuFad3. Por ejemplo, las sustituciones de nucleótidos que conducen a sustituciones de aminoácidos en los residuos de aminoácidos "no-esenciales" se pueden hacer en la secuencia de la SEQ ID NO: 7. Un residuo de aminoácido "no-esencial" es un residuo que se puede alterar de la secuencia de tipo-salvaje de LuFad3 (por ejemplo, la secuencia de la SEQ ID NO: 8) sin alterar la actividad biológica, mientras que un residuo de aminoácido "esencial" se requiere para la actividad biológica. Adicionalmente, los residuos adicionales de aminoácidos que se conservan entre los polipéptidos de LuFad3 de la presente invención y otros miembros de la familia de LuFad3 no sean probablemente sensibles a la alteración.

Se describen aquí moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos de LuFad3 que contienen los cambios en los residuos de aminoácidos que no son esenciales para la actividad. Tales polipéptidos de LuFad3 difieren en la secuencia de aminoácido a partir de la SEQ ID NO: 8, aún retienen actividad biológica. La molécula aislada de ácido nucleico puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido, en donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácido al menos aproximadamente 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la SEQ ID NO: 8. La molécula aislada de ácido nucleico puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica una región promotor, en donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácido al menos aproximadamente 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, o SEQ ID
NO: 10.

Una molécula aislada de ácido nucleico que codifica un polipéptido de LuFad3 idéntica al polipéptido de la SEQ ID NO: 8, se puede crear por la introducción de una o más sustituciones de nucleótidos, adiciones o deleciones en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7, de tal forma que una o más sustituciones de aminoácidos, adiciones o deleciones se introducen en el polipéptido codificado. Las mutaciones se pueden introducir en la SEQ ID NO: 7 tal como mutagénesis de sitio-dirigido y mutagénesis mediadas por PCR. Preferiblemente, las sustituciones conservadoras de aminoácidos se hacen en una o más residuos de aminoácidos no-esenciales pronosticados. Una "sustitución conservadora de aminoácido" es aquella en la cual el residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares han sido definidas en el oficio. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no-cargadas (por ejemplo, glicina, aspargina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteina, triptófano), cadenas laterales no-polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). De este modo, un residuo de aminoácido no-esencial pronosticado en un polipéptido de LuFad3 preferiblemente se reemplaza con otro residuo de aminoácido a partir de la misma familia de cadena lateral. Como alternativa, en otra modalidad, las mutaciones se pueden introducir aleatoriamente a lo largo de toda o parte de una secuencia de LuFad3 codificante, tal como mediante mutagénesis por saturación, y los mutantes resultantes se pueden seleccionar para la actividad biológica de LuFad3 para identificar los mutantes que retienen la actividad. Continuando con la mutagénesis de la SEQ ID NO: 7, el polipéptido codificado se puede expresar recombinantemente y la actividad del polipéptido se puede determinar.

Además de las moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos de LuFad3 descritos anteriormente, así como las regiones de promotores de estos genes, las moléculas aisladas de ácido nucleico que son antisentido a estas se describen. (por ejemplo, es antisentido a la cadena codificante de una molécula de ácido nucleico de LuFad3). Un ácido nucleico "antisentido" comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a un ácido nucleico "sentido" que codifica un polipéptido, por ejemplo, complementaria a la cadena codificante de una molécula de ADNc bicatenaria o complementaria a una secuencia de ARNm. Por consiguiente, un ácido nucleico antisentido puede unir el hidrógeno a un ácido nucleico sentido. El ácido nucleico antisentido puede ser complementario a una cadena codificante de LuFad3 total, o a solamente una porción de esta. Una molécula de ácido nucleico antisentido puede ser antisentido a una "región codificante" de la cadena codificante de una secuencia de nucleótidos que codifica LuFad3. El término "región codificante" se refiere a la región de la secuencia de nucleótidos que comprende codones que se traducen en residuos de aminoácidos. La molécula de ácido nucleico antisentido puede ser antisentido a una "región no-codificante" de la cadena codificante de una secuencia de nucleótidos que codifica LuFad3. El término "región no-codificante" se refiere a las secuencias 5' y 3' que flanquean la región codificante que no se traducen en aminoácidos (i.e., también se refiere como las regiones no-traducidas 5' y 3').

Dadas las secuencias de la cadena codificante, que codifican LuFad3 reveladas aquí, los ácidos nucleicos antisentido se pueden diseñar de acuerdo con las reglas de apareamiento de bases de Watson y Crick. Métodos similares se pueden aplicar a los promotores descritos en la invención, por lo cual las moléculas antisentido interfieren con las regiones control específicas dentro del promotor. La molécula de ácido nucleico antisentido puede ser complementaria a la región codificante total del ARNm de LuFad3, pero más preferiblemente es un oligonucleótido que es antisentido a solamente una porción de la región codificante o no-codificante del ARNm de LuFad3. Por ejemplo, el oligonucleótido antisentido puede ser complementario a la región circundante del sitio de inicio de la traducción del ARNm de LuFad3 (por ejemplo, entre las regiones -10 y +10 del sitio de inicio de una secuencia de nucleótidos del gen). Un oligonucleótido antisentido puede tener, por ejemplo, aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 nucleótidos en longitud. Un ácido nucleico antisentido se puede construir utilizando las reacciones de síntesis química y unión enzimática utilizando procedimientos conocidos en el oficio. Por ejemplo, un ácido nucleico antisentido (por ejemplo, un oligonucleótido antisentido) se puede sintetizar químicamente utilizando nucleótidos de origen natural o nucleótidos modificados de distinto modo, diseñadas para incrementar la estabilidad biológica de las moléculas o para incrementar la estabilidad física del dúplex formado entre los ácidos nucleicos antisentido y sentido, por ejemplo, se pueden utilizar, derivados fosforotioato y nucleótidos sustituidos de acridina. Ejemplos de nucleótidos modificados que se pueden utilizar para generar el ácido nucleico antisentido incluyen 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5-clorouracil, 5-iodouracil, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroxilmetil) uracil, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracil, dihidrouracil, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracil, 5-metoxiaminometil-2-tiouracil, beta-D-mannosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracil, 5-metoxiuracil, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxi acético (v), wybutoxosina, pseudouracil, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracil, 2-tiouracil, 4-tiouracil, 5-metiluracil, ácido uracil-5-oxi acético metilester, ácido uracil-5-oxi acético (v), 5-metil-2-tiouracil, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil) uracil, (acp3)w, y 2,6-diaminopurina. Como alternativa, el ácido nucleico antisentido puede ser producido biológicamente utilizando un vector de expresión en el cual un ácido nucleico ha sido subclonado en una orientación antisentido (i.e., ARN transcrito a partir del ácido nucleico insertado será de una orientación antisentido en un ácido nucleico blanco de interés, descrito además en la siguiente subdivisión).

Las moléculas de ácido nucleico antisentido usualmente se generan in situ de tal forma que hibridizan con o se unen con el ARNm celular y/o ADN genómico, que codifican un polipéptido de LuFad3, por consiguiente para inhibir la expresión del polipéptido, por ejemplo, inhibiendo la transcripción y/o traducción. La hibridación puede ser por complementariedad del nucleótido convencional para formar un dúplex estable, o, por ejemplo, en el caso de una molécula de ácido nucleico antisentido que se une a los dúplex de ADN, a través de las interacciones específicas en el surco principal de la doble hélice. Un ejemplo de una ruta de administración de moléculas de ácido nucleico antisentido incluye inyección directa en un sitio del tejido. Como alternativa, las moléculas de ácido nucleico antisentido se pueden modificar para seleccionar células blanco. Por ejemplo, las moléculas antisentido se pueden modificar de tal forma que específicamente se unen con los receptores o antígenos expresados en una superficie celular seleccionada, por ejemplo, por enlace de las moléculas de ácido nucleico antisentido con los péptidos o anticuerpos que se unen con receptores o antígenos de superficie celular. Las moléculas de ácido nucleico antisentido también se pueden entregar a las células utilizando los vectores descritos aquí. Para lograr suficientes concentraciones intra-celulares de las moléculas antisentido, se prefieren constructores del vector en los cual la molécula de ácido nucleico antisentido se colocan bajo el control de un promotor fuerte pol II o pol III.

La molécula de ácido nucleico antisentido puede ser una molécula de ácido nucleico \alpha-anomérica. Una molécula de ácido nucleico \alpha-anomérica forma híbridos bicatenarios específicos con ARN complementario en el cual, contrario a las \beta-unidades usuales, las cadenas corren paralelas entre sí (Gaultier et al. (1987) Nucleic Acids. Res. 15:6625-6641). La molécula de ácido nucleico antisentido también puede comprender un 2'-o-metilribonucleótido (Inoue et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:6131-6148) o un análogo de ARN-ADN quimérico (Inoue et al. (1987) FEBS Lett. 215:327-330).

Un ácido nucleico antisentido puede ser una ribozima. Las ribozimas son moléculas catalíticas de ARN con la actividad de la ribonucleasa que son capaces de dividir un ácido nucleico monocatenario, tal como un ARNm, para el cual tienen una región complementaria. De este modo, las ribozimas (por ejemplo, ribozimas de cabeza de martillo (descritas en Haselhoffand Gerlach (1988) Nature 334:585-591)) se pueden utilizar para dividir catalíticamente las transcripciones de ARNm de LuFad3 para inhibir por consiguiente la traducción de ARNm de LuFad3. Una ribozima que tiene especificidad para un ácido nucleico que codifica un LuFad3 se pueden diseñar basándose en la secuencia de nucleótidos de un ADNc de LuFad3 revelado aquí (i.e., SEQ ID NO: 7). Por ejemplo, se puede construir, un derivado de un ARN IVS de Tetrahymena L-19 en el cual la secuencia de nucleótidos del sitio activo es complementaria a la secuencia de nucleótidos que será dividida en un ARNm que codifica LuFad3. Ver, por ejemplo, Cech et al. Patente U.S. No. 4,987,071; y Cech et al. Patente U.S. No. 5,116,742. Como alternativa, el ARNm de LuFad3 se puede utilizar para seleccionar un ARN catalítico que tiene una actividad específica de la ribonucleasa a partir de una mezcla de moléculas de ARN. Ver, por ejemplo, Bartel, D. and Szostak, J.W. (1993) Science 261:1411-1418.

Como alternativa, la expresión del gen LuFad3 se puede inhibir dirigiendo las secuencias de nucleótidos complementarias a la región reguladora del LuFad3 (por ejemplo, el promotor LuFad3 y/o potenciadores) para formar estructuras de triple hélice que previenen la transcripción del gen LuFad3 en las células blanco. Ver generalmente, Helene, C. (1991) Anticancer Drug Des. 6(6): 569-84; Helene, C. et al. (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:27-36; and Maher, L.J. (1992) Bioassays 14(12):807-15.

Las moléculas de ácido nucleico LuFad3 de la presente invención se pueden modificar en la fracción base, fracción de azúcar o esqueleto de fosfato para mejorar, por ejemplo, la estabilidad, hibridación, o solubilidad de la molécula. Por ejemplo, el esqueleto de fosfato deoxiribosa de las moléculas de ácido nucleico se pueden modificar para generar ácido nucleicos peptídicos (ver Hyrup B. et al. (1996) Bioorganic & Medicinal Chemistry 4 (1): 5-23). Como se utiliza aquí, los términos "ácido nucleicos peptídicos" o "PNAs" se refieren a copias del ácido nucleico, por ejemplo, copias de ADN, en las cuales el esqueleto de fosfato deoxiribosa se reemplaza por un esqueleto seudopéptido y solamente las cuatro nucleobases naturales se retienen. Ha sido demostrado que el esqueleto de PNAs neutral permite la hibridación específica con el ADN y ARN bajo condiciones de fuerza iónica baja. La síntesis de los oligómeros de PNA se puede realizar utilizando, protocolos estándar de síntesis de péptidos de fase sólida como se describe en Hyrup B. et al. (1996) supra; Perry-O'Keefe et al. Proc. Natl. Acad Sci. 93: 14670-675.

Los PNAs de las moléculas de ácido nucleico de LuFad3 se pueden utilizar en aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico. Por ejemplo, los PNAs se pueden utilizar como agentes antisentido o antigenes para la modulación secuencia-específica de la expresión del gen mediante, por ejemplo, la inducción de la detención de la transcripción o traducción o inhibiendo la replicación. Los PNAs de las moléculas de ácido nucleico de LuFad3 también se pueden utilizar en el análisis de mutaciones de pares de bases sencillos en un gen, (por ejemplo, por aseguramiento de PCR de PNA-dirigido); como "enzimas de restricción artificial" cuando se utiliza en combinación con otras enzimas, (por ejemplo, nucleasas S1 (Hyrup B. (1996) supra)); o como sondas o cebadores para la secuenciación de ADN o hibridación (Hyrup B. et al. (1996) supra; Perry-O'Keefe supra).

Los PNAs de LuFad3 se pueden modificar, (por ejemplo, para mejorar su estabilidad o absorción celular), por fijación lipofílica u otros grupos auxiliares al PNA, mediante la formación de quimeras PNA-ADN, o por el uso de liposomas u otras técnicas de entrega de medicamentos conocidos en el oficio. Por ejemplo, se pueden generar quimeras PNA-ADN de las moléculas de ácido nucleico de LuFad3, que pueden combinar las ventajosas propiedades de PNA y ADN. Tales quimeras permiten enzimas de reconocimiento de ADN, (por ejemplo, Ribonucleasa H y polimerasas de ADN), para interactuar con la porción de ADN mientras la porción de PNA proporcionaran enlaces de alta afinidad y especificidad. Las quimeras de PNA-ADN se pueden unir utilizando ligantes de longitudes apropiadas seleccionadas en términos de apilamiento de bases, número de enlaces entre las nucleobases, y orientación (Hyrup B. (1996) supra). La síntesis de quimeras PNA-DNA se puede realizar como se describe en Hyrup B. (1996) supra and Finn P.J. et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24 (17): 3357-63. Por ejemplo, una cadena de ADN se puede sintetizar sobre un soporte sólido utilizando química de acoplamiento fosforamidita estándar y análogos de nucleósidos modificados, por ejemplo, se pueden utilizar el 5'-(4-metoxitritil)amino-5'-deoxi-timidina fosforamidita como uno entre el terminal PNA y el terminal 5' de ADN (Mag, M. et al. (1989) Nucleic Acid Res. 17: 5973-88). Los monómeros de PNA luego se acoplan por medio de etapas para producir una molécula quimérica con un segmento 5' PNA y un segmento 3' ADN (Finn P.J. et al. (1996) supra). Como alternativa, las moléculas quiméricas se pueden sintetizar con un segmento 5' ADN y un segmento 3' PNA (Peterser, K.H. et al. (1975) Bioorganic Med. Chem. Lett. 5: 1119-11124).

Se describe en este punto, un oligonucleótido que incluye otros grupos anexos tales como péptidos (por ejemplo, para receptores de célula huésped blanco in vivo), o agentes que facilitan el transporte a través de la membrana celular (ver, por ejemplo, Letsinger et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6553-6556; Lemaitre et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:648-652; PCT Publication No. W088/09810) o la barrera de hematoencefálica (ver, por ejemplo, PCT Publication No. W089/10134). Además, los oligonucleótidos se pueden modificar con agentes de división que provocan la hibridación (Ver, por ejemplo, Krol et al. (1988) Bio-Techniques 6:958-976) o agentes intercalantes. (Ver, por ejemplo, Zon (1988) Pharm. Res. 5:539-549). Con este fin, el oligonucleótido puede ser conjugado a otra molécula, (por ejemplo, un péptido, agente de unión en cruz desencadenante de la hibridación, agente de transporte, o agente de división desencadenante de la hibridación).

Como alternativa, las características de expresión de un gen LuFad3 endógeno dentro de una línea celular o microorganismo se pueden modificar, insertando un elemento regulador de ADN heterólogo en el genoma de una línea celular estable o microorganismo clonado de tal forma que el elemento regulador insertado se liga operativamente con el gen LuFad3 endógeno. Por ejemplo, un gen LuFad3 endógeno que es normalmente "silencioso trascripcionalmente", i.e., un gen LuFad3 que normalmente no se expresa, o se expresa solamente a muy bajos niveles en una línea celular o microorganismo, se puede activar insertando un elemento regulador que es capaz de promover la expresión de un producto génico normalmente expresado en esa línea celular o microorganismo. Como alternativa, un gen LuFad3, silencioso trascripcionalmente, endógeno, se puede activar, mediante la inserción de un elemento regulador promiscuo que trabaja a través de tipos de células.

Un elemento regulador heterólogo, se puede insertar en una línea celular estable o microorganismo clonado, de tal forma que se liga operativamente con un gen LuFad3 endógeno, utilizando técnicas, tales como recombinación homóloga blanco, que son bien conocidos por aquellos de habilidad en el oficio, y se describen, por ejemplo, en Chappel, Patente U.S. No. 5,272,071; PCT publicación No. WO 91/06667, publicada el 16 de Mayo, 1991.

II. Polipéptidos de LuFad3 aislados

Un aspecto de la invención pertenece a los polipéptidos aislados de LuFad3 o recombinantes y polipéptidos codificados por una molécula de ácido nucleico de acuerdo con el primer aspecto de la invención, y porciones activas biológicamente de esta, así como fragmentos del polipéptido apropiados para utilizar como inmunógenos para aumentar los anticuerpos anti-LuFad3. Los polipéptidos nativos de Fad3 se pueden aislar a partir de las fuentes de células o tejidos, por un esquema de purificación apropiado utilizando técnicas estándar de purificación de proteínas. Los polipéptidos de LuFad3 se pueden producir, por técnicas de ADN recombinante. Alternativo a la expresión recombinante, un polipéptido de LuFad3 o polipéptido se puede sintetizar químicamente utilizando técnicas estándar de síntesis de péptidos.

Un polipéptido "aislado" o "purificado" o una porción activa biológicamente de este, es sustancialmente libre de material celular u otras proteínas contaminantes a partir de la fuente de células o tejidos a partir del cual el polipéptido de LuFad3 se deriva, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. El lenguaje "sustancialmente libre de material celular" incluye preparaciones de polipéptido de LuFad3 en las cuales el polipéptido se separa de los componentes celulares de las células a partir de las cuales se aísla o produce recombinantemente. El lenguaje "sustancialmente libre de material celular" incluye preparaciones de polipéptido de LuFad3 que tienen menos de aproximadamente 30% (en peso seco) de polipéptidos no-LuFad3 (también se refiere aquí como una "proteína contaminante"), más preferiblemente menos de aproximadamente 20% de polipéptido no-LuFad3, aún más preferiblemente menos de aproximadamente 10% de polipéptido no-LuFad3, y más preferiblemente menos de aproximadamente 5% polipéptido no-LuFad3. Cuando el polipéptido de LuFad3 o la porción activa biológicamente de este se produce recombinantemente, también se prefiere sustancialmente libre de medio de cultivo, i.e., el medio de cultivo representa menos de aproximadamente 20%, más preferiblemente menos de aproximadamente 10%, y más preferiblemente menos de cerca de 5% del volumen de la preparación de la proteína.

El lenguaje "sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos" incluye preparaciones de polipéptido de LuFad3 en las cuales, el polipéptido se separa de los precursores químicos u otros productos químicos que se implican en la síntesis del polipéptido. El lenguaje "sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos" incluye preparaciones de polipéptido de LuFad3, que tiene menos de aproximadamente 30% (en peso seco) de precursores químicos o productos químicos no-LuFad3, más preferiblemente menos de cerca del 20% de precursores químicos o productos químicos no-LuFad3, aún más preferible menos de aproximadamente 10% de precursores químicos o productos químicos no-LuFad3, y más preferiblemente menos de aproximadamente 5% de precursores químicos o productos químicos no-LuFad3.

Como se utiliza aquí, una "porción activa biológicamente" de un polipéptido de LuFad3 incluye un fragmento de un polipéptido de LuFad3 que participa en una interacción entre una molécula de LuFad3 y una molécula no-LuFad3. Las porciones activas biológicamente de un polipéptido de LuFad3 incluyen péptidos que comprenden secuencias de aminoácidos suficientemente idénticas a o derivadas de la secuencia de aminoácido del polipéptido de LuFad3, por ejemplo, la secuencia de aminoácido mostrada en la SEQ ID NO: 8, que incluye menos aminoácidos que la longitud completa de los polipéptidos de LuFad3, y muestran al menos una actividad de un polipéptido de LuFad3. Usualmente, las porciones activas biológicamente comprenden un dominio o fracción con al menos una actividad del polipéptido de LuFad3, por ejemplo, modular enlaces dobles en ácidos grasos. Una porción activa biológicamente de un polipéptido de LuFad3 puede ser un polipéptido que tiene, por ejemplo, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 1 00, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375 o más aminoácidos de longitud. Las porciones activas biológicamente de un polipéptido de LuFad3 se pueden utilizar como blancos para desarrollar agentes que modulan una actividad mediada de LuFad3, por ejemplo, modular enlaces dobles en ácidos grasos.

Otro aspecto de la invención presenta fragmentos del polipéptido que tienen la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 8, por ejemplo, para utilizar como inmunógenos. En una modalidad, un fragmento comprende al menos aminoácidos (por ejemplo, aminoácidos contiguos o consecutivos) de la secuencia de aminoácido de la SEQ SEQ ID NO: 8. En otra modalidad, un fragmento comprende al menos 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más aminoácidos (por ejemplo, aminoácidos contiguos o consecutivos) de la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 8.

En una modalidad preferida, un polipéptido de LuFad3 tiene una secuencia de aminoácido mostrada en la SEQ ID NO: 8. En otras modalidades, el polipéptido de LuFad3 es sustancialmente idéntico a la SEQ SEQ ID NO: 8, y retiene la actividad funcional del polipéptido de la SEQ ID NO: 8, a pesar de eso, difiere en la secuencia de aminoácido debido a la variación alélica natural o mutagénesis, como se describe con detalle en el apartado I arriba. En otra modalidad, el polipéptido de LuFad3 es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido al menos aproximadamente 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la SEQ ID NO: 8.

En otra modalidad, la invención presenta un polipéptido de LuFad3 que es codificado por una molécula de ácido nucleico que consiste de una secuencia de nucleótidos al menos aproximadamente 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7, o un complemento de esta. Esta invención además presenta un polipéptido de LuFad3 que es codificado por una molécula de ácido nucleico que consiste de una secuencia de nucleótidos, la cual hibridiza bajo condiciones de hibridación rigurosas con un complemento de una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7, o un complemento de esta.

Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o de dos secuencias del ácido nucleico, las secuencias se alinean para propósitos de comparación óptimos (por ejemplo, se pueden introducir huecos en uno o en ambos de un primer y un segundo aminoácido o en la secuencia del ácido nucleico para una alineación óptima y se pueden prescindir secuencias no-idénticas para propósitos de comparación). La longitud de una secuencia referencia alineada para propósitos de comparación puede ser al menos 30%, preferiblemente al menos 40%, más preferiblemente al menos 50%, aún más preferiblemente al menos 60%, y aún más preferiblemente al menos 70%, 80%, o 90% de la longitud de la secuencia referencia (por ejemplo, cuando se alinea una segunda secuencia a la secuencia de LuFad3 del aminoácido de la SEQ ID NO: 8 que tiene 392 residuos de aminoácidos, al menos se alinean 117, preferiblemente al menos 156, más preferiblemente al menos 196, más preferiblemente al menos 235, aún más preferiblemente al menos 274, y aún más preferiblemente al menos 313 o 352 o más residuos de aminoácidos. Los residuos de aminoácidos o nucleótidos en las posiciones del aminoácido correspondiente o las posiciones del nucleótido, luego se comparan. Cuando una posición en la primera secuencia se ocupa por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido como la posición correspondiente en la segunda secuencia, luego las moléculas son idénticas a aquella posición (como se utiliza aquí "identidad" del aminoácido o ácido nucleico es equivalente a "homología" del aminoácido o ácido nucleico). El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, tomando en cuenta el número de huecos, y la longitud de cada hueco, que se necesita para ser introducido, para una alineación óptima de las dos secuencias.

La comparación de las secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias, se puede lograr utilizando un algoritmo matemático. En una modalidad preferida, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)) que ha sido incorporado en el programa GAP en el paquete de programas GCG (disponible en http://www.gcg.com), utilizando ya sea una matriz Blosum 62 o una matriz PAM250, y un peso del hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6, o 4 y un peso de la longitud de 1, 2, 3, 4, 5, o 6. En aún otra modalidad preferida, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se determina utilizando el programa GAP en el paquete de programas GCG (disponible en http://www.gcg.com), utilizando una matriz NWSgapdna.CMP y un peso del hueco de 40, 50, 60, 70, o 80 y un peso de la longitud de 1, 2, 3, 4, 5, o 6. Un ejemplo preferido, no-limitante de los parámetros que se utilizaran en conjunción con el programa GAP, incluyen una matriz de puntuación Blosum 62 con una penalización por hueco de 12, una penalización por extensión del hueco de 4, y una penalización por hueco del cambio de marco de 5.

El porcentaje de identidad entre dos aminoácidos o secuencias de nucleótidos se determina utilizando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)) que ha sido incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0 o versión 2.0U), utilizando una tabla de residuo de peso PAM120, una penalización por longitud de hueco de 12 y una penalización por hueco de 4.

El ácido nucleico y las secuencias de polipéptido de la presente invención se pueden además utilizar como una "secuencia de rastreo" para ejecutar una búsqueda contra las bases de datos públicas para, por ejemplo, identificar otros miembros de la familia o secuencias relacionadas. Tales búsquedas se pueden realizar utilizando los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Las búsquedas de nucleótidos BLAST se pueden realizar con el programa NBLAST, puntuación = 100, largo de la palabra = 12 para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a las moléculas de ácido nucleico LuFad3 de la invención. Las búsquedas de proteínas BLAST se pueden realizar con el programa XBLAST, puntuación = 100, largo de la palabra = 3, y una matriz Blosum62 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las moléculas del polipéptido de LuFad3 de la invención. Para obtener alineaciones incompletas para propósitos de comparación, Gapped BLAST se pueden utilizar como se describe en Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, los parámetros predeterminados de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y NBLAST) se pueden utilizar. Ver http://www.ncbi.nlm.nih.gov.

Se describen aquí las proteínas de fusión o quiméricas de LuFad3. Como se utiliza aquí, una "proteína quimérica" o "proteína de fusión" de LuFad3, comprende un polipéptido de LuFad3 ligado operativamente a un polipéptido no-LuFad3. Un "polipéptido de LuFad3" se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido que corresponde a Lufad3, mientras que un "polipéptido no-LuFad3" se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido que corresponde a un polipéptido que no es sustancialmente homóloga con los polipéptidos de LuFad3, por ejemplo, un polipéptido que es diferente del polipéptido de LuFad3 y que se deriva del mismo o un diferente organismo. Dentro de una proteína de fusión de LuFad3, el polipéptido de LuFad3 puede corresponder a toda o una porción de un polipéptido de LuFad3. Una proteína de fusión LuFad3 puede comprender al menos una porción activa biológicamente de un polipéptido de LuFad3.

Una proteína de fusión de LuFad3 puede comprender al menos dos porciones activas biológicamente de un polipéptido de LuFad3. Dentro de la proteína de fusión, el término "ligado operativamente" se entiende para indicar que el polipéptido de LuFad3 y el polipéptido de no-LuFad33 se combinan en-marco entre sí. El polipéptido de no-LuFad3 se puede combinar con el N-terminal o terminal-C del polipéptido de LuFad3.

Por ejemplo, la proteína de fusión puede ser una proteína de fusión GST-LuFAd3 en la cual la secuencia de LuFad3 se combina con el terminal-C de la secuencia GST. Tales proteínas de fusión pueden facilitar la purificación de LuFad3 recombinante.

La proteína de fusión puede ser un polipéptido de LuFad3 que contiene una secuencia señal heteróloga en su N-terminal. En ciertas células huésped (por ejemplo, células huésped de mamífero), la expresión y/o secreción de LuFad3 se puede incrementar a través del uso de una secuencia señal heteróloga.

III. Plantas Transgénicas

En otra modalidad, la invención proporciona plantas transgénicas que contienen los ácidos nucleicos de la invención. En una modalidad, la planta transgénica contiene la secuencia de nucleótidos que codifica los polipéptidos Conlinin 1, Conlinin 2, y/o Lufad3 de la invención. En otra modalidad, la invención además describe las plantas transgénicas que contienen secuencias del promotor de Conlinin 1, Conlinin 2, y/o LuFad3 ligadas operativamente a un gen de interés, preferiblemente un gen implicado en la biosíntesis de los lípidos. Con el fin de introducir las secuencias del ácido nucleico en las células de la planta en general una variedad de técnicas están disponibles para el artesano de habilidad. La transformación mediada del Agrobacterium para las células de la planta del lino ha sido reportada y los transformantes del lino se pueden obtener de acuerdo con los métodos explicados por Dong and McHughen (1993) Plant Science 88: 61-77, aunque una variedad de otras técnicas también se pueden utilizar para introducir los constructores de ADN quimérico en las células del lino, si así se desea.

Las plantas de lino transformadas crecen de acuerdo con prácticas agrícolas convencionales conocidas por alguien de habilidad en el oficio se permiten, para fijar la semilla. La semilla del lino, entonces se puede obtener a partir de plantas maduras del lino y se analizaron para las propiedades alteradas del lino con respecto a la semilla de tipo salvaje.

Dos o más generaciones de plantas se pueden cultivar y ya sea cruzada o autofecundada para permitir la identificación de plantas y cepas con características fenotípicas deseadas incluyendo la producción del polipéptido recombinante. Puede ser deseable asegurar la homocigosidad en las plantas para evaluar la herencia continuada del rasgo recombinante. Los métodos para seleccionar plantas homocigotas son bien conocidos por aquellos de habilidad en el oficio del cultivo de plantas e incluyen autofecundaciones periódicas y la selección y cultivo de anteras y microesporas. Las plantas homocigotas también se pueden obtener por la transformación de células haploides o tejidos seguidos por la regeneración de plántulas haploides posteriormente convertidas a plantas diploides por cualquier número de medios conocidos (por ejemplo, el tratamiento con colchicina u otros agentes perturbadores de microtúbulos).

Adicionalmente, una variedad de técnicas están disponibles para la introducción de secuencias del ácido nucleico, en particular ADN, en las células huésped de la planta en general. Por ejemplo, los constructores de ADN quiméricos se pueden introducir en las células huésped obtenidas de las plantas dicotiledóneas, tales como tabaco, y especies oleaginosas, tales como Brassica napus utilizando vectores estándar de Agrobacterium, mediante un protocolo de transformación tal como se describe por Moloney et al. (1989), Plant Cell Rep. 8: 238-242 o Hinchee et al. (1988) Bio/Technol. 6: 915-922; u otras técnicas conocidas por aquellos de habilidad en el oficio. Por ejemplo, el uso de T-ADN para la transformación de células de la planta ha recibido estudio extenso y se describe suficientemente en EP 0 120 516, Hoekema et al., (1985), Chapter V In: The Binary Plant Vector System Offset-drukkerij Kanters BV, Alblasserdam); Knauf et al. (1983), Genetic Analysis de Host Expression by Agrobacterium, p. 245, In: Molecular Genetics de Bacteria- Plant Interaction, Puhler, A. ed. Springer-Verlag, NY); and An et al., (1985), (EMBO J., 4: 277-284). La transformación del Agrobacterium también se puede utilizar para transformar especies de plantas monocotiledóneas (Patente U.S. 5,591,616).

Los explantes se pueden cultivar con el Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes para permitir la transferencia del constructor de transcripción en la célula huésped de la planta. Se continua la transformación utilizando el Agrobacterium, las células de la planta se dispersan en un medio apropiado para la selección, posteriormente se recuperan callos, brotes y eventualmente plantas. El huésped del Agrobacterium albergará un plásmido que comprende los genes vir necesarios para la transferencia del T-ADN a las células de la planta. Para la inyección y electroporación (ver más adelante) los Ti-plásmidos desarmados (carentes de los genes del tumor, particularmente la región T-ADN) se pueden introducir en la célula de la planta.

El uso de técnicas no-Agrobacterium permite el uso de constructores descritos aquí para obtener la transformación y la expresión en una amplia variedad de especies de plantas monocotiledóneas y dicotiledóneos. Estas técnicas son especialmente útiles para la transformación de las especies de plantas que son intratables en un sistema de transformación de Agrobacterium. Otras técnicas para transferencia génica incluyen bombardeo de partículas. (Sanford, (1988), Trends in Biotechn. 6: 299-302), electroporation (Fromm et al., (1985), PNAS USA, 82: 5824-5828; Riggs and Bates, (1986), PNAS USA 83: 5602-5606), PEG mediated DNA uptake (Potrykus et al., (1985), Mol. Gen. Genetics., 199: 169-177), microinjection (Reich et al., Bio/Techn. (1986) 4:1001-1004) and silicone carbide whiskers (Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Rep. 9: 415-418).

En otras aplicaciones específicas tales como para B. napus, las células huésped dirigidas para recibir constructores de ADN recombinante usualmente serán derivadas a partir de pecíolos cotiledonares como se describen por Moloney et al. (1989) Plant Cell Rep. 8: 238-242. Otros ejemplos utilizando semillas de aceite comerciales incluyen transformación de cotiledones en explantes de soja (Hinchee et al., (1988) Bio/Technol. 6: 915-922) y transformación del tallo del algodón (Umbeck et al., (1987) Bio/Technol. 5: 263-266).

Después de la transformación, las células, como por ejemplo discos de hojas, se cultivan en un medio selectivo. Una vez que los brotes comienzan a surgir, se remueven por incisión y se colocan dentro de un medio de enraizamiento. Después de que suficientes raíces se han formado, las plantas se transfirieron al suelo. Las plantas putativas transformadas luego se probaron para detectar la presencia de un marcador. El Southern blotting se realiza sobre un ADN genómico utilizando una sonda apropiada, para mostrar la integración en el genoma de la célula huésped.

Los métodos proporcionados por la presente invención se pueden utilizar en conjunto con un amplio rango de especies de plantas. Las células de la planta preferidas particularmente, empleadas de acuerdo con la presente invención incluyen células a partir de las siguientes plantas: soja (Glycine max), colza (Brassica napus, Brassica campestris), girasol (Helianthus annuus), algodón (Gossypium hirsutum), maíz (Zea mays), tabaco (Nicotiana tobacum), alfalfa (Medicago sativa), trigo (Triticum sp.), cebada (Hordeum vulgare), avena (Avena sativa L.), sorgo (Sorghum bicolor), Arabidopsis thaliana, patata (Solanum sp.), lino/linaza (Linum usitatissimum), cártamo (Carthamus tinctorius), palma de aceite (Eleais guineeis), cacahuete (Arachis hypogaea), nuez de Brasil (Bertholletia excelsa) coco (Cocus nucifera), castor (Ricinus communis), cilantro (Coriandrum sativum), calabaza (Cucurbita maxima), jojoba (Simmondsia chinensis) y arroz (Orvza sativa).

Se describe una planta transgénica que contiene un transgen, que comprende un ácido nucleico que contiene un promotor específico de la semilla que se liga operativamente a un gen de interés, preferiblemente un gen implicado en la biosíntesis de lípidos. En una modalidad preferida de la invención, la planta transgénica produce ácidos grasos, que pueden luego ser aislados y/o purificados de acuerdo con los métodos descritos previamente.

Esta invención adicionalmente se ilustra por los siguientes ejemplos que no se deberían interpretar como limitantes.

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Ejemplos Metodología General Material Vegetal

Se cultivaron lino linaza (Linum usitatissimum L.) cultivar CDC Normandy y S93-708 en la cámara de crecimiento bajo condiciones estándar. Las semillas cultivadas se cosecharon en diferentes días después de la floración (DAF) y se utilizaron para la escisión del embrión, aislamiento de ARN y la construcción de la genoteca ADNc. Semilleros de quince días de la misma variedad también se utilizaron para el aislamiento de ADN genómico y la construcción de la genoteca del lino genómico.

Aislamiento de ARN

Hojas, tallos, raíces y semillas en desarrollo de varios DAF se recolectaron y congelaron en nitrógeno líquido inmediatamente y se conservaron a -80ºC. El ARN total se extrajo, utilizando el kit RNeasy plant mini (Qiagen). Los embriones liberados de las semillas en desarrollo se homogenizaron con la solución de extracción RLC en el kit. El ARN total se eluyó con Ribonucleasa-libre de agua y su concentración se determinó por espectrofotómetro.

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Preparación y selección de la genoteca de ADNc

El ARN total se extrajo del embrión del lino sin tegumentos, mediante el kit RNeasy Plant Mini (Qiagen, Hilden, Germany). El enriquecimiento del ARNm se hizo por Dynabeads Oligo dT_{(25)} (Dynal, Oslo, Norway). El ARNm obtenido, luego se utilizó para la síntesis de ADNc, mediante el kit síntesis de ADNc-ZAP y la construcción de la genoteca en el Uni-Zap XR EcoRl y el vector lambda predigerido XhoI (Stratagene, La Jolla, USA).

La genoteca de ADNc se colocó en placas, sobre placas cuadradas grandes (24 x 24 cm) y aproximadamente 6 x 10^{4} clones se seleccionaron, utilizando sondasP-marcadas preparadas a partir de cADNs bicatenarios originarios del embrión del lino en la misma etapa de desarrollo según se utiliza en la construcción de la genoteca y a partir de semilleros de 15 días. 1152 clones expresados diferencialmente, dando una fuerte señal cuando se hibridiza con la sonda del embrión y ninguna o nivel de fondo con la sonda de ADNc del semillero se aislaron y almacenaron de una manera ordenada sobre placas de microtitulación. Para la clasificación por desempeño y la agrupación de clones aislados, la amplificación PCR formato-96 de los insertos (cebadores de vector específico T3 y T7) se realizaron y los productos PCR se transfirieron sobre una membrana de nylon cargada positivamente (Boehringer Mannheim, Germany) por transferencia puntual. Las membranas de transferencia puntual resultantes (llevando cada una 192 clones) luego se hibridizaron con insertos seleccionados aleatoriamente biotin-labeled (Biotin Chem-Link, Boehringer Mannheim, Germany). Los clones lambda seleccionados, luego se convirtieron en plásmidos vía escisión in-vivo y se secuenciaron. Se realizaron análisis de afinidad por búsquedas BLAST utilizando ambos programas blastn y blastx para bases de datos de búsquedas de secuencias de nucleótidos y de proteínas, respectiva-
mente.

Para identificar los clones de ADNc desaturasa, la genoteca de ADNc del embrión se seleccionó, mediante sondas del fragmento amplificado de PCR de degenerados. Dos cebadores degenerados 5'-AT(ACGT) T(GT)(ACGT) GG(AG) AA(ACGT) A(GA)(GA) TG (AG) TG-3' (SEQ ID NO: 12) y 5'-(AG)T(AGCT) GG(AGCT) CA(TC) GA(TC) TG(TC) GG(AGCT) CA-3' (SEQ ID NO: 13) se diseñaron para dirigir dos fracciones ricas en histidina en desaturasas microsomales. Las condiciones de PCR se agruparon por 4 min a 95ºC, seguido por 30 ciclos de desnaturalización por 1 min a 94ºC. la hibridación por 1 min a 50ºC, y la extensión por 2 min a 72ºC. Los fragmentos amplificados se purificaron a partir del gel de agarosa mediante el kit de purificación (Qiagen) y se clonaron dentro de los vectores de clonación TA (Invitrogen).

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Preparación y selección de la genoteca del lino genómico

El ADN genómico de alto peso molecular se aisló a partir de semilleros de 15 días utilizando el procedimiento de CTAB modificado, combinado con procedimientos de purificación Qiagen Genomic Tip (Qiagen, Hilden, Germany). El ADN genómico parcialmente se digirió con MboI, se extrae con fenol-cloroformo y luego parcialmente se llena con dGTP y dATP. El fraccionamiento por tamaño se hizo sobre un gradiente de sacarosa. La fracción que contiene fragmentos de ADN entre 16-21 kb luego se clonaron en el vector predigerido Lambda Fix II XhoI (Stratagene, La Jolla, USA).

La genoteca se colocó en placas sobre agarosa en la parte superior a alta densidad (aproximadamente medio millón de pfu por 15-cm de placa). Aproximadamente 8x10^{5} clones se seleccionaron, mediante sondas de ADNc ^{32}P-marcadas. Los clones positivos se subclonaron y se secuenciaron.

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Análisis Northern blot

Cantidades iguales de ARNs total de diferentes muestras se aplicaron al gel de agarosa desnaturalizado (gel de Formaldehido) que contiene 1 x MOPs de solución reguladora, 3% de formaldehido. El gel se corrió en 1 x MOPs de solución reguladora a 65 V por aproximadamente 1.5 horas. Después de la electroforesis, el ARN se transfirió a una membrana Hybond NX+ con 10 x SSC utilizando el sistema de transferencia descendente por aproximadamente 3 hr. La membrana luego se sumergió en agua tratada con DEPC por 1 min y se liga en cruz por un UV Stratalinker. La membrana se prehibridizó en 10 ml de QuikHyb (Stratagene) a 68ºC por 15 min. y luego se hibridiza, mediante sondas ^{32}P-marcadas (1x10^{6} cpm/ml) a 68ºC por 2 hr. La membrana se lavó una vez a 50ºC por 30 min con una solución de lavado 2 x SSC y 0.1% de SDS, y luego se lavó una vez a 60ºC por 30 min con una solución de lavado 0.1 x SSC y 0.1% (peso/vol) de SDS. La membrana hibridizada se expuso a una película de rayos-X con una rejilla de intensidad a -80ºC durante la noche.

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Análisis Southern blot

El ADN genómico de lino purificado se restringió con BamHI o EcoRI durante la noche a 37ºC. Las muestras restringidas se aplicaron a un gel de agarosa 1% (peso/vol) y se corrieron a un voltaje constante de 65 V por aproximadamente 2 horas. Los fragmentos de ADN en el gel se transfirieron a una membrana de nylon Hybond-NX (Amersham) con una solución de NaOH 0.25 N y NaCl 1.5 M por el sistema de transferencia descendente. El ADN genómico fue ligado en cruz UV a la membrana. Los procedimientos de prehibridación e hibridación fueron iguales como en el análisis northern blot.

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Construcción del vector binario

Aproximadamente la secuencia de 1 kb localizada en el extremo 5' en la región codificante se amplificó por PCR utilizando dos cebadores con los sitios de restricción HindIII y XbaI, adicionados en sus terminales 5', respectivamente. Para reducir la probabilidad de errores de incorporación base, la polimerasa de ADN termoestable recombinante DyNAzyme EXT (Finnzymes, Espoo, Finland) se utilizó en la amplificación PCR. El producto PCR primero se clonó en pCR2.1 (sistema de clonación TA, Invitrogen, Carlsbad, USA), Luego se tomó por escisión, mediante HindIII y XbaI y se subclonó en el vector binario basado en pBIN19. La secuencia del promotor se colocó en frente del gen indicador \beta-glucuronidasa (uidA, GUS) en el vector de transformación de la planta basado en pBIN19, reemplazando el promotor original CaMV 35S.

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Transformación del Lino

Los hipocótilos como explantes del lino se inocularon con la cepa Agrobacterium tumefaciens GV3101 (pMP90) que hospeda los vectores binarios. Los transformantes se seleccionaron del medio que contiene kanamicina y los brotes escape se eliminaron por la combinación de ensayo NPTII radioactivo, PCR del gen uidA y el ensayo de regeneración en el medio que contiene 150 mg/L de kanamicina.

Las plantas transgénicas se cultivaron en una cámara de crecimiento bajo una condición estándar. En la floración, las flores individuales se marcaron. Las semillas en desarrollo se cosecharon por el ensayo de actividad GUS. Siendo retiradas de la cápsula, algunas semillas se tiñeron completamente y otras se diseccionaron entre el tegumento y el embrión en desarrollo. Las hojas, tallos y raíces de las plantas transgénicas también se incluyeron en el ensayo para evaluar la especificidad del tejido del promotor. El sustrato GUS se infiltró dentro de los tejidos por vacío leve y los tejidos se incubaron a 37ºC durante la noche. Después de la incubación, las piezas de tejido se fijaron, blanquearon y observaron bajo estereomicroscopio.

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Transformación de Arabidopsis thaliana

El cultivo líquido saturado de la cepa Agrobacterium tumefaciens GV3101 que hospeda el vector binario y plásmido pMP90 auxiliar, se utilizó para infiltrar plantas de A. thaliana ecotipo Columbia. Varios cientos de semillas T1 desarrolladas se tiñeron para la actividad GUS y se observaron bajo estereomicroscopio para evaluar la especificidad del tejido del promotor del lino.

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Tinción histoquímica GUS y Ensayo fluorométrico GUS

Las plantas transgénicas se cultivaron en una cámara de crecimiento bajo una condición estándar. En la floración, las flores individuales se marcaron. Las semillas en desarrollo se cosecharon para la tinción GUS. Siendo retiradas de la cápsula, algunas semillas se tiñeron completamente y otras se diseccionaron entre el tegumento y el embrión en desarrollo. Las hojas, tallos y raíces de la plantas transgénicas también se incluyeron en el ensayo para evaluar la especificidad del tejido del promotor. El sustrato GUS se infiltró en los tejidos, mediante vacío leve y los tejidos se incubaron a 37ºC durante la noche. Después de la incubación, las piezas de tejido se fijaron, blanquearon y se observaron bajo estereomicroscopio.

Para el ensayo fluorométrico GUS, veinte semillas en desarrollo a los 20 DAF de 4 plantas transgénicas seleccionadas, así como de 2 plantas control transformadas por pBI121, se mezclaron y se utilizaron para el análisis cuantitativo de la actividad GUS. Las semillas se molieron en 3 ml de solución de extracción reguladora, después de la molienda, el volumen del extracto se incrementó a 12 ml, el cual luego se centrifugó a 12000 g a 4ºC por 30 min. El sobrenadante recolectado se extrajo con 2 volúmenes de hexano para facilitar el ensayo de proteína Bradford. 2 ul de la fracción acuosa se utilizaron en el ensayo de actividad GUS.

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Expresión de LuFad3 en levadura

El marco de lectura abierta de LuFad3 se amplificó por PCR utilizando la enzima Plus de Precisión (Stratagene) y se clonaron en un vector de clonación TA (pCR® 2.1, Invitrogen). Que ha confirmado que los productos PCR fueron idénticos a los cADNs originales por secuenciación, los fragmentos luego se liberaron por una digestión doble BamHI-EcoRI y se insertaron en el vector de expresión de la levadura pYES2 (Invitrogen) bajo el control del promotor GAL1inducible.

La cepa de la levadura InvSc2 (Invitrogen) se transformó con los constructores de expresión utilizando el método de acetato de litio y los transformantes se seleccionaron de placas de medio mínimo carentes de uracilo. Los transformantes primero se cultivaron en medio mínimo carente de uracilo y que contiene glucosa a 28ºC. Después del cultivo durante la noche, las células se centrifugaron, lavaron y se resuspendieron en agua destilada. El medio mínimo que contienen 2% de galactosa, con o sin 0.3 mM de sustrato de ácidos grasos en la presencia de 0.1% de tergitol, se inoculó con la suspensión de la célula transformante de la levadura e incubó a 20ºC por tres días, y luego a 15ºC por otros tres días.

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Análisis por GC de ácido graso

El cultivo celular de la levadura se centrifugó a 1000xg y los pellets de la célula se secaron por 2 min, colocando los tubos de vidrio hacia abajo sobre las toallas de papel. 2 ml de HCl metanólico 3N se adicionaron dentro de los pellets y los tubos se sellaron con una tapa adecuadamente y se incubaron a 80ºC por 1 hr. Después de enfriar, 0.5 ml de agua estéril y 200 \mul de hexano se adicionaron en el tubo y se mezclaron bien. La capa de hexano se separó por centrifugación a 4000xg por 10min y se transfirió a un vial de GC con tapa rosca para el análisis de ácidos grasos.

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Ejemplo Referencia I

Aislamiento y análisis de promotores y genes Conlinin Identificación de genes Conlinin del lino

De acuerdo con los patrones de hibridación, los cADNs expresados preferencialmente en las semillas en desarrollo se dividieron en tres grupos. El primer grupo de clones tiene similaridad con las proteínas de almacenamiento 2S a partir de otra especie de planta, el segundo grupo con las proteínas de almacenamiento 12S, y el tercer grupo consistió de cADNs que no hibridizó con ningún grupo.

Un clon (Conlinin 1) del primer grupo se seleccionó para otros análisis. Tiene 673 bp de largo (Figura 1, SEQ ID NO: 1) que codifica por unos 168 aminoácidos (Figura 2, SEQ ID NO: 2) con un peso molecular de 19 kd y un punto isoeléctrico a 7.5. También se identificó, otro clon de ADNc del mismo grupo (Conlinin 2), codificado por otro miembro de la familia de genes. Tiene 676 bp en longitud (Figura 3, SEQ ID NO: 3) y codifica por 169 aminoácidos (Figura 4, SEQ ID NO: 4). La diferencia en las secuencias de nucleótidos entre Conlinin 1 y Conlinin 2 es relativamente pequeña, con 43 mutaciones de punto y una deleción base 3 dentro del marco de lectura abierta pronosticado de Conlinin 1, como se muestra en una comparación de las proteínas (Figura 5). Las diferencias adicionales se presentan en las regiones no-traducidas 5' y 3'. La diferencia en secuencia de la proteína es menor, con una identidad de aminoácido entre las dos secuencias del 88%. La proteína de Conlinin 1 es un residuo de aminoácido más pequeño que la proteína Conlinin 2 (168 vis. 169 AA). Las posiciones de cisteína y la mayor parte de los residuos de glutamina, típicas para las albúminas 2S, todas son conservadoras entre las dos proteínas, como se muestra en la Figura 6.

Las proteínas conlinin deducidas no poseen una homología significante a las secuencias en bases de datos cuando se analizaron por búsquedas blastx blastp. Sin embargo, los residuos de cisteína circundante de alargamiento corto, se encontraron conservados con las proteínas de almacenamiento 2S a partir de otra especie de planta, tal como Ricinus communis, Arabidopsis thaliana, Gossypium hirsutum, Helianthus anuum. También se observó homología en la región del péptido señal putativo (Figura 7).

En el lino, no hay información disponible de la secuencia molecular acerca de la proteína de almacenamiento de las semillas. Los datos publicados sobre las proteínas de almacenamiento del lino linin (12S) y conlinin (2S) se limitan al análisis bioquímico del tamaño de la proteína y a los contenidos de aminoácidos. El análisis de la proteína putativa reveló que el contenido de aminoácido y tamaño de la proteína (después de la división del péptido señal putativo) codificado por el clon Conlinin 1 es muy cercano a aquel del conlinin del lino publicado previamente, como se muestra en la Tabla 1. Considerando que el análisis bioquímico de aminoácidos refleja la mezcla de proteínas codificada por posibles diferentes miembros de la familia de genes, Conlinin 1 es un miembro de la familia de genes que codifica para una proteína de almacenamiento conlinin en el lino.

TABLA 1 Comparación del CONLININ previamente reportado y CONLININ codificado por cADNs de Conlinin

1

Identificación de los promotores Conlinin del lino

Ocho clones lambda independientes se aislaron de la genoteca del lino genómico que hibridiza con el ADNc del Conlinin 1. Dos clones se secuenciaron utilizando los cebadores internos del ADNc. En la región en el extremo 5' del codón inicial pronosticado, varios cis-elementos previamente identificados como cruciales para la expresión específica de la semilla del gen napin A se detectaron en el promotor Conlinin 1 (Figura 8, SEQ ID NO: 5). Como el promotor napin, el promotor Conlinin 1 consiste de una configuración simétrica de elementos RY con la caja-G en el centro (CATGCATTATTACACGTGATCGC CATGCA). Este acomodamiento también se ve en el gen de la proteína 2S de A. thaliana (At2S1). La posición y la secuencia de la caja-G y el elemento 3' RY del Promotor Conlinin 1 son idénticas a aquellas del promotor At2S1. En el extremo 5' de la caja-G (23 bp), sin embargo, otra copia de caja-G ligeramente modificada (CTACGTG) y elementos-RY (CATGAA) también se detectó en el Promotor Conlinin 1. Esta organización de los cis-elementos, aunque con distancias comunes más grandes, también está presente en el segundo promotor conlinin, el promotor Conlinin 2 (Figura 9, SEQ ID NO: 6).

Análisis Northern blot del ADNc de Conlinin

El análisis de expresión puntual preliminar mostró que Conlinin 1 se expresó preferencialmente en las semillas en desarrollo, y no en tejidos de semilleros. Para definir precisamente el patrón de expresión, dos análisis northern blot que contienen el ARN total aislado de los hipocótilos, hojas, raíces, tallo, brotes de flores así como el embrión en desarrollo a partir de diferentes etapas se hibridizaron con la sonda Conlinin 1. Los resultados indicaron que solamente se detectó una banda fuerte única en las semillas en desarrollo, no en ningún otro tejido se analizó aún después de una exposición prolongada (Figura 10). En las semillas en desarrollo, primero se detectó, la señal de hibridación a aproximadamente 10 DAF (días después de la floración), después la expresión se aumentó gradualmente, y alcanzó el máximo nivel a 25-30 DAF (Figura 11).

Actividad del promotor Conlinin en lino

El Agrobacterium que lleva el constructor que contiene el promotor Conlinin 1 y la fusión GUS se utilizaron en la transformación de los hipocótilos del lino (var. CDC Normandy). Más de 10 plantas transgénicas se obtuvieron. En la floración, la flor individual de las plantas transgénicas se marcó. Las semillas en desarrollo de ambas plantas transformadas con el promotor Conlinin 1 y los promotores 35S se tiñeron para la actividad GUS. Los resultados indicaron que solamente las semillas en desarrollo, no otros tejidos tales como hojas, tallos y raíces del promotor Conlinin 1 transgénico, poseen actividad GUS (Figura 24). En la semilla, el gen GUS se expresó por todo el embrión, pero también se observó, alta actividad en las capas celulares interiores del tegumento. Mientras que, el promotor CaMV 35S es activo en los cotiledones, hojas, tallo, pero no se observó actividad en la raíz y el tegumento (Figura 24).

La actividad del promotor conlinin en las capas celulares interiores de los tegumentos, se segregó junto con la actividad en el embrión. Por consiguiente, las capas celulares interiores de los tegumentos donde el promotor se activa podrían ser el residuo dejado de las células del endospermo. En el embrión, la tinción azul tuvo intensidad más alta en el eje del embrión que en los cotiledones. Esto, sin embargo, podría ser causado por un acceso más fácil del sustrato enzimático y tinción más intensa de tejidos vasculares, como se observa previamente en otras especies.

Los ensayos GUS fluorimétricos cuantitativos se realizaron en cuatro plantas transgénicas de lino. Se pre-seleccionaron basándose en los patrones de segregación y su estado de copia único, el cual se confirmó por análisis Southern. El gen GUS conducido por el promotor conlinin constantemente, mostró expresión específica en las semillas en desarrollo (Figura 12). Comparado con las plantas transgénicas 35S-GUS copia única, los transgénicos del promotor conlinin del lino posee actividad GUS considerablemente más alta en el embrión en desarrollo a 20 DAF.

Para establecer la velocidad de contribución de la actividad GUS en la capa interna del tegumento con la expresión de la semilla total, embrión aislado y tegumentos a los 15, 20 y 25 5 DAF de una línea transgénica se analizaron. Los resultados mostraron que el tegumento constituye más bien, una porción considerable de la actividad GUS de la semilla total a los 15 DAF (66.5%), pero su participación se disminuye como el embrión incrementa con la edad -34.9% a los 20 y 26.6% a los 25 DAF (Figura 13). En cuanto a la actividad del promotor dentro del embrión propiamente dicho, el análisis de las semillas en desarrollo a la edad de 20 DAF mostró que los cotiledones sin el eje posee solamente 34.2% de la actividad total en el embrión se compara con el 65.8% en el eje del embrión. Este resultado está de acuerdo con la tinción histoquímica más fuerte en el eje del embrión. También se observó un patrón de expresión similar con actividad relativamente más alta en el eje del embrión e inferior en los cotiledones para el gen At2S1 de A. thaliana.

Actividad del promotor Conlinin en Arabidopsis thaliana

Para examinar la actividad del promotor en sistemas de plantas heterólogas, la Arabidopsis thaliana se transformó con el constructor que contiene el promotor Conlinin 1 y la fusión GUS por infiltración por goteo de vacío de la florescencia, lo que resultó en cientos de semillas transgénicas putativas. Siliques de plantas infiltradas que llevan semillas T1 desarrolladas en varias etapas de desarrollo se tiñeron para la actividad GUS y varios embriones en la etapa del cogollo demorado a la etapa torpedo se detectaron positivos en la tinción azul (Figura 25). Estos fueron eventos de transformación individual, como lo fueron solamente las semillas con la tinción azul del embrión en sus siliques. Este resultado indica que el promotor Conlinin 1 del lino, se activa específicamente en las semillas en desarrollo de Arabidopsis thaliana como en sus plantas huésped. Sin embargo, se observó una ligera diferencia en el patrón de expresión. En la Arabidopsis thaliana la actividad GUS se limitó al embrión y la actividad no se detectó en el tegumento.

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Ejemplo II

Aislamiento y análisis del gen y promotor LuFad3 Identificación de ADNc de LuFad3 en el lino

Para aislar el ADNc de LuFad3 a partir del lino, dos cebadores degenerados que dirigen la primera y tercer fracción rica en histidina, se utilizaron para RT-PCR el fragmento empleando el ARN total de las semillas en desarrollo como la plantilla. El análisis de secuencias de los fragmentos amplificados reveló que un clon tiene alta similaridad de la secuencia con las \omega-3 desaturasas a partir de otra especie de la planta. Una búsqueda blastn del ARNm de Lufad3 reveló una identidad aproximada del 60% con otras \omega-3 desaturasas a lo largo de toda la secuencia. Una búsqueda blastp utilizando la secuencia de LuFad3 de la proteína reveló una identidad aproximada del 69% de aminoácido con las \omega-3 desaturasas en la base de datos. El clon de ADNc de longitud total, luego se aisló utilizando el inserto como sondas para seleccionar una genoteca de ADNc de la semilla en desarrollo. La ADNc de longitud total es 1475 bp de largo (Figura 14, SEQ ID NO: 7) y contiene un marco de lectura abierta de 1179 bp que codifica 392 aminoácido con la masa molecular de 43 kd y el punto isoeléctrico de 9.0 (Figura 15, SEQ ID NO: 8). La proteína deducida contiene casi 50% de aminoácidos hidrofóbicos, reflejando su propiedad de membrana- asociada.

Expresión Funcional del gen de ADNc en levadura

Para examinar la funcionalidad de la secuencia, el ADNc de longitud total, a continuación se colocó en un vector de expresión de levadura bajo control de un promotor de inducción de la galactosa. Las células huésped de la levadura que hospeda el constructor fueron alimentados con el sustrato de \omega-3 desaturasa (ácido linoleico). El análisis por GC reveló un nuevo ácido graso en células de levadura que contienen la \omega-3 desaturasa putativa, mientras que las células control que contienen el vector sin el inserto no produjeron este novedoso ácido graso (Figura 16).

Existen dos líneas de evidencias indicando el nuevo ácido graso producido en levadura transgénica es el ácido \alpha-linolenico. Primero, el análisis de cromatografía de gases mostró que el tiempo de retención del nuevo ácido graso fue idéntico a aquel del estándar del ácido \alpha-linolenico. Segundo, el análisis de GC/MS del éster metílico de ácido graso indicó que el espectro de ambos el estándar ácido \alpha-linolenico y el nuevo ácido graso son idénticos (Figura 17). Tomados en conjunto, el LuFAD3 aislado de las semillas de lino en desarrollo es actualmente una \omega-3 desaturasa que puede introducir un doble en la posición 15 del ácido linoleico.

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Análisis Northern blot de LuFad3

Un análisis Northern blot de las semillas en desarrollo de Normandy en diferentes días después de la floración reveló que el LuFad3 inicia su expresión a aproximadamente 10 DAF, gradualmente incrementó su expresión con el desarrollo del embrión, alcanzó una máxima expresión al rededor de 20 DAF y después de esto, su expresión se redujo drásticamente (Figura 18).

Para examinar la expresión del gen, otro northern blot que contiene el ARN total aislado de las hojas, tallos, raíces y semillas en desarrollo se preparó y se exploró con el ADNc. El resultado mostró que LuFad3 solamente se expresó en las semillas en desarrollo, no en otros tejidos examinados (Figura 19).

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Análisis Southern del gen

Para examinar el número de copias del gen en los genomas, dos análisis southern blot se prepararon de los ADNs genómicos aislada a partir del Normandy y Solin (lino) y se digirió con EcoRI y BamH. Las transferencias, entonces se exploraron con las regiones codificantes promotor y 5' de LuFad3, respectivamente. Ambos EcoRI y BamHI no tienen el sitio de corte en la región promotor, pero EcoRI tiene dos. BamHI tiene un sitio de corte localizado en el cuarto intrón, que se cubre por la sonda de la región codificante 5'.

La hibridación Southern blot restringida con BamHI dió patrones complejos - bandas principales mezcladas y rodeadas con bandas menores, que no es fácil de interpretar. Sin embargo, la hibridación southern blot restringida con EcoRI proporcionó datos interpretables. La región codificante 5' que se probó dió cuatro bandas, la región promotor que se probó dió dos bandas con el mismo tamaño en ambos genomas, indicando que ambos genomas contienen dos copias del gen LuFad3 (Figura 20). Esta conclusión es concomitante con un estudio genético previo, que sugiere que existen dos loci en el lino que controlan el rasgo linolenico bajo.

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Identificación del promotor LuFad3 en el lino

Para identificar los clones genómicos del gen, una genoteca genómica de Normandy se seleccionó mediante sondas de ADNc de LuFad3. La comparación de secuencias genómicas y de cADN reveló cinco intrones en las secuencias genómicas.

La región promotor del gen, luego se identificó a partir del extremo 5' de la secuencia de ADNc (Figura 21, SEQ ID NO: 9). El análisis de secuencias de la región promotor no reveló ninguna homología significante con otros promotores específicos de la semilla. Una búsqueda blastn utilizando la secuencia del promotor Lufad3 no reveló ninguna homología significante, < (10%). La región promotor del gen LuFad3 a partir de Solin se muestra en la Figura 22 (SEQ ID NO: 10).

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Actividad del promotor in lino

El Agrobacterium que lleva el constructor que contiene el promotor LuFad3or 35S con la fusión GUS se utilizó en la transformación de los hipocótilos del lino (var. CDC Normandy). Más de 10 plantas transgénicas se obtuvieron. Bajo la floración, las flores individuales de las plantas transgénicas se marcaron. Las semillas en desarrollo de ambas plantas transformadas con el promotor LuFad3 y los promotores 35S se tiñeron para la actividad GUS. Los resultados indican que solamente el embrión en desarrollo, posee actividad GUS, los otros tejidos tales como tegumentos, hojas, tallos y raíces a partir de los transgénicos del promotor LuFad3 no tienen (Figura 26 y Figura 27). Mientras que, el promotor CaMV 35S es activo en el embrión, hojas y tallos (Figura 28). Estos resultados son consistentes con aquellos de la hibridación northern blot, indicando que el promotor LuFad3 se expresa específicamente en el embrión desarrollado del lino.

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Referencias citadas en la descripción Esta lista de referencias citadas por el aspirante es solamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento de la patente Europea. Aún cuando se ha tenido gran cuidado en recopilar las referencias, los errores u omisiones no se pueden excluir y la EPO desconoce toda responsabilidad a este respecto. Documentos de patentes citadas en la descripción

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Claims

1. Una molécula aislada de ácido nucleico que codifica un polipéptido o un fragmento de este, que tiene la actividad de catalizar la formación de un doble enlace, en donde dicha molécula de ácido nucleico o un fragmento de este comprende:

d. una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 50-100 o más nucleótidos en longitud e hibridiza bajo las condiciones rigurosas a un complemento de una molécula de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 7;

e. una secuencia de nucleótidos que codifica un fragmento de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 8, en donde el fragmento contiene al menos 15 aminoácidos continuos de la SEQ ID NO: 8, o un complemento de esta; o

f. una secuencia de nucleótidos que codifica una variante alélica que ocurre naturalmente de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 8, en donde la molécula de ácido nucleico hibridiza a una molécula de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 7, o un complemento de esta, bajo condiciones rigurosas.

2. La molécula aislada de ácido nucleico de la reivindicación 1, en donde la molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene una actividad de catalizar la formación de un doble enlace en la posición 15 del carboxilo terminal de una cadena grasa acil.

3. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1.

4. Una célula huésped transformada con y que comprende el vector de la reivindicación 3.

5. El vector de la reivindicación 3, el cual es un vector de expresión.

6. Una célula huésped transformada con y que comprende el vector de la reivindicación 5.

7. Un método para producir un polipéptido que comprende el cultivo de la célula huésped de la reivindicación 6 en un medio apropiado de cultivo para, por consiguiente, producir el polipéptido.

8. La célula huésped de las reivindicaciones 4 o 6, en donde la célula es una célula de planta.

9. Una planta transformada con y que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1.

10. Un método para producir una célula capaz de generar el ácido \alpha-linoleico, dicho método comprende la introducción en la citada célula de la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, en donde la molécula de ácido nucleico codifica una desaturasa que tiene una actividad de catalizar la formación de un doble enlace en la posición 15 del carboxilo terminal de una cadena grasa acil.

11. Un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico, como se reivindica en la reivindicación 1 o 2.