ES2969618T3

ES2969618T3 - Procesos para producir productos industriales de lípidos vegetales

Info

Publication number: ES2969618T3
Application number: ES15175769T
Authority: ES
Inventors: Thomas Vanhercke; James Petrie; Tahchy Anna El; Surinder Singh; Kyle Reynolds; Qing Liu; Benjamin Leita
Original assignee: Nuseed Global Innovation Ltd
Current assignee: Nuseed Global Innovation Ltd
Priority date: 2014-07-07
Filing date: 2015-07-07
Publication date: 2024-05-21
Anticipated expiration: 2035-07-07
Also published as: MX2020004734A; US20220364014A1; US11814600B2; EP4303288A2; RU2017102934A3; EP2966157C0; CN106852158A; RU2021103505A; RU2017102934A; AU2015286221A1; MY178434A; PH12019502112A1; CL2019000616A1; WO2016004473A1; AU2022218528A1; US10472587B2; US20200080022A1; JP2021121200A; EP4303288A3; RU2743384C2

Abstract

La presente invención se refiere a métodos para producir productos industriales a partir de lípidos vegetales, particularmente de partes vegetativas de plantas. En particular, la presente invención proporciona productos derivados del petróleo tales como biodiesel y diesel sintético y procesos para producirlos, así como plantas que tienen un nivel aumentado de uno o más lípidos no polares tales como triacilgliceroles y un contenido total de lípidos no polares aumentado. En una realización particular, la presente invención se refiere a combinaciones de modificaciones en dos o más enzimas manipuladoras de lípidos, proteínas de cuerpos oleosos, enzimas catabólicas lipídicas disminuidas y/o factores de transcripción que regulan la biosíntesis de lípidos para aumentar el nivel de uno o más lípidos no polares. y/o el contenido total de lípidos no polares y/o el contenido de ácidos grasos monoinsaturados en plantas o cualquier parte de las mismas. En una realización, la presente invención se refiere a un proceso para extraer lípidos. En otra realización, el lípido se convierte en uno o más productos hidrocarbonados en partes vegetativas de plantas cosechadas para producir ésteres alquílicos de ácidos grasos que son adecuados para su uso como combustible biodiesel renovable. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Procesos para producir productos industriales de lípidos vegetales

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a métodos para producir productos industriales de lípidos vegetales, en particular de partes vegetativas de las plantas. En particular, la presente invención proporciona procesos para la producción de productos de aceite tales como biodiésel y diésel sintético, y la memoria describe plantas que tienen un nivel incrementado de uno o más lípidos no polares tales como triacilgliceroles y un contenido de lípidos no polares total incrementado. En un aspecto particular, la presente memoria describe combinaciones de modificaciones en dos o más de enzimas de manejo de lípidos, proteínas de cuerpo lipídico, enzimas con catabolismo disminuido de lípidos y/o factores de transcripción que regulan la biosíntesis de lípidos para incrementar el nivel de uno o más lípidos no polares y/o el contenido de lípidos no polares y/o contenido de ácidos grasos monoinsaturados en plantas o en cualquier parte de las mismas. En una realización, la presente invención se refiere a un proceso para extraer lípidos. En otra realización, el lípido se convierte a uno o más productos de hidrocarburo en partes vegetativas cosechadas de la planta para producir ésteres de alquilo de los ácidos grasos que son adecuados para el uso como un combustible de biodiésel renovable.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La mayor parte de la energía a nivel mundial, en particular para el transporte, se suministra por combustibles derivados de petróleo, que tienen un suministro finito. Son necesarias las fuentes alternativas que sean renovables, tal como aceites producidos biológicamente. La patente US 2013/164798 divulga un proceso para producir un producto industrial p. ej. combustible diésel sintético y biocombustible, que comprende la obtención de la parte vegetativa de la planta y convertir los lípidos en la parte vegetativa de la planta en producto industrial aplicando a los lípidos calor, y medios químicos y/o enzimáticos.

Biosíntesis de triacilglicerol

Los triacilgliceroles (TAG) constituyen la principal forma de los lípidos en las semillas y consisten de tres cadenas de acilo esterificadas a un esqueleto de glicerol. Los ácidos grasos son sintetizados en los plástido como intermediarios de la proteína transportadora de acilos (ACP) donde pueden sufrir una primera desaturación catalizada. Esta reacción es catalizada por la estearoil-ACP desaturasa y produce ácido oleico (C l8:1ñ9). Subsiguientemente, las cadenas de acilo son transportadas al citosol y al retículo endoplásmico (ER) como ésteres de acil-Co-enzima (CoA). Antes de ingresar en la vía principal de biosíntesis de TAG, también conocida como la vía de Kennedy o de glicerol-3-fosfato (G3P), las cadenas de acilo típicamente se integran en los fosfolípidos de la membrana del e R, donde pueden sufrir una desaturación adicional. Dos enzimas clave en la producción de ácidos grasos poliinsaturados son las FAD2 y FAD3 desaturasas unidas a membrana que producen ácido linoléico (C18:2ñ912) y ácido a-linolénico (C18:3ñ91215), respectivamente.

La vía de biosíntesis de TAG por la vía de Kennedy consiste en una serie de acilaciones subsiguiente, cada una usando ésteres de acil-CoA como donante de acilo. El primer paso de acilación típicamente tiene lugar en la posiciónsn1del esqueleto de G3P y es catalizado por la glicerol-3-fosfato aciltransferasa (sn1-GPAT). El producto, ácidosn1-lisofosfatídico (sn1-LPA) sirve como sustrato para el ácido lisofosfatídico aciltransferasa (LPAAT) que acopla una segunda cadena de acilo en la posiciónsn2para formar ácido fosfatídico. El PA es desfosforilado luego en diacilglicerol (DAG) por el ácido fosfatídico fosfatasa (PAP) proporcionando así el sustrato para el paso de acilación final. Finalmente, la tercera cadena de acilo es esterificada en la posiciónsn3de DAG en una reacción catalizada por la diacilglicerol aciltransferasa (DGAT) para formar TAG que se acumula en los cuerpos grasos. Una segunda reacción enzimática, la fosfatidil glicerol aciltransferasa (PDAT), también da como resultado la conversión de DAG en TAG. Esta reacción no está relacionada con DGAT y emplea fosfolípidos como donantes de acilo.

Para maximizar los rendimientos para la producción comercial de lípidos, persiste la necesidad de un medio adicional para aumentar los niveles de lípidos, en particular de los lípidos no polares tales como DAGs y TAGs, en organismos transgénicos o partes de los mismos tales como plantas, semillas, hojas, algas y hongos. Los intentos por incrementar los rendimientos de lípidos neutros en plantas se han centrado fundamentalmente en los pasos enzimáticos críticos individuales relacionados con la biosíntesis de ácidos grasos o en ensamblaje de TAG. Sin embargo, estas estrategias han dado como resultado aumentos modestos en el contenido de aceites de semillas o de hojas. Trabajos recientes de manipulación metabólica mediante ingeniería genética en la levadura oleaginosaYarrowia lipoliticahan demostrado que un enfoque combinado de aumentar la producción de glicerol-3-fosfato y de impedir la degradación de TAG por medio de una p-oxidación dio como resultado aumentos acumulados en el contenido total de lípidos (Dulermo y colaboradores, 2011). La publicación de la solicitud de patente de Estados Unidos US 2013/0164798 también describe métodos para incrementar lípidos, particularmente lípidos no-polares en organismos o partes de los mismos, como plantas, semillas, hojas, algas y hongos.

Los lípidos vegetales, tales como los triacilgliceroles del aceite de las semillas (TAG), tienen muchos usos, por ejemplo, usos culinarios (materia grasa, textura, sabor), usos industriales (en jabones, velas, perfumes, cosméticos, adecuados como agentes de secado, aislantes, lubricantes) y proporcionan valor nutricional. También existe un interés creciente en el uso de lípidos vegetales para la producción de biocombustible.

Para maximizar los rendimientos para la producción biológica con fines comerciales de lípidos, existe la necesidad de medios adicionales para aumentar los niveles de lípidos, en particular lípidos no polares tales como DAG y TAG, en organismos transgénicos o partes de los mismos, tales como plantas, semillas, hojas, algas y hongos.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

Los presentes inventores han identificado un proceso para producir un producto de aceite de partes vegetativas de la planta.

En un primer aspecto, la presente invención proporciona un proceso para producir un producto de aceite, el proceso comprende los pasos de

(i) tratar, en un reactor, una composición que comprende

(a) partes vegetativas de una planta angiosperma, donde dicha parte vegetativa de la planta tiene un peso seco de al menos 2g y tienen un contenido de lípidos no polares total de al menos 5% en peso sobre una base de peso seco,

(b) un solvente que comprende agua, un alcohol, o ambos, y

(c) opcionalmente un catalizador,

en donde el tratamiento comprende calentar la composición en una temperatura entre 50°C y 450°C y en una presión entre 5x105 y 3.5x107Pa(5 y 350bar) por entre 1 y 120 minutos en un medio ambiente oxidativo, reductor o inerte, (ii) recuperar el producto de aceite del reactor en un rendimiento de al menos 35% en peso con respecto al peso seco de las partes vegetativas de la planta,

produciendo de esta manera el producto de aceite.

En una realización, las partes vegetativas de la planta tienen un peso seco de al menos 1kg.

En una realización, las partes vegetativas de la planta tiene un contenido de lípidos no polares de al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, 25%, 30%, 35%, entre 10% y 75%, entre 20% y 75% o de manera preferente entre 30% y 75% sobre una base de peso seco.

En una realización, la composición tiene una concentración de sólidos entre 5% y 90%, de manera preferente entre 15% y 50% (peso seco/peso).

Se puede usar cualquier catalizador adecuado. En una realización, el catalizador es un álcali, un ácido o un catalizador de metal precioso. Por ejemplo, en una realización el catalizador comprende NaOH o KOH o ambos, de manera preferente en una concentración de 0.1M a 2M.

En una realización, el tiempo de tratamiento es entre 1 y 60 minutos, de manera preferente entre 10 y 60 minutos, de manera más preferente entre 15 y 30 minutos. En una realización donde la presión es menor que 5x106Pa(50bar), el tiempo de reacción puede ser hasta 24 horas o aún hasta 7 días. En una realización preferida, la temperatura es entre 275°C y 360°C, la presión es entre 1x107 y 2x107Pa(100 y 200bar), y la reacción se presenta en 10-60 minutos.

En una realización, si el solvente es agua el proceso produce un rendimiento del producto de aceite entre un mínimo de 36%, 37%, 38%, 39% o 40% y un máximo de 55% o de manera preferente 60% en peso con respecto al peso seco de las partes vegetativas de la planta. En esta realización, el producto de aceite comprende al menos 2 veces, de manera preferente al menos 3 veces más de compuestos de hidrocarburos que ésteres de acilo grasos. De manera preferente, el producto de aceite comprende 35%, de manera más preferente 40% de compuestos de hidrocarburo C13-C22.

En otra realización, si el solvente comprende un alcohol, preferiblemente metanol, el proceso produce un rendimiento de producto de aceite entre un mínimo de 36%, 37%, 38%, 39% o 40% y un máximo de 65% o de manera preferente 70% en peso con respecto al peso seco de las partes vegetativas de la planta. En esta realización, el producto de aceite comprende al menos 1.5 veces, de manera preferente al menos 2 veces, más de ésteres de acilo graso que compuestos de hidrocarburos. De manera preferente, el producto de aceite comprende 40%, de manera más preferente 50%, de ésteres de metilo de ácido graso.

En una realización adicional, si el solvente comprende 80% en agua, el producto de aceite comprende 30% de compuestos de hidrocarburo C13-C22, de manera preferente de aproximadamente 35%, de manera más preferente aproximadamente 40% De compuestos de hidrocarburo C13-C22.

En otra realización, si el solvente comprende 50% de metanol, el producto de aceite comprende 50% de ésteres de metilo de ácido graso (FAME).

En una realización adicional, el producto de aceite recuperado tiene un contenido de agua de menor que 15% en peso, de manera preferente menor que 5% en peso.

En todavía otra realización, el rendimiento el producto de aceite es al menos 2% mayor en peso, de manera preferente al menos 4% mayor en peso, con respecto a un proceso correspondiente usando partes vegetativas de la planta correspondientes cuyo contenido de lípidos no polares es menor que 2% sobre una base de peso seco.

En una realización, las partes vegetativas de la planta en el paso (i)(a) se han procesado físicamente por uno o más de secado, picado, triturado, molienda, enrollado, prensado, estrujado o machacado. En una realización alternativa, las partes vegetativas de la planta no se han secado a un contenido de humedad de menor que 10% antes de la preparación de la composición. Por ejemplo, las partes vegetativas de la planta tienen un contenido de humedad de al menos 20% o al menos 30%, o las partes vegetativas de la planta retienen al menos 50% del contenido de agua que tuvieron en el momento en que se cosecharon.

En una realización, el proceso comprende además uno o más de:

(i) hidrodesoxigenación del producto de aceite recuperado,

(ii) tratamiento del producto de aceite recuperado con hidrógeno para reducir los niveles de cetonas o azúcares en el producto de aceite,

(iii) producción de gas sintético del producto de aceite recuperado, y

(iv) fraccionar el producto de aceite recuperado para producir uno o más de fueloil, diésel, queroseno o gasolina. Por ejemplo, el paso de fraccionamiento es mediante destilación fraccional.

En una realización, las partes vegetativas de la planta comprenden hojas de planta, tallos o ambos.

En una realización, las partes vegetativas de la planta comprenden una combinación de polinucleótidos exógenos y/o modificaciones genéticas como se define en la presente memoria.

Los presentes inventores también han mostrado incrementos significativos en el contenido de lípidos de organismos, particularmente en las partes vegetativas y semillas de plantas, mediante manipulación de biosíntesis de ácidos grasos, ensamblajes de lípidos y rutas de empacado de lípidos, y catabolismo de lípidos reducido. Varias combinaciones de genes y reducción de la expresión génica se usaron para lograr incrementos sustanciales en el contenido de aceite, que es de mayor significancia para la producción de biocombustibles y otros productos industriales derivados de aceite.

En un segundo aspecto, la presente memoria describe una célula eucariota recombinante que comprende

a) primer polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido de factor de transcripción que incrementa la expresión de uno o más genes glucolíticos y/o de la biosíntesis de ácidos grasos en la célula,

b) un segundo polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido implicado en la biosíntesis de uno o más lípidos no polares, y cualquiera o dos o tres de

c) una primera modificación genética que regula negativamente la producción de endógenos y/o actividad de un polipéptido implicado en el catabolismo de triacilgliceroles (TAG) en la célula cuando se compara con una célula correspondiente que carece de la modificación genética,

d) un tercer polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido que incrementa la exportación de ácidos grasos fuera de los plástidos de la célula cuando se compara con una célula correspondiente que carece del cuarto polinucleótido exógeno, y

e) un cuarto polinucleótido exógeno que codifica un segundo polipéptido de factor de transcripción que incrementa la expresión de uno o más de genes glucolíticos y/o de la biosíntesis de ácidos grasos en la célula,

en donde cada polinucleótido exógeno se liga operablemente a un promotor que es capaz de dirigir la expresión del polinucleótido en la célula.

En un aspecto, la célula comprende a), b) y c), y opcionalmente d) o e).

En un aspecto, la célula comprende a), b) y d), y opcionalmente c) o e).

En un aspecto, la célula comprende a), b) y e), y opcionalmente c) o d).

En un aspecto, la célula comprende además uno o más o todo de

a) un quinto polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido de recubrimiento de cuerpo lipídico (OBC), de manera preferente una proteína asociada a gotitas de lípidos (LDAP),

b) una segunda modificación genética que regula negativamente la producción endógena y/o actividad de un polipéptido implicado en importar ácidos grasos en los plástidos de la célula cuando se compara con una célula correspondiente que carece de la segunda modificación genética, y

c) una tercera modificación genética que regula negativamente la producción endógena y/o actividad de un polipéptido implicado en la producción de diacilglicerol (DAG) en el plástido cuando se compara con una célula correspondiente que carece de la tercera modificación genética.

En un aspecto, la célula eucariota recombinante comprende

a) un primer polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido de factor de transcripción que incrementa la expresión de uno o más genes glucolíticos y/o de la biosíntesis de ácidos grasos en la célula,

b) un segundo polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido implicado en la biosíntesis de uno o más lípidos no polares, y

c) una primera modificación genética que regula negativamente la producción endógena y/o actividad de un polipéptido implicado en el catabolismo de triacilgliceroles (TAG) en la célula cuando se compara con una célula correspondiente que carece de la modificación genética,

en donde cada polinucleótido exógeno se liga operablemente a un promotor que es capaz de dirigir la expresión del polinucleótido en la célula, y opcionalmente la célula comprende además uno o más o todo de

d) un tercer polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido de recubrimiento de cuerpo lipídico (OBC), de manera preferente un LDAP,

e) un cuarto polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido que incrementa la exportación de ácidos grasos fuera de los plástidos de la célula cuando se compara con una célula correspondiente que carece del cuarto polinucleótido exógeno,

f) una segunda modificación genética que regula negativamente la producción endógena y/o actividad de un polipéptido implicado en importar ácidos grasos en los plástidos de la célula cuando se compara con una célula correspondiente que carece de la segunda modificación genética, y

g) una tercera modificación genética que regula negativamente la producción endógena y/o actividad de un polipéptido implicado en la producción de diacilglicerol (DAG) en el plástido cuando se compara con una célula correspondiente que carece de la tercera modificación genética.

En un aspecto, la célula es una célula de planta de o en una parte vegetativa de una planta y uno o más o todos los promotores se expresan en un nivel más alto en la parte vegetativa con respecto a la semilla de la planta.

En un aspecto preferido, la presencia del c), d) o e), juntos con el primero y segundo polinucleótidos exógenos incrementa el contenido de lípidos no polares total de la célula, de manera preferente una célula en la parte vegetativa de la planta tal como una hoja o tallo, con respecto a una célula correspondiente que comprende el primero y segundo polinucleótidos exógenos pero que carecen de c), d) y e). De manera más preferente, el incremento es sinérgico. De manera mucho más preferente, al menos el promotor que dirige la expresión del primer polinucleótido exógeno es un promotor diferente a un promotor constitutivo.

En un aspecto, el polipéptido implicado en la biosíntesis de uno o más lípidos no polares es un DGAT o un PDAT y el polipéptido implicado en el catabolismo de TAG en la célula es una SDP1 lipasa.

En un aspecto, el polipéptido de factor de transcripción que incrementa la expresión de uno o más genes glucolíticos y/o de la biosíntesis de ácidos grasos en la célula es un polipéptido WRI1 y el polipéptido implicado en la biosíntesis de uno o más lípidos no polares es un DGAT o un PDAT.

En un aspecto, el polipéptido de factor de transcripción que incrementa la expresión de uno o más genes glucolíticos y/o de la biosíntesis de ácidos grasos en la célula es un polipéptido WRI1, un polipéptido LEC2, un polipéptido LEC1 o un polipéptido similar a LEC1 y el polipéptido implicado en la biosíntesis de uno o más lípidos no polares es un DGAT.

En un aspecto, el polipéptido de factor de transcripción que incrementa la expresión de uno o más genes glucolíticos y/o de la biosíntesis de ácidos grasos en la célula es un polipéptido WRI1, un polipéptido LEC2, un polipéptido LEC1 o un polipéptido similar a LEC1 y el polipéptido implicado en el catabolismo de triacilgliceroles (TAG) en la célula es una SDP1 lipasa.

En un aspecto, el polipéptido de factor de transcripción que incrementa la expresión de uno o más genes glucolíticos y/o de la biosíntesis de ácidos grasos en la célula es un polipéptido WRI1, un polipéptido LEC2, un polipéptido LEC1 o un polipéptido similar a LEC1, el polipéptido implicado en la biosíntesis de uno o más lípidos no polares es un DGAT o un PDA<t>y el polipéptido implicado en el catabolismo de triacilgliceroles (TAG) en la célula es una SDP1 lipasa.

En un aspecto, cuando están presentes, los factores de transcripción son WRI1 y LEC2, o WRI1 y LEC1.

En los aspectos anteriores, se prefiere que la célula esté en una parte vegetativa de una planta que está creciendo en el suelo o que se desarrolla en el suelo la parte de la planta se cosechó subsecuentemente, y en donde la célula comprende al menos 8% de TAG sobre una base en peso (% de peso seco) tal como por ejemplo entre 8% y 75% o entre 8% y 30%. De manera más preferente, el contenido de TAG es al menos 10%, tal como por ejemplo entre 10% y 75% o entre 10% y 30%. De manera preferente, estos niveles de TAG están presentes en las partes vegetativas antes de o en el florecimiento de la planta o antes de la etapa de establecimiento de la semilla del desarrollo de la planta. En estos aspectos, se prefiere que la relación del contenido de TAG en la hoja al contenido de TAG en los tallos de la planta sea entre 1:1 y 10:1, y/o la relación se incremente con respecto a una célula correspondiente que comprende el primero y segundo polinucleótidos exógenos y que carece de la primera modificación genética.

En los aspectos anteriores, la célula comprende de manera preferente un polinucleótido exógeno que codifica un DGAT una modificación genética que regula negativamente la producción de una SDP1 lipasa endógena. De manera más preferente, la célula no comprende un polinucleótido exógeno que codifica un PDAT, y/o es una célula diferente a una célula deNicotiana benthamiana,y/o el WRI1 es un WRI1 diferente al WRI1 deArabidopsis thaliana(SEQ ID NOs:21 o 22). De manera más preferente, al menos uno de los polinucleótidos exógenos en la célula se expresa de un promotor que no es un promotor constitutivo tal como, por ejemplo, un promotor que se expresa de manera preferente en tejidos verdes o tallos de la planta que se regula positivamente después del inicio de la floración o durante la senescencia.

En un tercer aspecto, la presente memoria describe una célula eucariota recombinante que comprende

c) un tercer polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido de recubrimiento de cuerpo lipídico (OBC), de manera preferente un polipéptido asociado atotitas de lípidos (LDAP),

en donde cada polinucleótido exógeno se liga operablemente a un promotor que es capaz de dirigir la expresión del polinucleótido en la célula, y en donde la célula eucariota recombinante tiene un nivel incrementado de uno o más lípido(s) no polar, y/o una cantidad incrementada del polipéptido OBC, con respecto a una célula correspondiente que comprende un tercer polinucleótido exógeno cuya secuencia de nucleótidos es el complemento de la secuencia proporcionada como SEQ ID NO: 176.

En un aspecto, la célula del aspecto anterior comprende además uno o más o todos de

d) una primera modificación genética que regula negativamente la producción endógena y/o actividad de un polipéptido implicado en el catabolismo de triacilgliceroles (TAG) en la célula cuando se compara con una célula correspondiente que carece de la primera modificación genética,

g) una tercera modificación genética que regula negativamente la producción endógena y/o actividad de un polipéptido implicado en la producción diacilglicerol (DAG) en el plástido cuando se compara con una célula correspondiente que carece de la tercera modificación genética.

En un aspecto, el polipéptido implicado en la biosíntesis de uno o más lípidos no polares es un DGAT o un PDAT y el polipéptido OBC es una oleosina. Alternativamente, el polipéptido OBC es un LDAP.

En un aspecto, el polipéptido de factor de transcripción que incrementa la expresión de uno o más genes glucolíticos y/o de la biosíntesis de ácidos grasos en la célula es un polipéptido WRJ1 y el polipéptido implicado en la biosíntesis de uno o más lípidos no polares es un DGAT o un PDAT.

En un aspecto, el polipéptido de factor de transcripción que incrementa la expresión de uno o más genes glucolíticos y/o de la biosíntesis de ácidos grasos en la célula es un polipéptido WRJ1, un polipéptido LEC2, un polipéptido LEC1 o un polipéptido similar a LEC1 y el polipéptido OBC es una oleosina. Alternativamente, el polipéptido OC es un LDAP.

En un aspecto, el polipéptido de factor de transcripción que incrementa la expresión de uno o más genes glucolíticos y/o de la biosíntesis de ácidos grasos en la célula es un polipéptido WRI1, un polipéptido LEC2, un polipéptido LEC1 o un polipéptido similar a LEC1, el polipéptido implicado en la biosíntesis de uno o más lípidos no polares es un DGAT o un PDA<t>y el polipéptido OBC es una oleosina. Alternativamente, el polipéptido OBC es un LDAP.

En un aspecto, la célula comprende dos polinucleótidos exógenos que codifican dos polipéptidos de factor de transcripción diferentes que incrementan la expresión de uno o más genes glucolíticos y/o de la biosíntesis de ácidos grasos en la célula, tal como WRI1 y LEC2, o W r I1 y LEC1.

En un aspecto preferido, la presencia del tercer polinucleótido exógeno que codifica el polipéptido OBC, de manera preferente un LDAP, junto con el primero y segundo polinucleótidos exógenos incrementa el contenido de lípidos no polares de la célula de planta, de manera preferente una célula en la parte vegetativa de la planta tal como una hoja o tallo, con respecto a una célula de planta correspondiente que comprende el primero y segundo polinucleótidos exógenos pero que carece del tercer polinucleótido exógeno. De manera más preferente, el incremento es sinérgico. De manera más preferente, al menos el promotor que dirige la expresión del primer polinucleótido exógeno es un promotor diferente a un promotor constitutivo.

En un cuarto aspecto, la presente memoria describe una célula eucariota recombinante que comprende plástidos y un primer polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido de factor de transcripción que incrementa la expresión de uno o más genes glucolíticos y/o de la biosíntesis de ácidos grasos en la célula, y uno o más o todo de;

a) un segundo polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido que incrementa la exportación de ácidos grasos fuera de los plástidos de la célula cuando se compara con una célula correspondiente que carece del segundo polinucleótido exógeno,

b) una primera modificación genética que regula negativamente la producción endógena y/o actividad de un polipéptido implicado en importar ácidos grasos en los plástidos de la célula cuando se compara con una célula correspondiente que carece de la primera modificación genética, y

c) una segunda modificación genética que regula negativamente la producción endógena y/o actividad de un polipéptido implicado en la producción diacilglicerol (DAG) en el plástido cuando se compara con una célula correspondiente que carece de la segunda modificación genética, en donde cada polinucleótido exógeno se liga operablemente a un promotor que es capaz de dirigir la expresión del polinucleótido en la célula.

En un aspecto, la célula, de manera preferente una célula de planta, comprende a) y opcionalmente b) o c).

En un aspecto, la célula del aspecto anterior comprende además uno o más o todo de

d) un tercer polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido implicado en la biosíntesis de uno o más lípidos no polares,

e) una tercera modificación genética que regula negativamente la producción endógena y/o actividad de un polipéptido implicado en el catabolismo de triacilgliceroles (TAG) en la célula cuando se compara con una célula correspondiente que carece la tercera modificación genética, y

f) un cuarto polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido de recubrimiento de cuerpo lipídico (OBC), de manera preferente un LDAP.

En un aspecto preferido, la célula, de manera preferente una célula de planta, comprende el primero, segundo y tercer polinucleótidos exógenos y opcionalmente la tercera modificación genética o el cuarto polinucleótido exógeno.

En un aspecto preferido, la presencia del segundo polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido que incrementa la exportación de ácidos grasos fuera de los plástidos de la célula, que es de manera preferente una aciltioesterasa grasa tal como un polipéptido FATA, junto con el primero y, si está presente, el tercer polinucleótidos exógenos incrementa el contenido de lípidos no polares de la célula de planta, de manera preferente una célula en la parte vegetativa de la planta tal como una hoja o tallo, con respecto a una célula de planta correspondiente que comprende el primero y, si está presente, tercer polinucleótidos exógenos pero que carecen del segundo polinucleótido exógeno. De manera más preferente, el incremento proporcionado por el segundo polinucleótido exógeno es sinérgico. De manera más preferente, al menos el promotor que dirige la expresión del primer polinucleótido exógeno es un promotor diferente a un promotor constitutivo.

En un aspecto, el polipéptido de factor de transcripción que incrementa la expresión de uno o más genes glucolíticos y/o de la biosíntesis de ácidos grasos en la célula es un polipéptido WRI1, un polipéptido LEC2, un polipéptido LEC1 o un polipéptido similar a LEC1, de manera preferente un factor de transcripción diferente a WRI1 deArabidopsis thaliana(s Eq ID NOs:21 o 22), y el polipéptido que incrementa la exportación de ácidos grasos fuera de los plástidos de la célula es un ácido graso tioesterasa, de manera preferente un polipéptido FATA o FATB, de manera más preferente un polipéptido FATA o una ácido graso tioesterasa diferente a una ácido grado tioesterasa de cadena media. La presencia de una tioesterasa diferente a una tioesterasa de cadena media se indica por el porcentaje de ácidos grasos C12:0 y/o C14:0 en el contenido de ácido graso total de la célula que es aproximadamente la misma con respecto a una célula correspondiente que carece del polinucleótido exógeno que codifica la tioesterasa. De manera preferente, la célula comprende además un polinucleótido exógeno que codifica un DGAT y una modificación genética que regula negativamente la producción de una SDP1 lipasa endógena. En un aspecto, la producción disminuida de una SDP1 lipasa actúa sinérgicamente con el factor de transcripción y la ácido graso tioesterasa para incrementar el contenido de lípidos no polares en la célula. De manera más preferente, la célula no comprende un polinucleótido exógeno que codifica un PDAT, y/o es una célula diferente a una célula deNicotiana benthamiana.De manera más preferente, al menos uno de los polinucleótidos exógenos en la célula se expresa de un promotor que no es un promotor constitutivo tal como, por ejemplo, un promotor expresado de manera preferente en los tejidos verdes o tallos de la planta o que se regula positivamente durante la senescencia.

En un aspecto, el polipéptido de factor de transcripción que incrementa la expresión de uno o más genes glucolíticos y/o de la biosíntesis de ácidos grasos en la célula es un polipéptido WRI1, un polipéptido LEC2, un polipéptido LEC1 o un polipéptido similar a LEC1, y el polipéptido implicado en importar ácidos grasos en los plástidos de la célula es un polipéptido TGD.

En un aspecto, el polipéptido de factor de transcripción que incrementa la expresión de uno o más genes glucolíticos y/o de la biosíntesis de ácidos grasos en la célula es un polipéptido WRI1, un polipéptido LEC2, un polipéptido LEC1 o un polipéptido similar a LEC1, y el polipéptido implicado en la producción de diacilglicerol (DAG) es un GPAT plastidial

En un aspecto, el polipéptido de factor de transcripción que incrementa la expresión de uno o más genes glucolíticos y/o de la biosíntesis de ácidos grasos en la célula es un polipéptido WRI1, un polipéptido LEC2, un polipéptido LEC1 o un polipéptido similar a LEC1, el polipéptido que incrementa la exportación de ácidos grasos fuera de los plástidos de la célula es una ácido graso tioesterasa, de manera preferente un polipéptido FATA o FATB, y el polipéptido implicado en importar ácidos grasos en los plástidos de la célula un polipéptido TGD.

En un aspecto, el polipéptido de factor de transcripción que incrementa la expresión de uno o más genes glucolíticos y/o de la biosíntesis de ácidos grasos en la célula es un polipéptido WRI1, un polipéptido LEC2, un polipéptido LEC1 o un polipéptido similar a LEC1, el polipéptido que incrementa la exportación de ácidos grasos fuera de los plástidos de la célula es una ácido grasa tioesterasa, de manera preferente un polipéptido FATA o FATB, y el polipéptido implicado en la producción de diacilglicerol (DAG) es un GPAT plastidial.

En un aspecto, el polipéptido de factor de transcripción que incrementa la expresión de uno o más genes glucolíticos y/o de la biosíntesis de ácidos grasos en la célula es un polipéptido WRI1, un polipéptido LEC2, un polipéptido LEC1 o un polipéptido similar a LEC1, el polipéptido implicado en importar ácidos grasos en los plástidos de la célula es un polipéptido TGD, y el polipéptido implicado en la producción de diacilglicerol (DAG) es un GPAT plastidial.

En los aspectos del segundo, tercero y cuarto aspecto, cuando la célula comprende un polinucleótido exógeno que codifica una ácido graso tioesterasa tal como, por ejemplo, un polipéptido FATA o FATB, la tioesterasa es de manera preferente un polipéptido FATA o una ácido graso tioesterasa diferente a una ácido graso tioesterasa.

En un quinto aspecto, la presente memoria describe una célula eucariota recombinante que comprende

a) un primer polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido de factor de transcripción que incrementa la expresión de uno o más genes glucolíticos y/o de la biosíntesis de ácidos grasos en la célula, de manera preferente un factor de transcripción WRI,

b) un segundo polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido implicado en la biosíntesis de uno o más lípidos no polares que es un LPAAT con actividad preferencial para ácidos grasos con una longitud de cadena media (C8 a C14), y

c) un tercer polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido que incrementa la exportación de ácidos grasos C8 a C14 fuera de los plástidos de la célula cuando se compara con una célula correspondiente que carece del tercer polinucleótido exógeno,

En un aspecto, el tercer polinucleótido exógeno codifica una tioesterasa, de manera preferente una FATB tioesterasa con actividad potencial para ácidos grasos con una longitud de cadena media (C8 a C14).

En un aspecto preferido, la presencia del tercer polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido que incrementa la exportación de ácidos grasos C8 a C14 fuera de los plástidos de la célula, junto con el primero y segundo polinucleótido exógenos incrementa el contenido de MCFA total de la célula, de manera preferente una célula en la parte vegetativa de la planta tal como una hoja, raíz o tallo, con respecto a una célula de planta correspondiente que comprende el primero y segundo polinucleótidos exógenos pero que carece del tercer polinucleótido exógeno. De manera más preferente, el incremento proporcionado por el tercer polinucleótido exógeno es sinérgico. De manera más preferente, al menos el promotor que dirige la expresión del primero polinucleótido exógeno es un promotor diferente a un promotor constitutivo.

En un aspecto, el polinucleótido exógeno que codifica la FATB tioesterasa con actividad preferencial para ácidos grasos con una longitud de cadena media (C8 a C14) aminoácidos cuya secuencia se expone en cualquiera de SEQ ID NOs: 193 a 199, o un fragmento biológicamente activo de cualquiera de las mismas, o un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es al menos 30% idéntica a cualquiera o más de SEQ ID NOs: 193 a 199. De manera más preferente, el polinucleótido exógeno que codifica la FATB tioesterasa con actividad preferencial para ácidos grasos con una longitud de cadena media (C8 a C14) comprende los aminoácidos cuya secuencia se expone como SEQ ID NOs: 193 a 199, o un fragmento biológicamente activo de cualquiera de las mismas, o un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es al menos 30% idéntica a cualquiera o ambas de SEQ ID NOs: 193 a 199.

En un aspecto del quinto aspecto, el factor de transcripción no es WRI1 deArabidopsis thaliana(SEQ ID NOs:21 o 22).

En un aspecto del quinto aspecto, el polinucleótido exógeno que codifica LPAAT comprende los aminoácidos cuya secuencia se expone como SEQ ID NO:200, o un fragmento biológicamente activo de la misma, o un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es al menos 30% idéntica a la misma.

En un aspecto del quinto aspecto, la célula comprende además uno o más o todo de;

d) un cuarto polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido adicional implicado en la biosíntesis de uno o más lípidos no polares,

e) una primera modificación genética que regula negativamente la producción endógena y/o actividad de un polipéptido implicado en el catabolismo de triacilgliceroles (TAG) en la célula cuando se compara con una célula correspondiente que carece la primera modificación genética,

f) un quinto polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido de recubrimiento de cuerpo lipídico (OBC), de manera preferente un LDAP,

g) una segunda modificación genética que regula negativamente la producción endógena y/o actividad de un polipéptido implicado en importar ácidos grasos en los plástidos de la célula cuando se compara con una célula correspondiente que carece la segunda modificación genética, y

h) una tercera modificación genética que regula negativamente la producción endógena y/o actividad de un polipéptido implicado en la producción de diacilglicerol (DAG) en el plástido cuando se compara con una célula correspondiente que carece la tercera modificación genética, en donde cada polinucleótido exógeno se liga operablemente a un promotor que es capaz de dirigir la expresión del polinucleótido en la célula.

En un aspecto del quinto aspecto, la célula es una célula de planta de o en una parte vegetativa de una planta y uno o más o todo de los promotores expresan en un nivel más alto en la parte vegetativa relacionada con la semilla de la planta.

En un aspecto del quinto aspecto, el ácido graso dentro de una longitud de cadena media es al menos ácido mirístico. En una realización preferida, la célula comprende un contenido de ácido mirístico de al menos aproximadamente 8%, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 11%, al menos aproximadamente 12%, al menos aproximadamente 15%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 25%, entre 8% y 25%, entre 8% y 20%, entre 10% y 25%, entre 11% y 25%, entre aproximadamente 15% y 25%, entre aproximadamente 20% y 25%, (p/p de peso seco).

En los aspectos del tercer, cuarto y quinto aspecto, se prefiere que la célula esté en una parte vegetativa de una planta que está creciendo en el suelo o que se desarrolló en el suelo y la parte de la planta se cosechó subsecuentemente, y en donde la célula comprende al menos 8% de TAG sobre una base en peso (% de peso seco) tal como por ejemplo entre 8% y 75% o entre 8% y 30%. De manera más preferente, el contenido de TAG es al menos 10%, tal como por ejemplo entre 10% y 75% o entre 10% y 30%. De manera preferente, estos niveles de TAG están presentes en las artes vegetativas antes de o en el florecimiento de la planta o antes de la etapa de establecimiento de la semilla del desarrollo de la planta. En estos aspectos, se prefiere que la relación del contenido de TAG en las hojas al contenido de TAG en los tallos de la planta sea entre 1:1 y 10:1, y/o la relación se incremente con respecto a una célula correspondiente que comprende el primero y segundo polinucleótidos exógenos y que carece de la primera modificación genética.

En los aspectos del segundo, cuarto y quinto aspecto, la célula comprende de manera preferente un polinucleótido exógeno que codifica un DGAT y una modificación genética que regula negativamente la producción de una SDP1 lipasa endógena. En un aspecto preferido, la célula no comprende un polinucleótido exógeno que codifica un PDAT, y/o es una célula diferente a una célula deNicotiana benthamianay/o es una célula diferente a una célula deBrassica napus.De manera más preferente, al menos uno de los polinucleótido exógenos en la célula se expresa de un promotor que no es un promotor constitutivo tal como, por ejemplo, un promotor expresado de manera preferente en tejidos verdes o tallos de la planta o que se regula positivamente durante la senescencia.

En un aspecto, una célula como se describe en la presente memoria (incluyendo el segundo, tercero, cuarto y quinto aspectos) tiene una o más o todas las siguientes características (donde sea aplicable);

i) la célula tiene una síntesis incrementada de ácidos grasos totales con respecto a una célula correspondiente que carece del primer polinucleótido exógeno, o un catabolismo disminuido de ácidos grados totales con respecto a una célula correspondiente que carece del primer polinucleótido exógeno, o ambos, tal que tiene un nivel incrementado de ácidos grasos totales con respecto a una célula correspondiente que carece del primer polinucleótido exógeno, ii) la célula tiene una expresión y/o actividad incrementada de una acil transferasa grasa que cataliza la síntesis de TAG, DAG o MAG, de manera preferente TAG, con respecto a una célula correspondiente que tiene el primer polinucleótido exógeno y que carece de polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido implicado en la biosíntesis de uno o más lípidos no polares,

iii) la célula la célula tiene una distribución disminuida de ácido lisofosfatídico (LPA) de acil-ACP y G3P en sus plástidos con respecto a una célula correspondiente que tiene el primer polinucleótido exógeno y que carece de la modificación genética que regula negativamente la producción y/o actividad endógena de un polipéptido implicado en la producción de diacilglicerol (DAG) en el plástido en la célula,

iv) la célula tiene una relación alterada de ácidos grasos C16:3 a C18:3 en su contenido de ácidos grasos total y/o su contenido de galactolípidos con respecto a una célula correspondiente que carece del polinucleótido(s) exógeno y/o modificación(es) genética, de manera preferente una relación disminuida,

v) la célula está en una parte vegetativa de una planta y comprende un contenido de lípidos no polares totales de al menos aproximadamente 8%', al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 11%, al menos aproximadamente 12%, al menos aproximadamente 15%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, entre 8% y 75%, entre 10% y 75%, entre 11% y 75%, entre aproximadamente 15% y 75%, entre aproximadamente 20% y 75%, entre aproximadamente 30% y 75%, entre aproximadamente 40% y 75%, entre aproximadamente 50% y 75%, entre aproximadamente 60% y 75%, o entre aproximadamente 25% y 50% (p/p de peso seco),

vi) la célula está en una parte vegetativa de una planta y comprende un contenido de TAG de al menos aproximadamente 8%, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 11%, al menos aproximadamente 12%, al menos aproximadamente 15%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, entre 8% y 75%, entre 10% y 75%, entre 11% y 75%, entre aproximadamente 15% y 75%, entre aproximadamente 20%) y 75%, entre aproximadamente 30% y 75%, entre aproximadamente 40% y 75%, entre aproximadamente 50% y 75%, entre aproximadamente 60% y 75%, o entre aproximadamente 25% y 50% (p/p de peso seco),

vii) el polipéptido de factor(es) de transcripción se selecciona del grupo que consiste en Wrinkled 1 (WRI1), Cotiledón de Hoja 1 (LEC1), similar a LEC1, Cotiledón de Hoja 2 (LEC2), BABY BOOM (BBM), FUS3, ABI3, ABI4, ABI5, Dof4 y Dof11, o el grupo que consiste de MYB73, bZIP53, AGL15, MYB115, MYB118, TANMEI, WUS, GFR2al, GFR2a2 y PHR1,

viii) el ácido oleico comprende al menos 20% (% en mol), al menos 22% (% en mol), al menos 30% (% en mol), al menos 40% (% en mol), al menos 50% (% en mol), o al menos 60% (% en mol), de manera preferente aproximadamente 65% (% en mol) o entre 20% y aproximadamente 65% del contenido de ácidos grados total en la célula,

ix) lípido no polar en la célula comprende un ácido graso que comprende un grupo hidroxilo, un grupo epoxi, un grupo ciclopropano, una ligación de carbono-carbono doble, una ligación de carbono-carbono triple, ligaciones dobles conjugadas, una cadena ramificada tal como una cadena ramificada metilada o hidroxilada, o una combinación de dos o más de los mismos, o cualquiera de dos, tres, cuatro, cinco o seis de los grupos mencionados en lo anterior, ligaciones o cadenas ramificadas,

x) lípido no polar en la célula comprende uno o más ácidos grasos poliinsaturados seleccionados de ácido eicosadienoico (EDA), ácido araquidónico (ARA), ácido estearidónico (SDA), ácido eicosatrienoico (ETE), ácido eicosatetraenoico (ETA), ácido eicosapentaenoico (EPA), ácido docosapentaenoico (DP A), ácido docosahexaenoico (DHA), o una combinación de dos o más de los mismos,

xi) la célula es una planta o parte de la misma, de manera preferente una parte vegetativa de la planta, o la célula es una célula de alga tal como una diatomea (bacilariofitos), algas verdes (clorofitos), algas azul-verde (cianofitos), altas doradas-cafés (crisofitos), haptofitos, algas cafés o algas heterocontas, o la célula es de o es un organismo adecuado para fermentación tal como un hongo.

xii) uno o más o todos los promotores se seleccionan del promotor diferente a un promotor constitutivo, de manera preferente un promotor específico de tejido tal como un promotor específico de hoja y/o tallo, un promotor desarrolladamente regulado tal como un promotor específico de senescencia tal como un promotor SAG12, un promotor inducible, o un promotor regulado por ritmo circadiano, de manera preferente en donde al menos uno de los promotores ligados operablemente a un polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido de factor de transcripción es un promotor diferente a un promotor constitutivo,

xiii) la célula comprende un contenido de ácido graso total que comprende ácidos grasos de cadena media, de manera preferente C12:0, C14:0 o ambos, en un nivel de al menos 5% del contenido de ácidos grasos total y opcionalmente un polinucleótido exógeno que codifica un LPAAT que tiene actividad preferencial para ácidos grasos con una longitud de cadena media (C8 a C14), de manera preferente C12:0 o C14:0,

xiv) la célula comprende un contenido de ácido graso total cuyo nivel de ácido oleico y/o nivel de ácido palmítico se incrementa por al menos 2% con respecto a una célula correspondiente que carece del polinucleótido(s) exógeno y/o modificación(es) genética, y/o cuyo nivel de ácido a-linolénico (ALA) y/o nivel de ácido linoléico se disminuye por al menos 2% con respecto a una célula correspondiente que carece del polinucleótido(s) exógeno y/o modificación(es) genética,

xv) lípido no polar en la célula comprende un nivel modificado de esteroles totales, de manera preferente esteroles libres (no esterificados), ésteres de esteroilo, glicósidos de esteroilo, con respecto al lípido no polar en una célula correspondiente que carece del polinucleótido(s) exógeno y/o modificación(es) genética,

xvi) lípido no polar en la célula comprende ceras y/o ésteres de cera,

xvii) la célula es un miembro de una población o recolección de al menos aproximadamente 1000 de las células, de manera preferente en una parte vegetativa de la planta o una semilla,

xviii) la célula comprende un polinucleótido exógeno que codifica un supresor de silenciamiento, en donde el polinucleótido exógeno se liga operablemente a un promotor que es capaz de dirigir la expresión del polinucleótido en la célula,

xix) el nivel de uno o más lípido(s) no polar y/o el contenido de lípido no polar total de la célula es al menos 2% mayor sobre una base en peso que en una célula correspondiente que comprende polinucleótidos exógenos que codifican un WRJ1 deArabidopsis thaliana(SEQ ID NO:21) y DGAT1 deArabidopsis thaliana(SEQ ID NO:l), y

xx) un contenido de ácidos grasos poliinsaturados totales (PUFA) que se disminuye con respecto al contenido de PUFA total de una célula correspondiente que carece de polinucleótido(s) exógeno y/o modificación(es) genética.

Los siguientes aspectos aplican a la célula como se describe en la presente memoria (incluyendo el segundo, tercero, cuarto y quinto aspectos) así como a métodos para producir las células y a métodos para usar las células. En estos aspectos, donde la célula es en una parte vegetativa de una planta, se prefiere que la planta se desarrolle en el suelo o fue desarrollada en el suelo.

En un aspecto, el polipéptido implicado en la biosíntesis de uno o más lípidos no polares es una acil graso aciltransferasa que se implica en la biosíntesis de TAG, DAG o monoacilglicerol (MAG) en la célula, de manera preferente de TAG en la célula, tal como, por ejemplo, un DGAT, PDAT, LPAAT, GPAT o M<g>AT, de manera preferente un DGAT o un PDAT.

En un aspecto, el polipéptido implicado en el catabolismo de triacilgliceroles (TAG) en la célula es una SDP1 lipasa, un polipéptido Cgi58, una acil-CoA oxidasa tal como ACX1 o ACX2, o un polipéptido implicado en p-oxidación de ácidos grasos en la célula tal como un transportador de casete de ligación a ATP peroxisomal PXA1, de manera preferente una SDP1 lipasa.

En un aspecto, el polipéptido de recubrimiento de cuerpo lipídico (OBC) es oleosina, tal como una polioleosina o una caleosina, o de manera preferente una proteína asociada a gotitas de lípidos (LDAP).

En un aspecto, el polipéptido que incrementa la exportación de ácidos grasos fuera de los plástidos de la célula es una ácido graso tioesterasa C16 o C18 tal como un polipéptido FATA o un polipéptido FATB, un transportador de ácido graso tal como un polipéptido ABCA9 o una acil-CoA sintetasa de cadena larga (LACS).

En un aspecto, el polipéptido implicado en importar ácidos grasos en los plástidos de la célula es un transportador de ácido graso, o subunidad del mismo, de manera preferente un polipéptido<t>G<d>tal como, por ejemplo, un polipéptidoTGD1,un polipéptido TGD2, un polipéptido TGD3, o un polipéptido t Gd 4.

En un aspecto, el polipéptido implicado en la producción de diacilglicerol (DAG) en el plástido es un GPAT plastidial, un LPAAT plastidial o un PAP plastidial.

En un aspecto, la célula es de o está en una planta 16:3, o en una parte vegetativa o semilla de la misma, y que comprende uno o más o todo de los siguiente;

a) un polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido que incrementa la exportación de ácidos grasos fuera de los plástidos de la célula cuando se compara con una célula correspondiente que carece del polinucleótido exógeno, b) una primera modificación genética que regula negativamente la producción endógena y/o actividad de un polipéptido implicado en importar ácidos grasos en los plástidos de la célula cuando se compara con una célula correspondiente que carece la primera modificación genética, y

c) una segunda modificación genética que regula negativamente la producción endógena y/o actividad de un polipéptido implicado en la producción de diacilglicerol (DAG) en el plástido cuando se compara con una célula correspondiente que carece la segunda modificación genética, en donde el polinucleótido exógeno se liga operablemente a un promotor que es capaz de dirigir la expresión del polinucleótido en la célula.

En un aspecto alternativo, la célula es de o está en una planta 18:3, o en una parte vegetativa o semilla de la misma.

En un aspecto, la célula es de o está en una hoja de planta, tallo o raíz, antes que la planta florezca, y la célula comprende un contenido de lípido no polar total de al menos aproximadamente 8%, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 11%, entre 8% y 15%, o entre 9% y 12% (p/p de peso seco). En un aspecto, el contenido de lípidos no polares total de la célula es al menos 3%, de manera más preferente al menos 5% mayor, que el contenido de lípidos no polares toral en una célula correspondiente transformada con genes que codifican un WRI1 y un DGAT pero que carecen de los otros polinucleótidos exógenos y modificaciones genéticas como se describe en la presente memoria para el segundo, tercero, cuarto y quinto aspectos. De manera más preferente, el grado de incremento es en una célula en un tallo o raíz de la planta.

En un aspecto, la adición de uno o más de los polinucleótidos exógenos o modificaciones genéticas, de manera preferente el polinucleótido exógeno que codifica un OBC o una acil grasa tioesterasa o la modificación genética que regula negativamente la producción endógena y/o actividad de un polipéptido implicado en el catabolismo de triacilgliceroles (TAG) en la célula, de manera más preferente el polinucleótido exógeno que codifica una FATA tioesterasa o un LDAP o que disminuye la expresión de una TAG lipasa endógena tal como una SDP1 TAG lipasa en la célula, da por resultado un incremento sinérgico en el contenido de lípidos no polares total de la célula cuando se agrega al par de transgenes WRI1 DGAT, particularmente antes que la planta florezca y de manera aún más particular en los tallos y/o raíces de la planta. Por ejemplo, ver Ejemplos 8, 11 y 15. En un aspecto preferido, el incremento en el contenido de<t>A<g>de la célula en un tallo o raíz de la planta es al menos 2 veces, de manera más preferente al menos 3 veces, con respecto a una célula correspondiente transformada con genes que codifican WRI1 y DGAT1 pero que carecen de la FATA tioesterasa, LDAP y la modificación genética que regula negativamente la producción endógena y/o actividad de un polipéptido implicado en el catabolismo de triacilgliceroles (TAG) en la célula. De manera más preferente, al menos el promotor que dirige la expresión del primer polinucleótido exógeno es un promotor diferente a un promotor constitutivo.

La modificación genética puede ser cualquier cambio a una célula de origen natural que logra el efecto deseado. Los métodos para modificar genéticamente las células son bien conocidos en la técnica. En un aspecto, cada una de la una o más o todas las modificaciones genéticas es una mutación de un gen endógeno que inactiva parcial completamente el gen, de manera preferente una mutación introducida, tal como una mutación puntual, una inserción, o una supresión (o una combinación de uno o más de los mismos). La mutación puntual puede ser un codón de detención prematuro, una mutación de sitio de empalme, una mutación de cambio de marco o una mutación de sustitución de aminoácidos que reduce la actividad del gen o el polipéptido codificado. La supresión puede ser de uno o más nucleótidos dentro de un exón o promotor transcrito del gen, o se extiende a través o en más de un exón, o se extiende para la supresión del gen completo. De manera preferente la supresión se introduce por el uso de tecnologías ZF, TALEN o CRISPR. En un aspecto, uno o más o todo de las modificaciones genéticas es un polinucleótido exógeno que codifica una molécula de ARN que muestra expresión del gen endógeno, en donde el polinucleótido exógeno se liga operablemente a un promotor que es capaz de dirigir la expresión del polinucleótido en la célula. Ejemplos de polinucleótidos exógenos que reduce la expresión de un gen endógeno se seleccionan del grupo que consiste de un polinucleótido antisentido, un polinucleótido de sentido, un microARN, un polinucleótido que codifica un polipéptido que liga la enzima endógena, una molécula de ARN de doble hebra y molécula de ADN procesado derivado de la misma. En un aspecto, la célula comprende modificaciones genéticas que son una mutación introducida en un gen endógeno y un polinucleótido exógeno que codifica una molécula de ARN que reduce la expresión de otro gen endógeno.

En un aspecto, el polinucleótido exógeno que codifica WRI1 comprende uno o más de lo siguiente:

i) nucleótidos que codifican un polipéptido que comprende aminoácidos cuya secuencia se expone como cualquiera de SEQ ID NOs:21 a 75 o 205 a 210, o un fragmento biológicamente activo de la misma, o un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es al menos 30% idéntica a cualquiera de una o más de las SEQ ID NOs: 21 a 75 o 205 a 210,

ii) nucleótidos cuya secuencia es al menos 30% idéntica a i), y

iii) nucleótidos que se hibridan a i) y/o ii) bajo condiciones rigurosas. De manera preferente, el polipéptido WRI1 es un polipéptido WRI1 diferente a WRI1 deArabidopsis thaliana(SEQ ID NOs:21 o 22). De manera más preferente, el polipéptido WRI1 comprende aminoácidos cuya secuencia se expone como SEQ ID NO:208, o un fragmento biológicamente activo de la misma, o un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es al menos 30% idéntica a la misma.

En un aspecto del segundo, tercero, cuarto o quinto aspectos, la célula recombinante es una célula de un tubérculo de patata(Solanum tuberosum),una célula de una remolacha azucarera(Beta vulgaris)u hoja, una célula de una caña de azúcar(Saccharumsp.) o tallo u hoja de sorgo(Sorghum bicolor),un célula de endospermo de una planta monoticoledonea, en donde la célula tiene un contenido de ácidos grasos total incrementado con respecto a una célula de endospermo de tipo silvestre correspondiente tal como, por ejemplo, una célula de un grano de trigo(Triticum aestivum),grano de arroz(Oryzasp.) o grano de maíz (Zeamays),una célula de una semilla deBrassicasp., que tiene un contenido de ácidos grasos total incrementado tal como, por ejemplo, una semilla de canola, o una célula de una semilla de leguminosa que tiene un contenido de ácidos grasos total incrementado tal como, por ejemplo, una semilla de soja(Glycine max).

En un sexto aspecto, la presente memoria proporciona un organismo no humano, o parte del mismo, que comprende, o que consiste de, una o más células como se describe en la presente memoria.

En un aspecto, la parte del organismo no humano es una semilla, fruta, o una parte vegetativa de una planta tal como una parte de la planta aérea o una parte verde tal como una hoja o tallo.

En otro aspecto, el organismo no humano es un organismo fototrófico tal como, por ejemplo, una planta o un alga, o un organismo adecuado para fermentación tal como, por ejemplo, un hongo.

En un séptimo aspecto, la presente memoria describe una planta transgénica, o parte de la misma, de manera preferente una parte vegetativa de la planta, que comprende

a) un primer polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido de factor de transcripción que incrementa la expresión de uno o más genes glucolíticos y/o de la biosíntesis de ácidos grasos en la planta,

b) un segundo polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido implicado en la biosíntesis de uno o más lípidos no polares, y cualquiera de uno o dos o tres de c) una modificación genética que regula negativamente la producción endógena y/o actividad de un polipéptido implicado en el catabolismo de triacilgliceroles (TAG) en la planta cuando se compara con una planta correspondiente que carece de la modificación genética,

d) un tercer polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido que incrementa la exportación de ácidos grasos fuera de los plástidos de las células de la planta cuando se compara con una célula correspondiente que carece del cuarto polinucleótido exógeno, y

e) un cuarto polinucleótido exógeno que codifica un segundo polipéptido de factor de transcripción que incrementa la expresión de uno o genes glucolíticos y/o de la biosíntesis de ácidos grasos en la planta,

en donde cada polinucleótido exógeno se liga operablemente a un promotor que es capaz de dirigir la expresión del polinucleótido en la planta.

En un aspecto, la planta o parte de la misma comprende a), b) y c), y opcionalmente d) o e).

En un aspecto, la planta o parte de la misma comprende a), b) y d), y opcionalmente c) o e).

En un aspecto, la planta o parte de la misma comprende a), b) y e), y opcionalmente c) o d).

En un aspecto preferido, la presencia de c), d) o e), junto con a) y b) incrementa el contenido de lípidos no polares totales de la planta o parte de la misma, de manera preferente una parte vegetativa de la planta tal como una hoja, raíz o tallo, con respecto a una planta correspondiente o parte de la misma que comprende a) y b) pero que carece cada una de c), d) y e). De manera más preferente, el incremento es sinérgico. De manera más preferente, al menos el promotor que dirige la expresión del primer polinucleótido exógeno es un promotor diferente a un promotor constitutivo.

En un aspecto, la planta, o parte de la misma, comprende además uno o más o todos de

a) un quinto polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido de recubrimiento de cuerpo lipídico (OBC), de manera preferente un LDAP,

b) una segunda modificación genética que regula negativamente la producción endógena y/o actividad de un polipéptido implicado en importar ácidos grasos en los plástidos de la planta cuando se compara con una planta correspondiente que carece de la segunda modificación genética, y

c) una tercera modificación genética que regula negativamente la producción endógena y/o actividad de un polipéptido implicado en la producción de diacilglicerol (DAG) en el plástido cuando se compara con una planta correspondiente que carece de la tercera modificación genética.

En un aspecto, la planta transgénica, o parte de la misma, comprende

a) un primer polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido de factor de transcripción que incrementa la expresión de uno o más genes glucolíticos y/o de la biosíntesis de ácidos grasos en la planta, de manera preferente de un promotor diferente a un promotor constitutivo,

c) una modificación genética que regula negativamente la producción endógena y/o actividad de un polipéptido implicado en el catabolismo de triacilgliceroles (TAG) en la planta cuando se compara con una planta correspondiente que carece de la modificación genética, en donde cada polinucleótido exógeno se liga operablemente a un promotor que es capaz de dirigir la expresión del polinucleótido en la planta, y opcionalmente la planta, o parte de la misma, comprende además uno o más o todo de

e) un cuarto polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido que incrementa la exportación de ácidos grasos fuera de los plástidos de la planta cuando se compara con una planta correspondiente que carece del cuarto polinucleótido exógeno,

f) una segunda modificación genética que regula negativamente la producción endógena y/o actividad de un polipéptido implicado en importar ácidos grasos en los plástidos de la planta cuando se compara con una planta correspondiente que carece de la segunda modificación genética, y

g) una tercera modificación genética que regula negativamente la producción endógena y/o actividad de un polipéptido implicado en la producción de diacilglicerol (DAG) en el plástido cuando se compara con una planta correspondiente que carece de la tercera modificación genética.

En un aspecto, la parte es una parte vegetativa uno o más o todo de los promotores expresan en un nivel más alto en la parte vegetativa relacionada con la semilla de la planta.

En un aspecto, el polipéptido implicado en la biosíntesis de uno o más lípidos no polares es un DGAT o un PDAT y el polipéptido implicado en el catabolismo de TAG en la planta es una SDP1 lipasa.

En un aspecto, el polipéptido de factor de transcripción que incrementa la expresión de uno o más genes glucolíticos y/o de la biosíntesis de ácidos grasos en la planta es un polipéptido WRI1 y el polipéptido implicado en la biosíntesis de uno o más lípidos no polares es un DGAT o un PDAT.

En un aspecto, el polipéptido de factor de transcripción que incrementa la expresión de uno o más genes glucolíticos y/o de la biosíntesis de ácidos grasos en la planta es un polipéptido WRI1, un polipéptido LEC2, un polipéptido LEC1 o un polipéptido similar a LEC1 y el he polipéptido implicado en la biosíntesis de uno o más lípidos no polares es un DGAT.

En un aspecto, el polipéptido de factor de transcripción que incrementa la expresión de uno o más genes glucolíticos y/o de la biosíntesis de ácidos grasos en la planta es un polipéptido WRI1, un polipéptido LEC2, un polipéptido LEC1 o un polipéptido similar a LEC1 y el polipéptido implicado en el catabolismo de triacilgliceroles (TAG) en la planta es una SDP1 lipasa.

En un aspecto, el polipéptido de factor de transcripción que incrementa la expresión de uno o más genes glucolíticos y/o de la biosíntesis de ácidos grasos en la planta es un polipéptido WRI1, un polipéptido LEC2, un polipéptido LEC1 o un polipéptido similar a LEC1, el polipéptido implicado en la biosíntesis de uno o más lípidos no polares es un DGAT o un PDA<t>y el polipéptido implicado en el catabolismo de triacilgliceroles (TAG) en la planta es una SDP1 lipasa.

En un aspecto, cuando están presentes, los dos factores de transcripción son WRI1 y LEC2, o WRI1 y LEC1.

En los aspectos anteriores, se prefiere que la planta se desarrolle en el suelo o fue desarrollada en el suelo y la parte de la misma se cosechó subsecuentemente. De manera preferente, una parte vegetativa de la planta comprende al menos 8% de TAG sobre una base en peso (% de peso seco) tal como por ejemplo entre 8% y 75% o entre 8% y 30%. De manera más preferente, el contenido de TAG es al menos 10%, tal como por ejemplo entre 10% y 75% o entre 10% y 30%. De manera preferente, estos niveles de TAG están presentes en la parte vegetativa antes de o en el florecimiento de la planta o antes de la etapa de establecimiento de la semilla del desarrolla de la planta. En estos aspectos, se prefiere que la relación del contenido de TAG en las hojas al contenido de TAG en los tallos de la planta sea entre 1:1 y 10:1, y/o la relación se incremente con respecto a una célula correspondiente que comprende el primero y segundo polinucleótidos exógenos y que carece de la primera modificación genética.

En los aspectos anteriores, el contenido de lípidos no polares totales de la planta o parte de la misma es de manera preferente al menos 3%, de manera más preferente al menos 5% mayor, que el contenido de lípido no polares no totales en una planta correspondiente o parte de la misma transformada con genes que codifican un WRI1 y un DGAT pero que carecen de los otros polinucleótidos exógenos y modificaciones genéticas como se describe en la presente memoria. De manera más preferente, el grado de incremento es en los tejidos del tallo o raíz de la planta.

En los aspectos anteriores, se prefiere que la adición de uno o más polinucleótido exógenos o modificaciones genéticas, de manera preferente el polinucleótido exógeno que codifica el OBC o la ácido graso tioesterasa o la modificación genética que regula negativamente la producción endógena y/o actividad de un polipéptido implicado en el catabolismo de triacilgliceroles (TAG) en la célula, de manera más preferente el polinucleótido exógeno que codifica una LDAP o FATA tioesterasa o que disminuye la expresión de una TAG lipasa endógena tal como una SDP1 TAG lipasa en la célula, da por resultado un incremento sinérgico en el contenido de lípidos no polares total de la planta o parte de la misma cuando se agrega al par de transgenes WRI1 y DGAT, particularmente antes que la planta florezca y de manera aún más particular en el tejido del tallo y/o raíz de la planta. Por ejemplo, ver Ejemplos 8, 11 y 15. En un aspecto preferido, el incremento en el contenido de TAG de los tejidos de la hoja, tallo o raíz, o los tres, de la planta es al menos 2 veces, de manera más preferente al menos 3 veces, con respecto a una parte correspondiente transformada con genes que codifican WRI1 y DGAT1 pero que carecen del polinucleótido exógeno que codifica el OBC o la ácido graso tioesterasa y la modificación genética que regula negativamente la producción y/o actividad endógena de un polipéptido implicado en el catabolismo de triacilgliceroles (TAG) en la célula.

En los aspectos anteriores, la planta o parte de la misma comprende de manera preferente un segundo polinucleótido exógeno que codifica un DGAT y una primera modificación genética que regula negativamente la producción de una SDP1 lipasa endógena. De manera más preferente, la planta o parte de la misma no comprende un polinucleótido exógeno que codifica un PDAT, y/o es una planta o parte de la misma diferente deNicotiana benthamianay/oBrassica napus,y/o el WRI1 es un WRI1 diferente a WRI1 deArabidopsis thaliana(SEQ ID NOs:21 o 22). En un aspecto, la planta es diferente a la caña de azúcar. De manera más preferente, al menos uno de los polinucleótido exógenos en la planta se expresa de un promotor que no es un promotor constitutivo tal como, por ejemplo, un promotor que se expresa de manera preferente en tejidos verdes o tallos de la planta o que se regula positivamente después del inicio del florecimiento o durante la senescencia. De manera preferente al menos el primer polinucleótido exógeno (que codifica un factor de transcripción) se expresa de tal promotor.

En un octavo aspecto, la presente memoria describe una planta transgénica, o parte de la misma, de manera preferente una parre de planta vegetativa, que comprende

c) un tercer polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido de recubrimiento de cuerpo lipídico (OBC), de manera preferente un LDAP,

en donde cada polinucleótido exógeno se liga operablemente a un promotor que es capaz de dirigir la expresión del polinucleótido en la planta y en donde la planta tiene un nivel incrementado de uno o más lípido(s) no polar y/o una cantidad incrementada del polipéptido<o>B<c>, con respecto a una planta correspondiente que comprende un tercer polinucleótido exógeno cuya secuencia de nucleótidos es el complemento de la secuencia proporcionada como SEQ ID NO: 176.

En un aspecto preferido, la presencia del tercer polinucleótido exógeno que codifica el polipéptido OBC, junto con el primero y segundo polinucleótidos exógenos, incrementa el contenido de lípidos no polares total de la planta o parte de la misma, de manera preferente una parte vegetativa de la planta tal como una hoja, raíz o tallo, con respecto a una parte de planta correspondiente que comprende el primero y segundo polinucleótidos exógenos pero que carece del tercer polinucleótido exógeno. De manera más preferente, el incremento es sinérgico. De manera más preferente, al menos el promotor que dirige la expresión del primer polinucleótido exógeno es un promotor diferente a un promotor constitutivo.

En un aspecto del octavo aspecto, la planta, o parte de la misma comprende además uno o más o todo de

d) una primera modificación genética que regula negativamente la producción endógena y/o actividad de un polipéptido implicado en el catabolismo de triacilgliceroles (TAG) en la planta cuando se compara con una planta correspondiente que carece de la primera modificación genética,

En un aspecto, el polipéptido implicado en la biosíntesis de uno o más lípidos no polares es un DGAT o un PDAT y el polipéptido OBC es una oleosina.

Alternativamente, el polipéptido OBC es un LDAP.

En un aspecto, el polipéptido de factor de transcripción que incrementa la expresión de uno o más genes glucolíticos y/o de la biosíntesis de ácidos grasos en la planta es un polipéptido WRI1, un polipéptido LEC2, un polipéptido LEC1 o un polipéptido similar a LEC1 y el polipéptido OBC es una oleosina. Alternativamente, el polipéptido OC es un LDAP.

En un aspecto, el polipéptido de factor de transcripción que incrementa la expresión de uno o más genes glucolíticos y/o de la biosíntesis de ácidos grasos en la planta es un polipéptido WRI1, un polipéptido LEC2, un polipéptido LEC1 o un polipéptido similar a LEO, el polipéptido implicado en la biosíntesis de uno o más lípidos no polares es un DGAT o un PDA<t>y el polipéptido OBC es una oleosina. Alternativamente, el polipéptido OBC es un LDAP.

En un aspecto, la célula comprende dos polinucleótidos exógenos que codifican dos polipéptidos de factor de transcripción diferentes que incrementan la expresión de uno o más genes glucolíticos y/o de la biosíntesis de ácidos grasos en la planta, tal como WRI1 y LEC2, o W<r>I1 y LEC1.

En un noveno aspecto, la presente memoria describe una planta transgénica o parte de la misma, de manera preferente una parte vegetativa de la planta, que comprende un primer polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido de factor de transcripción que incrementa la expresión de uno o más genes glucolíticos y/o de la biosíntesis de ácidos grasos en la planta y uno o más o todo de;

a) un segundo polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido que incrementa la exportación de ácidos grasos fuera de los plástidos de la planta cuando se compara con una planta correspondiente que carece de segundo polinucleótido exógeno,

b) una primera modificación genética que regula negativamente la producción endógena y/o actividad de un polipéptido implicado en importar ácidos grasos en los plástidos de la planta cuando se compara con una planta correspondiente que carece de la primera modificación genética, y

c) una segunda modificación genética que regula negativamente la producción endógena y/o actividad de un polipéptido implicado en la producción de diacilglicerol (DAG) en el plástido cuando se compara con una planta correspondiente que carece de la segunda modificación genética, en donde cada polinucleótido exógeno se liga operablemente a un promotor que es capaz de dirigir la expresión del polinucleótido en la planta.

En un aspecto, la planta o parte de la misma, de manera preferente una parte vegetativa de la planta,comprende a) y opcionalmente b) o c).

En un aspecto del noveno aspecto, la planta, o parte de la misma, comprende además uno o más o todo de

e) una tercera modificación genética que regula negativamente la producción endógena y/o actividad de un polipéptido implicado en el catabolismo de triacilgliceroles (TAG) en la planta cuando se compara con una planta correspondiente que carece de la tercera modificación genética, y

En un aspecto preferido, la planta o parte de la misma, de manera preferente una parte vegetativa de la planta, comprende el primero, segundo y tercer polinucleótido exógenos y opcionalmente la tercera modificación genética o el cuarto polinucleótido exógeno.

En un aspecto preferido, la presencia del segundo polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido que incrementa la exportación de ácidos grasos fuera de los plástidos de la planta, que es de manera preferente una acil grasa tioesterasa tal como un polipéptido FATA, junto con el primero y, está presente, tercero polinucleótidos exógenos incrementa el contenido de lípidos no polares totales de la parte de la planta, de manera preferente una parte vegetativa de la planta tal como una hoja, raíz o tallo, con respecto a una parte de planta correspondiente que comprende el primero, si está presente, tercer polinucleótidos exógenos pero que carece del segundo polinucleótido exógeno. De manera más preferente, el incremento proporcionado por el polinucleótido exógeno es sinérgico. De manera más preferente, al menos el promotor que dirige la expresión del primero polinucleótido exógeno es un promotor diferente a un promotor constitutivo.

En un aspecto, el polipéptido de factor de transcripción que incrementa la expresión de uno o más genes glucolíticos y/o de la biosíntesis de ácidos grasos en la planta es un polipéptido WRI1, un polipéptido LEC2, un polipéptido LEC1 o un polipéptido similar a LEC1, y el polipéptido implicado en importar ácidos grasos en los plástidos de la célula es un polipéptido TGD.

En un aspecto, el polipéptido de factor de transcripción que incrementa la expresión de uno o más genes glucolíticos y/o de la biosíntesis de ácidos grasos en la planta es un polipéptido WRI1, un polipéptido LEC2, un polipéptido LEC1 o un polipéptido similar a LEC1, y el polipéptido implicado en la producción de diacilglicerol (DAG) es GPAT plastidial.

En un aspecto, el polipéptido de factor de transcripción que incrementa la expresión de uno o más genes glucolíticos y/o de la biosíntesis de ácidos grasos en la planta es un polipéptido WRI1, un polipéptido LEC2, un polipéptido LEC1 o un polipéptido similar a LEC1, el polipéptido que incrementa la exportación de ácidos grasos fuera de los plástidos de la planta es una ácido grasa tioesterasa, de manera preferente un polipéptido FATA o FATB, y el polipéptido implicado en importar ácidos grasos en los plástidos de la planta es un polipéptido TGD.

En un aspecto, el polipéptido de factor de transcripción que incrementa la expresión de uno o más genes glucolíticos y/o de la biosíntesis de ácidos grasos en la planta es un polipéptido WRI1, un polipéptido LEC2, un polipéptido LEC1 o un polipéptido similar a LEC1, el polipéptido que incrementa la exportación de ácidos grasos fuera de los plástidos de la planta es una ácido grasa tioesterasa, de manera preferente un polipéptido FATA o FATB, y el polipéptido implicado en la producción de diacilglicerol (DAG) es un GPAT plastidial.

En un aspecto, el polipéptido de factor de transcripción que incrementa la expresión de uno o más genes glucolíticos y/o de la biosíntesis de ácidos grasos en la planta es un polipéptido WRI1, un polipéptido LEC2, un polipéptido LEC1 o un polipéptido similar a LEC1, el polipéptido implicado en importar ácidos grasos en los plástidos de la planta es un polipéptido TGD, y el polipéptido implicado en la producción de diacilglicerol (DAG) es un GPAt plastidial.

En un aspecto, la planta comprende dos polinucleótido exógenos que codifican dos polipéptidos de factor de transcripción diferentes que incrementan la expresión de uno o más genes glucolíticos y/o de la biosíntesis de ácidos grasos en la célula, tal como WRI1 y LEC2, o W<r>I1 y LEC1.

En algunos aspectos del séptimo, octavo y noveno aspecto, cuando la planta comprende un polinucleótido exógeno que codifica una ácidos graso tioesterasa tal como, por ejemplo, un polipéptido FATA o FATB, la tioesterasa es de manera preferente un polipéptido FATA o una ácido graso transferasa diferente a una ácido graso tioesterasa de cadena medial.

Es un décimo aspecto, la presente memoria describe una planta transgénica, o parte de la misma, de manera preferente una parte vegetativa, que comprende

a) un primer polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido de factor de transcripción que incrementa la expresión de uno o más genes glucolíticos y/o de la biosíntesis de ácidos grasos en la planta, de manera preferente un factor de transcripción WRI,

c) un tercer polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido que incrementa la exportación de ácidos grasos C8 a C14 fuera de los plástidos de la planta cuando se compara con una planta correspondiente que carece del tercer polinucleótido exógeno,

En un aspecto preferido, la presencia del tercer polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido que incrementa la exportación de ácidos grasos C8 a C14 fuera de los plástidos de la planta, junto con el primero y segundo polinucleótidos exógenos incrementa el contenido de MCFA total de la parte de la planta, de manera preferente una parte vegetativa de la planta tal como una hoja, raíz o tallo, con respecto a una parte de planta correspondiente que comprende el primero y segundo polinucleótido exógenos pero que carece del tercer polinucleótido exógeno. De manera más preferente, el incremento proporcionado por el tercer polinucleótido exógeno es sinérgico. De manera más preferente, al menos el promotor que dirige la expresión del primer polinucleótido exógeno es un promotor diferente a un promotor constitutivo.

En un aspecto del décimo aspecto, la planta transgénica o parte de la misma comprende además uno o más o todo de;

e) una primera modificación genética que regula negativamente la producción endógena y/o actividad de un polipéptido implicado en el catabolismo de triacilgliceroles (TAG) en la planta cuando se compara con una planta correspondiente que carece de la primera modificación genética,

g) una segunda modificación genética que regula negativamente la producción endógena y/o actividad de un polipéptido implicado en importar ácidos grasos en los plástidos de la planta cuando se compara con una planta correspondiente que carece de la segunda modificación genética, y

h) una tercera modificación genética que regula negativamente la producción endógena y/o actividad de un polipéptido implicado en la producción de diacil glicerol (DAG) en el plástido cuando se compara con una planta correspondiente que carece de la tercera modificación genética, en donde cada polinucleótido exógeno se liga operablemente a un promotor que es capaz de dirigir la expresión del polinucleótido en la planta.

En un aspecto del décimo aspecto, el factor de transcripción no es WRI1 deArabidopsis thaliana(SEQ ID NOs:21 o 22), y/o la planta no esN. benthamiana.

En un aspecto del décimo aspecto, el polinucleótido exógeno que codifica el LPAAT comprende aminoácidos cuya secuencia se expone como SEQ ID NO:200, o un fragmento biológicamente activo de la misma o un polipéptido LPAAT cuya secuencia de aminoácidos es al menos 30% idéntica a la misma.

En un aspecto del décimo aspecto, uno o más o todo de los promotores expresan en un nivel más alto en la parte vegetativa relacionada con la semilla de la planta, de manera preferente que incluye de manera preferente al menos el promotor que expresa el primer polinucleótido exógeno.

En un aspecto del décimo aspecto, el ácido graso dentro de una longitud de cadena media es al menos ácido mirístico (C14:0). En un aspecto preferido, la parte de la planta, de manera preferente una parte vegetativa de la planta, comprende un contenido de ácido mirístico de al menos aproximadamente 8%, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 11%, al menos aproximadamente 12%, al menos aproximadamente 15%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 25%, entre 8% y 25%, entre 8% y 20%, entre 10% y 25%, entre 11% y 25%, entre aproximadamente 15% y 25%, entre aproximadamente 20% y 25%, (p/p de peso seco).

En los aspectos del sexto, séptimo, octavo, noveno y décimo aspecto, se prefiere que la planta se desarrolle en el suelo o se desarrolló en el suelo y la parte de la planta, de manera preferente parte de la vegetativa, se cosechó subsecuentemente, y en donde la parte de la planta comprende al menos 8% de tAg sobre una base en peso (% de peso seco) tal como por ejemplo entre 8% y 75% o entre 8% y 30%. De manera más preferente, el contenido de TAG es al menos 10%, tal como por ejemplo entre 10% y 75% o entre 10% y 30%. De manera preferente, estos niveles de TAG están presentes en la parte vegetativa antes de o en la floración de la planta o antes de la etapa de establecimiento de la semilla del desarrollo de la planta. En estos aspectos, se prefiere que la relación del contenido de TAG en las hojas al contenido de TAG en los tallos de las plantas sea entre 1:1 y 10:1, y/o la relación se incremente con respecto a una célula correspondiente que comprende el primero y segundo polinucleótidos exógenos y que carece de la primera modificación genética.

En los aspectos del sexto, séptimo, octavo, noveno y décimo aspecto, la planta o parte de la misma comprende de manera preferente un polinucleótido exógeno que codifica un d Ga T y una modificación genética que regula negativamente la producción de una SDP1 lipasa endógena. En un aspecto preferido, la planta o parte de la misma no comprende un polinucleótido exógeno que codifica un PDAT, y/o es una planta diferente a una planta deNicotiana benthamiana.De manera más preferente, al menos uno de los polinucleótido exógenos en la planta o parte de la misma se expresa de n promotor que no es un promotor consecutivo tal como, por ejemplo, un promotor expresado de manera preferente en los tejidos verdes o tallos de la planta o que se regula positivamente durante la senescencia.

En un decimoprimer aspecto, la presente memoria describe una planta que comprende una parte vegetativa, o la parte vegetativa de la misma, en donde la parte vegetativa tiene un contenido de lípidos no polares totales de al menos aproximadamente 18%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, entre 18% y 75%, entre aproximadamente 20% y 75%, entre aproximadamente 30% y 75%, entre aproximadamente 40% y 75%, entre aproximadamente 50% y 75%, entre aproximadamente 60% y 75%, o entre aproximadamente 25% y 50% (p/p de peso seco), en donde el lípido no polar comprende al menos 90% triacilgliceroles (TAG).

En aspectos preferidos, la parte de planta vegetativa se caracteriza por aspectos como se describen en el séptimo, octavo, noveno y décimo aspectos. La planta es de manera preferente una planta 18:3.

En un aspecto de los aspectos anteriores, la célula de planta o parte de la planta se han tratado para ya no ser capaces de ser propagados o de dar origen a una planta viva, es decir, se muere. Por ejemplo, la célula de planta o parre de la planta se ha secado y/o se ha sembrado.

En un decimosegundo aspecto, la presente memoria describe una planta que comprende una parte vegetativa, o la parte vegetativa de la misma, en donde la parte vegetativa tiene as un contenido de TAG de al menos aproximadamente 18%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, entre 18% y 75%, entre aproximadamente 20% y 75%, entre aproximadamente 30% y 75%, entre aproximadamente 40% y 75%, entre aproximadamente 50% y 75%, entre aproximadamente 60% y 75%, o entre aproximadamente 25% y 50% (p/p de peso seco), en donde el lípido no polar comprende al menos 90% de triacilgliceroles (TAG). La planta es de manera preferente una planta 18:3.

En un decimotercer aspecto, la presente memoria describe una planta que comprende una parte vegetativa, o la parte vegetativa de la misma, en donde la parte vegetativa tiene un contenido de lípidos no polares totales de al menos 8%, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 1 1%, al menos aproximadamente 12%, al menos aproximadamente 15%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, entre 8% y 75%, entre 10% y 75%, entre 11% y 75%, entre aproximadamente 15% y 75%, entre aproximadamente 20% y 75%, entre aproximadamente 30% y 75%, entre aproximadamente 40% y 75%, entre aproximadamente 50% y 75%, entre aproximadamente 60% y 75%, o entre aproximadamente 25% y 50% (p/p de peso seco), en donde el lípido no polar comprende al menos 90% de triacilgliceroles (TAG), y en donde la planta es una planta 16:3 o parte vegetativa de la misma.

En un decimocuarto aspecto, la presente memoria describe una planta que comprende una parte vegetativa, o la parte vegetativa de la misma, en donde la parte vegetativa tiene un contenido de TAG de al menos 8%, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 11%, al menos aproximadamente 12%, al menos aproximadamente 15%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, entre 8% y 75%, entre 10% y 75%, entre 11% y 75%, entre aproximadamente 15% y 75%, entre aproximadamente 20% y 75%, entre aproximadamente 30% y 75%, entre aproximadamente 40% y 75%, entre aproximadamente 50% y 75%, entre aproximadamente 60% y 75%, o entre aproximadamente 25% y 50% (p/p de peso seco), en donde lípido no polar comprende al menos 90% de triacilgliceroles (TAG), y en donde la planta es una planta 16:3 o parte vegetativa de la misma.

En un aspecto, la célula como se describe en la presente memoria (incluyendo el segundo, tercero, cuarto y quinto aspectos) es una célula de las siguientes especies o géneros, o la planta o parte de la misma como se describe en la presente memoria (incluyendo el sexto, séptimo, octavo, noveno, décimo, decimoprimer, decimosegundo, decimotercer y decimocuarto aspectos) esAcrocomia aculeata(palma macauba),Arabidopsis thaliana, Aracinis hypogaea(cacahuate),Astrocaryum murumuru(murumuru),Astrocaryum vulgare(tucuma),Attalea geraensis(Indaia-rateiro),Attalea humilis(palma de aceite Americana),Attalea oleifera(andaia),Attalea phalerata(uricuri),Attalea speciosa(babasú),Avena sativa(avena),Beta vulgaris(remolacha azucarera),Brassicasp., tal como, por ejemplo,Brassica carinata, Brassica juncea, Brassica napobrassica, Brassica napus(canola),Camelina sativa(lino falso),Cannabis sativa(chemp),Carthamus tinctorius(cártamo),Caryocar brasiliense(pequi),Cocos nucifera(Coco),Crambe abyssinica(Abyssinian kale),Cucumis melo(melón),Elaeis guineensis(palma africana),Glycine max(soja),Gossypium hirsutum(algodón),Helianthussp., tal comoHelianthus annuus(cártamo),Hordeum vulgare(cebada),Jatropha curcas(nuez física),Joannesia princeps(árbol de nuez arara),Lemnasp. (lenteja de agua) tal comoLemna aequinoctialis, Lemna disperma, Lemna ecuadoriensis, Lemna gibba(lenteja de agua hinchada),Lemna japonica, Lemna minor, Lemna minuta, Lemna obscura, Lemna paucicostata, Lemna perpusilla, Lemna tenera, Lemna trisulca, Lemna turionifera, Lemna valdiviana, Lemna yungensis, Licania rigida(oiticica),Linum usitatissimum(lino),Lupinus angustifolius(lupino),Mauritia flexuosa(palma buriti),Maximiliana maripa(palma inaja),Miscanthus sp.,tal comoMiscanthus x giganteusyMiscanthus sinensis, Nicotianasp. (tabaco) tal comoNicotiana tabacumoNicotiana benthamiana, Oenocarpus bacaba(bacaba-do-azeite),Oenocarpus bataua(pataua),Oenocarpus distichus(bacaba-de-leque),Oryzasp. (arroz) tal comoOryza sativayOryza glaberrima, Panicum virgatum(césped de pradera),Paraqueiba paraensis(mari),Per sea amencana(aguacate),Pongamia pinnata(haya india),Populus trichocarpa, Ricinus communis(ricino),Saccharum sp.(caña de azúcar),Sesamum indicum(ajonjolí),Solanum tuberosum(papa),Sorghumsp. tal comoSorghum bicolor, Sorghum vulgare, Theobroma grandiforum(cupuassu),Trifolium sp., Trithrinax brasiliensis(palma de aguja brasileña),Triticumsp. (trigo) tal comoTriticum aestivumyZea mays(maíz).

En un decimoquinto aspecto, la presente memoria describe una planta de papa, o parte de la misma de manera preferente un tubérculo que tiene un diámetro de al menos 2cm, y tiene un contenido de TAG de al menos 0.5% sobre una base de peso seco y/o un contenido de ácido graso total de al menos 1%, de manera preferente al menos 1.5% o al menos 2.0%, sobre una base de peso seco. El tubérculo de patata tiene de manera preferente un nivel incrementado de ácidos grasos monoinsaturados (MUFA) y/o un nivel más bajo de ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) en tanto el contenido de ácido graso total como en la fracción de TAG del contenido de ácidos grasos total, tal como un nivel incrementado de ácido oleico y un nivel reducido de ALA, cuando se compara con un tubérculo de patata correspondiente que carece de las modificaciones genéticas y/o polinucleótido(s) exógeno. De manera preferente, el nivel Al a en el contenido de ácidos grasos total del tubérculo se reduce a menor que 10% y/o el nivel de ácido oleico en el contenido de ácido graso total se incrementa a al menos 5%, de manera preferente al menos 10% o de manera más preferente al menos 15%, cuando se compara con un tubérculo de patata correspondiente que carece de las modificaciones genéticas y/o polinucleótido(s) exógeno. Además, en un aspecto el nivel de ácido palmítico en el contenido de ácidos grasos total del tubérculo se incrementa y/o los niveles de ácido esteárico (18:0) disminuye en el contenido de ácidos grados total del tubérculo, cuando se compara con un tubérculo de patata correspondiente que carece de las modificaciones genéticas y/o polinucleótido(s) exógeno. En un aspecto, el contenido de almidón del tubérculo es entre aproximadamente 90% y 100% sobre una base en peso con respecto a un tubérculo de tipo silvestre cuando se desarrolla bajo las mismas condiciones.

En un aspecto, la planta de papa, o parte de la misma de manera preferente un tubérculo, como se describe en la presente memoria comprende

a) un primer polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido de factor de transcripción que incrementa la expresión de uno o más genes glucolíticos y/o de la biosíntesis de ácidos grasos en el tubérculo, y

b) un segundo polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido implicado en la biosíntesis de uno o más lípidos no polares,

en donde cada polinucleótido exógeno se liga operablemente a un promotor que es capaz de dirigir la expresión del polinucleótido en el tubérculo durante el crecimiento de la planta de papa.

En un aspecto preferido, el tubérculo de patata comprende además uno o más o todo de

d) una primera modificación genética que regula negativamente la producción endógena y/o actividad de un polipéptido implicado en el catabolismo de triacilgliceroles (TAG) en el tubérculo cuando se compara con un tubérculo de correspondiente que carece de la primera modificación genética, por ejemplo, donde el polipéptido es SDP1, e) un cuarto polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido que incrementa la exportación de ácidos grasos fuera de los plástidos del tubérculo cuando se compara con un tubérculo correspondiente que carece del cuarto polinucleótido exógeno,

f) una segunda modificación genética que regula negativamente la producción endógena y/o actividad de un polipéptido implicado en importar ácidos grasos en los plástidos del tubérculo cuando se compara con un tubérculo correspondiente que carece de la segunda modificación genética, y

g) una tercera modificación genética que regula negativamente la producción endógena y/o actividad de un polipéptido implicado en la producción de diacilglicerol (DAG) en plástidos del tubérculo cuando se compara con un tubérculo correspondiente que carece de la tercera modificación genética.

En aspectos adicionales, las modificaciones genéticas adicionales en el tubérculo son como se definen en el contexto de una célula o planta como se describe en la presente memoria.

En un decimosexto aspecto, la presente memoria describe planta de sorgo o caña de azúcar, o parte de la misma de manera preferente un tallo o una hoja, que tiene un contenido de ácido graso total de al menos 6% o al menos 8% sobre una base de peso seco y/o un contenido de TAG en el tallo de al menos 2% o al menos 3% sobre una base de peso seco y/o tiene un incremento en el contenido de TAG de al menos 50 veces en el tallo y/o al menos 100 veces en la hoja sobre una base en peso. En aspectos, la planta de sorgo o caña de azúcar, o parte de la misma de manera preferente un tallo o una hoja, se caracteriza por los aspectos como se definen en el contexto de una célula o planta o parte de la misma como se describe en la presente memoria.

En un decimoséptimo aspecto, la presente memoria describe planta de sorgo o caña de azúcar, o parte de la misma de manera preferente un tallo u hoja, que comprende

a) un primer polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido de factor de transcripción que incrementa la expresión de uno o más genes glucolíticos y/o de la biosíntesis de ácidos grasos en la planta o parte de la misma, y b) un segundo polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido implicado en la biosíntesis de uno o más lípidos no polares, en donde cada polinucleótido exógeno se liga operablemente a un promotor que es capaz de dirigir la expresión del polinucleótido en la planta o parte de la misma durante el crecimiento de la planta.

De manera preferente, el promotor que dirige la expresión de al menos el primer polinucleótido exógeno es un promotor diferente a un promotor de ubiquitina de arroz (Rubi3). De manera más preferente, el promotor no es un promotor de ubiquitina o cualquier otro promotor constitutivo. De manera preferente, el primer y segundo polinucleótidos exógenos y sus promotores respectivos se ligan en un constructo genético que se integra en el genoma de planta.

En un aspecto, el contenido de azúcar del tallo de la caña de azúcar es entre aproximadamente 70% y 100% sobre una base en peso con respecto a un tallo de caña de azúcar de tipo silvestre cuando se desarrolla bajo las mismas condiciones. Alternativamente, el contenido de azúcar es entre 50% y 70%.

En un aspecto, la planta de sorgo o caña de azúcar, o parte de la misma de manera preferente un tallo u hoja, como se describe en la presente memoria comprende

a) un primer polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido de factor de transcripción que incrementa la expresión de uno o más genes glucolíticos y/o de la biosíntesis de ácidos grasos en el tallo(s) de la planta, y

en donde al menos uno de los polinucleótidos exógenos, de manera preferente al menos el primer polinucleótido exógeno, se liga operablemente a un promotor que se expresa de manera preferente en el tallo(s) con respecto a las hojas durante el crecimiento de la planta.

En un aspecto, la planta de sorgo o caña de azúcar o parte de la misma como se describe en la presente memoria comprende además uno o más o todo de

d) una primera modificación genética que regula negativamente la producción endógena y/o actividad de un polipéptido implicado en el catabolismo de triacilgliceroles (TAG) en la planta o parte de la misma cuando se compara con una planta correspondiente o parte de la misma que carece de la primera modificación genética,

e) un cuarto polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido que incrementa la exportación de ácidos grasos fuera de los plástidos de la planta o parte de la misma cuando se compara con una planta correspondiente o parte de la misma que carece del cuarto polinucleótido exógeno,

f) una segunda modificación genética que regula negativamente la producción endógena y/o actividad de un polipéptido implicado en importar ácidos grasos en los plástidos de la planta o parte de la misma cuando se compara con una planta correspondiente o parte de la misma que carece de la segunda modificación genética, y

g) una tercera modificación genética que regula negativamente la producción endógena y/o actividad de un polipéptido implicado en la producción de diacilglicerol (DAG) en los plástidos de la planta o parte de la misma cuando se compara con una planta correspondiente o parte de la misma que carece de la tercera modificación genética.

La planta de sorgo o caña de azúcar o parte de la misma como se describe en la presente memoria tiene de manera preferente un nivel incrementado de ácidos grasos monoinsaturados (MUFA) y/o un nivel más bajo de ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) en tanto el contenido de ácidos grasos total como en la fracción TAG del contenido de ácidos grasos total, tal como un nivel incrementado de ácido oleico y un nivel reducido de ALA, cuando se compara con una planta correspondiente o parte de la misma que carece de modificaciones genéticas y/o polinucleótido(s) exógeno.

De manera preferente, el nivel de ALA en contenido de ácido graso total es menor que 10% y/o el nivel de ácido oleico en el contenido de ácido graso total es al menos 5%, de manera preferente al menos 10% o de manera más preferente al menos 15%, cuando se compara con una planta correspondiente o parte de la misma que carece de las modificaciones genéticas y/o polinucleótido(s) exógeno.

En aspectos adicionales, las modificaciones genéticas adicionales en la planta de sorgo o caña de azúcar o parte de la misma son como se definen en el contexto de una célula o planta como se describe en la presente memoria.

En un decimoctavo aspecto, la presente memoria describe una planta monocotiledónea transgénica, o parte de la misma de manera preferente una hoja, un grano, un tallo, una raíz o un endospermo, que tiene un contenido de ácido graso total o contenido de TAG que se incrementa al menos 5 veces sobre una base en peso cuando se compara con plantas monocotiledóneas no transgénicas correspondientes, o parte de la misma. Alternativamente, la memoria describe una planta monocotiledónea transgénica cuyo endospermo tiene un contenido de TAG que es al menos 2.0%, de manera preferente al menos 3%, de manera más preferente al menos 4% o al menos 5%, sobre una base en peso, o parte de la planta, de manera preferente una hoja, un tallo, una raíz, un grano o un endospermo. En un aspecto, el endospermo tiene un contenido de TAG de al menos 2% que se incrementa al menos 5 veces con respecto a un endospermo no transgénico correspondiente. De manera preferente, la planta es completamente fértil masculina y femenina, su polen es esencialmente 100% viable, y su grano tiene una velocidad de germinación que es entre 70% y 100% con respecto al grano de tipo silvestre correspondiente. En un aspecto, la planta transgénica es una planta de progenie de al menos dos generaciones derivadas de una planta de trigo transgénica inicial, y es de manera preferente homocigota para los transgenes. En los aspectos, la planta monocotiledónea, o parte de la misma de manera preferente una hoja, tallo, grano o endospermo, se caracteriza adicionalmente por una o más características como se define en el contexto de una célula o planta como se describe en la presente memoria.

En un decimonoveno aspecto, la presente memoria describe una planta monocotiledónea, o parte de la misma de manera preferente una hoja, un grano, talo o un endospermo, que comprende

a) un primer polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido de factor de transcripción que incrementa la expresión de uno o más genes glucolíticos y/o de la biosíntesis de ácidos grasos en la planta o parte de la misma, y b) un segundo polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido implicado en la biosíntesis de uno o más lípidos no polares,

en donde cada polinucleótido exógeno se liga operablemente a un promotor que es capaz de dirigir la expresión del polinucleótido en la planta o parte de la misma durante el crecimiento de la planta.

De manera preferente, el promotor que dirige la expresión de al menos el primer polinucleótido exógeno es un promotor diferente a un promotor constitutivo.

En un aspecto, el contenido de almidón del grano de una planta monocotiledónea como se describe en la presente memoria es entre aproximadamente 70% y 100% sobre una base en peso con respecto a un grano de tipo silvestre cuando las plantas de los cuales se obtienen se desarrollan bajo las mismas condiciones. Las plantas monocotiledóneas preferidas en los dos aspectos anteriores son trigo, arroz, sorgo y maíz (mazorca de maíz).

En un aspecto, la planta monocotiledónea, o parte de la misma, de manera preferente una hoja, un grano o endospermo, como se describe en la presente memoria comprende

a) un primer polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido de factor de transcripción que incrementa la expresión de uno o más genes glucolíticos y/o de la biosíntesis de ácidos grasos en el endospermo de la planta, y b) un segundo polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido implicado en la biosíntesis de uno o más lípidos no polares,

en donde al menos uno de los polinucleótidos exógenos, de manera preferente al menos el primer polinucleótido exógeno, se liga operablemente a un promotor que se expresa en un mayor nivel en el endospermo con respecto a las hojas durante el crecimiento de la planta.

En un aspecto preferido, la planta monocotiledónea o parte de la misma comprende además uno o más o todo de

d) una primera modificación genética que regula negativamente la producción endógena y/o actividad de un polipéptido implicado en el catabolismo de triacilgliceroles (TAG) en la planta o parte de la misma cuando se compara con una planta correspondiente o parte de la misma que carece la primera modificación genética,

e) un cuarto polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido que incrementa la exportación de ácidos grasos fuera de los plástidos de la planta o parte de la misma cuando se compara con una planta correspondiente o parte de la misma que carece del cuarto polinucleótido exógeno, f) una segunda modificación genética que regula negativamente la producción endógena y/o actividad de un polipéptido implicado en importar ácidos grasos en los plástidos de la planta o parte de la misma cuando se compara con una planta correspondiente o parte de la misma que carece la segunda modificación genética, y

En un aspecto, la planta monocotiledónea comprende las características a), b), una o ambos de d) y e), y opcionalmente una de c), f) y g).

La planta monocotiledónea, o parte de la misma de manera preferente una hoja, un grano, tallo o un endospermo como se describe en la presente memoria tiene de manera preferente un nivel incrementado de ácidos grasos monoinsaturados (MUFA) y/o un nivel más bajo de ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) en tanto el contenido de ácidos grasos total como en la fracción de TAG del contenido de ácidos grasos total, tal como por ejemplo un nivel incrementado de ácido oleico y un nivel reducido de LA (18:2), cuando se compara con una planta correspondiente o parte de la misma que carece de las modificaciones genéticas y/o polinucleótido(s) exógeno.

De manera preferente, el nivel de ácido linoléico (LA, 18:2) en el contenido de ácidos grasos total del grano o endospermo se reduce por al menos 5% y/o el nivel de ácido oleico en el contenido de ácidos grasos total se incrementa por al menos 5% con respecto a una planta de tipo silvestre correspondiente o parte de la misma, de manera preferente al menos 10% o de manera más preferente al menos 15%, cuando se compara con una planta correspondiente o parte de la misma que aparece de las modificaciones genéticas y/o polinucleótido(s) exógeno.

Los siguientes aspectos aplican a cada una de las plantas y plantas de las mismas de decimoquinto, decimosexto, decimoséptimo, decimoctavo y decimonoveno aspecto.

En un aspecto, el polipéptido de factor de transcripción que incrementa la expresión de uno o más genes glucolíticos y/o de la biosíntesis de ácidos grasos en la planta o parte de la misma es un polipéptido WRI1 y el polipéptido implicado en la biosíntesis de uno o más lípidos no polares es un DGAT o un PDAT.

En un aspecto, el polipéptido de factor de transcripción que incrementa la expresión de uno o más genes glucolíticos y/o de la biosíntesis de ácidos grasos en la planta o parte de la misma es un polipéptido WRI1, un polipéptido LEC2, un polipéptido LEC1 o un polipéptido similar LEC1 y el polipéptido OBC es una oleosina. Alternativamente, el polipéptido o Bc es un LDAP.

En un aspecto, el polipéptido de factor de transcripción que incrementa la expresión de uno o más genes glucolíticos y/o de la biosíntesis de ácidos grasos en la planta o parte de la misma es un polipéptido WRI1, un polipéptido LEC2, un polipéptido LEC1 o un polipéptido similar a LEC1, el polipéptido implicado en la biosíntesis de uno o más lípidos no polares es un DGAT o un PDAT y el polipéptido OBC es una oleosina. Alternativamente, el polipéptido OBC es un LDAP.

En un aspecto, la planta o parte de la misma comprende dos polinucleótidos exógenos que codifican dos polipéptidos de factor del factor de transcripción diferentes que incrementa la expresión de uno o más genes glucolíticos y/o de la biosíntesis de ácidos grasos en la célula, tal como WRI1 y LEC2, o WRI1 y LEC1.

En cada uno de los aspectos de las células, plantas y partes de las mismas como se describe en la presente memoria (incluyendo el segundo, tercero, cuarto, quinto, sexto, séptimo, octavo, noveno, décimo, decimoprimero, decimosegundo, decimotercero, decimocuarto, decimoquinto, decimoprimero, decimosegundo, decimotercero, decimocuarto, decimoquinto decimosexto, decimoséptimo, decimoctavo y decimonoveno aspecto), se prefiere que el polipéptido de factor de transcripción que incrementa la expresión de uno o más genes glucolíticos y/o de la biosíntesis de ácidos grasos en la célula es un polipéptido WRI1, un polipéptido LEC2, un polipéptido LEC1 o un polipéptido similar a LEC1, el polipéptido implicado en la biosíntesis de uno o más lípidos no polares es un DGAT o un PDA<t>y el polipéptido implicado en el catabolismo de triacilgliceroles (TAG) en la célula es una SDP1 lipasa.

En cada uno de las aspectos de las células, plantas y partes de las mismas como se describe en la presente memoria (incluyendo el segundo, tercero, quinto, sexto, séptimo, octavo, décimo, decimoprimero, decimosegundo, decimotercero, decimocuarto, decimoquinto, decimosexto, decimoséptimo, decimoctavo y decimonoveno aspectos, pero excluyendo el quinto y décimo aspecto), se prefiere que la el polipéptido de factor de transcripción que incrementa la expresión de uno o más genes glucolíticos y/o de la biosíntesis de ácidos grasos en la célula sea un polipéptido WRJ1, un polipéptido LEC2, un polipéptido LEC1 o un polipéptido similar a LEC1, el polipéptido implicado en la biosíntesis de uno o más lípidos no polares es un DGAT o un PDAT y el polipéptido que incrementa la exportación de ácidos grasos fuera de los plástidos de la célula es una ácido grasa tioesterasa, de manera preferente un polipéptido FATA o FATB, de manera más preferente un polipéptido FATA o una ácido graso tioesterasa diferente a una ácido graso tioesterasa de cadena media.

En cada uno de los aspectos anteriores de la células, plantas y partes de las mismas como se describe en la presente memoria (incluyendo el segundo, tercero, cuarto, quinto, sexto, séptimo, octavo, noveno, décimo, decimoprimero, decimosegundo, decimotercero, decimocuarto, decimoquinto, decimosexto decimoséptimo, decimoctavo y decimonoveno aspecto), se prefiere que el polipéptido de factor de transcripción que incrementa la expresión de uno o más genes glucolíticos y/o de la biosíntesis de ácidos grasos en la planta o parte de la misma se una combinación de al menos dos polipéptidos, de manera preferente un polipéptido WRI1 y un polipéptido LEC2. De manera más preferente, al menos dos polipéptidos de factor de transcripción se expresan de diferentes promotores. De manera más preferente, los polinucleótidos exógenos que codifican al menos dos polipéptidos se ligan en un constructo genético individual integrado en la célula o genoma de planta.

En cada uno de los aspectos anteriores, cuando la planta es una planta dicotiledónea, el factor de transcripción puede ser un factor de transcripción de planta monocotiledónea. A la inversa, cuando la planta es una planta monocotiledónea, el factor de transcripción puede ser un factor de transcripción de planta dicotiledónea. El factor de transcripción es de manera preferente un factor de transcripción diferente a WRI1 deA. thaliana(SEQ ID NOs: 21 o 22).

En cada uno de los aspectos anteriores, se prefiere que la planta sea una planta de progenie transgénica de al menos dos generaciones derivadas de una planta transgénica inicial, y es de manera preferente homocigota para los transgenes.

En aspectos adicionales, las modificaciones genéticas adicionales en la planta o parte de la misma son como se definen en el contexto de una célula como se describe en la presente memoria.

En un aspecto, una planta, o parte de la misma, como se describe en la presente memoria (incluyendo el sexto, séptimo, octavo, noveno, décimo, decimoprimero, decimosegundo, decimotercero, decimocuarto, decimoquinto, decimosexto decimoséptimo, decimoctavo y decimonoveno aspecto) tiene uno o más o todas las siguientes características (donde sea aplicable);

i) la planta comprende una parte, de manera preferente una parte vegetativa, que tiene una síntesis incrementada de ácidos grasos totales con respecto a una parte correspondiente que carece del primer polinucleótido exógeno, o un catabolismo disminuido de ácidos grasos totales con respecto a una parte correspondiente que carece el primer polinucleótido exógeno, o ambos, tal que tiene un nivel incrementado de ácidos grasos totales con respecto a una parte correspondiente que carece el primer polinucleótido exógeno,

ii) la planta comprende una parte, de manera preferente una parte vegetativa, que tiene una expresión incrementada y/o actividad de una acil-graso aciltransferasa que cataliza la síntesis de TAG, DAG o MAG, de manera preferente TAG, con respecto a una parte correspondiente que tiene el primer polinucleótido exógeno y que carece del polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido implicado en la biosíntesis de uno o más lípidos no polares, iii) la planta comprende una parte, de manera preferente una parte vegetativa, que tiene una distribución disminuida de ácido lisofosfatídico (LPA) de acil-ACP y G3P en sus plástidos con respecto a una parte correspondiente que tiene el primer polinucleótido exógeno y que carece de la modificación genética que regula negativamente la producción endógena y/o actividad de un polipéptido implicado en la producción de diacilglicerol (DAG) en los plástido en la parte de la planta,

iv) la planta comprende una parte, de manera preferente una parte vegetativa, que tiene una relación alterada de ácidos grasos C16:3 a C18:3 en su contenido de ácido graso total y/o su contenido de galactolípidos con respecto a una parte correspondiente que carece del polinucleótido(s) exógeno y/o modificación(es) genética, de manera preferente una relación disminuida.

v) una parte vegetativa de la planta comprende un contenido de lípidos no polares totales de al menos aproximadamente 8%, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 11%, al menos aproximadamente 12%, al menos aproximadamente 15%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, entre 8% y 75%, entre 10% y 75%, entre 11% y 75%, entre aproximadamente 15% y 75%, entre aproximadamente 20% y 75%, entre aproximadamente 30% y 75%, entre aproximadamente 40% y 75%, entre aproximadamente 50% y 75%, entre aproximadamente 60% y 75%, o entre aproximadamente 25% y 50% (p/p de peso seco), de manera preferente antes del florecimiento,

vi) una parte vegetativa de la planta comprende un contenido de TAG de al menos aproximadamente 8%, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 11%, al menos aproximadamente 12%, al menos aproximadamente 15%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, entre 8% y 75%, entre 10% y 75%, entre 1 1% y 75%, entre aproximadamente 15% y 75%, entre aproximadamente 20% y 75%, entre aproximadamente 30% y 75%, entre aproximadamente 40% y 75%, entre aproximadamente 50% y 75%, entre aproximadamente 60% y 75%, o entre aproximadamente 25% y 50% (p/p de peso seco), de manera preferente antes del florecimiento,

vii) el polipéptido(s) de factor de transcripción se selecciona del grupo que consiste de WRI1, LEC1, LEC1-like, LEC2,B<m>, FUS3, ABI3, ABI4, ABI5, Dof4 y Dof11, de manera preferente WRI1, LEC1 o LEC2, o el grupo que consiste de MYB73, bZIP53, AGL15, MYB115, MYB118, TANMEI, WUS, GFR2a1, GFR2a2 y PHR1,

viii) el ácido oleico comprende al menos 20% (% en mol), al menos 22% (% en mol), al menos 30% (% en mol), al menos 40% (%en mol), al menos 50% (%en mol), o al menos 60% (% en mol), de manera preferente aproximadamente 65% (%en mol) o entre 20% y aproximadamente 65% del contenido de ácido graso total en la planta, o parte de la misma,ix) lípido no polar en la planta, o parte del mismo de manera preferente una parte vegetativa, comprende un nivel incrementado de uno o más ácidos grasos que comprenden un grupo hidroxilo, un grupo epoxi, un grupo ciclopropano, una ligación de carbono-carbono doble, una ligación de carbono-carbono triple, ligaciones dobles conjugadas, una cadena ramificada tal como una cadena ramificada metilada o hidroxilada, o una combinación de dos o más de las mismas, o cualquiera de dos, tres, cuatro, cinco o seis de los grupos mencionados en lo anterior, ligaciones o cadenas ramificadas,

x) lípido no polar en la planta, o parte de la misma de manera preferente una parte vegetativa, comprende uno o más ácidos graso poliinsaturados seleccionados de ácido eicosadienoico (EDA), ácido araquidónico (ARA), ácido estearidónico (SDA), ácido eicosatrienoico (ETE), ácido eicosatetraenoico (ETA), ácido eicosapentaenoico (EPA), ácido docosapentaenoico (DPA), ácido docosahexaenoico (DHA), o una combinación de dos o más de los mismos, xi) la parte es una parte vegetativa de la planta, tal como una hoja o un tallo, o parte de la misma, xii) uno o más o todos los promotores se seleccionan del promotor diferente a un promotor constitutivo, de manera preferente un promotor específico de tejido tal como un promotor específico de hoja y/o tallo, un promotor desarrolladamente regulado tal como un promotor específico de senescencia tal como un promotor SAG 12, un promotor inducible, o un promotor regulado por ritmo circadiano, de manera preferente en donde al menos uno de los promotores ligados operablemente a un polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido de factor de transcripción es un promotor diferente a un promotor constitutivo,

xiii) la planta, o parte de la misma de manera preferente una parte vegetativa, comprende un contenido de ácidos grasos total que comprende ácidos grasos de cadena media, de manera preferente C12:0, C14:0 o ambos, en un nivel de al menos 5% del contenido de ácidos grasos total y opcionalmente un polinucleótido exógeno que codifica un LPAAT que tiene actividad preferencial para ácidos grasos con una longitud de cadena media (C8 a C14), de manera preferente C12:0 o C14:0,

xiv) la planta, o parte de la misma de manera preferente una parte vegetativa, comprende un contenido de ácido graso total cuyo nivel de ácido oleico y/o nivel de ácido palmítico se incrementa por al menos 2% con una planta correspondiente, o parte de la misma, que carece del polinucleótido(s) exógeno y/o modificación(es) genética, y/o cuyo nivel de ácido a-linolénico (ALA) y/o nivel de ácido linoléico disminuye por al menos 2% con respecto a una planta correspondiente, o parte de la misma, que carece del polinucleótido(s) exógeno y/o modificación(es) genética, xv) lípido no polar en la planta, o parte de la misma de manera preferente una parte vegetativa, comprende un nivel modificado de esteroles totales, de manera preferente esteroles libres (no esterificados) esteroles, esteroles de esteroilo, glicósidos de esteroilo, con respecto al lípido no polar en una planta correspondiente, o parte de la misma, que carece del polinucleótido(s) exógeno y/o modificación(es) genética,

xvi) lípido no polar en la planta, o parte de la misma, comprende ceras y/o ésteres de cera,

xvii) la planta, o parte de la misma de manera preferente una parte vegetativa, es un miembro de una población o colección de al menos aproximadamente 1000 de las plantas, o partes de las mismas,

xviii) la planta comprende un polinucleótido exógeno que codifica un supresor de silenciamiento, en donde el polinucleótido exógeno se liga operablemente a un promotor que es capaz de dirigir la expresión del polinucleótido en la planta,

xix) el nivel de uno o más lípido no polar y/o el contenido de lípidos no polares total de la planta o parte de la misma, de manera preferente una parte vegetativa de la planta, es al menos 2% mayor sobre una base en peso que en una planta correspondiente o parte, respectivamente, que comprende polinucleótidos exógenos que codifican un WRI1 deArabidopsis thaliana(SEQ ID NO:21) y un DGAT1 deArabidopsis thaliana(SEQ ID NO: 1),

xx) un contenido de ácidos grasos poliinsaturados total (PUFA) que disminuye con respecto al contenido de PUFA total e una planta correspondiente que carece del polinucleótido(s) exógeno y/o modificación(es) genética, xxi) la parte de la planta es un tubérculo de patata(Solanum tuberosum),una remolacha azucarera(Beta vulgaris),una caña de azúcar(Saccharumsp.) o tallo de sorgo(Sorghum bicolor),una semilla de planta monocotiledónea que tiene un contenido de ácidos grasos total incrementados en su endospermo tal como, por ejemplo, un grano de trigo(Triticum aestivum)o un grano de maíz (Zeamays),una hoja deNicotianaspp., o una semilla leguminosa que tiene un contenido de ácidos grasos total incrementado tal como, por ejemplo, una semilla deBrassicasp., o una semilla de soja(Glycine max),

xxii) si la parte de la planta es una semilla, la semilla germina en una velocidad sustancialmente la misma como una semilla de tipo silvestre correspondiente o cuando se siembra en el suelo produce una planta cuya semilla germina en una velocidad sustancialmente la misma como la semilla de tipo silvestre correspondiente, y

xxiii) la planta es una planta de alga tal como de diatomeas (bacilariofitos), algas verdes (clorófitos), algas azulesverdes (cianófitos), algas doradas-cafés (crisófitos), haptófitos, alga cafés o algas heterocontas.

En los aspectos anteriores, una parte de la planta preferida es una pieza de hoja que tiene un área superficial de al menos 1cm2 o una pieza de tallo que tiene una longitud de al menos 1cm.

En un aspecto de los aspectos anteriores, la planta o parte de la planta que se ha tratado de esta manera ya no es capaz de ser propagada o dar origen a una planta viva, es decir, está muerta. Por ejemplo, la planta o parte de la planta se ha secado y/o se ha molido.

En los aspectos anteriores, se prefiere que el contenido de lípidos no polares total de la parte de la planta sea al menos 3% mayor, de manera más preferente al menos 5% mayor, que el contenido de lípidos no polares total en una parte de planta correspondiente transformada con genes que codifican un WRI1 y un DGAT pero que carecen de los otros polinucleótidos exógenos y modificaciones genéticas como se describe en la presente memoria para los aspectos anteriores. De manera más preferente, el grado de incremento es un tallo o raíz de la planta.

En un aspecto, la adición de uno o más de los polinucleótidos exógenos o modificaciones genéticas, de manera preferente el polinucleótido exógeno que codifica un OBC o una acil grasa tioesterasa o la modificación genética que regula negativamente la producción endógena y/o actividad de un polipéptido implicado en el catabolismo de triacilgliceroles (TAG) en la planta, de manera más preferente el polinucleótido exógeno que codifica una FATA tioesterasa o una LDAP o que disminuye la expresión de una TAG lipasa endógena tal como una SDP1 TAG lipasa en la planta, da por resultado un incremento sinérgico en el contenido de lípidos no polares total de la parte de la planta cuando se agrega al par de transgenes WRI1 y DGAT, particularmente antes que la planta florezca y aún de manera más particular en los<tallos y/o raíces de la planta. Por ejemplo, ver Ejemplos>8<, 11 y 15. En un aspecto preferido, el incremento en el contenido>de TAG del tallo o raíz de la planta es al menos 2 veces, de manera más preferente al menos 3 veces, con respecto a una parte correspondiente transformada con genes que codifican WRI1 y DGAT1 pero que carecen de la FATA tioesterasa, LDAP y la modificación genética que regula negativamente la producción endógena y/o actividad de un polipéptido implicado en el catabolismo de triacilgliceroles (TAG) en la planta. De manera más preferente, al menos el promotor que dirige la expresión del primer polinucleótido exógeno es un promotor diferente a un promotor constitutivo.

En los aspectos del sexto, séptimo, octavo, noveno, décimo, decimoprimero, decimosegundo, decimotercero, decimocuarto, decimosexto, decimoctavo y decimonoveno aspecto, se prefiere que la planta o la parte de la misma sea fenotípicamente normal, en que no se reduzca significativamente en su capacidad para desarrollarse y reproducirse cuando se compare con una planta no modificada o parte de la misma. De manera preferente, la biomasa, velocidad de crecimiento, velocidad de germinación, tamaño de órgano de almacenamiento, tamaño de la semilla y/o el número de semillas viables producidas no sea menor que 90% de aquella de una planta de tipo silvestre correspondiente cuando se desarrolla bajo condiciones idénticas. En un aspecto, la planta es fértil masculina y femenina al mismo grado como una planta de tipo silvestre correspondiente y su polen (si se produce) es tan viable como el polen de la planta de tipo silvestre correspondiente, de manera preferente de aproximadamente 100% viable. En un aspecto, la planta produce semillas que tienen una velocidad de germinación de al menos 90% con respecto a la velocidad de germinación de la semilla correspondiente de una planta de tipo silvestre, donde la especie de planta produce semillas. En un aspecto, la planta como se describe en la presente memoria tiene una altura de planta que es menos 90% con respecto a la altura de la planta de tipo silvestre correspondiente desarrollada bajo las mismas condiciones. Se prevé una combinación de cada una de estas características. En un aspecto alternativo, la planta de la invención tiene una altura de planta que es entre 60% y 90% con respecto a la altura de la planta de tipo silvestre correspondiente desarrollada bajo las mismas condiciones. En un aspecto, la planta o parte de la misma como se describe en la presente memoria, de manera preferente una hoja de planta, no muestra necrosis incrementada, es decir el grado de necrosis, si está presente, es el mismo como aquel mostrado por una planta de tipo silvestre correspondiente o parte de la misma desarrollada bajo las mismas condiciones y la misma etapa del desarrollo de la planta. Esta característica aplica en particular a la planta o parte de la misma que comprende un polinucleótido exógeno que codifica una ácido graso tioesterasa tal como una FATB tioesterasa.

Los siguientes aspectos aplican a la planta, o parte de la misma, de la invención (incluyendo el sexto, séptimo, octavo, noveno, décimo, decimoprimero, decimosegundo, decimotercero, decimocuarto, decimosexto, decimoctavo y decimonoveno aspecto), así como un método para producir la planta o parte de la misma o un método para usar la misma. En un aspecto, el polipéptido implicado en la biosíntesis de uno o más lípidos no polares es una acilo graso aciltransferasa implicado en la biosíntesis de<t>A<g>, DAG o monoacilglicerol (MAG) en la planta o parte de la misma, de manera preferente de TAG en la planta o parte de la misma, tal como un DGAT, PDAT, LPAAT, GPAT o MGAT, de manera preferente un DGAT o un PDAT.

En otro aspecto, el polipéptido implicado en el catabolismo de triacilgliceroles (TAG) en la planta o parte de la planta es una SDP1 lipasa, un polipéptido Cgi58, una acil-CoA oxidase tal como ACX1 o ACX2, o un polipéptido implicado en p-oxidación de ácidos grasos en la planta tal como un transportador de casete de ligación ATP peroxisomal PXA1, de manera preferente una SDP1 lipasa.

En un aspecto, el polipéptido que incrementa la exportación de ácidos grasos fuera de los plástidos de la planta<es un ácido graso tioesterasa C>16<o C18 tal como un polipéptido FATA o un polipéptido FATB, un transportador de ácidos>grasos tal como un polipéptido ABCA9 o una acil-CoA sintetasa de cadena larga (LACS).

En un aspecto, el polipéptido implicado en importar ácidos grasos en los plástidos de la planta es un transportador de ácidos grasos, o subunidad del mismo, de manera preferente un polipéptido TGD tal como, por ejemplo, un polipéptido TGD1, un polipéptido TGD2, un polipéptido TGD3 o un polipéptido Tg D4.

En un aspecto, la planta, o parte de la misma, como se describe en la presente memoria es una planta 16:3, o parte de la misma, y que comprende uno o más o todo de lo siguiente;

a) un polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido que incrementa la exportación de ácidos grasos fuera de los plástidos de la planta cuando se compara con una planta correspondiente que carece del polinucleótido exógeno, b) una primera modificación genética que regula negativamente la producción endógena y/o actividad de un polipéptido implicado en importar ácidos grasos en los plástidos de la planta cuando se compara con una planta correspondiente que carece de la primera modificación genética, y

c) una segunda modificación genética que regula negativamente la producción endógena y/o actividad de un polipéptido implicado en la producción de diacilglicerol (DAG) en el plástido cuando se compara con una planta correspondiente que carece de la segunda modificación genética, en donde el polinucleótido exógeno se liga operablemente a un promotor que es capaz de dirigir la expresión del polinucleótido en la planta, o parte de la misma.

En un aspecto alternativo, la planta, o parte de la misma, como se describe en la presente memoria es una planta 18:3 o parte de la misma.

En un aspecto, antes que la planta florezca, una parte vegetativa de la planta comprende un contenido de lípidos no polares totales de al menos aproximadamente 8%, al menos aproximadamente 10%, aproximadamente 11%, entre 8% y 15%, o entre 9% y 12% (p/p de peso seco).

En un aspecto, uno o más o todo de la modificación genéticas es una mutación de un gen endógeno que inactiva parcial o completamente el gen, tal como una mutación puntual, una inserción, o una supresión (o una combinación de una o más de las mismas), de manera preferente una mutación introducida. La mutación puntual puede ser un codón de detención prematuro, una mutación de sitio de empalme, una mutación de cambio de marco o una mutación de sustitución de aminoácidos que reduce la actividad del gen o el polipéptido codificado. La supresión puede ser de uno o más nucleótidos dentro de un exógeno o promotor transcrito del gen, o extendido a través de o en más de un exón, o extendido a la supresión del gen completo. De manera preferente la supresión se introduce mediante el uso de tecnologías ZF, TALEN o CRISPR. En un aspecto alterno, una o más o todas las modificaciones genéticas es un polinucleótido exógeno que codifica una molécula de ARN que inhibe la expresión del gen endógeno, en donde el polinucleótido exógeno se liga operablemente a un promotor que es capaz de dirigir la expresión del polinucleótido en la planta, o parte de la misma.

i) nucleótidos que codifican un polipéptido que comprende aminoácidos cuya secuencia se expone como cualquiera de SEQ ID NOs:21 a 75 o 205 a 210, o un fragmento biológicamente activo de las mismas, o un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es al menos 30% idéntica a cualquiera de una o más de las SEQ ID NOs: 21 a 75 o 205 a 210,

ii) nucleótidos cuya secuencia es al menos 30% idéntica a i), y

iii) nucleótidos que se hibridan a i) y/o ii) bajo condiciones rigurosas. De manera preferente, el polipéptido WRI1 es un polipéptido WRI1 diferente al<w>R1 deArabidopsis thaliana(SEQ ID NOs:21 o 22). De manera más preferente, el polipéptido WRI1 comprende los aminoácidos cuya secuencia se expone como SEQ ID NO:208, o un fragmento biológicamente activo de la misma, o un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es al menos 30% idéntica a la misma.

En un aspecto, el contenido de lípidos no polares total, o el uno o más lípidos no polares y/o el nivel del ácido oleico o un PUFA en la planta o parte de la misma es determinable por el análisis al usar cromatografía de gas de ésteres de metilo de ácido graso obtenidos de la planta o parte vegetativa de los mismos.

En un aspecto adicional, en donde la parre de la planta es una hoja y el contenido de lípidos no polares total de la hoja es determinable por el análisis usando Resonancia Magnética Nuclear (NMR).

En un aspecto, la planta, o parte de la misma, es un miembro de una población o recolección de al menos aproximadamente 1000 de tales plantas o partes.

En un aspecto adicional, la presente memoria describe una población de al menos aproximadamente 1000 plantas, cada una que es una planta de la invención, desarrollada en un campo.

En otro aspecto, la presente memoria describe una recolección de al menos aproximadamente 1000 partes vegetativas de la planta, cada una que es parte vegetativa de la planta como se describe en la presente memoria, en donde las partes vegetativas de la planta se han cosechado de plantas que se desarrollan de un campo.

En un aspecto de la célula, el organismo no humano, planta o parte de la misma como se describe en la presente memoria, el polipéptido de factor de transcripción que incrementa la expresión de uno o más genes glucolíticos y/o de la biosíntesis de ácidos grasos en la célula es un factor de transcripción WRI1, el polipéptido implicado en la biosíntesis de uno o más lípidos no polares es un DGAT tal como a DGAT1 o un DGAT2, o un PDA<t>, y el polipéptido implicado en el catabolismo de triacilgliceroles (TAG) en la célula es una SDP1 lipasa. En un aspecto preferido, el polipéptido de recubrimiento de cuerpo lipídico (OBC) es una oleosina, el polipéptido que incrementa la exportación de ácidos grasos fuera de los plástidos de la célula es una ácido grasa tioesterasa tal como a FATA o FATB tioesterasa, el polipéptido implicado en importar ácidos grasos en los plástidos de la célula es un polipéptido TGD, de manera preferente un polipéptido TGD1, y el polipéptido implicado en la producción de diacilglicerol (DAG) en el plástido es un GPAT plastidial. En un aspecto más preferido, la célula es una parte vegetativa de la planta y el contenido de TAG de la parte vegetativa de la planta antes del florecimiento de la planta es al menos 8% (% en peso seco).

En una aspecto, la planta, parte vegetativa de la planta, organismo no humano o parte del mismo, semilla o tubérculo de patata comprende un primer polinucleótido exógeno que codifica un WRI1, un segundo polinucleótido exógeno que codifica un DGAT o un PDAT, de manera preferente un DGAT1, un tercer polinucleótido exógeno que codifica un RNA que reduce la expresión de un gen que codifica un polipéptido SDP1, y un cuarto polinucleótido exógeno que codifica una oleosina. En aspectos preferidos, la parte vegetativa de la planta, organismo no humano o parte del mismo, semilla o tubérculo de patata tiene una o más o todas las siguientes características:

i) un contenido de lípidos total de al menos 8%, al menos 10%, al menos 12%, al menos 14%, o al menos 15.5% (% en peso),

ii) al menos a 3 veces, al menos a 5 veces, al menos a 7 veces, al menos 8 veces, o al menos 10 veces, en contenido de lípidos total más alto en la parte vegetativa de la planta u organismo no humano con respecto a una parte vegetativa de la planta correspondiente u organismo no humano que carece de los polinucleótidos exógenos,

iii) un contenido de TAG total de al menos 5%, al menos 6%, al menos 6.5% o al menos 7% (% en peso de peso seco o peso de semilla),

iv) al menos a 40 veces, al menos a 50 veces, al menos a 60 veces, o al menos 70 veces, al menos 100 veces, o al menos a 120 veces de contenido TAG total más alto con respecto a una parte vegetativa de la planta u organismo no humano que carece de los polinucleótido exógenos,

v) el ácido oleico comprende al menos 15%, al menos 19% o al menos 22% (% en peso de peso seco o de peso de semilla) de los ácidos grasos en TAG,

vi) al menos a 10 veces, al menos a 15 veces o al menos a 17 veces de nivel más alto de ácido oleico en TAG con respecto a una parte vegetativa de la planta correspondiente y organismo no humano que carece de los polinucleótidos exógenos,

vii) el ácido palmítico comprende al menos 20%, al menos 25%, al menos 30% o al menos 33% (% en peso) de los ácidos grasos en TAG,

viii) al menos un nivel de 1.5 veces más alto de ácido palmítico en TAG con respecto a una parte vegetativa de la planta correspondiente u organismo no humano que carece de los polinucleótidos exógenos,

ix) el ácido linoléico comprende al menos 22%, al menos 25%, al menos 30% o al menos 34% (% en peso) de los ácido grasos en TAG,

x) el ácido a-linolénico comprende menor que 20%, menor que 15%, menor que 11% o menor que 8% (% en peso) de los ácidos grasos en TAG,

xi) un nivel más bajo de ácido graso a-linoléico de al menos 5 veces, o al menos 8 veces, en TAG con respecto a una parte vegetativa de la planta correspondiente u organismo no humano que carece de los polinucleótidos exógenos, y xii) para un tubérculo de papa, un contenido de TAG de al menos 0.5% sobre una base de peso seco y/o un contenido de ácido graso total de al menos 1%, de manera preferente al menos 1.5% o al menos 2.0%, sobre una base de peso seco.

También se proporciona la semilla de, u obtenida de una planta de la invención.

En otro aspecto, la memoria describe un tallo de planta transgénica, o parte de un tallo de al menos 1g de peso seco, cuyo contenido de TAG es al menos 5% sobre una base en peso (peso seco), de manera preferente al menos 6%, de manera más preferente al menos 7%. En un aspecto, el tallo de planta transgénica o parte de tallo es de, o se cosecha de manera preferente de, una planta dicotiledónea. Alternativamente, el tallo de planta transgénica o parte de tallo es de, o se cosecha de manera preferente de, una planta monocotiledónea. En un aspecto, el tallo de planta o parte de tallo es de o de una planta diferente a la caña de azúcar. En los aspectos, el tallo de planta o la parte de tallo se caracteriza adicionalmente por una o más características como se define en el contexto de una célula o planta como se describe en la presente memoria.

En otro aspecto, la memoria describe una célula de planta que comprende

a) un primer polinucleótido exógeno que codifica un PDAT,

b) una primera modificación genética que regula negativamente la producción endógena y/o actividad de un polipéptido implicado en importar ácidos grasos en los plástidos de la célula, de manera preferente un polipéptido TGD, cuando se compara con una célula correspondiente que carece la primera modificación genética, y uno o más de c) una segunda modificación genética que regula negativamente la producción endógena y/o actividad de un polipéptido implicado en el catabolismo de triacilgliceroles (TAG) en la célula, de manera preferente un polipéptido SDp1, cuando se compara con una célula correspondiente que carece de la modificación genética,

d) un segundo polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido que incrementa la exportación de ácidos grasos fuera de los plástidos de la célula, de manera preferente una acilo graso tioesterasa, cuando se compara con una célula correspondiente que carece del segundo polinucleótido exógeno, y

e) una tercera modificación genética que regula negativamente la producción endógena y/o actividad de un polipéptido implicado en la producción de diacilglicerol (DAG) en el plástido cuando se compara con una célula correspondiente que carece la tercera modificación genética,

en donde cada polinucleótido exógeno se liga operablemente a un promotor que es capaz de dirigir la expresión del polinucleótido en la célula. En un aspecto preferido, la presencia en la célula de la primera, segunda o tercera modificación genética o el segundo polinucleótido exógeno incrementa sinérgicamente el contenido de lípidos no polares total de la célula cuando se compara con una célula correspondiente que tiene el PDAT pero que carece de la modificación genética adicional o polinucleótido exógeno. De manera más preferente, al menos uno de los polinucleótidos exógenos se expresa de un promotor diferente a un promotor constitutivo.

En otro aspecto, la presente memoria describe un proceso para obtener una célula eucariota recombinante como se describe en la presente memoria, el proceso comprende los pasos de:

i) introducir en una célula eucariota al menos un polinucleótido exógeno y/o al menos una modificación genética como se define en la presente memoria para producir una célula eucariota que comprende una modificación genética como se define en la presente memoria para producir una célula eucariota que comprende un conjunto de polinucleótidos exógenos y/o modificaciones genéticas como se define en la presente memoria,

ii) expresar el polinucleótido(s) exógeno en la célula o una célula progenie de la misma,

iii) analizar el contenido de lípidos de la célula o célula progenie, y

iv) seleccionar una célula como se describe en la presente memoria.

En un aspecto, el uno o más polinucleótidos exógenos se integran establemente en el genoma de la célula o célula progenie.

En un aspecto, el proceso comprende además el paso para regenerar una planta transgénica de la célula o célula progenie que comprende el uno o más polinucleótidos exógenos.

En un aspectoadicional, el paso para regenerar una planta transgénica se lleva a cabo antes del paso de expresar el uno o más polinucleótidos exógenos en la célula o una célula progenie de la misma, y/o ante del paso de analizar el contenido de lípidos de la célula o célula progenie y/o antes del paso de seleccionar la célula o célula progenie que tiene un nivel incrementado de uno o más lípidos no polares.

En otro aspecto, el proceso comprende además un paso para obtener una semilla o una planta progenie de la planta transgénica, en donde la semilla o planta progenie comprende el uno o más polinucleótidos exógenos.

En todavía otro aspecto, la célula seleccionada o planta regenerada de la misma, o una parte vegetativa de la planta o semilla de la planta regenerada, tiene una o más de las características como se define en la presente memoria.

En un aspecto adicional, la presente memoria describe un método para producir una planta que tiene integrado en su genoma un conjunto de polinucleótidos exógenos y/o modificaciones genéticas como se define en la presente memoria, el método comprende los pasos de

i) cruzar dos plantas precursoras en donde una planta comprende al menos uno de los polinucleótidos exógenos y/o al menos modificaciones genéticas como se define en la presente memoria, y la otra planta comprende al menos uno de los polinucleótidos exógenos y/o al menos una de las modificaciones genéticas como se define en la presente memoria, y en donde entre las dos plantas precursoras comprenden un conjunto de polinucleótidos exógenos y/o modificaciones genéticas como se define en la presente memoria,

ii) clasificar una o más plantas progenie de la cruza por la presencia o ausencia del conjunto de polinucleótidos exógenos y/o modificaciones genéticas como se define en la presente memoria, y

iii) seleccionar una planta progenie que comprende el conjunto de polinucleótidos exógenos y/o modificaciones genéticas como se define en la presente memoria,

produciendo de esta manera la planta.

También se proporciona una célula transgénica o planta transgénica obtenida usando el proceso o una parte de la misma, obtenida de la misma que comprende el conjunto de polinucleótidos exógenos y/o modificaciones genéticas como se define en la presente memoria.

También se proporciona el uso de un conjunto de polinucleótidos exógenos y/o modificaciones genéticas como se define en la presente memoria para producir una célula transgénica, un organismo no humano transgénico o una parte del mismo o una semilla que tiene una capacidad mejorada para producir uno o más lípidos no polares con respecto a una célula correspondiente, organismo no humano o parte del mismo o semilla que carece del conjunto de polinucleótidos exógenos y/o modificaciones genéticas, en donde cada polinucleótido exógeno se liga operablemente a un promotor que es capaz de dirigir la expresión del polinucleótido exógeno en la célula transgénica, organismo no humano o una parte del mismo o semilla.

De manera preferente, al menos uno de los promotores ligados operablemente a un polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido de factor de transcripción es un promotor diferente a un promotor constitutivo.

En un aspecto, la célula transgénica, organismo no humano o parte del mismo, o semilla comprende uno o más de las características definidas en la presente memoria.

En un aspecto adicional, la presente memoria describe un proceso para producir un producto industrial, el proceso comprende los pasos de:

i) obtener una célula eucariota recombinante como se describe en la presente memoria, un organismo no humano transgénico o una parte del mimo como se describe en la presente memoria, una planta transgénica o parte de la misma como se describe en la presente memoria, una semilla como se describe en la presente memoria, o una célula transgénica o planta transgénica o parte de la misma como se describe en la presente memoria, y

ii) convertir al menos uno de lípido en la célula, organismo no humano o parte del misma, planta o parte de la misma, o semilla, al producto industrial al aplicar medios de calor, químicos o enzimáticos, o cualquier combinación de los mismos a lípidoin situen el organismo no humano o parte del mismo, y

iii) recuperar el producto industrial,

produciendo de esta manera el producto industrial.

i) obtener una célula eucariota recombinante como se describe en la presente memoria, un organismo no humano transgénico una parte del mismo de la invención, una planta transgénica o parte de la misma como se describe en la presente memoria, una semilla de la invención, o una célula transgénica o planta transgénica o parte de la misma como se describe en la presente memoria, y

ii) procesar físicamente la célula, organismo no humano o parte del mismo, planta o parte de la misma o semilla del paso i),

iii) convertir simultánea o subsecuentemente al menos uno de lípido en la célula procesada, organismo no humano o parte del mismo, planta o parte de la misma, o semilla, al producto industrial al aplicar medios de calor, químicos o enzimáticos, o cualquier combinación de los mismos, al lípido en la célula procesada, organismo no humano o parte del mismo, planta o parte de la misma, o semilla, y

iv) recuperar el producto industrial,

produciendo de esta manera el producto industrial.

En un aspecto, de los aspectos anterior, la parte de la planta es una parte vegetativa de la planta.

i) obtener una parte vegetativa de la planta que tiene un contenido de lípidos no polares totales de al menos aproximadamente 18%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, entre 18% y 75%, entre aproximadamente 20% y 75%, entre aproximadamente 30% y 75%, entre aproximadamente 40% y 75%, entre aproximadamente 50% y 75%, entre aproximadamente 60% y 75%, o entre aproximadamente 25% y 50% (p/p en peso seco),

ii) convertir al menos uno de los lípidos en la parte vegetativa de la planta al producto industrial al aplicar medios de calor, químicos o enzimáticos, o cualquier combinación de los mismos, al lípidoin situen la parte vegetativa de la planta, y

iii) recuperar el producto industrial,

produciendo de esta manera el producto industrial.

En otro aspecto, la presente memoria describe un proceso para producir un producto industrial, el proceso comprende los pasos de:

i) obtener una parte vegetativa de la planta que tiene un contenido de lípidos no polares total de al menos aproximadamente 18%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, entre 18% y 75%, entre aproximadamente 20% y 75%, entre aproximadamente 30% y 75%, entre aproximadamente 40% y 75%, entre aproximadamente 50% y 75%, entre aproximadamente 60% y 75%, o entre aproximadamente 25% y 50% (p/p de peso seco),

ii) progresar físicamente la parte vegetativa de la planta del paso i),

iii) convertir simultánea o subsecuentemente al menos uno de lípido en la parte vegetativa de la planta procesada al producto industrial al aplicar medios de calor, químicos o enzimáticos, o cualquier combinación de los mismos, al lípido en la parte vegetativa de la planta procesada, y

iv) recuperar el producto industrial,

produciendo de esta manera el producto industrial.

En todavía otro aspecto adicional, la presente memoria describe un proceso para producir un producto industrial, el proceso comprende los pasos de:

i) obtener una parte vegetativa de la planta que tiene un contenido de lípidos no polares total de al menos aproximadamente 1 1 %, al menos aproximadamente 12%, al menos aproximadamente 15%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, entre 8% y 75%, entre 10% y 75%, entre 11% y 75%, entre aproximadamente 15% y 75%, entre aproximadamente 20% y 75%, entre aproximadamente 30% y 75%, entre aproximadamente 40% y 75%, entre aproximadamente 50% y 75%, entre aproximadamente 60% y 75%, o entre aproximadamente 25% y 50% (p/p de peso seco), en donde la planta es una planta 16:3 o parte vegetativa de la misma,

ii) convertir al menos alguno de los lípidos en la parte vegetativa de la planta al producto industrial al aplicar medios de calor, químicos o enzimáticos, o cualquier combinación de los mismos, al lípidoin situen la parte vegetativa de la planta, y

iii) recuperar el producto industrial,

produciendo de esta manera el producto industrial.

i) obtener una parte vegetativa de la planta que tiene un contenido de lípidos no polares total de al menos aproximadamente 1 1%, al menos aproximadamente 12%, al menos aproximadamente 15%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, entre 8% y 75%, entre 10% y 75%, entre 11% y 75%, entre aproximadamente 15% y 75%, entre aproximadamente 20% y 75%, entre aproximadamente 30% y 75%, entre aproximadamente 40% y 75%, entre aproximadamente 50% y 75%, entre aproximadamente 60% y 75%, o entre aproximadamente 25% y 50% (p/p de peso seco), en donde la planta es una planta 16:3 o parte vegetativa de la misma,

ii) procesar físicamente la parte vegetativa de la planta del paso i),

iii) convertir simultánea o subsecuentemente al menos uno de los lípidos en la parte vegetativa de la planta procesada al producto industrial al aplicar medios de calor, químicos, o enzimáticos, o cualquier combinación de los mismos, al lípido en la parte vegetativa de la planta procesada, y

iv) recuperar el producto industrial,

produciendo de esta manera el producto industrial.

En un aspecto, el paso para procesar físicamente la célula, organismo no humano o parte del mismo, planta o parte de la misma, o semilla comprende uno o más de enrollar, prensar, estrujar o moler la célula, organismo no humano o parte del mismo, planta o parte de la misma, o semilla.

En un aspecto, el proceso comprende los pasos de:

(a) extraer al menos algo del contenido de lípidos no polares de la célula, organismo no humano o parte del mismo, planta o parte de la misma, o semilla as lípido no polar, y

(b) recuperar el lípido no polar extraído,

en donde los pasos (a) y (b) se llevan a cabo antes del paso de convertir al menos algo del lípido en la célula, organismo no humano o parte del mismo, planta o parte de la misma, o semilla al producto industrial.

En un aspecto, el lípido no polar extraído comprende triacilgliceroles, en donde los triacilgliceroles comprenden al menos 90%, de manera preferente al menos 95%, del lípido extraído.

En un aspecto, el producto industrial es un producto de hidrocarburo tal como ésteres de ácido graso, de manera preferente de ésteres de metilo de ácido graso y/o ésteres de etilo de ácido graso, un alcano tal como metano, etano o un alcano de cadena más larga, una mezcla de alcanos de cadena más larga, un alqueno, un biocombustible, monóxido de carbono y/o gas hidrógeno, un bioalcohol tal como etanol, propanol, o butanol, biocarbono, o una combinación de monóxido de carbono, hidrógeno o biocarbono. En un aspecto preferido, el contenido de ácido graso total de la parte vegetativa de la planta comprende al menos 5% de C12:0, C14:0 o la suma de C12:0 y C14:0 es al menos 5% del contenido de ácidos grasos total y el producto industrial producido de lípido en la parte vegetativa de la planta es un componente en un combustible de avión.

En un aspecto adicional, la presente memoria describe un proceso para producir lípido extraído, el proceso comprende los pasos de:

i) obtener una célula eucariota recombinante como se describe en la presente memoria, un organismo no humano transgénico o una parte del mismo como se describe en la presente memoria, una planta transgénica o parte de la misma como se describe en la presente memoria, una semilla como se describe en la presente memoria, o una célula transgénica o planta transgénica o parte de la misma como se describe en la presente memoria,

ii) extraer el lípido de la célula, organismo no humano o parte del mismo, planta o parte de la misma o semilla, y

iii) recuperar el lípido extraído,

produciendo de esta manera el lípido extraído.

i) obtener una parte vegetativa de la planta que tiene un contenido de lípidos no polares totales de al menos aproximadamente 18%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, entre 18% y 75%, entre aproximadamente 20% y 75%, entre aproximadamente 30% y 75%, entre aproximadamente 40% y 75%, entre aproximadamente 50% y 75%, entre aproximadamente 60% y 75%, o entre aproximadamente 25% y 50% (p/p de peso seco),

ii) extraer el lípido de la parte vegetativa de la planta, y

iii) recuperar el lípido extraído,

produciendo de esta manera el lípido extraído.

i) obtener una parte vegetativa de la planta que tiene un contenido de lípidos no polares totales de al menos aproximadamente 11 %, al menos aproximadamente 12%, al menos aproximadamente 15%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, entre 8% y 75%, entre 10% y 75%, entre 11% y 75%, entre aproximadamente 15% y 75%, entre aproximadamente 20% y 75%, entre aproximadamente 30% y 75%, entre aproximadamente 40% y 75%, entre aproximadamente 50% y 75%, entre aproximadamente 60%) y 75%, o entre aproximadamente 25% y 50% (p/p de peso seco), en donde la planta es una planta 16:3 o parte vegetativa de la misma,

ii) extraer el lípido de la parte vegetativa de la planta, y

iii) recuperar el lípido extraído,

produciendo de esta manera el lípido extraído.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un proceso de extracción del aceite de la planta, este proceso comprende las etapas de:

i) obtener de la parte vegetativa de la planta de una angiosperma que tiene un contenido total en lípidos no polares entre 30% y 75% (p/p de peso seco),

ii) extraer el aceite de la parte vegetativa de la planta, y

iii) recuperar el aceite extraído,

extrayendo de esa manera el aceite de la planta.

En una realización, un proceso de extracción comprende uno o más pasos tales como secar, enrollar, prensar, estrujar o moler la célula, organismo no humano o parte del mismo, planta o parte de la misma, semilla, y/o purificar el lípido extraído o aceite de semilla.

En una realización, el proceso usa un solvente orgánico en el proceso de extracción para extraer el aceite.

En una realización adicional, el proceso comprende recuperar el lípido extraído o aceite al recolectarlo en un recipiente y/o uno o más de desgomar, desodorizar, decolorar, secar, fraccionar el lípido o aceite extraído, remover al menos algo de ceras y/o ésteres de cera del lípido o aceite extraído, o analizar la composición de ácidos grasos del lípido o aceite extraídos.

En una realización, el volumen de lípido o aceite extraído es al menos 1 litro.

En una realización adicional, uno o más o todas las siguientes características aplican:

(i) el lípido o aceite extraído comprende triacilgliceroles, en donde los triacilgliceroles comprenden al menos un 90%, de manera preferente al menos un 95% o 96%, de los lípidos o el aceite extraídos,

(ii) los lípidos o el aceite extraídos comprenden esteroles libres, esteroil ésteres, esteroil glicósidos, ceras o ésteres de ceras o cualquier combinación de los mismos, y

(iii) el contenido total y/o la composición de esteroles en los lípidos o el aceite extraídos es significativamente diferente del contenido y/o la composición de esteroles en los lípidos o el aceite extraídos producidos a partir de un correspondiente organismo no humano o una parte del mismo, o de una semilla.

En una realización, el proceso comprende además convertir los lípidos o el aceite extraídos en un producto industrial.

En una realización, el industrial es un producto de hidrocarburo tal como ésteres de ácido graso, de manera preferente de ésteres de metilo de ácido graso y/o ésteres de etilo de ácido graso, un alqueno tal como metano, etano o un alcano de cadena más larga, una mezcla de alcanos de cadena más larga, un alqueno, un biocombustible, monóxido de carbono y/o gas hidrógeno, un bioalcohol tal como etanol, propanol, o butanol, biocarbón, o una combinación de monóxido de carbono, hidrógeno y biocarbón. En una realización preferida, el contenido de ácido graso total de la parte vegetativa de la planta comprende al menos 5% de C12:0, C14:0 o la suma de C12:0 y C14:0 es al menos 5% del contenido de ácido graso total y el producto industrial producido de lípido en la parte vegetativa de la planta es un componente en un combustible de aviación.

En una realización adicional, la parte vegetativa de la planta es una hoja o tallo de planta. En una realización alternativa, la parte de la planta es un tubérculo o remolacha, tal como un tubérculo de patata(Solarium tuberosum)o una remolacha azucarera.

En todavía un aspecto adicional, el proceso comprende además un paso para recolectar la célula, organismo no humano o parte del mismo, planta o parte de la misma tal como a tubérculo o remolacha, o semilla, de manera preferente con un cosechador mecánico, o por un proceso que comprende filtración, centrifugación, sedimentación, flotación o floculación de algas u organismos fúngicos.

En otra realización, el nivel de un lípido en la parte vegetativa de la planta es determinable por análisis al usar cromatografía de gas de ésteres de metilo de ácido graso preparados a partir del lípido o del aceite extraídos.

En todavía otra realización, el proceso comprende además recolectar la parte de una planta.

En una realización, la parte de la planta es una parte vegetativa que comprende un contenido de lípidos no polares total de al menos aproximadamente 30%, al menos 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, entre 30% y 75%, entre aproximadamente 40% y 75%, entre aproximadamente 50% y 75%, entre aproximadamente 60% y 75% (p/p de peso seco).

En una realización adicional, la parte de la planta es una parte vegetativa de la planta que comprende un contenido de TAG total de al menos aproximadamente 18%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, entre 18% y 75%, entre aproximadamente 20% y 75%, entre aproximadamente 30% y 75%, entre aproximadamente 40% y 75%, entre aproximadamente 50% y 75%, entre aproximadamente 60% y 75%, o entre aproximadamente 25% y 50% (p/p de peso seco).

En otra realización, la parte de la planta es una parte vegetativa de la planta que comprende un contenido de lípidos no polares totales de al menos aproximadamente 30%, al menos 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, entre 30% y 75%, entre aproximadamente 40% y 75%, entre aproximadamente 50% y 75%, o entre aproximadamente 60% y 75%, (p/p de peso seco), y en donde la parte vegetativa de la planta procede de una planta 16:3.

En todavía otra realización, la parte de la planta es una parte vegetativa de la planta que comprende un contenido TAG total de al menos aproximadamente 11%, al menos aproximadamente 12%, al menos aproximadamente 15%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, entre 8% y 75%, entre 10% y 75%, entre 11% y 75%, entre aproximadamente 15% y 75%, entre aproximadamente 20% y 75%, entre aproximadamente 30% y 75%, entre aproximadamente 40% y 75%, entre aproximadamente 50% y 75%, entre aproximadamente 60% y 75%, o entre aproximadamente 25% y 50% (p/p de peso seco), y en donde la parte vegetativa de la planta es de una planta 16:3.

También se describe un proceso para producir semillas, el proceso comprende:

i) desarrollar una planta como se describe en la presente memoria, y

ii) recolectar la semilla de la planta.

En un aspecto, el proceso anterior comprende desarrollar una población de al menos aproximadamente 1000 plantas, cada una siendo una planta como se describe en la presente memoria, y recolectar la semilla de la población de plantas.

En todavía un aspecto adicional, la presente memoria describe un proceso de fermentación que comprende los pasos de:

i) proporcionar un recipiente que contiene una composición líquida que comprende una célula eucariota recombinante como se describe en la presente memoria, o el organismo no humano transgénico como se describe en la presente memoria, en donde la célula u organismo no humano es adecuado para la fermentación, y constituyentes requeridos para la fermentación y biosíntesis de ácidos grasos, y

ii) proporcionar condiciones conductivas a la fermentación de la composición líquida contenida el en recipiente.

También se proporciona un lípido recuperado o extraído obtenible de una célula eucariota recombinante como se describe en la presente memoria organismo no humano transgénico o una parte del mismo como se describe en la presente memoria, una planta transgénica o parte de la misma como se describe en la presente memoria, una semilla como se describe en la presente memoria, o una célula transgénica o planta transgénica o parte de la misma como se describe en la presente memoria, u obtenible por el proceso como se describe en la presente memoria.

En un aspecto adicional, la presente memoria describe un producto industrial producido por el proceso de la invención, que es un producto de hidrocarburo tal como ésteres de ácido graso, de manera preferente ésteres de metilo de ácido graso y/o ésteres de etilo de ácido graso, un alcano tal como metano, etano o un alcano de cadena más larga, una mezcla de alcano de cadena más larga, un alqueno, un biocombustible, monóxido de carbono y/o gas hidrógeno, un bioalcohol tal como etanol, propanol, o butanol, biocarbón, o una combinación de monóxido de carbono, hidrógeno y biocarbón.

También se proporciona el uso de una célula eucariota recombinante como se describe en la presente memoria, un organismo no humano transgénico o una parte del mismo como se describe en la presente memoria, una planta transgénica o parte de la misma como se describe en la presente memoria, una semilla como se describe en la presente memoria, o una planta transgénica o planta transgénica o parte de la misma como se describe en la presente memoria, o el lípido recuperado o extraído como se describe en la presente memoria para la fabricación de un producto industrial.

Ejemplos de productos industriales producidos por el proceso de la invención incluyen, pero no se limitan a, un producto de hidrocarburo tal como ésteres de ácido graso, de manera preferente ésteres de metilo de ácido graso y/o ésteres de etilo de ácido graso, un alqueno tal como metano, etano o un alcano de cadena más larga, una mezcla de alcanos de cadena más larga, un alqueno, un biocombustible, monóxido de carbono y/o gas hidrógeno, un bioalcohol tal como etanol, propanol, o butanol, biocarbón, o una combinación de monóxido de carbono, hidrógeno y biocarbón.

En un aspecto adicional, la presente memoria describe un proceso para producir combustible, el proceso comprende:

i) hacer reaccionar el lípido producido por el proceso de la invención con un alcohol, opcionalmente, en presencia de un catalizador, para producir ésteres de alquilo, y

ii) opcionalmente, mezclar los ésteres de alquilo combustible basado en petróleo.

En un aspecto del proceso anterior, los ésteres de alquilo son ésteres de metilo.

En todavía un aspecto adicional, la presente memoria describe un proceso para producir un combustible diésel sintético, el proceso comprende:

i) convertir el lípido en una célula eucariota recombinante como se describe en la presente memoria, un organismo no humano transgénico o una parte del mismo como se describe en la presente memoria, una planta transgénica o parte de la misma como se describe en la presente memoria, una semilla como se describe en la presente memoria, o una planta transgénica o planta transgénica o parte de la misma como se describe en la presente memoria, a un bioaceite mediante un proceso que comprende pirólisis o procesamiento hidrotérmico o a un gas sintético por gasificación, y ii) convertir el bioaceite a combustible diésel sintético mediante un proceso que comprende fraccionamiento, seleccionar de manera preferente compuesto de hidrocarburo que se condensan entre aproximadamente 150°C a aproximadamente 200°C o entre aproximadamente 200°C a aproximadamente 300°C, o que convierte el gas sintético a un biocombustible usando un catalizador de metal o un catalizador microbiano.

En otro aspecto, la presente memoria describe un proceso para producir un biocombustible, el proceso comprende convertir el lípido en una célula eucariota recombinante como se describe en la presente memoria, un organismo no humano transgénico o una parte del mismo como se describe en la presente memoria, una planta transgénica o parte de la misma como se describe en la presente memoria, una semilla como se describe en la presente memoria, o una célula transgénica o planta transgénica o parte de la misma como se describe en la presente memoria a biocombustible por pirolisis, un bioalcohol por fermentación, o un biogás por gasificación o digestión anaeróbica.

En un aspecto del proceso anterior, la parte es una parte vegetativa de la planta.

También se proporciona un proceso para producir un alimento, el proceso comprende administrar una célula eucariota recombinante como se describe en la presente memoria, un organismo no humano transgénico o una parte del mismo como se describe en la presente memoria, una planta transgénica o parte de la misma como se describe en la presente memoria, semilla como se describe en la presente memoria, o una célula transgénica o planta transgénica o parte de la misma como se describe en la presente memoria, u obtenible por el proceso como se describe en la presente memoria, o un extracto o porción del mismo, por al menos otro ingrediente alimenticio.

En un aspecto adicional, la presente memoria describe alimentos, cosméticos o químicos que comprenden una célula eucariota recombinante como se describe en la presente memoria, un organismo no humano transgénico o una parte del mismo como se describe en la presente memoria, una planta transgénica o parte de la misma como se describe en la presente memoria, una semilla como se describe en la presente memoria, o una célula transgénica o planta transgénica o parte de la misma como se describe en la presente memoria, u obtenible por el proceso como se describe en la presente memoria, o un extracto o porción del mismo.

En otro aspecto, la presente memoria describe un proceso para alimentar a un animal, el proceso comprende proporcionar a un animal la planta transgénica o parte de la misma como se describe en la presente memoria, una semilla como se describe en la presente memoria, o planta transgénica o parte de la misma como se describe en la presente memoria, o el lípido recuperado o extraído como se describe en la presente memoria.

Cualquiera de las realizaciónes de la presente memoria se aplicarámutatis mutandisa cualquier otra realización a menos que específicamente se defina de otra manera.

En toda esta memoria descriptiva, a menos que específicamente se defina de otra manera o que el contexto requiera lo contrario, la referencia a un paso, composición de materia, grupo de pasos o grupo de composiciones de materia individual abarcará una y una pluralidad (es decir uno o más) de dichos pasos, composiciones de materia, grupos de pasos o grupo de composiciones de materia.

La invención se describirá de aquí en adelante por medio de los siguientes Ejemplos y con referencia a las figuras adjuntas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Una representación de síntesis de lípidos en células eucariotas, que muestra la exportación de algunos de los ácidos grasos sintetizados en los plástidos al Retículo Endoplásmico (ER) a través de la Membrana Asociada a Plástidos (PLAM), e importación de algunos de los ácidos grasos en el plásmido de ER para la síntesis de galactolípidos eucariotas. Abreviaciones:

Acetil-CoA y Malonil-CoA: acetil-coenzima A y malonil-coenzimaA;

ACCasa: Acetil-CoA carboxilasa;

FAS: complejo de ácido graso sintasa;

16:0-ACP, 18:0-ACP y 18:1-ACP: proteína portadora C16:0-acill (ACP), proteína portadora C18:0-aciilo, proteína portadora C18:1-acilo;

KAS II: cetoacil-ACP sintasa II (EC 2.3.1.41);

PLPAAT: plastidial LP A AT;

PGP AT: plastidial GPAT;

PAP: PA fosforilasa (EC 3.1.3.4);

G3P: glicerol-3-fosfato;

LPA: ácido lisofosfatídico;

PA: ácido fosfatídico;

DAG: diacil glicerol;

TAG: triacilglicerol;

Acil-CoA y Acil-PC: acil-coenzima A y acil- fosfatidilcolina;

PC: fosfatidilcolina;

GPAT: glicerol-3-fosfato aciltransferasa;

LPAAT: ácido lisofosfatídico etiltransferasa (EC 2.3.1.51);

LPCAT: acil-CoA:lisofosfatidilcolina aciltransferasa; o sinónimos 1-acilglicerofosfocolina O-aciltransferasa; acil-CoA: 1-acil-sn-glicero-3-fosfocolina O-aciltransferasa (EC 2.3.1.23);

CPT: CDP-colina:diacilglicerol colinafosfotransferasa; o sinónimos 1 -alquil-2-acetilglicerol colinafosfotransferasa; alquilacilglicerol colinafosfotransferasa; colinafosfotransferasa; fosforilcolina-glicérido transferasa (EC 2.7.8.2); PDCT: fosfatidilcolina:diacilglicerol colinafosfotransferasa;

PLC: fosfolipasa C (EC 3.1.4.3);

PLD: Fosfolipasa D; colina fosfatasa; lecitinasa D; lipofosfodiesterasa II (EC 3.1.4.4);

PDAT: fosfolípido:diacilglicerol aciltransferasa; o sinónimo fosfolípido: 1-diacil-sn-glicerol O-aciltransferasa (EC 2.3.1.158);

FAD2: ácido grasoA12-desaturasa; FAD3, ácido grasoA15-desaturasa;

UDP-Gal: Uridina difosfato galactosa;

MGDS: monogalactosildiacilglicerol sintasa;

<MGDG: monogalactosildiacilglicerol; DGDG: digalactosildiacilglicerol FAD>6<, 7,>8<: ácido graso plastidial A 12->desaturasa,o3-desaturasa,o3-desaturasa plastidial inducida a baja temperatura, respectivamente.

Figura 2. Mapa genético esquemático de constructos para incrementar el contenido de aceite de semilla en plantas dicotiledóneas. Abreviaciones: PRO Pissa-Vicilin, promotor de vicilin deP isum sa tivu my 5' UTR; líder TMV, 5'UTR de virus de mosaico de tabaco; Arath-DGAT1, región de codificación de proteínas que codifican DGAT1 deA. th a lia n a ;TER Glyma-Lectina, región 3' terminadora/poliadenilación de un gen de lectina deG lyc in e m a x ;PRO Phavu-Faseolina, promotor de un gen de proteína de Faseolina deP h a se o lu s vu lg a ris ;Arath-WRI1, región de codificación de proteína que codifica WRI1 deA. th a lia n a ;TER Agrtu-NOS, región 3' terminadora/poliadeninlación de un gen Nos deA g ro b a c te r iu m tu m e fa c ie n s ;PRO Phavu-PHA, promotor de un gen de faseolina deP h a se o lu s vu lg a ris ;Sesina-Oleosina, región de codificación de proteína que codifica un gen de oleosina deS esa m e in d ic u m ;TER Phavu-PHA, región 3' terminadora/poliadenilación de un gen de faseolina deP h a se o lu s vu lg a ris .

Figura 3. Diagrama esquemático del vector pOIL122. Abreviaciones: TER Agrtu-Nos, terminador de nopalina sintasa deA g ro b a c te r iu m tu m e fa c ie n s ;NPTII, región de codificación de proteína de neomicina fosfotransferasa; PRO CaMV35S-Ex2, promotor de Virus 35S de Mosaico de la Coliflor con región mejoradora doble; Arath-DGAT1, región de codificación de proteína a DGAT1 aciltransferasa deA ra b id o p s is th a lia n a ;PRO Arath-Rubisco SSU, promotor de subunidad pequeña de Rubisco deA. th a lia n a ;Arath-FATA2, región de codificación de proteína FATA2 tioesterasa deA. th a lia n a ;Arath-WRI, región e codificación de proteína del factor de transcripción WRI1 deA. th a lia n a ;TER Glyma-Lectina, terminador del lectina deG lyc in e m a x ;un promotor de TCUP2, promotor constitutivo críptico deN ico tia n a ta b a c u m ; attB 1ya ttB 2 ,sitios de recombinación Gateway; fragmento de NB SDP1, región SDP1 deN ico tia n a b e n th a m ia n aorientadas al silenciamiento de hpRNAi; terminador OCS, terminador de octopina sintasa deA. tu m e fa c ie n s .Las características de cadena principal fuera de la región de T-ADN se derivan de pORE04 (Coutu y colaboradores, 2007).

Figura 4. Perfiles de éster de metilo de ácido graso totales (FAME) (% en peso) ilustra el efecto del fondo de aceite alto mediado por WRI1+DGAT1 en la producción de MCFA en la hoja deN ico tia n a b e n th a m ia n a(n=4). Se observó en la producción de MCFA más alta después de la adición de Arath-WRI1.

Figura 5. Perfiles FAME total de la hoja (% en peso) que induce el efecto de WRI1 en la acumulación de MCFA (n=4). La adición de Arath-WRI1 incrementó en gran medida la producción del ácido graso relevante (C12:0, C14:0 o C16:0) con respecto a la adición previa del Cocnu-LPAAT solo.

Figura 6. Niveles de TFA (% en peso), niveles de TAG, niveles de MCFA (C16:0 y C14:0, % de ácidos grasos totales) en TFA y MCFA en TAG (% de contenido de ácido grasos totales en TAG) en células de planta después de la expresión de las combinaciones de tres DGATs de palma de aceite FATB, LPAAT y WRIT. Los números 1-10 son como se lista en el texto (Ejemplo 9).

Figura 7. Niveles de TAG (% de peso seco de la hoja) en el tejido de la hoja deN. b e n th a m ia n a ,infiltrados con genes que codifican diferentes polipéptidos WRI1 ya sea con (barras de lado derecho) o sin (barras del lado izquierdo) la co-expresión de DGAT1 (n=3). Todas las muestras se infiltraron con el constructo P19 también.

Figura 8. Representación esquemática del constructo de horquilla SDP1 deN. b e n th a m ia n a .Los segmentos genéticos se muestran cómo se describe en el Ejemplo 11. Las abreviaciones son conforme la Figura 3. Los sitiosattBrepresentan sitios de recombinación del vector pHELLSGATE12.

Figura 9. Contenido de TAG en muestras de hojas verdes de plantas de tabaco transformadas en el T-ADN de pOIL51, líneas #61 y #69, recolectadas antes del florecimiento. Las muestras de control (precursoras) fueron de plantas transformadas con el T-ADN de pJP3502.

Figura 10. Niveles de TAG (% de peso seco) en el tejido de raíz y tallo de plantas deN. tabacumde tipo silvestre (wt) transgénicas que contienen el T-ADN de pJP3502 solo o adicionalmente con el T-ADN de pOIL051.

Figura 11. Niveles de TAG (% de peso seco) en el tejido de raíz y tallo de plantas deN. tabacumde tipo silvestre (wt) y transgénicas que contienen el T-ADN de pJP3502 solo o adicionalmente con el T-ADN de pOIL049.

Figura 12. Contenido de TAG en las muestras de plantas de tabaco transformadas en etapa de establecimiento de la semilla de crecimiento, transformadas con el T-ADN de pOIL049, líneas #23c y #32b. Las muestras de control (precursores) fueron de plantas transformadas con el T-ADN de pJP3502. La línea superior muestra el porcentaje 18:2 en el TAG y la línea inferior muestra el porcentaje 18:3 (ALA) en el contenido de ácido graso.

Figuras 13A y 13B. Figura 13A. Contenido de almidón en el tejido de la hoja de plantas de tipo silvestre (WT) y plantas transgénicas que contienen el T-ADN de pJP3502 (control h O) o los T-ADNs tanto pJP3502 como pOIL051 (pOIL51.61 y pOIL51.69) o tanto pJP3502 como pOIL049 (pOIL49.32b). Los datos representan resultados combinados de al menos tres plantas individuales.Figura 13B. Correlación de entre el contenido de almidón y TAG en el tejido de hoja de las plantas de tipo silvestre (WT) y plantas transgénicas que contienen el T-ADN de pJP3502 (control h O) o T-ADNs de tanto pJP3502 como pOIL051 (pOIL51.61 y pOIL51.69) o tanto pJP3502 como pOIL049 (pOIL49.32b). Los datos representan los resultados combinados de al menos tres plantas individuales.

Figura 14. Representación esquemática del vector binario pTV55. Abreviaciones: PRO, promotor; TER, región 3' terminación/poliadenilación; Arath,A. thaliana;Linus,Linum usitatissimum;Nicta,Nicotiana tabacum;Glyma,G. max;Cn11, conlinina 1 de lino; Cnl2, Conlinina 2 de lino; MAR Nicat-RB7, región de unión de matriz del tabaco RB7, o como en la Figura 3. Abreviaciones de los genes MGAT2, DGAT1, GPAT4, WRI1 como en el texto.

Figura 15. Contenido de aceite (%) de semillas T2 deC. sativatransformadas con pTV55, pTV56 y pTV57 como se determina por la NMR. Cada punto de datos representa el contenido de aceite promedio de tres lotes independientes de 50 mg de semillas para cada línea transgénica. Las semillas de control negativas fueron semillas deC. sativuna(no transformadas) de tipo silvestre, desarrolladas bajo las mismas condiciones en el invernadero. N indica el número de eventos transgénicos independientes para cada constructo.

Figura 16. Árbol filogenético de polipéptidos LDAP (Ejemplo 15).

Figura 17. Representación esquemática del constructo genético pJP3506 que incluye la región T-ADN entre los límites izquierdos y derechos. Las abreviaciones son conforme la Figura 3 y: Sesina-Oleosina, región de codificación de proteína oleosina deSesame indicum.

Figura 18. Rendimiento y cambios de valor caloríficos para la producción de biocombustible por HTP de material de planta vegetativo de tabaco con alto contenido de aceite, tipo silvestre y transgénico como alimento.

CLAVE PARA EL LISTADO DE SECUENCIAS

SEQ ID NO: 1 polipéptido de DGAT1 deArabidopsis thaliana(CAB44774.1)

SEQ ID NO: 2 polipéptido de DGAT2Arabidopsis thaliana (NP_566952.1)

SEQ ID NO: 3 polipéptido de DGAT2Ricinus communis(AAY16324.1)

SEQ ID NO: 4 polipéptido de DGAT2 deVernicia fordii(ABC94474.1)

SEQ ID NO: 5 polipéptido de DGAT2 deMortierella ramanniana(AAK84179.1)

SEQ ID NO: 7 polipéptido de DGAT2 deHomo sapiens(Q58HT5.1)

SEQ ID NO: 9 polipéptido de DGAT2 deMus musculus(AAK84175.1)

SEQ ID NO: 10 motivo de secuencia DGAT2 y/o MGAT1/2 conservado con tripéptido YFP

SEQ ID NO: 11 motivo de secuencia DGAT2 y/o MGAT1/2 conservado con tetrapéptido HPHG

SEQ ID NO: 12 motivo de secuencia DGAT2 vegetal conservado con tetrapéptido EPHS

SEQ ID NO: 13 RXGFX(K/R)XAXXXGXXX(L/V)VPXXXFG(E/Q) -motivo de secuencia conservado largo de DGAT2 que forma parte del dominio putativo de fosfolípido glicerol

SEQ ID NO: 14 FLXLXXXN - motivo de secuencia conservado de DGAT2 y MGAT1/2 de ratón que es un dominio de unión de lípidos neutro putativo

SEQ ID NO: 15 dominio plsC aciltransferasa (PF01553) de GPAT

SEQ ID NO: 16 dominio de la superfamilia de hidrolasa tipo HAD (PF12710) de GPAT

SEQ ID NO: 17 dominio de fosfoserina fosfatasa (PF00702). GPAT4-8 contiene una región N-terminal homóloga de este dominio

SEQ ID NO: 18 secuencia de aminoácidos GDLVICPEGTTCREP conservada de GPAT

SEQ ID NO: 19 secuencia de aminoácidos conservada de GPAT/fosfatasa (Motivo I)

SEQ ID NO: 20 secuencia de aminoácidos conservada de GPAT/fosfatasa (Motivo III)

SEQ ID NO: 21 polinucleótido WRI1 deArabidopsis thaliana(A8MS57)

SEQ ID NO: 22 polipéptido WRI1 deArabidopsis thaliana(Q6X5Y6)

SEQ ID NO: 23 polipéptido WRI1 deArabidopsis lyratasubsp.lyrata(XP_002876251.1)

SEQ ID NO: 24 polipéptido WRI1 deBrassica napus(ABD16282.1)

SEQ ID NO: 25 polipéptido WRI1 deBrassica napus(ADO16346.1)

SEQ ID NO: 26 polipéptido WRI1 deGlycine max(XP_003530370.1)

SEQ ID NO: 27 polipéptido WRI1 deJatropha curcas(AEO22131.1)

SEQ ID NO: 28 polipéptido WRI1 deRicinus communis(XP_002525305.1)

SEQ ID NO: 29 polipéptido WRI1 dePopulus trichocarpa(XP_002316459.1)

SEQ ID NO: 30 polipéptido WRI1 deVitis vinifera(CBI29147.3)

SEQ ID NO: 31 polipéptido WRI1 deBrachypodium distachyon(XP_003578997.1)

SEQ ID NO: 32 polipéptido WRI1 deHordeum vulgaresubsp.vulgare(BAJ86627.1)

SEQ ID NO: 33 polipéptido WRI1 deOryza sativa(EAY79792.1)

SEQ ID NO: 34 polipéptido WRI1 deSorghum bicolor(XP_002450194.1)

SEQ ID NO: 35 polipéptido WRI1 deZea mays(ACG32367.1)

SEQ ID NO: 36 polipéptido WRI1 deBrachypodium distachyon(XP_003561189.1)

SEQ ID NO: 37 polipéptido WRI1 deBrachypodium sylvaticum(ABL85061.1)

SEQ ID NO: 38 polipéptido WRI1 deOryza sativa(BAD68417.1)

SEQ ID NO: 39 polipéptido WRI1 deSorghum bicolor(XP_002437819.1)

SEQ ID NO: 40 polipéptido WRI1 deSorghum bicolor(XP_002441444.1)

SEQ ID NO: 41 polipéptido WRI1 deGlycine max(XP_003530686.1)

SEQ ID NO: 42 polipéptido WRI1 deGlycine max(XP_003553203.1)

SEQ ID NO: 43 polipéptido WRI1 dePopulus trichocarpa(XP_002315794.1)

SEQ ID NO: 44 polipéptido WRI1 deVitis vinifera(XP_002270149.1)

SEQ ID NO: 45 polipéptido WRI1 deGlycine max(XP_003533548.1)

SEQ ID NO: 46 polipéptido WRI1 deGlycine max(XP_003551723.1)

SEQ ID NO: 47 polipéptido WRI1 deMedicago truncatula(XP_003621117.1)

SEQ ID NO: 48 polipéptido WRI1 dePopulus trichocarpa(XP_002323836.1)

SEQ ID NO: 49 polipéptido WRI1 deRicinus communis(XP_002517474.1)

SEQ ID NO: 50 polipéptido WRI1 deVitis vinifera(CAN79925.1)

SEQ ID NO: 51 polipéptido WRI1 deBrachypodium distachyon(XP_003572236.1)

SEQ ID NO: 52 polipéptido WRI1 deOryza sativa(BAD10030.1)

SEQ ID NO: 53 polipéptido WRI1 deSorghum bicolor(XP_002444429.1)

SEQ ID NO: 54 polipéptido WRI1 deZea mays(NP_001170359.1)

SEQ ID NO: 55 polipéptido WRI1 deArabidopsis lyrata subsp. lyrata(XP_002889265.1)

SEQ ID NO: 56 polipéptido WRI1 deArabidopsis thaliana(AAF68121.1)

SEQ ID NO: 57 polipéptido WRI1 deArabidopsis thaliana(NP_178088.2)

SEQ ID NO: 58 polipéptido WRI1 deArabidopsis lyrata subsp. lyrata(XP_002890145.1)

SEQ ID NO: 59 polipéptido WRI1 deThellungiella halophila(BAJ33872.1)

SEQ ID NO: 60 polipéptido WRI1 deArabidopsis thaliana(NP_563990.1)

SEQ ID NO: 61 polipéptido WRI1 deGlycine max(XP_003530350.1)

SEQ ID NO: 62 polipéptido WRI1 deBrachypodium distachyon(XP_003578142.1)

SEQ ID NO: 63 polipéptido WRI1 deOryza sativa(EAZ09147.1)

SEQ ID NO: 64 polipéptido WRI1 deSorghum bicolor(XP_002460236.1)

SEQ ID NO: 65 polipéptido WRI1 deZea mays(NP_001146338.1)

SEQ ID NO: 66 polipéptido WRI1 deGlycine max(XP_003519167.1)

SEQ ID NO: 67 polipéptido WRI1 deGlycine max(XP_003550676.1)

SEQ ID NO: 68 polipéptido WRI1 deMedicago truncatula(XP_003610261.1)

SEQ ID NO: 69 polipéptido WRI1 deGlycine max(XP_003524030.1)

SEQ ID NO: 70 polipéptido WRI1 deGlycine max(XP_003525949.1)

SEQ ID NO: 71 polipéptido WRI1 dePopulus trichocarpa(XP_002325111.1)

SEQ ID NO: 72 polipéptido WRI1 deVitis vinifera(CBI36586.3)

SEQ ID NO: 73 polipéptido WRI1 deVitis vinifera(XP_002273046.2)

SEQ ID NO: 74 polipéptido WRI1 dePopulus trichocarpa(XP_002303866.1)

SEQ ID NO: 75 polipéptido WRI1 deVitis vinifera(CBI25261.3)

SEQ ID NO: 76 Sorbi-WRL1

SEQ ID NO: 77 Lupan-WRL1

SEQ ID NO: 78 Ricco-WRL1

SEQ ID NO: 79 polipéptido WRI1 deLupin angustifoliuspolipéptido WRI1

SEQ ID NO: 80 polipéptido DGAT1 deAspergillus fumigatus(X_755172.1)

SEQ ID NO: 81 polipéptido DGAT1 deRicinus communis(AAR11479.1)

SEQ ID NO 82 polipéptido DGAT1 deVemicia fordii(ABC94472.1)

SEQ ID NO 83 polipéptido DGAT1 deVernonia galamensis(ABV21945.1)

SEQ ID NO 84 polipéptido DGAT1 deVernonia galamensis(ABV21946.1)

SEQ ID NO 85 polipéptido DGAT1 deEuonymus alatus(AAV31083.1)

SEQ ID NO 86 polipéptido DGAT1 deCaenorhabditis elegans(AAF82410.1)

SEQ ID NO 87 polipéptido DGAT1 deRattus norvegicus(NP_445889.1)

SEQ ID NO 88 polipéptido DGAT1 deHomo sapiens(NP_036211.2)

SEQ ID NO 89 motivo WRI1 (R G V T/S R H R W T G R)

SEQ ID NO 90 motivo WRI1 (F/Y E A H L W D K)

SEQ ID NO 91 motivo WRI1 (D L A A L K Y W G)

SEQ ID NO 92 motivo WRI1 (S X G F S/A R G X)

SEQ ID NO 93 motivo WRI1 (H H H/Q N G R/K W E A R I G R/K V)

SEQ ID NO 94 motivo WRI1 (Q E E A A A X Y D)

SEQ ID NO 95 polipéptido de oleosina deBrassica napus(CAA57545.1)

SEQ ID NO 96 polipéptido de oleosina S1-1 deBrassica napus(ACG69504.1)

SEQ ID NO 97 polipéptido de oleosina S2-1 deBrassica napus(ACG69503.1)

SEQ ID NO 98 polipéptido de oleosina S3-1 deBrassica napus(ACG69513.1)

SEQ ID NO 99 polipéptido de oleosina S4-1 deBrassica napus(ACG69507.1)

SEQ ID NO 100 pol péptido de oleosina S5-1 deBrassica napus(ACG69511.1)

SEQ ID NO 101 pol péptido de oleosina 1 deArachis hypogaea(AAZ20276.1)

SEQ ID NO 102 pol péptido de oleosina 2 deArachis hypogaea(AAU21500.1)

SEQ ID NO 103 pol péptido de oleosina 3 deArachis hypogaea(AAU21501.1)

SEQ ID NO 104 pol péptido de oleosina 5 deArachis hypogaea(ABC96763.1)

SEQ ID NO 105 pol péptido de oleosina 1 deRicinus communis(EEF40948.1)

SEQ ID NO 106 pol péptido de oleosina 2 deRicinus communis(EEF51616.1)

SEQ ID NO 107 pol péptido de la isoterma a de oleosina deGlycine max(P29530.2)

SEQ ID NO 108 pol péptido de la isoterma b de oleosina deGlycine max(P29531.1)

SEQ ID NO 109 polipéptido de la isoterma de bajo peso molecular de oleosina deLinum usitatissimum(ABB01622.1)

SEQ ID NO: 110 secuencia de aminoácidos del polipéptido de la isoforma de alto peso molecular de oleosina deLinum usitatissimum(ABB01624.1)

SEQ ID NO: 111 polipéptido de oleosina deHelianthus annuus(CAA44224.1)

SEQ ID NO: 112 polipéptido de oleosina deZea mays(NP_001105338.1)

SEQ ID NO: 113 polipéptido de esteroleosina deBrassica napus(ABM30178.1)

SEQ ID NO: 114 polipéptido de esteroleosina SLO1-1 deBrassica napus(ACG69522.1)

SEQ ID NO: 115 polipéptido de esteroleosina SLO2-1 deBrassica napus(ACG69525.1)

SEQ ID NO: 116 polipéptido de esteroleosina deSesamum indicum(AAL13315.1)

SEQ ID NO: 117 polipéptido de esteroleosina deZea mays(NP_001152614.1)

SEQ ID NO: 118 polipéptido de caleosina CLO-1 deBrassica napus(ACG69529.1)

SEQ ID NO: 119 polipéptido de caleosina CLO-3 deBrassica napus(ACG69527.1)

SEQ ID NO: 120 polipéptido de caleosina deSesamum indicum(AAF13743.1)

SEQ ID NO: 121 polipéptido de caleosina deZea mays(NP_001151906.1)

SEQ ID NO: 122 secuencia de T-ADN del pJP3502 (insertada en el genoma)

SEQ ID NO: 123 secuencia del vector pJP3507

SEQ ID NO: 124 secuencia conectora

SEQ ID NO: 125 secuencia parcial de CGI-58 deN. benthamiana Nicotianaseleccionada para el silenciamiento con hpARNi (pTV46)

SEQ ID NO: 126 secuencia parcial de AGPasa deN. tabacumseleccionada para el silenciamiento con hpARNi (pTV35)

SEQ ID NO: 127 motivo de lipasa GXSXG

SEQ ID NO: 128 motivo de aciltransferasa HX(4)D

SEQ ID NO: 129 probable motivo de unión a lípidos VX(3)HGF

SEQ ID NO: 130 polinucleótido CGi58 deArabidopsis thaliana(NM_118548.1)

SEQ ID NO: 131 polinucleótido CGi58 deBrachypodium distachyon(XM_003578402.1)

SEQ ID NO: 132 polinucleótido CGi58 deGlycine max(XM_003523590.1)

SEQ ID NO: 133 polinucleótido CGi58 deZea mays(NM_001155541.1)

SEQ ID NO: 134 polinucleótido CGi58 deSorghum bicolor(XM_002460493.1)

SEQ ID NO: 135 polinucleótido CGi58 deRicinus communis(XM_002510439.1)

SEQ ID NO: 136 polinucleótido CGi58 deMedicago truncatula(XM_003603685.1)

SEQ ID NO: 137 polinucleótido LEC2 deArabidopsis thaliana(NM_102595.2)

SEQ ID NO: 138 polinucleótido LEC2 deMedicago truncatula(X60387.1)

SEQ ID NO: 139 polinucleótido LEC2 deBrassica napus(HM370539,1)

SEQ ID NO: 140 polinucleótido BBM deArabidopsis thaliana(NM_121749.2)

SEQ ID NO: 141 polinucleótido BBM deMedicago truncatula(AY899909,1)

SEQ ID NO: 142 polipéptido LEC2 deArabidopsis thaliana(NP_564304.1)

SEQ ID NO: 143 polipéptido LEC2 deMedicago truncatula(CAA42938.1)

SEQ ID NO: 144 polipéptido LEC2 deBrassica napus(ADO16343.1)

SEQ ID NO: 145 polipéptido BBM deArabidopsis thaliana(NP_197245.2)

SEQ ID NO: 146 polipéptido BBM deMedicago truncatula(AAW82334.1)

SEQ ID NO: 147 promotor inducible alcA deAspergilus niger

SEQ ID NO: 148 inductor AlcR que activa al promotor AlcA en la presencia de etanol

SEQ ID NO:149 LEC1 deArabidopsis thaliana;(AAC39488)

SEQ ID NO:150 LEC1 deArabidopsis lyrata(XP_002862657)

SEQ ID NO:151 LEC1 deBrassica napus(ADF81045)

SEQ ID NO:152 LEC1 deRicinus communis(XP_002522740)

SEQ ID NO:153 LEC1 deGlycinemax (XP_006582823)

SEQ ID NO:154 LEC1 deMedicago truncatula(AFK49653)

SEQ ID NO:155 LEC1 deZea mays(AAK95562)

SEQ ID NO:156 LEC1 deArachis hypogaea(ADC33213)

SEQ ID NO:157 similar a LEC1 deArabidopsis thaliana(AAN15924)

SEQ ID NO:158 similar a LEC1 deBrassica napus(AHI94922)

SEQ ID NO:159 similar a LEC1 dePhaseolus coccineus(AAN01148)

SEQ ID NO:160 FUS3 deArabidopsis thaliana(AAC35247)

SEQ ID NO:161 FUS3 deBrassica napus

SEQ ID NO:162 FUS3 deMedicago truncatula

SEQ ID NO:163 secuencia SDP1 ADNc deArabidopsis thaliana,No. de acceso NM_120486, 3275nt

SEQ ID NO:164 SDP1 ADNc deBrassica napus;No. de acceso GN078290

SEQ ID NO:165 SDP1 ADNc deBrachypodium distachyon,2670nt

SEQ ID NO:166 SDP1 ADNc dePopulus trichocarpa,3884nt

SEQ ID NO:167 SDP1 ADNc deMedicago truncatula;XM_003591377; 2490nt

SEQ ID NO:168 SDP1 ADNc deGlycine maxXM_003521103; 2783nt

SEQ ID NO:169 SDP1 ADNc deSorghum bicolorXM_002458486; 2724nt

SEQ ID NO:170 SDP1 ADNc deZea mays,NM_001175206; 2985nt

SEQ ID NO:171 SDP1 ADNc dePhyscomitrella patens,XM_001758117; 1998nt

SEQ ID NO:172 SDP1 ADNc deHordeum vulgare,AK372092; 3439nt

SEQ ID NO:173 SDP1 ADNc deNicotiana benthamiana,Nbv5tr6404201

SEQ ID NO:174 región SDP1 ADNc deNicotiana benthamianaorientada para silenciamiento hpRNAi

SEQ ID NO:175 Promotor del genSDP1deArabidopsis thaliana,1.5kb

SEQ ID NO:176 Secuencia de nucleótidos del complemento del gen pSSU-Oleosina en el T-ADN de pJP3502. En orden (secuencias complementarias): terminador de Lectina deGlycine max348nt, exón 3' 255nt, intrón UBQ10304nt, exón 5' 213nt, promotor SSU 1751nt

SEQ ID NO:177 GPAT ADNc plastidial deArabidopsis thaliana,NM_179407

SEQ ID NO:178 polipéptido g Pa T plastidial deArabidopsis thaliana,NM_179407

SEQ ID NO:179 GA<t>ADNc plastidial dePopulus trichocarpa,XP_006368351

SEQ ID NO:180 GPAT ADNc plastidial deJatropha curcas,ACR61638

SEQ ID NO:181 GPAT ADNc plastidial deRicinus communis,XP_002518993

SEQ ID NO:182 GPAT ADNc plastidial deHelianthus annuus,ADV16382

SEQ ID NO:183 GPAT ADNc plastidial deMedicago truncatula,XP_003612801

SEQ ID NO:184 GPAT ADNc plastidial deGlycine max,XP_003516958

SEQ ID NO:185 GPAT ADNc plastidial deCarthamus tinctorius,CAHG3PACTR

SEQ ID NO:186 GPAT ADNc plastidial deSolanum tuberosum,XP_006352898

SEQ ID NO:187 GPAT ADNc plastidial deOryza sativa,Japonica, NM_001072027

SEQ ID NO:188 GPAT ADNc plastidial deSorghum bicolor,XM_002467381

SEQ ID NO:189 GPAT ADNc plastidial deZea mays,NM_001158637

SEQ ID NO:190 GPAT ADNc plastidial deHordeum vulgare,AK371419

SEQ ID NO:191 GPAT ADNc plastidial dePhyscomitrella patens,XM_001771247

SEQ ID NO:192 GPAT ADNc plastidial deChlamydomonas reinhardtii,XM_001694925

SEQ ID NO:193 14:0-ACP tioesterasa deCinnamomum camphora(Cinca-TE), cloroplástica, 382aa, (No. de acceso Q39473.1)

SEQ ID NO:194 acil-ACP tioesterasa FatB1 deCocos nucifera(Cocnu-TE1; 417aa, No. de acceso AEM72519.1 SEQ ID NO:195 acil-ACP tioesterasa FatB2 deCocos nucifera(Cocnu-TE2; 423aa, No. de acceso AEM72520.1) SEQ ID NO:196 acil-ACP tioesterasa FatB3 deCocos nucifera(Cocnu-TE3; 414aa, No. de acceso AEM72521.1) SEQ ID NO:197 acil(ACP) tioesterasa tipo B deCuphea lanceolata(Cupla-TE, 419aa, No. de acceso CAB60830.1) SEQ ID NO:198 FatB1 deCuphea viscosissima(Cupvi-TE; 419aa, No. de acceso AEM72522.1)

SEQ ID NO:199 12:0-ACP tioesterasa (proteína portadora de Lauroil-acilo tioesterasa) deUmbellularia californica(Umbca-TE, 382aa; No. de acceso Q41635.1)

SEQ ID NO:200 LPAAT deCocos nucifera(Cocnu-LPAAT, 308aa, No. de acceso Q42670.1)

SEQ ID NO:201 LPAAT1 plastidial deArabidopsis thaliana(Arath-PLPAAT; 356aa, No. de acceso AEE85783.1) SEQ ID NO:202 FATA1 deArabidopsis thaliana

SEQ ID NO:203 FATA2 deArabidopsis thaliana

SEQ ID NO:204 FATAB deArabidopsis thaliana

SEQ ID NO:205 WRI3 deArabidopsis thaliana

SEQ ID NO:206 WRI4 deArabidopsis thaliana

SEQ ID NO:207 WRI1 deAvena sativa

SEQ ID NO:208 WRI1 deSorghum bicolor

SEQ ID NO:209 WRI1 deZea mays

SEQ ID NO:210 WRI1 deTriadica sebifera

SEQ ID NO:211 secuencia promotora B33 de S.tuberosumPatatin

SEQ ID NOs 212 cebadores de oligonucleótidos de 215 y 245 a 254

SEQ ID NO:216 región promotora SEE1 deZ. mays(1970nt de Número de acceso AJ494982)

SEQ ID NO:217 secuencia promotora AISAP deA. littoralis,Número de acceso DQ885219

SEQ ID NO:218 secuencia promotora ArRolC deA. rhizogenes,No. de acceso DQ160187

SEQ ID NO:219 constructo hpRNAi que contiene un fragmento 732bp de GPAT plastidial deN. benthamiana

SEQ ID NO:220 DGAT1 (aceite de palma) deElaeis guineensis

SEQ ID NO:221 MYB73 deG. max,No. de acceso ABH02868

SEQ ID NO:222 bZIP53 deA. thaliana,No. de acceso AAM14360

SEQ ID NO:223 AGL15 deA. thaliana,Número de acceso NP_196883

SEQ ID NO:224 MYB118 deA. thaliana,No. de acceso AAS58517

SEQ ID NO:225 MYB115 deA. thaliana,No. de acceso AAS10103

SEQ ID NO:226 TANMEIde A. thaliana,No. de acceso BAE44475

SEQ ID NO:227 WUS deA. thaliana,No. de acceso NP_565429

SEQ ID NO:228 GFR2a1 deB. napus,No. de acceso AFB74090

SEQ ID NO:229 GFR2a2 deB. napus,No. de acceso AFB74089

SEQ ID NO:230 PHR1 deA. thaliana,No. de acceso AAN72198

SEQ ID NO:231 fragmento TGD1 deN. benthamiana

SEQ ID NO:232 aminoácido SDP1 de papa

SEQ ID NO:233 secuencia de nucleótidos SDP1 de papa

SEQ ID NO:234 subunidad pequeña AGPasa de papa

SEQ ID NO:235 secuencia de nucleótidos de subunidad pequeña AGPasa de papa:

SEQ ID NO:236 secuencia de nucleótidos LDAP-1 deSapium sebiferum

SEQ ID NO:237 secuencia de aminoácidos LDAP-1 deSapium sebiferum

SEQ ID NO:238 secuencia de nucleótidos LDAP-2 deSapium sebiferum

SEQ ID NO:239 secuencia de aminoácidos LDAP-2 deSapium sebiferum

SEQ ID NO:240 secuencia de nucleótidos LDAP-3 deSapium sebiferum

SEQ ID NO:241 secuencia de aminoácidos LDAP-3 deSapium sebiferum

SEQ ID NO:242 SDP1 de S.bicolor(Número de acceso XM_002463620)

SEQ ID NO:243 secuencia de nucleótidos SDP1 deT. aestivum(Número de acceso AK334547)

SEQ ID NO:244 fragmento SDP1 hpARNi de S.bicolor.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Técnicas generales

A menos que específicamente se defina de otra manera, se considera que todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que el conocido comúnmente por el especialista en el arte (por ejemplo, en cultivo celular, genética molecular, inmunología, inmunohistoquímica, química de proteínas, química de lípidos y ácidos grasos, producción de biocombustible y bioquímica).

A menos que se indique de otra manera, las técnicas de proteínas recombinantes, de cultivo celular e inmunológicas utilizadas en la presente invención son procedimientos estándar, bien conocidos por los especialistas en el arte. Dichas técnicas se describen y explican en la literatura en fuentes tales como, J. Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning,John Wiley y Sons (1984), J. Sambrook y colaboradores,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T.A. Brown (editor),Essential Molecular Biology: A Practical Approach,Volúmenes 1 y 2, IRL Press (1991), D.M. Glover y B.D. Hames (editores),DNA Cloning: A Practical Approach,Volúmenes 1-4, IRL Press (1995 y 1996), F.M. Ausubel y colaboradores, (editores),Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub. Associates y Wiley-Interscience (1988, incluyendo todas las actualizaciones hasta el presente), Ed Harlow y David Lane (editores),Antibodies: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), y J.E. Coligan y colaboradores, (editores),Current Protocols in Immunology,John Wiley & Sons (incluyendo todas las actualizaciones hasta el presente).

Definiciones seleccionadas

El término “organismo no humano transgénico” se refiere, por ejemplo, a una planta completa, un alga, un animal no humano o un organismo adecuado para la fermentación tal como una levadura o un hongo, que comprende un polinucleótido exógeno (transgen) o un polipéptido exógeno. En una realización, el organismo no humano transgénico no es un animal o una parte del mismo. En una realización, el organismo no humano transgénico es un organismo fototrófico (por ejemplo, una planta o un alga) capaz de obtener energía de la luz solar para sintetizar compuestos orgánicos para su nutrición.

El término “exógeno” en el contexto de un polinucleótido o polipéptido hace referencia al polinucleótido o polipéptido cuando está presente en una célula que naturalmente no comprende el polinucleótido o polipéptido. Dicha célula es referida en la presente memoria como “célula recombinante” o una “célula transgénica”. En una realización, el polinucleótido o polipéptido exógeno es de un género diferente al de la célula que comprende el polinucleótido o polipéptido exógeno. En otra realización, el polinucleótido o polipéptido exógeno es de una especie diferente. En una realización el polinucleótido o polipéptido exógeno se expresa en una planta o célula vegetal hospedadora y el polinucleótido o polipéptido exógeno es de una especie o género diferente. El polinucleótido o polipéptido exógeno puede ser de origen no natural, tal como, por ejemplo, una molécula de ADN sintética que ha sido producida por métodos de ADN recombinante. La molécula de ADN puede, con frecuencia preferentemente, incluir una región que codifica para una proteína que se le han optimizado los codones para la expresión en la célula, produciendo de este modo un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que el polipéptido de origen natural, aunque la secuencia de nucleótidos de la región que codifica para la proteína no es de origen natural. El polinucleótido exógeno puede codificar, o puede ser el polipéptido exógeno: una diacilglicerol aciltransferasa (DGAT) tal como una DGAT1 o una DGAT2, , un factor de transcripción Wrinkled 1 (WRI1), un OBC como una Oleosina o preferiblemente un LDAP, una tioesterasa de ácido graso como los polipéptidos FATA o FATB, o un polipéptido supresor por silenciamiento.

Como se usa en la presente memoria, el término “ lípido extraído” se refiere a una composición extraída de un organismo transgénico, o una parte del mismo, que comprende al menos un 60% (peso en peso) del lípido.

Como se usa en la presente memoria, el término “ lípido no polar” se refiere a ácidos grasos y derivados de los mismos, que son solubles en solventes orgánicos pero insolubles en agua. Los ácidos grasos pueden ser ácidos grasos libres y/o se pueden encontrar en una forma esterificada. Los ejemplos de formas esterificadas incluyen, pero en un sentido no limitativo, triacilglicerol (TAG), diacilglicerol (DAG), monoacilglicerol (MAG). Los lípidos no polares también incluyen esteroles, ésteres esterol y ésteres de ceras. Los lípidos no polares también se conocen como “lípidos neutros”. El lípido no polar típicamente es líquido a temperatura ambiente. Preferentemente, el lípido no polar comprende predominantemente (>50%) ácidos grasos que son de al menos 16 carbonos de longitud. Más preferentemente, al menos un 50% de los ácidos grasos totales en el lípido no polar son ácidos grasos de C18 como por ejemplo ácido oleico. En una realización, al menos un 50%, más preferentemente al menos un 70%, más preferentemente al menos un 80%, más preferentemente al menos un 90%, más preferentemente al menos un 91%, más preferentemente al menos un 92%, más preferentemente al menos un 93%, más preferentemente al menos un 94%, más preferentemente al menos un 95%, más preferentemente al menos un 96%, más preferentemente al menos un 97%, más preferentemente al menos un 98%, más preferentemente al menos un 99% de los ácidos grasos en el lípido no polar producido por el proceso de la invención se pueden encontrar como TAG. El lípido no polar se puede purificar o tratar además, por ejemplo mediante hidrólisis con una base fuerte para liberar el ácido graso libre, o mediante fraccionamiento, destilación o semejantes. El lípido no polar puede estar presente o ser obtenido de partes de plantas tales como semilla, hojas o frutos, de células recombinantes o de organismos no humanos tal como levaduras. El lípido no polar producido por el proceso de la invención puede formar parte del “aceite de semillas” si es obtenido de la semilla.

Las concentraciones de esterol libre y esterificado (por ejemplo, sitoesterol, campesterol, estigmaesterol, brassicaesterol, D5-avenaesterol, sitostanol, campestanol y colesterol) en los lípidos extraídos pueden ser como se describe en Phillips y colaboradores, 2002. Los esteroles en los aceites de semillas están presentes como alcoholes libres, ésteres con ácidos grasos (esteroles esterificados), glicósidos y glicósidos acilados de esteroles. Las concentraciones de esteroles en aceites vegetales de origen natural (aceites de semilla) varían hasta un máximo de aproximadamente 1100mg/100g. El aceite de palma hidrogenado tiene una de las concentraciones más bajas de aceites vegetales de origen natural de aproximadamente 60mg/100g. Los aceites de semillas recuperados o extraídos como se describe en la presente memoria preferentemente tienen entre aproximadamente 100 y aproximadamente 1000mg de esterol total/100g de aceite. Para su uso en alimentos o alimentación, se prefiere que los esteroles estén presentes como formas libres o esterificadas en lugar de formas glicosiladas. En los aceites de semillas como se describe en la presente memoria, preferentemente al menos 50% de los esteroles en los aceites están presentes como esteroles esterificados, excepto para el aceite de semillas de soja que tiene aproximadamente 25% de los esteroles esterificados. El aceite de semillas de canola y aceite de semillas de colza como se describe en la presente memoria preferentemente tienen entre aproximadamente 500 y aproximadamente 800 mg de esterol total/100g, con sitoesterol como el esterol principal y campesterol el más abundante. El aceite de semillas de maíz como se describe en la presente memoria preferentemente tiene entre aproximadamente 600 y aproximadamente 800 mg de esterol total/100g, con sitoesterol como esterol principal. El aceite de semillas de soja como se describe en la presente memoria preferentemente tiene entre aproximadamente 150 y aproximadamente 350 mg de esterol total/100g, con sitoesterol como el esterol principal y estigmasterol como el más abundante, y con más esterol libre que esterol esterificado. El aceite de semillas de algodón como se describe en la presente memoria preferentemente tiene entre aproximadamente 200 y aproximadamente 350 mg de esterol total/100g, con sitoesterol como el esterol principal. El aceite de coco y el aceite de palma como se describe en la presente memoriapreferentemente tienen entre aproximadamente 50 y aproximadamente 100mg de esterol total/100g, con sitoesterol como el esterol principal. El aceite de semillas de cártamo como se describe en la presente memoria preferentemente tiene entre aproximadamente 150 y aproximadamente 250mg de esterol total/100g, con sitoesterol como el esterol principal. El aceite de maní como se describe en la presente memoria preferentemente tiene entre aproximadamente 100 y aproximadamente 200mg de esterol total/100g, con sitoesterol como el esterol principal. El aceite de semillas de sésamo como se describe en la presente memoria preferentemente tiene entre aproximadamente 400 y aproximadamente 600mg de esterol total/100g, con sitoesterol como el esterol principal. El aceite de girasol como se describe en la presente memoria preferentemente tiene entre aproximadamente 200 y 400mg de esterol total/100g, con sitoesterol como el esterol principal. Los aceites obtenidos de partes de plantas vegetativas como se describe en la<presente memoria preferentemente tienen menos de>200<mg de esterol total/>100<g, más preferentemente menos de>100<mg de esterol total/100 g, y aún más preferentemente menos de 50mg de esteroles totales/>100<g, siendo la mayor parte de>los esteroles, esteroles libres.

Como se usa en la presente memoria, el término “aceite de semillas” se refiere a una composición obtenida a partir de semillas/granos de una planta que comprende al menos un 60% (peso en peso) de lípidos, o que se puede obtener a partir de semillas/granos si el aceite de semillas aún está presente en dichas semillas/granos. Es decir, el aceite de semillas como se describe en la presente memoria incluye un aceite de semillas que está presente en dichas semillas/granos o en una porción de los mismos, así como un aceite de semillas que ha sido extraído de las semillas/granos. El aceite de semillas preferentemente es un aceite de semillas extraído. Típicamente el aceite de semillas es un líquido a temperatura ambiente. Preferentemente, el contenido de ácidos grasos totales (TFA) en el aceite de semillas comprende predominantemente (>50%) ácidos grasos que tienen al menos 16 carbonos de longitud. Más preferentemente, al menos un 50% de los ácidos grasos totales en el aceite de semillas son ácidos grasos de C18 como por ejemplo ácido oleico. Los ácidos grasos típicamente se pueden encontrar en una forma esterificada tal como, por ejemplo, TAG, DAG, acil-CoA o fosfolípido. Los ácidos grasos pueden ser ácidos grasos libres y/o se pueden encontrar en una forma esterificada. En un aspecto, al menos un 50%, más preferentemente al menos un 70%, más preferentemente al menos un 80%, más preferentemente al menos un 90%, más preferentemente al menos un 91%, más preferenteme al menos un 92%, más preferentemente al menos un 93%, más preferentemente al menos un 94%, más preferenteme al menos un 95%, más preferentemente al menos un 96%, más preferentemente al menos un 97%, más preferenteme al menos un 98%, más preferentemente al menos un 99% de los ácidos grasos en el aceite de semillas de la invención se pueden encontrar como TAG. En un aspecto, el aceite de semillas como se describe en la presente memoria es un aceite “sustancialmente purificado” o “purificado” que fue separado de uno o más lípidos adicionales, ácidos nucleicos, polipéptidos u otras moléculas contaminantes con los cuales está asociado en la semilla o en un extracto crudo. Se prefiere que el aceite de semillas sustancialmente purificado esté al menos un 60% libre, más preferentemente al menos un 75%

libre y, más preferentemente, al menos un 90% libre de otros componentes con los cuales esté asociado en la semilla o el extracto. El aceite de semillas como se describe en la presente memoria puede comprender además moléculas de ácidos no grasos tales como, en un sentido no limitativo, esteroles. En un aspecto, el aceite de semillas es aceite de semillas de canola(Brassica sp.tal comoBrassica carinata, Brassica júncea, Brassica napobrassica, Brassica napus)aceite de mostaza(Brassica júncea),otro aceite de Brassica (por ejemplo,Brassica napobrassica, Brassica camelina),aceite de girasol(Helianthus sp.tal comoHelianthus annuus),aceite de semillas de lino(Linum usitatissimum),aceite de soja(Glicina max),aceite de cártamo(Carthamus tinctorius),aceite de maíz (Zeamays),aceite de tabaco(Nicotiana sp.

tal comoNicotiana tabacumoNicotiana benthamiana),aceite de maní(Arachis hypogaea),aceite de palma(Elaeis guineensis),aceite de semillas de algodón(Gossypium hirsutum),aceite de coco(Cocos nucifera),aceite de palma(Persea americana),aceite de oliva(Olea europaea),aceite de castaña de cajú(Anacardium occidentale),aceite de macadamia(Macadamia intergrifolia),aceite de almendras(Prunus amygdalus),aceite de semillas de avena(Avena sativa),aceite de arroz(Oryza sp.tal comoOryza sativayOryza glaberrima),aceite de semillas deArabidopsis (Arabidopsis thaliana),o aceite de la semilla deAcrocomia aculeata(palma macaúba),Aracinis hypogaea(maní),Astrocaryum murumuru(murumuru),Astrocaryum vulgare(tucuma),Attalea geraensis(Indaiá-rateiro),Attalea humilis

(palma de aceite americana),Attalea oleifera(andaiá),Attalea phalerata(uricuri),Attalea speciosa(babassu),Beta vulgaris(remolacha azucarera),Camelina sativa(lino falso),Caryocar brasiliense(pequi),Crambe abyssinica(col abisinio),Cucumis melo(melón),Hordeum vulgare(cebada),Jatropha curcas(jatrofa),Joannesia princeps(árbol de nuez de Brasil),Licania rigida(oiticica),Lupinus angustifolius(lupino),Mauritia flexuosa(palma de moriche),Maximiliana maripa

(palma inaja),Miscanthus sp.tal comoMiscanthus x giganteusyMiscanthus sinensis, Oenocarpus bacaba(milpesos de aceite),Oenocarpus bataua(pataua),Oenocarpus distichus(milpesos de leche),Panicum virgatum(mijo),Paraqueiba paraensis(mari),Persea amencana(palta),Pongamia pinnata(haya india),Populus trichocarpa, Ricinus communis(ricino),Saccharum sp.(caña de azúcar),Sesamum indicum(sésamo),Solanum tuberosum(papa),Sorghum sp.tal comoSorghum bicolor, Sorghum vulgare, Theobroma grandiflorum(copoazú),Trifolium sp., Trithrinax brasiliensis(caranday brasileño) yTriticum sp.(trigo) tal comoTriticum aestivum.El aceite de semillas se puede extraer de las semillas/granos mediante cualquier método conocido en el arte. Esto comprende típicamente extracción con solventes no polares tales como éter dietílico, éter de petróleo, mezclas de cloroformo/metanol o butanol, asociados generalmente con la primera molienda de las semillas. Los lípidos asociados con el almidón en el grano se pueden extraer con butanol saturado con agua. El aceite de semillas se puede “desgomar” mediante métodos conocidos en el arte para eliminar polisacáridos o se puede tratar de otras maneras para eliminar los contaminantes o mejorar la pureza, la estabilidad o el color. Los TAG y otros ésteres en el aceite de semillas se puede hidrolizar para liberar los ácidos grasos libres o el aceite de semillas se puede hidrogenar, tratar química o enzimáticamente como es sabido en el arte.

Como se usa en la presente memoria, el término “ácido graso” se refiere a un ácido carboxílico con una cola<alifática larga de al menos>8<átomos de carbono de longitud, ya sea saturado o insaturado. Típicamente, los ácidos grasos>tienen una cadena de carbono-carbono de al menos 12 carbonos de longitud. La mayoría de los ácidos grasos naturales tienen un número par de átomos de carbono porque su biosíntesis comprende acetato que tiene dos átomos de carbono.

Los ácidos grasos se pueden encontrar en un estado libre (no esterificado) o en una forma esterificada tal como una parte de un triglicérido (TAG), diacilglicérido (DAG), monoacilglicérido (MAG), unido a acil-CoA (tio-éster) u otra forma unida.

Cuando está unido de manera covalente en una forma esterificada, en la presente memoria el ácido graso se conoce como un grupo “acilo”. El ácido graso puede estar esterificado como un fosfolípido tal como una fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilglicerol, fosfatidilinositol o difosfatidilglicerol. Los “ácidos grasos saturados” no contienen ningún enlace doble o ningún grupo funcional a lo largo de la cadena. El término “saturado” se refiere a hidrógeno, en que todos los carbonos (además del grupo de ácido carboxílico [-COOH]) contiene tantos hidrógenos como sea posible. En otras palabras, el extremo omega (w) contiene 3 hidrógenos (CH3-) y cada carbono dentro de la cadena contiene 2 hidrógenos (-CH2-). Los “ácidos grasos insaturados” son de una forma similar a los ácidos grasos saturados, excepto que existe uno o más grupos funcionales alqueno a lo largo de la cadena, donde cada alqueno sustituye una parte “-CH2-CH2-” de enlace simple de la cadena con una porción “-CH=CH-” unida mediante un enlace doble (es decir, un carbono unido mediante un enlace doble a otro carbono). Los dos átomos de carbono siguientes en la cadena que están unidos por cualquiera de los lados del enlace doble pueden presentar una configuración cis o trans.

Como se usa en la presente memoria, los términos “ácido graso monoinsaturado” o “MUFA” se refiere a un ácido graso que comprende al menos 12 átomos de carbono en su cadena de carbono y solo un grupo alqueno (ligación doble de carbono-carbono), que puede estar en una forma esterificada o no esterificada (libre). Como se usa en la presente memoria, los términos “ácidos grasos poliinsaturados” o “PUFA” se refieren a un ácido graso que comprende al menos 12 átomos de carbono en su cadena de carbonos y al menos dos grupos alqueno (dobles enlaces carbono-carbono) que pueden estar en una forma esterificada o no esterificada.

Como se usa en la presente memoria, un ácido graso con una “ longitud de cadena media”, también referida como “MCFA”, comprende una cadena de acilo de 8 a 14 carbonos. La cadena de acilo se puede modificar (por ejemplo, puede comprender uno o más ligaciones dobles, un grupo hidroxilo, un grupo epoxi, etc.) o no modificado (saturado). Este término incluye al menos uno o más o todos ácido caprílico (C8:0), ácido cáprico (C10:0), ácido láurico (C12:0) y ácido mirístico (C14:0).

Un “monoacilglicérido” o “MAG” es un glicérido en el cual el glicerol está esterificado con un ácido graso. Como se usa en la presente memoria, un MAG comprende un grupo hidroxilo en la posición sn-1/3 (en el presente también denominado sn-1 MAG o 1-MAG o 1/3-MAG) o sn-2 (en la presente memoria también denominado 2-MAG) y por ello el MAG no incluye moléculas fosforiladas tal como PA o PC. Por lo tanto, MAG es un componente de lípidos neutros en una célula.

Un “diacilglicérido” o “DAG” es un glicérido en el cual el glicerol está esterificado con dos ácidos grasos que pueden ser los mismos o, preferentemente, diferentes. Como se usa en la presente memoria, un DAG comprende un grupo hidroxilo en la posición sn-1,3 o sn-1,2/2,3, y por ello DAG no incluye moléculas fosforiladas tal como PA o PC. Por lo tanto, DAG es un componente de lípidos neutros en una célula. En la vía Kennedy de la síntesis de DAG (Figura 1), el precursor sn-glicerol-3-fosfato (G-3-P) se esterifica a dos grupos acilo, cada uno proveniente de un éster de coenzima A de ácidos grasos, en una primera reacción catalizada por una glicerol-3-fosfato aciltransferasa (GPAT) en la posiciónsn-1 para formar LisoPA, seguido por una segunda acilación en la posición sn-2 catalizada por un ácido lisofosfatídico aciltransferasa (LPAAT) para formar ácido fosfatídico (PA). Este intermediario se desfosforila luego para formar DAG. En una vía anabólica alternativa (Figura 1), el DAG se puede formar por la acilación de ya sea sn-1 MAG o preferentemente sn-2 MAG, catalizada por MGAT. El DAG también se puede formar a partir de TAG por eliminación de un grupo acilo con una lipasa, o a partir de PC esencialmente por eliminación de un grupo cabeza de colina con cualquiera de las enzimas CPT, PDCT o PLC (Figura 1).

Un “triacilglicérido” o “TAG” es un glicérido en el cual el glicerol está esterificado con tres ácidos grasos que pueden ser los mismos (por ejemplo, como en trioleina) o, más comúnmente, diferentes. En la vía Kennedy de la síntesis de TAG, el DAG se forma como se describió previamente, y luego se esterifica un tercer grupo acilo en el esqueleto de glicerol por la actividad de DGAT. Las vías alternativas para la formación de TAG incluyen una catalizada por la enzima PDAT (Figura 1) y la vía MGAT que se describe en la presente memoria.

Como se usa en la presente memoria, el “tipo silvestre” o variaciones del mismo se refieren a una parte vegetativa de la planta, célula, semilla u organismo no humano o parte del mismo, tal como a tubérculo o remolacha, que no se ha modificado genéticamente, tal que comprende un polinucleótido(s) exógeno, como se describe en la presente memoria.

El término “que corresponde” se refiere a una parte vegetativa de la planta, una célula, semilla u organismo no humano o parte del mismo (tal como a tubérculo o remolacha) que tiene el mismo antecedente genético o similar o como una parte vegetativa de la planta, una célula, semilla u organismo no humano o parte del mismo como se describe en la presente memoria pero que no se ha modificado como se describe en la presente memoria (por ejemplo, una parte vegetativa de la planta, una célula, semilla u organismo no humano o parte del mismo que carece de polinucleótido(s) exógeno y/o carece de la modificación(es) genética). En una realización preferida, la parte vegetativa de la planta correspondiente, célula eucariota, semilla u organismo no humano o parte del mismo está en la misma etapa de desarrollo como la parte vegetativa de la planta, célula eucariota, semilla u organismo no humano o parte del mismo como se describe en la presente memoria. Por ejemplo, si el organismo no humano es una planta en florecimiento, entonces de manera preferente la planta correspondiente también está floreciendo. Una parte vegetativa de la planta correspondiente, célula eucariota, semilla u organismo no humano o parte del mismo, se puede usar como un control para comparar niveles de ácido nucleico o expresión de proteínas, o el grado en naturaleza en la modificación del atributo, por ejemplo producción y/o contenido de lípidos no polares, con la parte vegetativa de la planta, célula eucariota, semilla u organismo no humano o parte del mismo como se describe en la presente memoria que se modifica como se describe en la presente memoria.

Una persona experta en la técnica es fácilmente capaz de determinar una parte vegetativa de la planta “correspondiente” apropiada, célula eucariota, semilla u organismo no humano o parte del mismo, tejido, órgano u organismo para tal comparación.

Como se usa en la presente memoria, “comparado con” o “con respecto a” se refiere a comparar niveles de un lípido no polar, contenido de lípidos no polares totales, contenido de ácidos grasos u otro parámetro de la parte de planta vegetativa, célula eucariota, semilla, organismo no humano o parte de la misma (tal como un tubérculo o remolacha) que expresa uno o más polinucleótidos exógenos o polipéptidos exógenos con una parte de planta vegetativa, célula eucariota, semilla, organismo no humano, o parte del mismo que carece de uno o más polinucleótidos o polipéptidos exógenos.

Como se usa en la presente memoria, “capacidad mejorada para producir lípidos no polares” es un término relativo que se refiere a la cantidad total de lípido no polar que produce por una parte de planta vegetativa, célula eucariota, semilla, u organismo no humano, o parte del mismo (tal como un tubérculo o remolacha) como se describe en la presente memoria que se incrementa con respecto a una parte de planta vegetativa correspondiente, célula eucariota, semilla u organismo no humano o parte del mismo. En una realización, el contenido de TAG y/o ácidos grasos poliinsaturados, o el contenido de ácido oleico en el contenido de ácidos grasos total del lípido no polar se incrementa, o el contenido de ácido linoléico en el contenido de ácidos grasos total del lípido no polar se disminuye, por ejemplo, por al menos 2% en términos absolutos.

Como se usa en la presente memoria, “sinergismo”, “sinérgico”, “que actúa sinérgicamente” y términos relacionados son cada uno un término comparativo que significa que el efecto de una combinación de elementos presentes en una célula, planta o parte de la misma como se describe en la presente memoria, por ejemplo una combinación de elementos A y B, es mayor que la suma de los efectos de los elementos separadamente en el células correspondientes, plantas o partes de las mismas, por ejemplo, la suma del efecto de A y del efecto de B. Donde más de dos elementos están presentes en la célula, planta o parte de la misma, por ejemplo, elementos A, B y C, significa que el efecto de la combinación de todos los elementos es mayor que la suma de los efectos de los efectos individuales de los elementos. En una realización preferida, significa que el efecto de la combinación de elementos A, B y C es mayor que la suma del efecto de los elementos A y B combinados y el efecto del elemento C. En tal caso, se puede decir que el elemento C actúa sinérgicamente con los elementos A y B. Como sería entendido, los efectos se miden en células correspondientes, plantas o partes de las mismas, por ejemplo desarrolladas bajo las mismas condiciones y en la misma etapa de desarrollo biológico.

Como se usa en la presente memoria, “germinan en una velocidad sustancialmente la misma conforme a una planta de tipo silvestre correspondientes” se refiere a la semilla de una planta como se describe en la presente memoria relativamente capaz de germinar cuando se compara con las semillas de una planta de tipo silvestre que carece del polinucleótido(s) exógeno definido. La germinación se puede medirin vitroo en el medio de cultivo del tejido o en el suelo como se presenta en el campo. En una realización, el número de semillas que germinan, por ejemplo, cuando se desarrollan bajo condiciones de invernadero óptimas para las especies de plantas, es al menos 75%, de manera más preferente al menos 90%, cuando se compara con la semilla de tipo silvestre correspondiente. En otra realización, las semillas que germinan, por ejemplo, cuando se desarrollan bajo condiciones de invernadero óptimas para la especie de planta, producen plántulas que se desarrollan en una velocidad que, en promedio es al menos 75%, de manera más preferente al menos 90%, cuando se comparan con las plantas de tipo silvestre correspondientes. Esto es referido como “vigor de la plántula”. En una realización, la velocidad del crecimiento de la raíz inicial y el crecimiento del retoño de las plántulas como se describe en la presente memoria es esencialmente la misma comparada con una plántula de tipo silvestre correspondiente que se desarrolla bajo las mismas condiciones. En una realización, la biomasa de hoja (peso seco) de las plantas como se describe en la presente memoria es al menos 80%, de manera preferente al menos 90%, de la biomasa de hoja con respecto a una planta de tipo silvestre correspondiente que se desarrolla bajo las mismas condiciones, de manera preferente en el campo. En una realización, la altura de las plantas como se describe en la presente memoria es al menos 70%, de manera preferente al menos 80%, de manera más preferente al menos 90%, de la altura de la planta con respecto a una planta de tipo silvestre correspondiente que se desarrolla bajo las mismas condiciones, de manera preferente en el campo y de manera preferente en la madurez.

Como se usa en la presente memoria, el término “un polinucleótido exógeno que regula negativamente la producción y/o actividad de un polipéptido de endógenos” o variantes de los mismos, se refiere a un polinucleótido que codifica una molécula de ARN (por ejemplo, que codifica una ARNami o ARNihp) que regula negativamente la producción y/o actividad, o regula negativamente sola la producción y/o actividad (por ejemplo, es una ARNami o ARNhp que se puede suministrar directamente a, por ejemplo, una célula) de un polipéptido endógeno por ejemplo, SDP1 TAG lipasa, GPAT plastidial, LPAAT plastidial, polipéptido TGD, AGPasa, o delta-12 ácido graso desaturasa (FAD2), o una combinación de dos o más de las mismas. Típicamente, la molécula de ARN disminuye la expresión de un gen endógeno que codifica el polipéptido.

Como se usa en la presente memoria, el término “sobre una base en peso” se refiere al peso de una sustancia (por ejemplo, TAG, DAG, ácido graso) como un porcentaje del peso de la composición que comprende la sustancia (por ejemplo, semilla, hoja). Por ejemplo, sí una semilla transgénica tiene 25 |jg de ácido graso total por 120 |jg de peso de semilla, el porcentaje del ácido graso total sobre una base en peso es 20.8%).

Como se usa en la presente memoria, el término “sobre una base relativa” se refiere a un parámetro tal como la cantidad de una sustancia en una composición que comprende la sustancia en comparación con el parámetro para una composición correspondiente, como un porcentaje. Por ejemplo, una reducción de 3 unidades a 2 unidades es una reducción de 33% sobre una base relativa.

Como se usa en la presente memoria, “plástidos” son organelos en las plantas, incluyendo algas, que son el sito de fabricación de compuestos basados en carbono de la fotosíntesis incluyendo azúcares, almidón y ácidos grasos. Los plástidos incluyen cloroplastos que contienen clorofila y llevan a cabo la fotosíntesis, etioplastos que son predecesores de los cloroplastos, así como plástidos especializados tales como cromoplastos que son plástidos coloreados para la síntesis y almacenamiento de pigmentos, gerontoplastos que controlan el desmantelamiento del aparato fotosintético durante la senescencia, amiloplastos para la síntesis del almidón y almacenamiento, elaioplastos para el almacenamiento de lípidos, y proteinoplastos para almacenar y modificar proteínas.

Como se usa en la presente memoria, el término “biocombustible” se refiere a cualquier tipo de combustible, típicamente como se usa para accionar la maquinaria tales como automóviles, aeroplanos, botes, tractores o motores accionados con petróleo, cuya energía se deriva de la difusión de carbono biológico. Los biocombustibles incluyen combustibles derivados de la conversión de biomasa, así como biomasa sólida, combustibles líquidos y biogases. Ejemplos de biocombustibles incluyen bioalcoholes, biodiésel, diésel sintético, aceite vegetativo, bioéteres, biogás, gas sintético, biocombustibles sólidos, combustible derivado de algas, biohidrógeno, biometanol, 2,5-Dimetilfurano (DMF), éter biodimetílico (bioDME), diésel de Fischer-Tropsch, diésel de biohidrógeno, alcoholes mezclados y diésel de madera.

Como se usa en la presente memoria, el término “bioalcohol” se refiere a alcoholes biológicamente producidos, por ejemplo, etanol, propanol y butanol. Los bioalcoholes se producen por la acción de microorganismos y/o enzimas a través de la fermentación de los azúcares, hemicelulosa o celulosa.

Como se usa en la presente memoria, el término “biodiésel” se refiere a una composición que comprende ésteres de metilo o etilo de ácido graso derivados de lípidos por transesterificación, los lípidos son de células vivas no de combustible fósiles.

Como se usa en la presente memoria, el término “diésel sintético” se refiere a una forma de combustible diésel que se deriva de materia prima renovable en lugar de la materia prima fósil utilizada en la mayoría de los combustibles diésel.

Como se usa en la presente memoria, el término “aceite vegetal” incluye un aceite puro de planta (o aceite vegetal simple) o un aceite vegetal residual (subproducto de otras industrias), incluyendo aceite producido en ya sea en la parte de planta vegetativa o en la semilla.

Como se usa en la presente memoria, el término “biogas” se refiere a metano o una mezcla inflamable de metano y otros gases producidos por la digestión anaeróbica de material orgánico por los anaerobios.

Como se usa en la presente memoria, el término “gas sintético” se refiere a una mezcla de gas que contiene cantidades variantes de monóxido de carbono e hidrógeno y posiblemente otros hidrocarburos, producidos por combustión parcial de la biomasa. El gas sintético se puede convertir en metanol en la presencia de catalizador (usualmente basado en cobre), con deshidratación de metanol subsecuente en presencia de un catalizador diferente (por ejemplo, sílicealúmina).

Como se usa en la presente memoria, el término “Fischer-Tropsch” se refiere a un conjunto de reacciones químicas que convierten una mezcla de monóxido de carbono e hidrógeno en hidrocarburos líquidos. El gas sintético<primero se puede acondicionar usando, por ejemplo, un cambio de agua-gas para lograr la relación de H>2</CO requerida.>La conversión se lleva a cabo en presencia de un catalizador, usualmente hierro o cobalto. La temperatura, presión y catalizador determinan sí se produce un crudo sintético ligero o pesado. Por ejemplo, a 330°C la mayoría de gasolina y olefinas se producen mientras que 180° a 250°C la mayoría de diésel y ceras se producen. Los líquidos producidos del gas sintético, que comprenden varias fracciones de hidrocarburo, son hidrocarburos de cadena recta muy limpios (sin azufre).

Como se usa en la presente memoria, el término “biocarbón” se refiere a un carbón mineral fabricado de biomasa, por ejemplo, mediante pirolisis de la biomasa.

Como se usa en la presente memoria, el término “materia prima” se refiere a un material, por ejemplo, biomasa o un producto de conversión de la misma (por ejemplo, gas sintético) cuando se usa para producir un producto, por ejemplo, un biocombustible tal como biodiésel o un diésel sintético.

Como se usa en la presente memoria, el término “producto industrial” se refiere a un producto de hidrocarburo que se fabrica predominantemente de carbono e hidrógeno tal como ésteres de metilo y/o etilo de ácido graso o alcanos tales como metano, mezclas de alcanos de cadenas más larga que son típicamente líquidos en temperatura ambiente o un biocombustible, monóxido de carbono y/o hidrógeno, o un bioalcohol tal como etanol, propanol, o butanol, o biocarbón.

El término “producto industrial” se propone para incluir productos intermediarios que se pueden convertir a otros productos industriales, por ejemplo, gas sintético que se considera que es un producto industrial que se puede usar para sintetizar un producto de hidrocarburo que también se considera que es un producto industrial. El término producto industrial como se usa en la presente memoria incluye tanto formas puras de los compuestos anteriores, o más comúnmente una mezcla de varios compuestos y componentes, por ejemplo, el producto de hidrocarburo puede contener un intervalo de longitudes de cadena de carbono, como es entendido en la técnica.

Como se usa en la presente memoria, “progenie” significa las generaciones inmediatas y subsecuentes de la descendencia producida de un precursor, por ejemplo, una descendencia de segunda, tercera o última generación.

Por toda esta memoria la palabra “comprenden”, o variaciones tales como “comprende” o “que comprende” se entenderá que implica la inclusión de un elemento establecido, número entero o paso, o grupo de elementos, números enteros o pasos, pero no la exclusión de cualquier otro elemento, número entero o paso, o grupo de elementos, números enteros o pasos.

El término “y/o”, por ejemplo, “X e/o Y” se entenderá que propone ya sea “X e Y” o “X o Y” y se tomará para proporcionar un soporte explicito para ambos significados o para cualquier significado.

Como se usa en la presente memoria, el término “aproximadamente”, a menos que se establezca lo contrario, se refiere a /-10%, de manera más preferente /- 5%, de manera más preferente /- 2%, de manera más preferente /-1%, aún de manera más preferente /- 0.5%, del valor designado.

Producción de Lípidos no polares y Triacilgliceroles

La presente invención se basa en el descubrimiento de que el contenido de lípidos no polares en células eucariotas recombinantes se puede incrementar por una combinación de modificaciones seleccionadas de aquellas designadas en la presente memoria como (A). Empujar, (B). Extraer, (C). Proteger, (D). Empaque, (E). Exportación Plastidial, (F). Importación Plastidial y (G). Ruta Procariota. Como se describe en la presente memoria, las células sin plástidos pueden comprender varias combinaciones de A-D, mientras que las células con plástidos, tales como células de planta y algas, pueden comprender varias combinaciones de A-G.

Las células recombinantes, animales no humanos transgénicos o una parte de los mismos, y plantas transgénicas o partes de las mismas, como se describe en la presente memoria tienen por lo tanto un número de combinaciones de polinucleótidos exógenos y/o modificaciones genéticas cada una de las cuales proporciona una de las modificaciones. Estos polinucleótidos exógenos y/o modificaciones genéticas incluyen:

(A) un polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido de factor de transcripción que incrementa la expresión de uno o más genes glucolíticos y/o de la biosíntesis de ácidos grasos en la célula, animal no humano transgénico o una parte del mismo, o planta transgénica o parte la misma, que proporciona la modificación “Empujar”,

(B) un polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido implicado en la biosíntesis de uno o más lípidos no polares en la célula, animal no humano transgénico o una parte del mismo, o planta transgénica o parte de la misma, que proporciona la modificación “Extraer”,

(C) una modificación genética que regula negativamente la producción endógena y/o actividad de un polipéptido implicado en el catabolismo de triacilgliceroles (TAG) en la célula, animal no humano transgénico o una parte del mismo, o planta transgénica o parte de la misma cuando se compara con una célula correspondiente, el animal no humano transgénico o una parte del mismo, o una planta transgénica o parte de la misma que carece de la modificación genética, que proporciona la modificación “Protección”,

(D) un polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido de recubrimiento de cuerpo lipídico (OBC), que proporciona la modificación “Empaque”,

(E) un polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido que incrementa la exportación de ácidos grasos fuera de los plástidos de la célula, animal no transgénico, o una parte del mismo, o planta transgénica o parte de la misma, cuando se compara con una célula correspondiente, animal no humano transgénico o parte del mismo, o planta transgénica o parte del mismo que carece del polinucleótido exógeno, que proporciona la modificación “Exportación Plastidial”, (F) una modificación genética que regula negativamente la producción endógena y/o actividad de un polipéptido implicado en importar ácidos grasos en los plástidos de la célula, animal no humano transgénico o una parte del mismo, o planta transgénica o parte de la misma cuando se compara con una célula correspondiente, animal no humano transgénico o una parte del mismo, o planta transgénica o parte de la misma que carece de la modificación genética, que proporciona la modificación “Importación Plastidial”, y

G) una modificación genética que regula negativamente la producción endógena y/o actividad de un polipéptido implicado en la producción de diacilglicerol (DAG) en el plástido de la célula, animal no humano transgénico o una parte del mismo, o planta transgénica o parte de la misma cuando se compara con una célula correspondiente, animal no humano transgénico o una parte del mismo, o planta transgénica o parte de la misma que carece de la modificación genética, que proporciona la modificación “Ruta procariota”.

Las combinaciones preferidas (también referidas en la presente memoria como conjuntos) de polinucleótido exógenos y/o modificación genéticas como se describe en la presente memoria son;

1) A, B y opcionalmente uno de C, D, E, F o G;

2) A, C y opcionalmente uno de D, E, F o G;

3) A, D y opcionalmente uno de E, F o G;

4) A, E y opcionalmente F o G;

5) A, F y opcionalmente G;

6) A y G;

7) A, B, C y opcionalmente uno de D, E, F o G;

8) A, B, D y opcionalmente uno de E, F o G;

9) A, B, E y opcionalmente F o G;

10) A, B, F y opcionalmente G;

11) A, B, C, D y opcionalmente uno de E, F o G;

12) A, B, C, E y opcionalmente F o G;

13) A, B, C, F y opcionalmente G;

14) A, B, D, E y opcionalmente F o G;

15) A, B, D, F y opcionalmente G;

16) A, B, E, F y opcionalmente G;

17) A, C, D y opcionalmente uno de E, F o G;

18) A, C, E y opcionalmente F o G;

19) A, C, F y opcionalmente G;

20) A, C, D, E y opcionalmente F o G;

21<) A, C, D, F y opcionalmente G;>

22) A, C, E, F y opcionalmente una quinta modificación G;

23) A, D, E y opcionalmente F o G;

24) A, D, F y opcionalmente G;

25) A, D, E, F y opcionalmente G;

26) A, E, F y opcionalmente G;

27) Seis de A, B, C, D, E, F y G que omiten uno de A, B, C, D, E, F o G, y

28) Cualquiera de uno de 1-26 anteriores donde existen dos o más polinucleótidos exógenos que codifican dos o más polipéptidos de factor de transcripción diferentes que incrementan la expresión de uno o más genes glucolíticos y/o de la biosíntesis de ácidos grasos en la célula, por ejemplo, un polinucleótido exógeno que codifica WRI1 y otro polinucleótido exógeno que codifica LEC2.

En cada una de las combinaciones preferidas anteriores puede haber al menos dos polinucleótidos exógenos diferentes que codifican al menos dos polipéptidos de factor de transcripción diferentes que incrementa la expresión de uno o más genes glucolíticos y/o de la biosíntesis de ácidos grasos en la célula, animal no humano transgénico o parte del mismo, o planta transgénica o parte de la misma.

Estas modificaciones se describen como sigue:

A. La modificación “Empuje” se caracteriza por una síntesis incrementada de ácidos grasos totales en los plástidos de la célula eucariota. En una realización, esto se presenta por la expresión incrementada y/o actividad de un factor de transcripción que regula la síntesis de ácidos grasos en los plástidos. En una realización, esto se puede lograr al expresar en una célula transgénica un polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido de factor de transcripción que incrementa la expresión de uno o más genes glucolíticos y/o de la biosíntesis de ácidos grasos en la célula. En una realización, la síntesis de ácidos grasos incrementada no es provocada por la provisión a la célula de una ACCasa alterada cuya actividad es manos inhibida por los ácidos graso, con respecto a la ACCasa endógena en la célula. En una realización, la célula comprende un polinucleótido exógeno que codifica el factor de transcripción, de manera preferente bajo el control de un promotor diferente a un promotor constitutivo. El factor de transcripción se puede seleccionar del grupo que consiste de WRI1 , LEC1, LEC1-like, LEC2, BBM, FUS3, ABI3, ABI4, ABI5, Dof4, Dofl1 o el grupo que consiste de MYB73, bZIP53, AGL15, MYB1 15, MYB118, TANMEI, WUS, GFR2a1, GFR2a2 y PHR1, y es de manera preferente WRI1, LEC1 o LEC2. En una realización adicional, la síntesis incrementada de los ácidos grasos totales es relativa con una célula de tipo silvestre correspondiente. En una realización, existen dos o más polinucleótidos exógenos que codifican dos o más polipéptidos de factor de transcripción diferentes.

B. La modificación “Extraer” se caracteriza por la expresión incrementada y/o actividad en la célula de un acilo graso aciltransferasa que cataliza la síntesis de<t>A<g>, DAG o MAG en la célula, tal como un DGAT, PDAT, LPAAT, GPAT o MGAT, de manera preferente un DGAT o un PDAT. En una realización, esto se puede lograr al expresar en una célula transgénica un polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido implicado en la biosíntesis de uno o más lípidos no polares. En una realización, la aciltransferasa es una aciltransferasa ligada membrana que usa un sustrato de acil-CoA como el donador de acilo en el caso de DGAT, LPAAT, GPAT o MGAT, o un grupo acilo de PC como el donador de acilo en el caso de PDAT. La modificación extraer puede ser relativa con una célula de tipo silvestre correspondiente o, de manera preferente, relativa con una célula correspondiente que tiene la modificación Empujar. En una realización, la célula comprende un polinucleótido exógeno que codifica el acilo graso aciltransferasa.

C. La modificación “Protección” se caracteriza por una reducción en el catabolismo de triacilgliceroles (TAG) en la célula. En una realización, esto se puede lograr a través de una modificación genética en la célula que regula negativamente la producción endógena y/o actividad de un polipéptido implicado en el catabolismo de triacilgliceroles (TAG) en la célula cuando se compara con una célula correspondiente que carece de la modificación genética. En una realización, la célula tiene expresión reducida y/o actividad de una<t>A<g>lipasa endógena en la célula, de manera preferente una SDP1 lipasa, un polipéptido Cgi58, una acil-CoA oxidasa tal como la ACX1 o ACX2, o un polipéptido implicado en la p-oxidación de ácidos grasos en la célula tal como un transportador de casete de ligación a ATP peroxisomal PXA1. Esto puede presentarse por la expresión en la célula de un polinucleótido exógeno que codifica una molécula de ARN que reduce la expresión de, por ejemplo, un gen endógeno que codifica la TAG lipasa tal como la SDP1 lipasa, acil-CoA oxidasa o el polipéptido implicado en la p-oxidación de ácidos grasos en la célula, o por una mutación en un gen endógeno que codifica, por ejemplo, la TAG lipasa, acil-CoA oxidasa o polipéptido implicado en la p-oxidación de la actividad relativa con una célula de tipo silvestre correspondiente o relativa con una célula correspondiente que tiene la modificación Empujar.

D. La “Empaque” se caracteriza por una expresión incrementada y/o acumulación de un polipéptido de recubrimiento de cuerpo lipídico (OBC). En una realización, esto se puede lograr al expresar en una célula transgénica un polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido de recubrimiento de cuerpo lipídico (OBC). El polipéptido OBC puede ser una oleosina, tal como por ejemplo una polioleosina, una caoleosina o una esteroleosina, o de manera preferente un LDAP. En una realización, el nivel de oleosina que se acumula en la célula eucariota es al menos 2 veces más alto con respecto a la célula correspondiente que comprende el gen de oleosina del T-ADN de pJP3502. En una realización, la expresión incrementada o acumulación del polipéptido OBC no es provocado solamente por la modificación Empuje. En una realización, la expresión y acumulación relativa con una célula de tipo silvestre correspondiente o, de manera preferente, relativa con una célula correspondiente que tiene la modificación Empuje. E. La modificación “Exportación Plastidial” se caracteriza por una velocidad incrementada de exportación de ácidos grasos totales fueran de los plástidos de la célula eucariota. En una realización, esto se puede lograr al expresar en una célula transgénica un polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido que incrementa la exportación de ácidos grasos fuera de los plástidos de la célula cuando se compara con una célula correspondiente que carece del polinucleótido exógeno. En una realización, esto se presenta por la expresión incrementada y/o actividad de un ácido graso tioesterasa (TE), un polipéptido transportador de ácido graso tal como un polipéptido ABCA9, o una acil-CoA sintetasa de cadena larga (LACS). En una realización, la célula comprende un polinucleótido exógeno que codifica la TE, polipéptido transportador de ácido graso o LACS. La TE puede ser un polipéptido FATB o de manera preferente un polipéptido FATA. En una realización, la TE es de manera preferente una TE con especificidad para MCFA. En una realización, la modificación de Exportación Plastidial es relativa con una célula de tipo silvestre correspondiente o, de manera preferente, relativa con una célula correspondiente que tiene la modificación Empuje.

F. La modificación “Importación Plastidial” se caracteriza por una velocidad reducida de importación de ácidos grasos en los plástidos de la célula del exterior de los plástidos. En una realización, esto se puede lograr a través de una modificación genética en la célula que regula negativamente la producción endógena y/o actividad de un polipéptido implicado en importar ácidos grasos en los plástidos de la célula cuando se compara con una célula correspondiente que carece de la modificación genética. Por ejemplo, esto se puede presentar por la expresión en la célula de un polinucleótido exógeno que codifica una molécula de ARN que reduce la expresión de un gen endógeno que codifica un polipéptido transportador tal como un polipéptido TGD, por ejemplo, un polipéptido TGD1, TGD2, TGD 3 o TGD4, o por una mutación en un gen endógeno que codifica el polipéptido TGD. En una realización, la velocidad reducida de importación es relativa con una célula de tipo silvestre correspondiente o relativa con una célula correspondiente que tiene la modificación Empuje.

G. La modificación “Ruta Procariota” se caracteriza por una cantidad disminuida de DAG o una velocidad de producción de DAG en los plástidos de la célula. En una realización, esto se puede lograr a través de una modificación genética en la célula que regula negativamente la producción endógena y/o actividad de un polipéptido implicado en la producción de diacilglicerol (DAG) en el plástido cuando se compara con una célula correspondiente que carece de la modificación genética. En una realización, la cantidad o velocidad disminuida de la producción de DAG se presenta por una producción disminuida de LPA de acil-ACP y G3P en los plástidos. La cantidad o velocidad disminuida de producción de DAG puede presentarse por la expresión en la célula de un polinucleótido exógeno que codifica una molécula de ARN que reduce la expresión de un gen endógeno que codifica un GPAT plastidial, LP AAT plastidial o un PAP plastidial, de manera preferente un GPAT plastidial, o por una mutación en un gen endógeno que codifica el polipéptido plastidial. En una realización, la cantidad o velocidad de disminución de producción de DAG es relativa con una célula de tipo silvestre correspondiente, o de manera preferente, relativa con una célula correspondiente que tiene la modificación Empuje.

La modificación de Empuje es esencial a la invención, y la modificación de Extracción es preferida. Las modificaciones Protección y Empaque pueden ser complementarias es decir una de las dos puede ser suficiente. La célula puede comprender una, dos o tres de la Exportación Plastidial, Importación Plastidial y modificaciones de la Ruta Procariota. En una realización, al menos uno de los polinucleótidos exógenos en la célula, de manera preferente al menos el polinucleótido exógeno que codifica el factor de transcripción que regula la síntesis de ácidos grasos en los plástidos, se expresa bajo el control de (H) un promotor diferente a un promotor constitutivo tal como, por ejemplo, un promotor de desarrollo relacionado, un promotor que está de manera preferente activo en las células fotosintéticas, un promotor específico de tejido, un promotor que se ha modificado al reducir su nivel de expresión con respecto a un promotor nativo correspondiente, o es de manera preferente un promotor específico de senescencia. De manera más preferente, al menos el polinucleótido exógeno que codifica el factor de transcripción que regula la síntesis de ácidos grasos en los plástidos que expresa bajo el control de un promotor diferente a un promotor constitutivo y por el nucleótido exógeno que codifica una molécula de ARN que regula negativamente la producción endógena y/o actividad de un polipéptido implicado en el catabolismo de triacilgliceroles también se expresa bajo el control de un promotor diferente a un promotor constitutivo, los promotores que pueden ser los mismos o diferentes.

Las plantas producen algo, pero no todo, de sus lípidos de membrana tales como MGDG en los plástidos por la así llamada ruta procariota (Figura 1). En las plantas, también existe una ruta eucariota para la síntesis de galactolípidos y glicerolípidos que sintetiza FA primero de todo en el plástido y después ensambla el FA en glicerolípidos en el ER. MGDG sintetizado por la ruta eucariota contiene ácido graso C18:3 (ALA) esterificado en la posiciónsn-2de MGDG. La cadena principal de DAG incluyendo la ALA para la síntesis de MGDG mediante esta ruta se ensambla en ER y después se importa en el plástido. En contraste, el MGDG sintetizado por la ruta procariota contiene ácido graso C16:3 esterificado en la posición sn-2 de MGDG. La relación de la contribución de la ruta procariota con respecto a la ruta eucariota en la producción de MGDG (16:3) vs MGDG (18:3) es un aspecto característico y distintivo de diferentes especies de plantas (Mongrand y colaboradores 1998). Esta composición de ácidos grasos distintiva de MGDG permite que todas las plantas superiores (angiospermos) se clasifiquen como ya sea las así llamadas plantas 16:3 o 18:3. Las especies 16:3, ejemplificadas porArabidopsisyBrassica napus,tienen ambas en general las rutas procariotas y eucariotas de la operación de la síntesis de MGDG, mientras que la especie 18:3 ejemplificada porNicotiana tabacum, Pisum sativumyGlycine maxtienen en general solo (o casi completamente) la ruta eucariota de la síntesis de MGDG, proporcionando poco o nada de acumulación de ácidos grasos C16:3 en los tejidos vegetativos. Como se usa en la presente memoria, una “planta 16:3” o “especie de planta 16:3” es una que tiene más de 2% de ácido graso C16:3 en el contenido de ácidos grasos total de sus tejidos fotosintéticos. Como se usa en la presente memoria, una “planta 18:3” o “especie 18:3” es una que tiene menor que 2% de ácido graso C16:3 en el contenido de ácidos grasos total de sus tejidos fotosintéticos. Como se describe en la presente memoria, una planta se puede convertir de ser una planta 16:3 a una planta 18:3 por modificaciones genéticas adecuadas. La proporción de flujo entre las rutas procariotas y eucariotas no se conserva a través de diferentes especies o tejidos de plantas. En las especies 16:3 hasta 40% del flujo en las hojas se presenta a través de la ruta procariota (Browse y colaboradores, 1986), mientras que en las especies 18:3, tales como guisante y soja, aproximadamente 90% de FAs que se sintetizan en el plástido se exportan fuera del plástido al ER para suministrar la fuente de FA para la ruta fue eucariota (Ohlrogge and Browse, 1995; Somerville y colaboradores, 2000).

Por lo tanto, diferentes cantidades de ácidos grasos 18:3 y 16:3 se encuentran dentro de los glicolípidos de diferentes especies de plantas. Esto se usa para distinguir entre plantas 18:3 cuyos ácidos grasos con 3 ligaciones dobles<son casi completamente ácidos grasos C18 y las planas 16:3 que contienen tanto ácidos grasos C>16<como C>18<que tienen>3 ligaciones dobles. En los cloroplastos de las plantas 18:3, las actividades enzimáticas que catalizan la conversión de fosfatidato a diacilglicerol y de diacilglicerol a monogalactosildiacilglicerol (MGD) son significativamente menos activos que en los cloroplastos 16:3. En las hojas de plantas 18:3, los cloroplastos sintetizan el estearoil-ACP2 en el estoma, introducen la primera ligación doble en la cadena de hidrocarburos saturada, y después hidrolizan el tioéster por tioesterasas (Figura 1). El oleato liberado se exporta a través de las envolturas de cloroplastos en las membranas de la parte eucariota de la célula, probablemente el retículo endoplásmico, donde se incorpora en el PC. Los grupos oleoilo ligados a PC se desaturan en estas membranas y se mueven de nuevo subsecuentemente al cloroplasto. Los grupos acilo ligados a MGD son sustratos para la introducción de la tercera ligación doble para producir MGD con dos residuos de linolenoilo. Este galactolípido es característico de plantas 18:3 tales comoAsteraceaeyFabaceae,por ejemplo. En las células fotosintéticamente activas de las plantas 16:3 que son representadas, por ejemplo, por miembros deApiaceaeyBrassicaceae,dos rutas que operan en paralelo para proporcionar tilalcoides con MGD.

En una realización, la parte de planta vegetativa, célula eucariota, semilla u organismo no humano transgénico o parte del mismo (tal como a tubérculo o remolacha) como se describe en la presente memoria produces altos niveles de lípidos no polares tales como TAG, o contenido de ácido graso total (TFA), de manera preferente ambos, que una parte de planta vegetativa correspondiente, célula eucariota, semilla u organismo no humano o parte del mismo que carece de las modificaciones genéticas o polinucleótido exógenos. En un ejemplo, las plantas como se describe en la presente memoria producen semillas, hojas, o tienen porciones de hoja de al menos 1cm2 en el área superficial, tallos y/o tubérculos que tienen un contenido de lípidos no polares incrementado tal como contenido de TAG o TFA, de manera preferente ambos, cuando se comparan con las semillas correspondientes, hojas, porciones de hoja de al menos 1cm2 en el área superficial, tallos o tubérculos.

En otra realización, la parte de planta vegetativa, organismo no humano transgénico o parte del mismo (tal como a tubérculo o remolacha), de manera preferente una planta tubérculo, remolacha o semilla, producen TAGs que se enriquecen para uno o más ácidos grasos particulares. Un amplio espectro de ácidos grasos se puede incorporar en los TAGs, incluyendo ácidos grasos saturados e insaturados y ácidos grasos de cadena corta y cadena larga. Algunos ejemplos no limitantes de ácidos grasos que se pueden incorporar en los TAGs y que se pueden incrementar en el nivel incluyen: ácidos capríco (10:0), laúrico (12:0), mirístico (14:0), palmítico (16:0), palmitoleico (16:1), esteárico (18:0), oleico (18: 1), vacénico (18: 1), linoléico (18:2), eleoesteárico (18:3),y-linolenico (18:3), a-linolenico (18:3w3), estearidonico (18:4w3), araquídico (20:0), eicosadienoico (20:2), dihomo-y-linoléico (20:3), eicosatrienoico (20:3), araquidónico (20:4), eicosatetraenoico (20:4), eicosapentaenoico (20:5u>3), behénico (22:0), docosapentaenoico (22:5u>), docosahexaenoico (22:6w3), lignocérico (24:0), nervonico (24: 1), cerótico (26:0), y montanico (28:0). En un aspecto de la presente memoria, la parte de planta vegetativa, célula eucariota, semilla u organismo transgénico o partes del mismo (tal como un tubérculo o remolacha) se enriquece para TAGs que comprende ácido oleico, y/o se reduce en ácido linoléico (ALA), de manera preferente por al menos 2% o al menos 5% sobre una base absoluta.

De manera preferente, la parte de planta vegetativa, célula eucariota, semilla u organismo no humano transgénico o parte del mismo como se describe en la presente memoria se transforman con uno o más ADNs quiméricos (polinucleótido exógenos). En el caso de múltiples ADNs quiméricos, se ligan de manera preferente covalentemente en una molécula de ADN tal como, por ejemplo, una molécula de T-ADN individual, y se integran de manera preferente en un sitio individual en el genoma de la célula hospedadora. Alternativamente, los ADNs quiméricos están en dos o más moléculas de ADN que se pueden desligar en el genoma hospedador, o la molécula(s) de ADN no se integra en el genoma hospedador, tal como se presenta en los experimentos de expresión transitorios. La planta, parte de planta vegetativa, célula eucariota, semilla u organismo no humano transgénico o parte del mismo es de manera preferente homocigoto para la molécula de ADN insertada en su genoma.

Factores de Transcripción

Varios factores de transcripción se implican en las células eucariotas en la síntesis de ácido graso y lípidos que incorporan los ácidos grasos tales como TAG, y por lo tanto se pueden manipular para la modificación de empuje. Un factor de transcripción preferido es WRI1. Como se usa en la presente memoria, el término “Wrinkled 1” o “WRI1” o “WRL1” hace referencia a un factor de transcripción de la clase AP2/ERWEBP que regula la expresión de varias enzimas involucradas en la glicólisis y síntesisde novode ácidos grasos. WRI1 tiene dos dominios de unión a ADN específicos de planta (AP2/EREB). WRI1 en al menosArabidopsistambién regula la ruptura de sacarosa por medio de la glicólisis regulando de ese modo la provisión de precursores para la biosíntesis de ácidos grasos. En otras palabras, controla el flujo de carbonos del fotosintato a lípidos de almacenamiento. Los mutantes dewriltienen el fenotipo de semilla wrinkled, debido a un defecto en la incorporación de sacarosa y glucosa a los TAG.

Los ejemplos de genes que son transcriptos por WRI1 incluyen, a título enunciativo no taxativo, uno o más, preferentemente todos, de piruvato quinasa (At5g52920, At3g22960), subunidad E1alfa piruvato deshidrogenasa (PDH) (At1g01090), acetil-CoA carboxilasa (ACCasa), subunidad BCCP2 (At5g15530), enoil-ACP reductasa (At2g05990; EAR), fosfoglicerato mutasa (At1g22170), fructoquinase citosólica, y fosfoglicerato mutasa citosólica, sacarosa sintasa (SuSi) (véase, por ejemplo, Liu y colaboradores, 2010b; Baud y colaboradores, 2007; Ruuska y colaboradores, 2002).

El WRL1 contiene el dominio conservado AP2 (cd00018). El AP2 es un dominio de unión a ADN encontrado en los reguladores de transcripción en plantas tales como APETALA2 y EREBP (proteína de unión al elemento de respuesta a etileno). En las EREBP el dominio se une específicamente a la caja GCC de 11pb del elemento de respuesta a etileno (ERE), un elemento promotor esencial para la respuesta etileno. Las EREBP y el factor de unión a repeticiones de C CBF1, que está involucrado en la respuesta al estrés, contiene una copia única del dominio AP2. Las proteínas similares a APETALA2, que tienen un papel en el desarrollo de la planta contienen dos copias.

Otros motivos de secuencia en WRI1 y sus homólogos funcionales incluyen:

1. R G V T/S R H R W T G R (SEQ ID NO:356).

2. F/Y E A H L W D K (SEQ ID NO:357).

3. D L A A L K Y W G (SEQ ID NO:358).

4. S X G F S/A R G X (SEQ ID NO:359).

5. H H H/Q N G R/K W E A R I G R/K V (SEQ ID NO:360).

6. Q E E A A A X Y D (SEQ ID NO:361).

Como se usa en la presente memoria, el término “Wrinkled 1” o “WRM” también incluye proteínas “similares a Wrinkled 1” o “similares a WRI1”. Los ejemplos de proteínas WRI1 incluyen Nos. de Acceso: Q6X5Y6,(Arabidopsis thaliana;SEQ ID NO:280), XP_002876251.1(Arabidopsis lyrata subesp. Lyrata;SEQ ID NO:281), ABD16282.1(Brassica napus;SEQ ID NO:282), ADO16346.1(Brassica napus;SEQ ID NO:283), XP_003530370.1(Glicina max;SEQ ID NO:284), AEO22131.1(Jatropha curcas;SEQ ID NO:285), XP_002525305.1(Ricinus communis;SEQ ID NO:286), XP_002316459.1(Populus trichocarpa;SEQ ID NO:287), CBI29147.3(Vitis vinifera;SEQ ID NO:288), XP_003578997.1(Brachypodium distachyon;SEQ ID NO:289), BAJ86627.1(Hordeum vulgaresubesp.vulgare;SEQ ID NO:290), EAY79792.1(Oryza sativa;SEQ ID NO:291), XP_002450194.1(Sorghum bicolor;SEQ ID NO:292), ACG32367.1(Zea mays;SEQ ID No :293), XP_003561189.1(Brachypodium distachyon;SEQ ID NO:294), ABL85061.1(Brachypodium sylvaticum;SEQ ID NO:295), BAD68417.1(Oryza sativa;SEQ ID NO:296), XP_002437819.1(Sorghum bicolor;SEQ ID NO:297), XP_002441444.1(Sorghum bicolor;SEQ ID NO:298), XP_003530686.1(Glicina max;SEQ ID NO:299), XP_003553203.1(Glicina max;SEQ ID NO:300), XP_002315794.1(Populus trichocarpa;SEQ ID NO:301), XP_002270149.1(Vitis vinifera;SEQ ID NO:302), XP_003533548.1(Glicina max;SEQ ID NO:303), XP_003551723.1(Glicina max;SEQ ID NO:304), XP_003621117.1(Medicago truncatula;SEQ ID NO:305), XP_002323836.1(Populus trichocarpa;SEQ ID NO:306), XP_002517474.1(Ricinus communis;SEQ ID NO:307), CAN79925.1(Vitis vinifera;SEQ ID NO:308), XP_003572236.1(Brachypodium distachyon;SEQ ID NO:309), BAD10030.1(Oryza sativa;SEQ ID NO:310), XP_002444429.1(Sorghum bicolor,SEQ ID NO:311), NP_001170359.1(Zea mays;SEQ ID NO:312), XP_002889265.1(Arabidopsis lyrata subesp. lyrata;SEQ ID NO:313), AAF68121.1(Arabidopsis thaliana;SEQ ID NO:314), NP_178088.2(Arabidopsis thaliana;SEQ ID NO:315), XP_002890145.1(Arabidopsis lyrata subesp. lyrata;S<e>Q ID NO:316), BAJ33872.1(Thellungiella halophila;SEQ ID NO:317), NP_563990.1(Arabidopsis thaliana;SEQ ID NO:318), XP_003530350.1(Glicina max;SEQ ID NO:319), XP_003578142.1(Brachypodium distachyon;SEQ ID NO:320), EAZ09147.1(Oryza sativa;SEQ ID NO:321), XP_002460236.1(Sorghum bicolor;SEQ ID NO:322), NP_001146338.1(Zea mays;SEQ ID NO:323), XP_003519167.1(Glicina max;SEQ ID NO:324), XP_003550676.1(Glicina max;SEQ ID NO:325), XP_003610261.1(Medicago truncatula;SEQ ID NO:326), XP_003524030.1(Glicina max;SEQ ID NO:327), XP_003525949.1(Glicina max;SEQ ID NO:328), XP_002325111.1(Populus trichocarpa;SEQ ID NO:329), CBI36586.3(Vitis vinifera;SEQ ID NO:330), XP_002273046.2(Vitis vinifera;SEQ ID NO:331j, XP_002303866.1(Populus trichocarpa;SEQ ID NO:332j, y CBI25261.3(Vitis vinifera;SEQ ID NO:333). Otros ejemplos incluyen Sorbi-WRLI (SEQ ID NO:334), Lupan-WRLI (SEQ ID NO:335), Ricco-WRL1 (SEQ ID NO:336), yLupin angustifoliusWRI1 (SEQ ID NO:337). Un WRI1 preferido es un WRI1 o un WRI1 de sorgo.

Más recientemente, un subconjunto de factores de transcripción similares a WRI1 se han vuelto a clasificar como factores de transcripción WRI2, WRI3 o WRI4, que se caracterizan por la expresión preferente en tallos y/o realices de las plantas en lugar de semillas en desarrollo (To y colaboradores, 2012). A pesar de su reclasificación, estos se incluyen en la definición de “WRI1” en la presente memoria. Los factores de transcripción similares a WRI1 preferidos son aquellos que pueden complementar la función de una mutaciónwrilen una planta, particularmente la función en la semilla en desarrollo de la planta tal como en un mutanteA. thaliana wril.La función un polipéptido similar a WRI1 también se puede evaluar en los ensayos transitoriosN. benthamianaen la presente memoria.

Como se usa en la presente memoria, un “COTIDELON DE HOJA” o polipéptido “LEC” significa un factor de transcripción que es un factor de transcripción LEC1, LEC1-like, LEC2, ABI3 o FUS3 que muestra un amplio control en la maduración de la semilla y síntesis de ácidos grasos. LEC2, FUS3 y ABI3 son polipéptidos relacionados que contienen cada uno un dominio de ligación a B3 ADN de 120 aminoácidos (Yamasaki y colaboradores, 2004) que se encuentra solamente en las proteínas de planta. Se pueden distinguir por el análisis filogenético para determinar la relación en la secuencia de aminoácidos a los miembros de los polipéptidos deA. thalianaque tienen los Números de Acceso como sigue: LEC2, NO. de Acceso AAL12004.1; FUS3 (también conocido como FS<c>A3), No. de Acceso AAC35247, LEC1 que pertenece a una clase diferente de polipéptidos y es homologo a un polipéptido HAP3 de la clase del factor de ligación a CBF (Lee y colaboradores, 2003). Los genes LEC1, LEC2 y FUS3 son requeridos en la embriogénesis temprana para mantener el destino celular embriónico y especificar la identidad del cotiledón y después en el inicio y mantenimiento de la maduración del embrión (Santos-Mendoza y colaboradores, 2008). También se induce la expresión de los genes que codifican las proteínas de almacenamiento de semillas mediante la ligación a los motivos RY presentes en los promotores, y los genes de oleosina. También se pueden distinguir por sus patrones de expresión en el desarrollo de la semilla o por su capacidad de complementar la mutación correspondiente enA. thaliana.

Como se usa en la presente memoria, el término “Cotiledón de Hoja 1” o “LEC1” se refiere a un factor de transcripción de tipo NF-YB que participa en el desarrollo cigocítico y en la embriogénesis somática. El gen endógeno se expresa específicamente en la semilla en tanto el embrión como en el endospermo. El LEC1 activa el gen que codifica WRI1 así como una clase grande de genes de síntesis de ácidos grasos. La expresión ectópica de LEC2 también provoca la rápida activación de los genes sensibles a la auxina y puede provocar la formación de embriones somáticos. Ejemplos de polipéptidos LEC1 incluyen proteínas deArabidopsis thalianaa (AAC39488, SEQ ID NO:149),Medicago truncatula(AFK49653, SEQ ID NO: 154) yBrassica napus(ADF81045, SEQ ID NO: 151),f\. lyrata(XP_002862657, SEQ ID NO: 150),R. communis(XP_002522740, SEQ ID NO: 152),G max(XP_006582823, SEQ ID NO:153),f\. hypogaea(ADC33213, SEQ ID NO: 156), Zmays(AAK95562, SEQ ID NO: 155).

Similar a LEC1 (L1L) se relaciona estrechamente con LEC1 pero tiene un patrón diferente de la expresión génica, que se expresa temprano durante la embriogénesis (Kwong y colaboradores, 2003). Ejemplos de polipéptidos similares a LEC1 incluyen proteínas deArabidopsis thaliana(AAN15924, SEQ ID NO: 157),Brassica napus(AHI94922, SEQ ID NO: 158), yPhaseolus coccineusLEC1-like (AAN01 148, SEQ ID NO: 159).

Como se usa en la presente memoria, el término “Cotiledón de Hoja 2” o “LEC2” se refiere a un factor de transcripción de dominio B3 que participa en el desarrollo cigocítico y en la embriogénesis somática y que activa la expresión de un gen que codifica WRI1. Su expresión ectópica facilita la embriogénesis de los tejidos de planta vegetativos (Alemanno y colaboradores, 2008). Ejemplos de polipéptidos LEC2 incluyen proteínas deArabidopsis thaliana(No. de Acceso NP_564304.1, SEQ ID NO: 142),Medicago truncatula(No. de Acceso CAA42938.1, SEQ ID NO: 143) yBrassica napus(No. de Acceso AD016343.1, SEQ ID NO: 144).

En una realización, un polinucleótido exógeno como se describe en la presente memoria que codifica un LEC2 comprende uno o más de lo siguiente:

i) nucleótidos que codifican un polipéptido que comprende aminoácidos cuya secuencia se expone como en cualquiera de SEQ ID NOs: 142 a 144, o un fragmento bilógicamente activo del mismo, o un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es al menos 30% idéntica a cualquiera de una o más de SEQ ID NOs:142 a 144,

ii) nucleótidos cuya secuencia es al menos 30% idéntica a i), y

iii) un polinucleótido que se hibrida a uno ambos de i) o ii) bajo condiciones rigurosas.

Como se usa en la presente memoria, el término “FUS3” se refiere a un factor de transcripción de dominio B3 que participa en el desarrollo cigocítico y en la embriogénesis somática y se detecta principalmente en el tejido protodérmico del embrión (Gazzarrini y colaboradores, 2004). Ejemplos de polipéptido FUS3 incluyen proteínas deArabidopsis thaliana(AAC35247, SEQ ID NO: 160),Brassica napus(XP 006293066.1, SEQ ID N0: 161) yMedicago truncatula(XP_003624470, SEQ ID NO: 162). La sobreexpresión de cualquiera de LEC1, L1L, LEC2, FUS3 y ABI3 de un polinucleótido exógeno se controla de manera preferente por un promotor desarrolladamente regulado tal como un promotor específico de senescencia, un promotor inducible, o un promotor que se ha diseñado para proporcionar un nivel reducido de expresión con respecto a un promotor nativo, particularmente en las plantas diferentes aArabidopsis thalianayB. napus cv.Westar, a fin de evitar las anormalidades de desarrollo en el desarrollo de la planta que se asocian comúnmente con la sobreexpresión de estos factores de transcripción (Mu y colaboradores, 2008).

Como se usa en la presente memoria, el término “BABY BOOM” o “BBM” se refiere a un factor de transcripción AP2/ERF que induce la regeneración bajo condiciones cuyo cultivo que normalmente no soportan la regeneración en las plantas de tipo silvestre. La expresión ectópica de los genesBBMdeBrassica napus (BnBBM)enB. napusyArabidopsisinduce la embriogénesis somática espontánea y la organogénesis de las plántulas desarrolladas en el medio basal sin hormonas (Boutilier y colaboradores, 2002). En el tabaco, la expresión BBM ectópica es suficiente para inducir la regeneración de retoños y raíces accidental en el medio basal, pero la citoquinina exógena es requerida para la formación de embriones somáticos (SE) (Srinivasan y colaboradores, 2007). Ejemplos de polipéptidos BBM incluyen proteínas deArabidopsis thaliana(No. de Acceso NPJ97245.2, SEQ ID NO: 145), maíz (US 7579529),Sorghum bicolor(No. de Acceso XP_002458927) yMedicago truncatula(No. de Acceso AAW82334.1, SEQ ID NO: 146).

En una realización, un polinucleótido exógeno como se describe en la presente memoria que codifica BBM comprende, a menos que se especifique de otra manera, uno o más de lo siguiente:

i) nucleótidos que codifican un polipéptido que comprende aminoácidos cuya secuencia se expone como un de SEQ ID NOs: 145 o 146, o un fragmento bilógicamente activo de las mismas, o un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es al menos 30% idéntica a una o ambos de SEQ ID NOs: 145 o 146,

ii) nucleótidos cuya secuencia es al menos 30% idéntica a i), y

iii) un polinucleótido que hibrida uno o ambos de i) o ii) bajo condiciones rigurosas.

Un polipéptido ABI3 (No. de Acceso NP_189108 deA. thaliana)se relaciona con la proteína VP1 de maíz, se expresa en bajos niveles en los tejidos vegetativos y afecta el desarrollo de plástidos. Un polipéptido ABI4 (No. de Acceso n P_181551 deA. thaliana)pertenece a una familia de factores de transcripción que contienen un dominio AP2 específico de planta (Finkelstein y colaboradores, 1998) y actúa cadena debajo de ABI3. ABI5 (No. de Acceso NP_565840 deA. thaliana)es un factor de transcripción de la familia bZIP que afecta la sensibilidad de ABA y controla la expresión de algunos genes LEA en las semillas. Se liga a un elemento sensible a ABA.

Cada uno de los siguientes factores de transcripción se seleccionó sobre la base de que funcionaron en la embriogénesis en las plantas. Los números de acceso se proporcionan en la Tabla 10. Los homólogos de cada uno se pueden identificar fácilmente en muchas otras especies de plantas y sometidas a prueba como se describe en el Ejemplo 10.

MYB73 es un factor de transcripción que se ha identificado en la soja, implicado en las respuestas de estrés.

bZIP53 es un factor de transcripción en la familia de la proteína bZIP, identificada enArabidopsis.

AGL15 (15 similar a Agamous) es un factor de transcripción de secuencia MADS que se expresa nativamente durante la embriogénesis. AGL15 también se expresa nativamente en los primordios de hoja, meristemos apicales del retoño y botones florales jóvenes, sugiriendo que AGL15 también puede tener una función durante el desarrollo pos germinativo. El AGL15 tiene una función en la embriogénesis y catabolismo de ácido giberélico. Fija como objetivo los factores de transcripción del dominio B3 que son reguladores claves de la embriogénesis.

MYB1 15 y MYB1 18 son factores de transcripción en la familia MYB deArabidopsisimplicada en la embriogénesis.

TANMEI también conocido como EMB2757 codifica una proteína de repetición WD requerida para el desarrollo del embrión enArabidopsis.

WUS, también conocido como Wuschel, es un gen de la homosecuencia que controla la acumulación de células madre en embriones. Se expresa en el centro de organización de células madre de los meristemos y es requerido para mantener las células madre en un estado no diferenciado. El factor de transcripción se liga a un motivo de núcleo de elemento TAAT.

GFR2a1 y GFR2a2 son factores de transcripción al menos de la soja.

Acilo Graso Aciltransferasas

Como se usa en la presente memoria, el término “acilo graso aciltransferasa” se refiere a una proteína que es capaz de transferir un grupo acilo de acil-CoA, PC o acil-ACP, de manera preferente acil-Co A o PC, sobre un sustrato para formar TAG, DAG o Ma G. Estas aciltransferasas incluyen DGAT, PDAT, MGAT, GPAT y LPAAT.

Como se usa en la presente memoria, el término “diacilglicerol aciltransferasa” (DGAT) se refiere a una proteína que transfiere un grupo acilo graso de acil-CoA a un sustrato DAG para producir TAG. De esta manera, el término “actividad de diacilglicerol aciltransferasa” se refiere a la transferencia de un grupo acilo de acil-CoA a DAG para producir TAG. Un DGAT también pueden tener función MGAT pero funciona predominantemente como DGAT, es decir, tiene mayor actividad catalítica como un DGAT que como un MGAT cuando la actividad enzimática se expresa en unidades de producto nmoles/min/mg de proteína (ver por ejemplo, Yen y colaboradores, 2005). La actividad de DGAT puede ser limitante de velocidad en la síntesis de TAG en las semillas (Ichihara y colaboradores, 1988). El DGAT usa un sustrato de acil-CoA como el donador de acilo y lo transfiere a la posiciónsn-3para formar TAG. La enzima funciona en su estado nativo en retículo endoplásmico (ER) de la célula.

Existen tres tipos conocidos de DGAT, referidos como DGAT1, DGAT2 y DGAT3, respectivamente. Los polipéptidos DGAT1 son proteínas de membrana que tienen típicamente 10 dominios transmembrana, los polipéptidos DGAT2 también son las proteínas de membrana pero tienen típicamente 2 dominios transmembrana, mientras que los polipéptidos DGAT3 tienen típicamente ninguno y se cree que son solubles en el citoplasma, no integrados en las membranas. Los polipéptidos DGAT1 de planta tiene típicamente aproximadamente 510-550 residuos de aminoácidos mientras que los polipéptidos DGAT2 tienen típicamente de aproximadamente 310-330 residuos. DGAT1 es la enzima principal responsable para producir TAG de DAG en la mayoría de plantas en desarrollo, mientras que DGAT2s de las especies de planta tal como árbol de tung(Vemicia fordii)y semilla de aceite de ricino(Ricinus communis)que producen altas cantidades de ácidos grasos inusuales que parece que tienen funciones importantes en la acumulación de los ácidos grasos inusuales en TAG. La sobreexpresión de AtDGAT1 en las hojas de tabaco dio por resultado un contenido de TAG incrementado de 6-7 veces (Bouvier-Nave y colaboradores, 2000).

Ejemplos de polipéptidos DGAT1 incluyen proteínas DGAT1 deAspergillus fumigatus(XP_755172.1; SEQ ID NO:80),Arabidopsis thaliana(CAB44774.1; S<e>Q ID NO: 1),Ricinus communis(AAR1 1479.1; SEQ ID NO:81),Vemicia fordii(ABC94472.1; SEQ ID NO:82),Vernonia galamensis(ABV21945.1 y ABV21946.1; SEQ ID NO:83 y SEQ ID NO:84, respectivamente),Euonymus alatus(AAV31083.1; SEQ ID NO-.85),Caenorhabditis elegans(AAF82410.1; SEQ ID NO:86),Rattus norvegicus(NP_445889.1; SEQ ID NO:87),Homo sapiens(NP_03621 1.2; S<e>Q ID NO:88), así como variantes y/o mutantes de las mismas. Ejemplos de polipéptidos DGAT2 incluyen proteínas codificadas por los genesArabidopsis thaliana(NP_566952.1; S<e>Q ID NO:2),Ricinus communis(AAY16324.1; SEQ ID NO:3),Vemicia fordii(ABC94474.1; SEQ ID NO:4),Mortierella ramanniana(AAK84179.1; SEQ ID NO:5),Homo sapiens(Q96PD7.2; SEQ ID NO:6) (Q58HT5.1 ; SEQ ID NO:7),Bos taurus(Q70VZ8.1; SEQ ID NO:8),Mus musculus(AAK84175.1; SEQ ID NO:9), así como variantes y/o mutantes de los mismos. Las secuencias de aminoácidos DGAT1 y DGAT2 muestran poca homología. La expresión en las hojas de una DGAT2 exógena fue dos veces tan eficaz como una DGAT1 en el incremento del contenido de aceite (TAG). Además, unaA. thalianaDGAT2 tuvo una mayor presencia para linoleoil-CoA y linolenoil-CoA como donadores de acilo con respecto al oleoil-CoA, comparado con DGAT1. Esta preferencia de sustrato se puede usar para distinguir las dos clases de DGAT además de sus secuencias de aminoácidos.

Ejemplos de polipéptidos DGAT3 incluyen proteínas codificadas por los genes DGAT3 de cacahuate(Arachis hypogaea,Saha, y colaboradores, 2006), así como variantes y/o mutantes de los mismos. Un DGAT tiene poco o nada de actividad de MGAT detectable, por ejemplo, menor que 300 pmol/min/mg de proteína, de manera preferente menor que 200 pmol/min/mg de proteína, de manera más preferente menor que 100 pmol/min/mg de proteína.

En una realización, un polinucleótido exógeno como se describe en la presente memoria que codifica un DGAT1 comprende uno o más de lo siguiente:

i) nucleótidos que codifican un polipéptido que comprende los aminoácidos cuya secuencia se expone en cualquiera de SEQ ID NOs: 1 u 80 a 88, o fragmento biológicamente activo del mismo, o un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es al menos 30% idéntica a cualquiera de una o más de SEQ ID NOs: 1 u 80 a 88,

ii) nucleótidos cuya secuencia es al menos 30% idéntica a i), y

iii) un polinucleótido que se hibrida a uno o ambos de i) o ii) bajo condiciones rigurosas.

En una realización, un polinucleótido exógeno como se describe en la presente memoria que codifica un DGAT2 comprende uno o más de lo siguiente:

i) nucleótidos que codifican un polipéptido que comprende los aminoácidos cuya secuencia se expone como cualquiera de SEQ ID NOs: 2 a 9, o un fragmento biológicamente activo de la misma, o un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es al menos 30% idéntica a cualquiera de una o más de SEQ ID NOs: 2 a 9,

ii) nucleótidos cuya secuencia es al menos 30% idéntica a i), y

iii) un polinucleótido que se hibrida a una o ambos de i) o ii) bajo condiciones rigurosas.

Como se usa en la presente memoria, el término “fosfolípido:diacilglicerol aciltransferasa” (PDAT; EC 2.3.1.158) o su sinónimo “fosfolípido:1,2-diacil-sn-glicerol O-aciltransferasa” significa una aciltransferasa que transfiere un grupo acilo de un fosfolípido, típicamente Pc, la posición sn-3 de DAG para formar TAG. Esta reacción no se relaciona con DGAT y usa fosfolípidos como los donadores de acilo. Existen varias formas de PDAT en las células de planta incluyendo PDAT1, PDAT2 o PDAT3 (Ghosal y colaboradores, 2007).

Como se usa en la presente memoria, el término “monoacilglicerol aciltransferasa” o “MGAT” se refiere a una proteína que transfiere un grupo de acilo graso de la acil-CoA a un sustrato MAG por ejemplosn-2MAG para producir DAG. Por lo tanto, el término “actividad monoacilglicerol aciltransferasa” se refiere al menos a la transferencia de un grupo acilo de la acil-CoA al MAG para producir DAG. El término “MGAT” según se usa en la presente memoria incluye enzimas que actúan sobre sustratos sn-1/3 MAG y/o sn-2 MAG para formar sn-1,3 DAG y/o sn-1,2/2,3-DAG, respectivamente. En una realización preferida, la MGAT tiene preferencia por el sustrato sn-2 MAG con relación a sn-1 MAG, o sustancialmente emplea solamente sn-2 MAG como sustrato. Como se usa en la presente memoria, la MGAT no incluye enzimas que transfieren preferencialmente un grupo acilo a LisoPA con relación a MAG, donde dichas enzimas se conocen como LPAAT. Es decir, una MGAT emplea preferencialmente sustratos de monoacilo no fosforilados, aun cuando pueden también mostrar una actividad catalítica baja sobre LisoPA. Una MGAT preferida no tiene una actividad detectable en la acilación de LisoPA. Una MGAT también puede tener una función DGA<t>pero funciona predominantemente como una MGAT, es decir, tiene mayor actividad catalítica como una MGAT que como una DGAT cuando la actividad de la enzima se expresa en unidades de nmoles de producto/min/mg de proteína (véase también Yen y colaboradores, 2002). Existen tres clases conocidas de MGAT, referidas como, MGAT1, MGAT2 y MGAT3, respectivamente. Los Ejemplos de polipéptidos MGAT1, MGAT2 y MGAT3 se describen en WO2013/096993.

Como se usa en la presente memoria, la “vía de MGAT” se refiere a una vía anabólica, diferente de la vía Kennedy, para la formación de TAG, en la cual se forma DAG por la acilación de sn-1 MAG o, preferentemente, sn-2 MAG, catalizada por MGAT. El DAG se puede usar subsecuentemente para formar TAG u otros lípidos. La WO2012/000026 mostró en primer lugar que el tejido de la hoja de la planta puede sintetizar MAG de G-3-P tal que el MAG es accesible a un MGAT exógeno expresado en el tejido de la hoja, en segundo lugar el MGAT de varias fuentes puede funcionar en los tejidos de planta, requiriendo una interacción exitosa con otros factores de planta implicados en la síntesis de lípidos y en tercer lugar el DAG producido por la actividad de MGAT exógena es accesible a una planta DGAT, o un DGAT exógeno, para producir TAG. La actividad de MGAT y DGAT puede someterse a ensayo al introducir constructos que codifican las enzimas (o enzimas candidato) en la cepa deSaccharomyces cerevisiaeH1246 y mostrar la acumulación de TAG.

Algunos de los motivos que han demostrado ser importantes para la actividad catalítica de DGAT2 en algunas DGAT2, también están conservados en las aciltransferasas MGAT. De particular interés es un dominio de unión a lípidos neutros putativo con la secuencia consenso FLXLXXXN (SEQ ID NO: 224), donde cada X es de manera independiente cualquier aminoácido distinto de prolina, y N es cualquier aminoácido no polar, ubicado dentro de la región transmembrana N-terminal seguido por un dominio glicerol/fosfolípido aciltransferasa putativo. El motivo FLXLXXXN está presente en la DGAT2 (aminoácidos 81-88) y en la MGAT1/2 de ratón pero no en las DGAT2 de levaduras o plantas. Es importante para la actividad de la DGAT2 de ratón. Otros motivos de secuencias de DGAT2 y/o MGAT1/2 incluyen:

1. Un tripéptido YFP altamente conservado (SEQ ID NO:220) en la mayoría de los polipéptidos de DGAT2 y también en MGAT1 y MGAT2, por ejemplo, presente como los aminoácidos 139-141 en DGAT2 de ratón. Una mutación de este motivo dentro de la DGAT2 de levadura con sustituciones no conservadoras volvió a la enzima no funcional. 2. Un tetrapéptido HPHG (SEQ ID NO: 221), altamente conservado en las MGAT así como en las secuencias de DGAT2 de animales y hongos, por ejemplo, presente como los aminoácidos 161-164 en DGAT2 de ratón, e importante para la actividad catalítica al menos en DGAT2 de levadura y ratón. Las aciltransferasas DGAT2 de plantas contienen en su lugar una secuencia conservada EPHS (SEQ ID NO: 222), de modo que se pueden tolerar cambios conservadores en el primer y cuarto aminoácidos.

3. Un motivo conservado más largo que forma parte del dominio putativo de fosfolípido glicerol. Un ejemplo de este motivo es RXGFX(K/R)XAXXXGXXX(L/V)VPXXXFG(E/Q) (SEQ ID NO: 223), que está presente como los aminoácidos 304-327 en la DGAT2 de ratón. Este motivo está menos conservado en una secuencia de aminoácidos que los demás, como sería de esperar por su longitud, pero se pueden reconocer homólogos mediante búsqueda de motivos. El espaciado puede variar entre los aminoácidos más conservados, es decir, puede existir X aminoácidos adicionales o X aminoácidos menos dentro del motivo en comparación con la secuencia anterior.

Un componente importante en la síntesis de glicerolípidos de los ácidos grasos esterificados a ACP o CoA es la enzima sn-glicerol-3 -fosfato aciltransferasa (GPAT), que es otro de los polipéptidos implicados en la biosíntesis de lípidos no polares. Esta enzima se implica en diferentes rutas metabólicas y funciones fisiológicas. Cataliza la siguiente reacción: G3P acil graso-ACP o -CoA - LPA ACP libre o -CoA. La reacción catalizada por GPAT se presenta en tres compartimientos subcelulares de planta distintos: plástido, retículo endoplásmico (ER) y mitocondria. Estas reacciones se catalizan por tres tipos diferentes de enzimas GPAT, una forma soluble localizada en el estroma plastidial que usa acil-ACP como su substrato de acilo natural (PGP AT en la Figura 1), y dos formas ligadas a membrana situadas en el ER y mitocondria que usan acil-CoA y acil-ACP como donadores de acilo naturales, respectivamente (Chen y colaboradores, 2011).

Como se usa en la presente memoria, el término “glicerol-3-fosfato aciltransferasa” (GPAT; EC 2.3.1.15) y su sinónimo “glicerol-3 -fosfato-O-aciltransferasa” se refieren a una proteína que acila glicerol-3-fosfato (G-3-P) para formar LisoPA y/o MAG, donde éste último producto se forma si la GPAT también tiene actividad fosfatasa sobre LisoPA. El grupo acilo transferido típicamente es de acil-ACP si el GPAT es un GPAT de tipo ER (una “acil-CoA: sn-glicerol-3-fosfato 1-O-aciltransferasa) también referida como “GPAT microsómica” o de acil-ACP si a GPAT es una GOAT de tipo plastidial (PGPAT). Por lo tanto, el término “actividad glicerol-3-fosfato aciltransferasa” se refiere a la acilación de G-3-P para formar LisoPA y/o MAG. El término “GPAT” abarca enzimas que acilan G-3-P para formar sn-1 LPA y/o sn-2 LPA, preferentementesn-2LPA. De manera preferente, el GPAT que se puede sobreexpresar en la modificación extracción es una GPAT ligada a membrana que funciona en el ER de la célula, de manera más preferente una GPAT9, y la GPAT plastidial que se regula negativamente en la modificación de la Ruta Procariota es una GPAT soluble (“GPAT plastidial”). En una realización preferida, la GPAT tiene actividad fosfatasa. En una realización más preferida aún, la GPAT es una sn-2 GPAT que tiene una actividad fosfatasa que produce sn-2 MAG.

Como se usa en la presente memoria, el término “sn-1 glicerol-3-fosfato aciltransferasa” (sn-1 GPAT) se refiere a una proteína que acila sn-glicerol-3-fosfato (G-3-P) para formar preferencialmente 1-acil-sn-glicerol-3-fosfato (sn-1 LPA). De esta manera, el término “actividad de sn-1 glicerol-3 -fosfato aciltransferasa” se refiere a la acilación de sn-glicerol-3-fosfato para formar 1-acil-sn-glicerol-3-fosfato (sn-1 LPA).

Como se usa en la presente memoria, el término “sn-2 glicerol-3 -fosfato aciltransferasa” (sn-2 GPAT) se refiere a una proteína que acila el sn-glicerol-3-fosfato (G-3-P) para formar de manera preferente 2-acil-sn-glicerol-3-fosfato (sn-2 LPA). De esta manera, el término “actividad sn-1 glicerol-3-fosfato aciltransferasa” se refiere a la acilación de sn-glicerol-3-fosfato para formar 1-acil-sn-glicerol-3-fosfato (sn-2 LPA).

La familia GPAT es grande y todos los miembros conocidos contienen dos dominios conservados, un dominio plsC aciltransferasa (PF01553; SEQ ID NO: 15) y un dominio de la superfamilia de hidrolasas tipo HAD (PF12710; SEQ ID NO: 16). Además de esto, enArabidopsis thaliana,la GPAT4-8 contiene una región N-terminal homóloga de un dominio fosfoserina fosfatasa (PF00702; SEQ ID NO:17) y GPATs que producen MAG como un producto se pueden identificar por la presencia de la región homóloga. Algunas GPATs expresadas endógenamente en el tejido de la hoja comprenden la secuencia de aminoácidos conservada GDLVICPEGTTCREP (SEQ ID NO:18) ambas GPAT4 y GAT6 contienen residuos conservados conocidos por ser críticos para la actividad fosfatasa, específicamente aminoácidos conservados en el Motivo I (DXDX[T/V][L/V]; SEQ ID NO:19) y en el Motivo III (K-[G/S][D/S]XXX[D/N]; SEQ ID NO:20) ubicados por el extremo N-terminal (Yang y colaboradores, 2010).

Los homólogos de GPAT4 (NP_171667.1) y GPAT6 (NP_181346.1) incluyen AAF02784.1(Arabidopsis thaliana),AAL32544.1(Arabidopsis thaliana),AAP03413.1(Oryza sativa),ABK25381.1(Picea sitchensis),ACN34546.1 (ZeaMays),BAF00762.1(Arabidopsis thaliana),BAH00933.1(Oryza sativa),EAY84189.1(Oryza sativa),EAY98245.1(Oryza sativa),EAZ21484.1(Oryza sativa),EEC71826.1(Oryza sativa),EEC76137.1(Oryza sativa),EEE59882.1(Oryza sativa),EFJ08963.1(Selaginella moellendorffii)e Fj 11200.1(Selaginella moellendorffii),NP_001044839.1(Oryza sativa),NP_001045668.1(Oryza sativa),NP_001147442.1(Zea mays),NP_001149307.1(Zea mays),NP_001168351.1(Zea mays),AFH02724.1(Brassica napus)NP_191950.2(Arabidopsis thaliana),XP_001765001.1(Physcomitrella patens),XP_001769671.1(Physcomitrella patens), (Vitis vinifera),XP_002275348.1(Vitis vinifera),XP_002276032.1(Vitis vinifera),XP_002279091.1(Vitis vinifera),XP_002309124.1(Populus trichocarpa),XP_002309276.1(Populus trichocarpa),XP_002322752.1(Populus trichocarpa),XP_002323563.1(Populus trichocarpa),XP_002439887.1(Sorghum bicolor),XP_002458786.1(Sorghum bicolor),XP_002463916.1(Sorghum bicolor),XP_002464630.1(Sorghum bicolor),XP_002511873.1(Ricinus communis),XP_002517438.1(Ricinus communis),XP_002520171.1(Ricinus communis),ACT32032.1(Vernicia fordii),Np_001051189.1(Oryza sativa),AFH02725.1(Brassica napus),XP_002320138.1(Populus trichocarpa),XP_002451377.1(Sorghum bicolor),XP_002531350.1(Ricinus communis),y XP_002889361.1(Arabidopsis lyrata).

Las GPATs plastidiales solubles (PGPAT, también conocida como ATS1 enArabidopsis thaliana)se han purificado y los genes que las codifican se han clonado de varias especies de planta tales como guisante(Pisum sativum,Número de acceso: P30706.1), espinaca(Spinacia oleracea,Número de acceso: Q43869.1), calabaza(Cucurbita moschate,Número de acceso: P10349.1), pepino(Cucumis sativus,Número de acceso: Q39639.1) yArabidopsis thaliana(Número de acceso: Q43307.2). La GPAT plastidial soluble es el primer paso comprometido para lo que es conocido como la ruta procariota de la síntesis de glicerolípidos y es operativa solo en el plástido (Figura 1). La así llamada ruta procariota se sitúa exclusivamente en los plástidos de planta y ensambla DAG para la síntesis de galactolípidos (MGDG y DGMG) que contienen ácidos grasos C16:3 esterificados en la posición sn-2 de la cadena principal de glicerol.

Los motivos y/o residuos conservados se pueden usar como elemento diagnóstico basado en secuencias para la identificación de enzimas GPAT/fosfatasa bifuncionales. Como alternativa, se podría usar un ensayo basado en la función más severo. Dicho ensayo comprende, por ejemplo, alimentar glicerol-3-fosfato etiquetado a células o microsomas y cuantificar los niveles de productos etiquetados por cromatografía en capa delgada o una técnica similar. La actividad GPAT da como resultado la producción de LPA etiquetado en tanto la actividad GPAT/fosfatasa da como resultado la producción de MAG etiquetado.

Como se usa en la presente memoria, el término “ácido lisofosfatídico aciltransferasa” (LPAAT; EC 2.3.1.51) y sus sinónimos “1-acil-glicerol-3-fosfato aciltransferasa”, “acil-CoA: 1-acil-sn-glicerol-3-fosfato 2-O-aciltransferasa” y “ lacilglicerol-3-fosfato C-aciltransferasa” se refiere a una proteína que cataliza el ácido lisofosfatídico (LPA) para formar ácido fosfatídico (PA). El grupo acilo que se transfiere es de acil-CoA si el LPAAT es un LPAAT de tipo ER o de acil-ACP si el LPAAT es un LPAAT de tipo plastidial (PLPAAT). De esta manera, el término “actividad de ácido lisofosfatídico aciltransferasa” se refiere a la acilación de LPA para formar PA.

Polipéptidos que Contienen Cuerpo lipídico

Las semillas de planta y polen acumulan TAG en estructuras subcelulares llamadas cuerpos de aceite que varían en general de 0.5-2.5 |jm en dinámetro. Como se usa en la presente memoria, “gotitas de lípidos”, también referidas como “cuerpos de aceite”, son organelos celulares ricos en lípidos para almacenamiento o intercambio de lípidos neutros incluyendo predominantemente TAG. Las gotitas de lípidos pueden variar en gran medida en tamaño de aproximadamente 20nm a 100 jm . Estos organelos tienen un TAG rodeado por una monocapa de fosfolípidos que contiene varias proteínas incrustadas que se implican en el metabolismo de lípidos y almacenamiento, así como tráfico de lípidos a otras membranas, incluyendo oleosinas si los cuerpos de aceite son de semillas de planta o tejidos florales (Jolivet y colaboradores, 2004). Consisten en general de 0.5-3.5% de proteínas mientras que el resto es el lípido. Son los menos densos de los organelos en la mayoría de células y por lo tanto se pueden aislar fácilmente por centrifugación de flotación. Las oleosinas representan lo más abundante (al menos 80%) de la proteína en la membrana de los cuerpos de aceite de las semillas.

Como se usa en la presente memoria, el término “Oleosina” se refiere a una proteína anfipática presente en la membrana de los cuerpos de aceite en los tejidos de almacenamiento de las semillas (ver, por ejemplo, Huang, 1996; Lin y colaboradores, 2005; Capuano y colaboradores, 2007; Lui y colaboradores, 2009; Shimada y Hara-Nishimura, 2010) y variantes artificialmente producidas (ver por ejemplo WO2011/053169 y WO2011/127118).

Las oleosinas son deMrbajo (15-26,000), que corresponden a aproximadamente 140-230 residuos de aminoácidos, que les permiten ser estrechamente empacados sobre la superficie de los cuerpos de aceite. Dentro de cada especie de semilla, existen usualmente dos o más oleosinas de diferente Mr. Cada molécula de oleosina contiene un dominio N terminal relativamente hidrofílico (por ejemplo, aproximadamente 48 residuos de aminoácidos), un dominio central totalmente hidrofóbico (por ejemplo, de aproximadamente entre 70 y 80 residuos de aminoácidos) que es particularmente rico en aminoácidos alifáticos tales como alanina, glicina, leucina, isoleucina y valina, y un dominio ahélice anfipático (por ejemplo, de aproximadamente 33 residuos de aminoácidos) en o cerca del extremo C terminal. El dominio hidrofóbico central contiene típicamente un motivo de nudo de prolina de aproximadamente 12 residuos en su centro. En general, el estiramiento central de los residuos hidrofóbicos se inserta en el núcleo de lípidos y la N-terminal anfipática y/o C-terminal anfipática se sitúan en la superficie de los cuerpos de aceite, con residuos positivamente cargados incrustados en una monocapa de fosfolípidos y las cargadas negativamente expuestas al exterior.

Como se usa en la presente memoria, el término “oleosina” abarca polioleosinas que tienen múltiples polipéptidos oleosina fusionados junto a un polipéptido simple, por ejemplo 2x, 4x o 6x péptidos oleosina, y caleosinas que unen calcio (Froissard y colaboradores, 2009), y esteroleosinas que unen esteroles. Sin embargo, generalmente una gran proporción de las oleosinas de cuerpos grasos no serán caleosinas y/o esteroleosinas. El término “oleosina” también abarca polipéptidos de oleosina que se han modificado artificialmente, tales oleosinas que tienen uno o más residuos de aminoácidos de las oleosinas nativas reemplazadas artificialmente dentro de los residuos de cisteína, como se describe en WO2011/053169. Típicamente, 4-8 residuos se sustituyen artificialmente, de manera preferente 6 residuos, pero tantos como entre 2 y 14 residuos se pueden sustituir. De manera preferente, tanto los dominios N-terminal como C-terminal anfipáticos comprenden sustituciones de cisteína. La modificación incrementa la capacidad de reticulación de las oleosinas e incrementa la estabilidad térmica y/o la estabilidad de las proteínas contra la degradación por las proteasas.

Un número sustancial de secuencias de proteínas de oleosinas y secuencias de nucleótidos que codifican las mismas, son conocidas de un gran número de diferentes especies de plantas. Ejemplos incluyen pero no se limitan a, oleosinas deArabidposis,canola, maíz, arroz, cacahuate, aceite de ricino, soja, lino, uva, col, algodón, girasol, sorgo y cebada. Los ejemplos de oleosinas (con sus Nos. de Acceso) incluyen oleosina deBrassica napus(CAA57545.1; SEQ iD NO:95), oleosina S1-1 deBrassica napus(ACG69504.1; S<e>Q ID NO:96), oleosina S2-1 deBrassica napus(ACG69503.1; SEQ iD NO:97), oleosina S3-1 deBrassica napus(ACG69513.1; SEQ ID NO:98), oleosina S4-1 deBrassica napus(ACG69507.1; Se Q ID NO:99), oleosina S5-1 deBrassica napus(ACG69511.1; SEQ ID NO:100), oleosina 1 deArachis hypogaea(AAZ20276.1; SEQ ID NO:101), oleosina 2 deArachis hypogaea(AAU21500.1; SEQ ID NO:102), oleosina 3 deArachis hypogaea(AAU21501.1; SEQ ID NO:103), oleosina 5 deArachis hypogaea(ABC96763.1; SEQ ID NO:104), oleosina 1 deRicinus communis(EEF40948.1; SEQ ID NO:105), oleosina 2 deRicinus communis(EEF51616.1; SEQ iD NO:106), isoforma a de oleosina deGlicina max(P29530.2; SEQ ID NO:107), isoforma b de oleosina deGlicina max(P29531.1; SEQ ID NO:108), isoforma de bajo peso molecular de oleosina deLinum usitatissimum(ABB01622.1; SEQ ID NO:109), isoforma de alto peso molecular de oleosina deLinum usitatissimum(ABB01624.1; SEQ ID NO:110), oleosina deHelianthus annuus(CAA44224.1; SEQ ID NO:111), oleosina deZea mays(NP_001105338.1; SEQ ID NO:112), esteroleosina deBrassica napus(ABM30178.1; SEQ ID NO:113), esteroleosina SLO1-1 deBrassica napus(ACG69522.1; SEQ ID NO:114), esteroleosina SLO2-1 deBrassica napus(ACG69525.1; SEQ ID NO:115), esteroleosina deSesamum indicum(AAL13315.1; SEQ ID NO:116), esteroleosina deZea mays(NP_001152614.1; SEQ ID NO:117), caleosina CLO-1 deBrassica napus(ACG69529.1; S<e>Q ID NO:118), caleosina CLO-3 deBrassica napus(ACG69527.1; SEQ ID NO:119), caleosina deSesamum indicum(AAF13743.1; SEQ ID NO:120), caleosina deZea mays(NP_001151906.1; SEQ iD NO:121), caleosina deGlycine max(AAB71227). Otros polipéptidos de encapsulación de lípidos que son funcionalmente equivalentes son plastoglobulinas y polipéptidos MLDP (wO2011/127118).

En una realización, un polinucleótido exógeno como se describe en la presente memoria que codifica una oleosina comprende, a menos que se especifique de otra manera, uno o más de lo siguiente:

i) nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende aminoácidos cuya secuencia se expone como en cualquiera de SEQ ID NOs: 95 a 112, o un fragmento biológicamente activo del mismo, o un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es al menos 30% idéntica a cualquiera de una o más de SEQ ID NOs: 95 a 12,

ii) nucleótidos cuya secuencia es al menos 30% idéntica a i), y

En una realización, un polinucleótido exógeno como se describe en la presente memoria que codifica una esteroleosina comprende, a menos que se especifique de otra manera, uno o más de lo siguiente:

i) nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende aminoácidos cuya secuencia se expone como en cualquiera de SEQ ID NOs: 113 a 117, o un fragmento biológicamente efectivo de la misma, o un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es al menos 30% idéntica a cualquiera de una o más de SEQ ID NOs: 113 a 117,

ii) nucleótidos cuya secuencia es al menos 30% idéntica a i), y

Como se usa en la presente memoria, una “proteína asociada a gotitas de lípidos” o “LDAP” significa un polipéptido que se asocia con gotitas de lípidos en las plantas en tejidos u órganos diferentes a las semillas, antera y polen, tales como tejidos de fruta incluyendo pericarpio y mesocarpio. Las LDAPs se pueden asociar con cuerpos de aceite en las semillas, anteras o polen así como en los tejidos u órganos diferentes a las semillas, anteras y polen. Son distintas de las oleosinas que son polipéptidos asociados con la superficie de gotitas de lípidos en los tejidos de semillas, anteras y polen. Las LDAPs como se usa en la presente memoria incluyen polipéptidos de LDAP que se producen naturalmente en los tejidos de planta, así como variantes de secuencias de aminoácidos que se producen artificialmente. La función de tales variantes se puede someter a prueba como se ejemplifica en el Ejemplo 15.

Horn y colaboradores (2013) identificó dos genes de LDAP que expresan en el pericarpio del aguacate. Los polipéptidos LDAP1 y LDAP2 de aguacate codificados fueron 62% idénticos en la secuencia de aminoácidos y tuvieron homología al polipéptido codificado porArabidopsisAt3g05500 y una proteína similar a SRPP de árbol de caucho. Gidda y colaboradores (2013) identificó tres genes LDAP que se expresaron en el mesocarpio de la palma de aceite(Elaeis guineensis)pero no en los granos y concluyó que los genes LDAP fueron específicos de planta y se conservaron entre todas las especies de planta. Los polipéptidos LDAP pueden contener dominios adicionales (Gidda y colaboradores, (2013). Los genes que codifican LDAPs se regulan positivamente en general en los tejidos no de semilla con lípidos abundantes y se pueden identificar de esta manera, pero se cree que se expresan en todas las células no de semilla que producen aceite incluyendo almacenamiento transciente. Horn y colaboradores (2013) muestra un árbol filogenético de proteínas similares a SRPP en las plantas. Los polipéptidos LDAP ejemplares se describen en el Ejemplo 15 en la presente memoria. Los homólogos de LDAPs en otras especies de plantas se pueden identificar fácilmente por aquellas personas expertas en la técnica.

En una realización, un polinucleótido exógeno como se describe en la presente memoria que codifica una LDAP comprende, a menos que se especifique de otra manera, uno o más de lo siguiente:

i) nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende aminoácidos cuya secuencia se expone como en cualquiera de SEQ ID NOs: 237, 239 o 241, o un fragmento biológicamente activo del mismo, o un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es al menos 30% idéntica a cualquiera de una o más de SEQ ID NOs: 237, 239 o 241,

ii) nucleótidos cuya secuencia es al menos 30% idéntica a i), y

Como se usa en la presente memoria, el término un “polipéptido involucrado en la biosíntesis de almidón” hace referencia a cualquier polipéptido, cuya disminución en una célula por debajo de los niveles normales (tipo silvestre) da como resultado una reducción en el nivel de la síntesis de almidón y una disminución en los niveles del almidón. Un ejemplo de tal polipéptido es AGPasa.

Como se usa en la presente memoria, el término “ADP-glucosa fosforilasa” o “AGPasa” hace referencia a una enzima que regula la biosíntesis de almidón, catalizando la conversión de glucosa-1-fosfato y ATP a ADP-glucosa que sirve como el bloque de construcción para los polímeros de almidón. La forma activa de la enzima AGPasa consiste de 2 subunidades grandes y 2 pequeñas.

La enzima ADPasa en plantas existe principalmente como un tetrámero que consiste de 2 subunidades grandes y 2 pequeñas. A pesar de que estas subunidades difieren en sus papeles catalíticos y regulatorios dependiendo de la especie (Kuhn y colaboradores, 2009), en las plantas la subunidad pequeña generalmente muestra una actividad catalítica. El peso molecular de la subunidad pequeña es aproximadamente entre 50 y 55 kDa. El peso molecular de la unidad grande es aproximadamente entre 55 y 60 kDa. La enzima vegetal es activada fuertemente por 3-fosfoglicerato (PGA), un producto de la fijación de dióxido de carbono; en ausencia de PGA, la enzima exhibe sólo aproximadamente 3% de su actividad. La AGPasa vegetal también es inhibida fuertemente por fosfato inorgánico (Pi). Por el contrario, la AGPasa bacteriana y de algas existe como homotetrámeros de 50kDa. La enzima de algas, tal como su contraparte vegetal, es activada por PGA e inhibida por Pi, mientras que la enzima bacteriana es activada por fructosa-1,6-bisfosfato (FBP) e inhibida por AMP y Pi.

TAG Lipasas y Beta-Oxidación

Como se usa en la presente memoria, el término “polipéptido involucrado en la degradación lípidos y/o que reduce el contenido de lípidos” hace referencia a cualquier polipéptido que cataboliza lípidos, cuya disminución en una célula por debajo de los límites normales (de tipo silvestre) resulta en un aumento en el nivel de aceites, tal como ácidos grasos y/o TAG, en la célula, preferentemente una célula de tejido vegetativo de una planta. Los ejemplos de dichos polipéptidos incluyen, a título enunciativo no taxativo, lipasas, o una lipasa tal como polipéptido CGi58, triacilglicerol lipasa SUGAR-DEPENDENT1 (véase, por ejemplo, Kelly y colaboradores, 2012) o una lipasa descrita en WO 2009/027335.

Como se usa en la presente memoria, el término “ lipasa TAG” hace referencia a una proteína que hidroliza grasas a glicerol y ácidos grasos. Por lo tanto, el término “actividad lipasa” hace referencia a la hidrólisis de grasas a glicerol y ácidos grasos.

Como se usa en la presente memoria, el término “CGi58” hace referencia a una ácido lisofosfatídico aciltransferasa soluble dependiente de acil-CoA también conocida en el arte como “At4g24160” (en plantas) y “ Ict1p” (en levaduras). El gen vegetal tal como el dellocusdel gen deArabidopsis,At4g24160, se expresa como dos transcriptos alternativos: una isoforma de longitud completa más larga (At4g24160.1) y una isoforma más pequeña (At4g24160.2) que carece de una porción del extremo 3' (véase James y colaboradores, 2010; Ghosh y colaboradores, 2009; US 201000221400). Ambos ARNm codifican para una proteína que es homóloga a la proteína CGI-58 humana y otros miembros ortólogos de esta familia de a/p hidrolasa (ABHD). En una realización, la proteína CGI58 (At4g24160) contiene tres motivos que están conservados entre las especies vegetales: un motivo GXSXG de lipasa (SEQ ID NO:419), un motivo HX(4)D de aciltransferasa (SEQ ID NO:420), y VX(3)HGF, un motivo de unión a lípidos probable (SEQ ID NO:421). La proteína CGI-58 humana tiene actividad ácido lisofosfatídico aciltransferasa (LPAAT) pero no actividad lipasa. Por el contrario, las proteínas vegetales y de levaduras poseen un motivo GXSXG de secuencia de lipasa canónico (SEQ ID NO:419), que está ausente en proteínas de vertebrados (humanos, ratones, y peces cebra). A pesar de que la proteína CGI58 vegetal y de levaduras parece que poseen cantidades detectables de actividades TAG lipasa y fosfolipasa A además de la actividad de LPAAT, la proteína humana no.

La alteración del genCGI-58homólogo enArabidopsis thalianada como resultado la acumulación de gotas de lípidos neutros en hojas maduras. La espectrometría de masas de gotas de lípidos aisladas de mutantes con pérdida de funcióncgi-58mostró que las mismas contienen triacilgliceroles con ácidos grasos específicos de hojas comunes. Las hojas de plantascgi-58maduras exhiben un aumento etiquetado en los niveles absolutos de triacilglicerol, más de 10 veces mayor que en las plantas de tipo silvestre. Los niveles de lípidos en las semillas que almacenan aceite de las plantascgi-58con pérdida de función no cambiaron, y a diferencia de mutaciones en la p-oxidación, las semillas decgi-58germinaron y crecieron normalmente, sin requerir rescate con sacarosa (James y colaboradores, 2010).

Los ejemplos de nucleótidos que codifican polipéptidos CGi58 incluyen aquellos de las proteínas deArabidopsis thaliana(NM_118548.1 que codifica NP_194147.2; SEQ ID NO:130),Brachypodium distachyon(XP_003578450.1; SEQ ID NO:131),Glicina max(XM_003523590.1 que codifica XP_003523638.1; SEQ ID NO:132),Zea mays(NM_001155541.1 que codifica NP_001149013.1; SEQ ID NO:133),Sorghum bicolor(XM_002460493.1 que codifica XP_002460538.1; SEQ ID NO:134),Ricinus communis(XM_002510439.1 que codifica XP_002510485.1; SEQ ID NO:135),Medicago truncatula(XM_003603685.1 que codifica XP_003603733.1; SEQ ID NO:136), yOryza sativa(que codifica EAZ09782.1).

En una realización, una modificación genética como se describe en la presente memoria regula negativamente la producción endógena de CGi58, en donde CGi58 se codifica por uno o más de lo siguiente:

i) nucleótidos que comprenden una secuencia expuesta como en cualquiera de SEQ ID NOs:130 a 136, y ii) nucleótidos que comprenden una secuencia que es al menos 30% idéntica a cualquiera de una o más de SEQ ID NOs: 130 a 136, y

Otras lipasas que tienen actividad de lipasa en el TAG incluyen triacilglicerol lipasa dependiente de azúcar 1 (SDP1, ver por ejemplo Eastmond y colaboradores, 2006; Kelly y colaboradores, 201 1) y polipéptidos similares a SDP1 encontrados en las especies de plantas así como levadura (polipéptido TGL4) y células animales, que se implican en la descomposición de TAG en almacenamiento. El SDP1 y los polipéptidos similares a SDP1 parece que son responsables por iniciar la descomposición de TAG en las semillas después de la germinación (Eastmond y colaboradores, 2006). Las plantas que son mutantes en SDP1, en ausencia de WRI1 y DGAT1, exógeno, muestran niveles incrementados de PUFA en su TAG. Como se usa en la presente memoria, “polipéptidos SDP1” incluyen polipéptidos SDP1, polipéptidos similares a SDP1 y sus homólogos en las especies de plantas. SDP1 y polipéptidos similares a SDP1 en plantas son residuos de 800-910 aminoácidos en longitud y tienen un dominio de acilhidrolasa similar a patatina que pueden asociarse con superficies de cuerpo lipídico e hidrolizan el TAG en presencia de DAG o MAG. SDP1 se cree que tiene una preferencia para hidrolizar el grupo acilo en la posición sn-2 de TAG.Arabidopsiscontiene al menos tres genes que codifican las SDP1 lipasas, particularmente SDP1 (No. de Acceso NP_196024, secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 163 y homólogos en otras especies), SDP1L (No. de Acceso NM_202720 y homólogos en otras especies, Kelly y colaboradores, 2011) y ATGLL (Atlg33270) (Eastmond y colaboradores, 2006). De interés particular para reducir la actividad del gen son los genes SDP1 que se expresan en los tejidos vegetativos en las plantas, tal como en las hojas, tallos y raíces. Los niveles de lípidos no polares en las partes vegetativas de la planta por lo tanto se pueden incrementar al reducir la actividad de polipéptidos SDP1 en las partes de la planta, por ejemplo, por ya sea mutación de un gen endógeno que codifica un polipéptido SDP1 o introducción de un gen exógeno que codifica una molécula de ARN de silenciamiento que reduce la expresión de un gen SDP1 endógeno. Tal reducción es de beneficio particular en los cultivos de tubérculos tales como remolacha azucarera y papa, y en plantas “con alto contenido de sacarosa” tal como caña de azúcar y la remolacha azucarera.

Los genes que codifican los homólogos de SDP1 (incluyendo homólogos similares a SDP1) en una especie de planta de elección se puede identificar fácilmente por homología a las secuencias de genes SDP1 conocidas. Las secuencias de nucleótidos o aminoácidos SDP1 conocidas incluyen los Nos. de Acceso: enBrassica napus,GN078290 (SEQ ID NO: 164), GN078281, GN078283;Capsella rubella,XP_006287072;Theobroma cacao,XP_007028574.1;Populus trichocarpa,XP_002308909 (SEQ ID NO: 166);Prunus pérsica,XP_007203312;Primus mume,XP_008240737;Mains domestica,XP_008373034;Ricinus communis,XP_002530081;Medicago truncatula,XP_003591425 (SEQ ID NO:167);Solatium lycopersicum,XP_004249208;Phaseolus vulgaris,XP_007162133;Glycine max,XP_003554141 (SEQ ID NO: 168);Solanum tuberosum,XP_006351284;Glycine max,XP_003521 151;Cicer arietinum,XP_004493431;Cucumis sativus,XP_004142709;Cucumis melo,XP_008457586;Jatropha curcas,KDP26217;Vitis vinifera,CBI30074;Oryza sativa, Japonica GroupBAB61223;Oryza sativa,Indica Group EAY75912;Oryza sativa,Japonica Group NP_001044325;Sorghum bicolor,XP_002458531 (SEQ ID NO: 169);Brachypodium distachyon,XP_003567139 (SEQ ID NO:165);Zea mays,AFW85009;Hordeum vulgare,BAK03290 (SEQ ID NO: 172);Aegilops tauschii,EMT32802;Sorghum bicolor,XP_002463665;Zea mays,NP_001168677 (SEQ iD NO: 170);Hordeum vulgare,BAK01155;Aegilops tauschii,EMT02623;Triticum urartu,EMS67257;Physcomitrella patens,XP_001758169 (SEQ ID N0:171). Las secuencias SDP1 preferidas para el uso en los constructos genéticos para inhibir la expresión de los genes endógenos son de ADNcs que corresponden a los genes que se expresan más en gran medida en las células, partes vegetativas de la planta o las semillas cualquiera que se vaya a modificar. Las secuencias de nucleótidos que se conservan en gran medida entre los ADNcs que corresponden a todos los genes SDP1 en una especie de planta son preferidos si se desea reducir la actividad de todos los miembros de una familia de genes en esa especie.

En una realización, una modificación genética como se describe en la presente memoria regula negativamente la producción endógena de SDP1, en donde SDP1 se codifica por uno o más de lo siguiente:

i) nucleótidos cuya secuencia se expone como en cualquiera de SEQ ID NOs: 163 a 174,

ii) nucleótidos cuya secuencia es al menos 30% idéntica a cualquiera de una o más de las secuencias expuesta como SEQ ID NOs: 163 a 174, y

iii) una secuencia de nucleótidos que se hibrida a uno o ambos de i) o ii) bajo condiciones rigurosas.

Como se muestra en los Ejemplos, la reducción de la expresión y/o actividad de la SDP1 TAG lipasa en las hojas de la planta incrementan en gran medida contenido de TAG, tanto en términos de la cantidad de TAG que se acumuló y el tiempo temprano de acumulación durante el desarrollo de la planta, en el contexto de co-expresión del factor de transcripción WRI1 y una acil graso aciltransferasa. En particular, el incremento se observó en las plantas antes del florecimiento, y fue de hasta aproximadamente 70% sobre una base en peso (% de peso seco) en el inicio de la senescencia. El incremento fue relativo con los niveles de TAG observados en las hojas de las plantas correspondientes transformadas con polinucleótidos exógenos que codifican el WRI1 y la acilo graso aciltransferasa pero que carecen de la modificación que redujo la expresión de SDP1 y/o actividad.

La reducción de la expresión de otros genes de catabolismo de TAG en las partes de la planta también puede incrementar el contenido de TAG, tal como los genes CX que codifica la acil-CoA oxidasas tal como los genes Acxl (At4gl6760 y homólogos en otras especies de plantas) o Acx2 (At5g65110 y homólogos en otras especies de plantas). Otro polipéptido implicado en el catabolismo de lípidos es PXA1 que es un transportador del casete de ligación a ATP peroxisomal que es requerido para la importación de ácido graso para la p-oxidación (Zolman y colaboradores 2001).

Exportación de Ácidos Grasos de Plástidos

Como se usa en la presente memoria, el término “polipéptido que incrementa la exportación de ácidos grasos de los plástidos de la célula” se refiere a cualquier polipéptido que ayuda a los ácidos grasos que se transfieren desde dentro de los plástidos (en las células que tiene plástidos tales como una célula de una parte vegetativa, tubérculo, remolacha o una semilla de una planta) al exterior del plástido, que puede ser cualquier otra parte de la célula tal como por ejemplo el reticulo endoplásmico (ER). Ejemplos de tales polipéptidos incluyen, pero no se limitan a, una ácido graso tioesterasa C16 o C18 tal como un polipéptido fAt A o un polipéptido FATB, una ácido graso tioesterasa C8 a C14 (que también es un polipéptido FATB), un transportador de ácido graso tal como un polipéptido ABCA9 o una acil-CoA sintetasa de cadena larga (LACS).

Como se usa en la presente memoria, el término “ácido graso tioesterasa” o “FAT” se refiere a una enzima que cataliza la hidrólisis de la ligación de tioéster entre una porción de acilo y la proteína portadora de acilo (ACP) en el acil-ACP y la liberación de un ácido graso libre. Estas enzimas funcionan típicamente en los plástidos de un organismo que está sintetizando de nuevo los ácidos grasos. Como se usa en la presente memoria, el término “ácido graso tioesterasa C16 o C18” se refiere a una enzima que cataliza la hidrólisis de la ligación de tioéster entre una porción de acilo C16 y/o C18 y ACP en acil-ACP y la liberación del ácido graso C16 o C18 libre en el plástido. El ácido graso libre después se vuelve a esterificar a CoA en la envoltura del plástido como se transporta fuera del plástido. La especificidad del substrato de la enzima ácido graso tioesterasa (FAT) en el plástido se implica en la determinación del espectro de la longitud de cadena y el grado de saturación de los ácidos grasos exportados del plástido. Las enzimas FAT se pueden clasificar en dos clases basadas en su especificidad de substrato y secuencias de nucleótidos, FATA y FATB (EC 3.1.2.14) (Jones y colaboradores, 1995). Los polipéptidos FATA prefieren el oleoil-ACP como substrato, mientras que los polipéptidos muestran mayor actividad hacia los acil-ACPs saturados de diferentes longitudes de cadena tal como actuando en elpalmitoil-ACP para producir el ácido palmítico libre. Ejemplos de polipéptidos FATA útiles para la invención incluyen, pero no se limitan a, aquellos deArabidopsis thaliana(Np_189147),Arachis hypogaea(GU324446),Helianthus annum(AAL79361),Carthamus tinctorius(AAA33020),Morus notabilis(<x>P_010104178.1),Brassica napus(CDX77369.1),Ricinus communis(XP_002532744.1) yCamelina sativa(AFQ60946.1). Ejemplos de polipéptidos FATB útiles para la invención incluyen, pero no se limitan a, aquellos deZea mays(AIL28766),Brassica napus(ABH11710),Helianthus annuus(AAX19387),Arabidopsis thaliana(AEE28300),Umbellularia californica(AAC49001),Arachis hypogaea(AFR54500),Ricinus communis(EEF47013) yBrachypodium sylvaticum(ABL85052.1).

Una subclase de polipéptidos FATB son ácidos grasos tioesterasas que tienen actividad de hidrólisis sobre una porción de acilo saturada C8-C14 ligada por una ligación de tioéster a ACP. Tales enzimas también son referidas como ácido graso tioesterasas de cadena media (MCFA) o enzimas MC-FAT. Tales enzimas también pueden tener actividad de tioesterasa en C16-ACP, de hecho, pueden tener mayor actividad de tioesterasa en un substrato acil-ACP C16 que en un substrato MCFA-ACP, no obstante se consideran en la presente memoria que son una MCFA tioesterasa si producen al menos 0.5% de MCFA en el contenido de ácidos grasos totales cando se expresaron exógenamente en una célula de planta. Ejemplos de MCFA tioesterasas se proporcionan en el Ejemplo 9 en la presente memoria.

Como se usa en la presente memoria, el término “transportador de ácido graso” se refiere a un polipéptido presente en la membrana de plástido que se implica en transferir activamente ácidos grasos de un plástido al exterior del plástido. Ejemplos de polipéptidos ABCA9 (miembro 9 de la familia A de transportador ABC 9) útiles para la invención incluyen pero no se limitan a, aquellos deArabidopsis thaliana(Q9FLT5),Capsella rubella(XPJ306279962.1),Arabis alpine(KFK27923.1),Camelina sativa(XP_010457652.1),Brassica napus(CDY23040.1) yBrassica rapa(XP_009136512.1).

Como se usa en la presente memoria, el término “acil-CoA sintetasa” o “ACS” (EC 6.2.1.3) significa un polipéptido que es un miembro de una familia de ligasa que cataliza la formación de acil-CoA graso por un proceso de dos pasos que procede a través de un intermediario adenilado, usando un ácido graso no esterificado, CoA y ATP como substratos para producir un éster de acil-CoA, AMP y pirofosfato como productos. Como se usa en la presente memoria, el término “acil-CoA sintetasa de cadena larga” (LACS) es una ACS que tiene actividad en al menos un substrato de ácido graso libre C18 aunque puede tener una actividad más amplia en cualquiera de los ácidos grasos libres C14-C20. Las enzimas LACS plastidiales endógena se localizan en la membrana exterior del plástido y funcionan con la ácido graso tioesterasa para la exportación de ácidos grasos del plástido (Schnurr y colaboradores, 2002). EnArabidopsis,existen al menos nueve genes LACS identificados (Shockey y colaboradores, 2002). Los polipéptidos LACS preferidos son de la subclase LACS9, que enArabidopsis esel LACS plastidial principal. Ejemplos de polipéptidos LACS útiles para la invención incluyen, pero no se limitan, a aquellos deArabidopsis thaliana(Q9CAP8),Camelina sativa(XP_010416710.1),Capsella rubella(XP_006301059.1),Brassica napus(CDX79212.1),Brassica rapa(XP_009104618.1),Gossypium raimondii(XP_012450538.1) yVitis Vinifera(XP_002285853.1). Los homólogos de los polipéptidos mencionados en lo anterior en otras especies se pueden identificar fácilmente por aquellas personas expertas en la técnica.

Polipéptidos Implicados en la Producción de Diacilglicerol (DAG) en Plástidos

Los niveles de lípidos no polares en, por ejemplo, partes vegetativas de la planta también se pueden incrementar al reducir la actividad de polipéptidos implicados en la producción de diacilglicerol (DAG) en el plástido en la partes de la planta, por ejemplo por ya sea mutación de un gen endógeno que codifica tal polipéptido o introducción de un gen exógeno que codifica una molécula de ARN de silenciamiento que reduce la expresión de un gen objetivo implicado en la producción de diacilglicerol (DAG) en el plástido.

Como se usa en la presente memoria, el término “polipéptido implicado en la producción de diacilglicerol (DAG) en el plástido” se refiere a cualquier polipéptido en el plástido (en las células que tienen plástidos tal como una célula de una parte vegetativa, tubérculo, remolacha, o una semilla de una planta) que se implica directamente en la síntesis de diacilglicerol. Ejemplos de los polipéptidos incluyen, pero no se limitan a, un GPAT plastidial, un LPAAT plastidial o un PAP plastidial.

Los GPATs se describen en cualquier lugar en el presente documento. Ejemplos de polipéptidos GPAT plastidiales que se pueden fijar como objetivo para la regulación por decremento en la invención incluyen, pero no se limita a aquellos deArabidopsis thaliana(BAA00575),Capsella rubella(XP_006306544.1),Camelina sativa(010499766.1),Brassica napus(CDY43010.1),Brassica rapa(XP_009145198.1),Helianthus animus(ADV16382.1) yCitrus unshiu(BAB79529.1). Los homólogos en otras especies se pueden identificar fácilmente por aquellas personas expertas en la técnica.

Los LPAATs se describen en cualquier lugar en el presente documento. Ya que la persona experta apreciaría, los LPAATs plastidiales que se fijan como objetivo para la regulación por decremento para reducir la síntesis de DAG en el plástido son los LPAATs no endógenos que funcionan fuera del plástido tal como aquellos en el ER, por ejemplo como se describe en la presente memoria por ser útiles para producir TAG que comprenden ácidos grasos de longitud de cadena media. Ejemplos de polipéptidos LPAAT plastidiales que se pueden fijar como objetivo para la regulación por decremento en la invención incluyen, pero no se limitan a, aquellos deBrassica napus(ABQ42862),Brassica rapa(XP_009137939.1),Arabidopsis thaliana(NP_194787.2),Camelina sativa(XP_010432969.1),Glycine max(XP_006592638.1) ySolanum tuberosum(XPJ306343651.1). Los homólogos en otras especies de los polipéptidos mencionados en lo anterior se pueden identificar fácilmente por aquellas personas expertas en la técnica.

Como se usa en la presente memoria, el término “ácido fosfatídico fosfatasa” (PAP) (EC 3.1.3.4) se refiere a una proteína que hidroliza el grupo fosfato en tres 3-sn-fosfatidato para producir 1,2-diacil-sn-glicerol (DAG) y fosfato. Ejemplos de polipéptidos PAP plastidiales que se pueden fijar como objetivo para la regulación por decremento en la invención incluyen, pero no se limitan a, aquellos deArabidopsis thaliana(Q6NLA5),Capsella rubella(XP_006288605.1),Camelina sativa(Xp_010452170.1),Brassica napus(CDY10405.1),Brassica rapa(XP_009122733.1),Glycine max(XP_003542504.1) ySolarium tuberosum(XP_006361792.1). Los homólogos en otras especies de los polipéptidos mencionados en lo anterior se pueden identificar fácilmente por aquellas personas expertas en la técnica.

Importación de Ácidos Grasos en los Plástidos

Los niveles de lípidos no polares en las partes vegetativas de la planta también se pueden incrementar al reducir la actividad de polipéptidos TGD en la partes de la planta, por ejemplo por ya sea mutación de un gen endógeno que codifica un polipéptido TGD o introducción de un gen exógeno que codifica una molécula de ARN de silenciamiento que reduce la expresión de un gen endógeno. Como se usa en la presente memoria, un “polipéptidos de trigalactosildiacilglicerol (TGD)” es uno que se implica en el ER a tráfico de lípidos de cloroplastos (Xu y colaboradores, 2010) y se implica en formar un complejo de proteína que tiene una función de permeasa para los lípidos. Cuatro de los polipéptidos son conocidos para formar o ser asociado con una TGD permeasa, particularmente TGD-1 (No. de Acceso. Atlgl 9800 y homólogos en otras especies), TGD-2 (No. de Acceso At2g20320 y homólogos en otras especies), TGD-3 (No. de Acceso. NM-105215 y homólogos en otras especies) y TGD-4 (At3g06960 y homólogos en otras especies) (US 20120237949). Los polipéptidos TGD-1, -2 y -3 se cree que son componentes de un transportador de casete de ligación a ATP (ABC) asociado con la membrana de envoltura interior del cloroplasto. Los polipéptidos TGD-2 y TGD-4 se ligan al ácido fosfatídico mientras que el polipéptido TGD-3 funciona con una ATPasa en el estroma de cloroplasto. Como se usa en la presente memoria, un “genTGDendógeno” es un gen que codifica un polipéptido TGD en una planta. Las mutaciones en el gen TGD-1A. thalianaprovocó la acumulación de triacilgliceroles, oligogalactolípidos y ácido fosfatídico (PA) (Xu y colaboradores, 2005). Las mutaciones en los genesTGDo genesSDP1,o de hecho cualquier gen deseado en una planta, se puede introducir en una manera específica de sitio por dedo de zinc nucleasa artificial (ZFN), efector TAL (TALEN) o tecnologías CRISPR (usando una nucleasa tipo Cas9) como es conocido en la técnica. Los genes exógenos referidos que codifican ARNs de silenciamiento son aquellos que codifican una molécula de ARN de doble hebra tal como un a Rn de horquilla o un precursor de micro-ARN artificial.

Enzimas Modificadoras de Ácidos Grasos

Como se usa en la presente memoria, el término “FAD2” hace referencia a una desaturasa de ácidos grasos delta-12 unida a membrana que desatura el ácido oleico para producir ácido oleico (18:1ñ9) para producir ácido linoléico (C18:2A912).

Como se usa en la presente memoria, el término “epoxigenasa” o “epoxigenasa de ácidos grasos” hace referencia a una enzima que introduce un grupo epoxi en un ácido graso que resulta en la producción de un ácido graso epoxi. En una realización preferida, el grupo epoxi se introduce en el carbono 12 de una cadena de ácido graso, en cuyo caso la epoxigenasa es una A12-epoxigenasa, especialmente de una cadena de ácido graso de C16 o C18. La epoxigenasa puede ser una A9-epoxigenasa, una A15 epoxigenasa, o actuar en una posición diferente en la cadena de acilos como se conoce en el arte. La epoxigenasa puede ser de la clase P450. Las epoxigenasas preferidas son de la clase monooxigenasa como se describe en WO98/46762. Se han clonado numerosas epoxigenasas o epoxigenasas presumidas y son conocidas en el arte. Otros ejemplos de epoxigenasas incluyen proteínas que comprenden una secuencia de aminoácidos provista en SEQ ID NO:21 de WO 2009/129582, polipéptidos codificados por los genes deCrepis paleastina(CAA76156, Lee y colaboradores, 1998),Stokesia laevis(AAR23815, Hatanaka y colaboradores, 2004) (tipo monooxigenasa),Euphorbia lagascae(AAL62063) (tipo P450), CYP2J2 humano (ácido araquidónico epoxigenasa, U37143); CYPIA1 humano (ácido araquidónico epoxigenasa, K03191), así como variantes y/o mutantes de los mismos.

Como se usa en la presente memoria, el término, “hidrolasa” o “hidrolasa de ácido grasos” hace referencia a una enzima que introduce un grupo hidroxilo en un ácido graso que da como resultado la producción de un ácido graso hidroxilado. En una realización preferida, el grupo hidroxilo es introducido en el 2do, 12do y/o 17vo carbono de una cadena de C18. Preferentemente, el grupo hidroxilo se introduce en el carbono 12do, en cuyo caso la hidrolasa es una A12-hidrolasa. En otra realización preferida, el grupo hidroxilo se introduce en el carbono 15to en una cadena de ácido graso C16. Las hidrolasas también pueden tener actividad enzimática como una ácido graso desaturasa. Los ejemplos de genes que codifican para A12-hidrolasas incluyen aquellos deRicinus communis(AAC9010, van de Loo 1995);Physarialindheimeri,(ABQ01458, Dauk y colaboradores, 2007);Lesquerella fendleri,(AAC32755, Broun y colaboradores, 1998);Daucus carota,(AAK30206); hidrolasas de ácidos grasos que hidroxilan el extremo de los ácidos grasos, por ejemplo:A, thaliana<CYP>86<A>1<(P48422, ácido graso w-hidrolasa); Vicia sativa CYP94A1 (P98188, ácido graso w-hidrolasa); c Yp2E1>de ratón (X62595, ácido láurico w-1 hidrolasa); CYP4A1 de rata (M57718, ácido graso w-hidrolasa), así como variantes y/o mutantes de las mismas.

Como se usa en la presente memoria, el término “conjugasa” o “ácido graso conjugasa” hace referencia a una enzima que tiene la capacidad de formar un enlace conjugado en la cadena de acilos de un ácido graso. Los ejemplos de conjugados incluyen aquellos codificados por genes deCalendula officinalis(AF343064, Qiu y colaboradores, 2001);Vernicia fordii(AAN87574, Dyer y colaboradores, 2002);Punica granatum(AY178446, Iwabuchi y colaboradores, 2003) yTrichosanthes kirilowii(AY178444, Iwabuchi y colaboradores, 2003); así como variantes y/o mutantes de los mismos.

Como se usa en la presente memoria, el término “acetilenasa” o “ácido graso acetilenasa” hace referencia a una enzima que introduce un triple enlace a un ácido graso que da como la producción de un ácido graso acetilénico. En una realización preferida, el triple enlace se introduce en el 2do, 6to, 12do y/o l7 mo carbono en una cadena de ácido graso C18. Los ejemplos de acetilenasas incluyen aquellas deHelianthus annuus(AA038032, ABC59684), así como las variantes y/o mutantes de las mismas.

Los ejemplos de genes que modifican los ácidos grasos incluyen proteínas de acuerdo a los siguientes Números de Acceso que están agrupados por su función putativa, y homólogos de otras especies: A12 acetilenasas ABC00769, CAA76158, AAO38036, AAO38032; A12 conjugasas AAG42259, AAG42260, AAN87574; A12 desaturasas P46313, ABS18716, AAS57577, AAL61825, AAF04093, AAF04094; A12 epoxigenasas XP_001840127, CAA76156, AAR23815; A12 hidrolasas ACF37070, AAC32755, ABQ01458, AAC49010; y enzimas A12 P450 tal como AF406732.

Supresores de Silenciamiento

En una realización, una célula recombinante/transgénica como se describe en la presente memoria puede comprender un supresor de silenciamiento.

Como se usa en la presente memoria, un “supresor de silenciamiento” mejora la expresión transgénica en una célula como se describe en la presente memoria. Por ejemplo, la presencia del supresor de silenciamiento da por resultado niveles más altos de un polipéptido(s) que produjo un polinucleótido(s) exógeno en una célula como se describe en la presente memoria cuando se compara con una célula correspondiente que carece del supresor de silenciamiento. En una realización, el supresor de silenciamiento liga de manera preferente una molécula de ARNds que es 21 pares base en longitud con respecto a una molécula de ARNds de una longitud diferente. Esta es una característica de al menos el tipo p19 del supresor de silenciamiento, particularmente para p19 y sus ortólogos funcionales. En otra realización, el supresor de silenciamiento se liga de manera preferente a una molécula de ARN de doble hebra que tiene extremos 5' pendientes con respecto a una molécula de ARN de doble hebra correspondiente que tiene extremos romos. Esta es una característica del tipo V2 del supresor de silenciamiento, particularmente para V2 y sus ortólogos funcionales. En una realización, la molécula de ARNds, o un producto de ARN procesado del mismo comprende al menos 19 nucleótidos consecutivos, de manera preferente cuya longitud es de 19-24 nucleótidos con 19-24 pares base consecutivos en el caso de una molécula de ARN de horquilla de doble hebra o producto de ADN procesado, de manera más preferente que consiste de 20, 21 , 22, 23 o 24 nucleótidos en longitud, y que comprende de manera preferente un nucleótido metilado, que es al menos 95% idéntico al complemento de la región del ARN objetivo, y en donde la región del ARN objetivo es i) dentro de una región no traducida 5' del ARN objetivo, ii) dentro de una mitad 5' del ARN objetivo, iii) dentro de un marco de lectura abierto que codifica la proteína del ARN objetivo iv) dentro de una mitad 3' del ARN objetivo, o v) dentro de una región no traducida 3' del ARN objetivo.

Los detalles adicionales con respecto a los supresores de silenciamiento son bien conocidos en la técnica y se describen en WO 2013/096992 y WO 2013/096993.

Polinucleótidos

Los términos “polinucleótido” y “ácido nucleico” se usan indistintamente. Se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sea desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, o análogos de los mismos. Un polinucleótido como se describe en la presente memoria puede ser de origen genómico, ADNc, semi-sintético, o sintético, de cadena doble o de cadena simple y en virtud de su origen o manipulación: (1) no está asociado con todo o una porción de un polinucleótido con el cual está asociado en la naturaleza, (2) está ligado a un polinucleótido distinto del polinucleótido al cual está ligado en la naturaleza o (3) no existe en la naturaleza. Los siguientes son ejemplos no limitativos de polinucleótidos: regiones de codificación o no codificantes de un gen o fragmento de gen,loci (locus)definidos por análisis de ligamiento, exones, intrones, ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia (ARNt), ARN ribosómico (ARNr), ribozimas, ADNc, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, ADN quimérico de cualquier secuencia, sondas de ácido nucleico y cebadores. Para el usoin vitro,un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tal como por conjugación con un componente de etiquetado.

Como se usa en la presente memoria, un “polinucleótido aislado” se refiere a un polinucleótido que se ha separado de las secuencias de polinucleótidos con las cuales se asocia o se liga en su estado nativo, o un polinucleótido no de origen natural.

Como se usa en la presente memoria, el término “gen” se interpreta es su sentido más amplio e incluye las secuencias de desoxirribonucleótidos que comprenden a la región transcrita y, si se traducen, la región codificante de la proteína, de un gen estructural e inclusive las secuencias ubicadas adyacentes a la región codificante por ambos extremos 5' y 3' para una distancia de al menos 2 kb aproximadamente por cualquier extremo y que están relacionadas con la expresión del gen. En este sentido, el gen incluye las señales de control, tales como promotores, potenciadores, señales de terminación y/o de poliadenilación, que están asociadas naturalmente con un gen dado, o señales de control heterólogas en cuyo caso el gen se conoce como un “gen quimérico”. Las secuencias ubicadas 5' con respecto a la región codificante de la proteína y que están presentes sobre el ARNm se denominan secuencias no traducidas 5'. Las secuencias ubicadas 3' con respecto a la región codificante de la proteína y que están presentes sobre el ARNm se denominan secuencias no traducidas 3'. El término “gen” abarca tanto al ADNc como las formas genómicas de un gen. Una forma genómica o clon de un gen contiene la región codificante que puede interrumpirse con secuencias no codificantes denominadas “ intrones” o “regiones intervinientes” o “secuencias intervinientes”. Los intrones son segmentos de un gen que se transcriben en un ARN nuclear (ARNn). Los intrones pueden contener elementos reguladores tales como potenciadores. Los intrones son removidos o “procesados fuera” del transcripto nuclear o primario; los intrones están por lo tanto están ausentes en el trascripto de ARNm. Un gen que contiene al menos un intrón se puede someter a empalme variable, dando por resultado ARNms alternativos de un gen transcripto individual y por lo tanto variantes de polipéptido. Un gen en su estado nativo, o un gen quimérico pueden carecer de intrones. El ARNm funciona durante la traducción especificando la secuencia o el orden de los aminoácidos en un polipéptido naciente. El término “gen” incluye una molécula sintética o de fusión que codifica todo o parte de las proteínas como se describe en la presente memoria que se describen en la presente memoria y una secuencia de nucleótidos complementaria de cualquiera de las mencionadas anteriormente.

Como se usa en la presente memoria, “ADN quimérico” se refiere a cualquier molécula de ADN que no existe naturalmente en la naturaleza; también denominada “construcción de ADN” o “construcción genética”. Típicamente, un ADN quimérico comprende secuencias reguladoras y transcritas o codificantes de proteínas que no existen juntos en la naturaleza. Por consiguiente, un ADN quimérico puede comprender secuencias reguladoras y secuencias codificantes derivadas de distintas fuentes o secuencias reguladoras y secuencias codificantes derivadas de la misma fuente, pero en una disposición diferente de la hallada en la naturaleza. El marco de lectura abierto puede estar ligado, o no, a sus elementos reguladores 5' y 3' naturales. El marco de lectura abierto se puede incorporar, por ejemplo, en el genoma de la planta, en una ubicación no natural o en un replicón o vector donde no existe naturalmente tal como en un plásmido bacteriano o un vector viral. El término “ADN quimérico” no se limita a moléculas de ADN que se pueden replicar en un hospedador, sino que incluye ADN capaz de ligarse en un replicón, por ejemplo, mediante secuencias adaptadoras específicas.

Un “transgen” es un gen que fue introducido en el genoma mediante un procedimiento de transformación. El término incluye un gen en una célula de progenie, planta, semilla, organismo no humano o una parte del mismo que se introdujo en el genoma de una célula progenitora del mismo. Dichas células de la progenie, etc. pueden ser al menos una progenie de 3ra o 4ta generación respecto a la célula progenitora que fue la primera célula transformada o de la planta transgénica progenitora (referiría en la presente memoria como una planta T0). La progenie se puede producir por reproducción sexual o vegetativamente tal como, por ejemplo, a partir de tubérculos en papas o soca en caña de azúcar. El término “modificado genéticamente”, “modificación genética” y variaciones de los mismos, es un término más amplio que incluye introducir un gen en una célula por transformación o transducción, mutar un gen en una célula y alterar o modular genéticamente la regulación de un gen en una célula, o la progenie de cualquier célula modificada como se describió previamente.

Una “región genómica”, según se usa en la presente memoria, se refiere a una posición dentro del genoma en donde se ha insertado un transgen, o un grupo de transgenes (también denominado agrupación en la presente memoria), en una célula, o en un predecesor de la misma. Dichas regiones comprenden solamente nucleótidos que fueron incorporados por la intervención del hombre, tal como mediante los métodos que se describen en la presente memoria.

Un “polinucleótido recombinante” como se describe en la presente memoria se refiere a una molécula de ácido nucleico que se construyó o modificó mediante métodos recombinantes artificiales. El polinucleótido recombinante puede estar presente en una célula en una cantidad alterada o se puede expresar a un índice alterado (por ejemplo, en el caso del ARNm) en comparación con su estado nativo. En una realización, el polinucleótido se introduce en una célula que no comprende naturalmente al polinucleótido. Típicamente se usa un ADN exógeno como templado para la transcripción del ARNm que luego es traducido en una secuencia de residuos de aminoácidos continua que codifican un polipéptido como se describe en la presente memoria dentro de la célula transformada. En otra realización, el polinucleótido es endógeno para la célula y su expresión es alterada por medios recombinantes, por ejemplo, se introduce una secuencia de control exógena 5' con respecto a un gen endógeno de interés para permitir la expresión del polipéptido codificado por el gen por parte de la célula transformada, o se crea una supresión en un gen de interés por los métodos ZFN, TALEN o CRISPR.

Un polinucleótido recombinante como se describe en la presente memoria incluye polinucleótidos que no han sido separados de los demás componentes del sistema de expresión basado en células o sin células, en el cual está presente, y los polinucleótidos producidos en tales sistemas celulares o no celulares que luego se separan por purificación de por lo menos algunos de los demás componentes. El polinucleótido puede ser una extensión contigua de nucleótidos existente en la naturaleza, o comprende dos o más extensiones contiguas de nucleótidos de fuentes diferentes (naturales y/o sintéticas) unidas para formar un solo polinucleótido. Típicamente dichos polinucleótidos quiméricos comprenden al menos un marco de lectura abierto que codifica un polipéptido como se describe en la presente memorialigado operativamente a un promotor adecuado para dirigir la transcripción del marco de lectura abierto en una célula de interés.

Con respecto a los polipéptidos definidos, se podrá apreciar que las cifras de % de identidad mayores que las provistas antes abarcarán realizaciónes preferidas. Por consiguiente, cuando fuera aplicable, a la luz de las cifras mínimas de % de identidad, se prefiere que el polinucleótido comprenda una secuencia de polinucleótidos que es al menos un 60%, más preferentemente al menos un 65%, más preferentemente al menos un 70%, más preferentemente al menos un 75%, más preferentemente al menos un 80%, más preferentemente al menos un 85%, más preferentemente al menos un 90%, más preferentemente al menos un 91%, más preferentemente al menos un 92%, más preferentemente al menos un 93%, más preferentemente al menos un 94%, más preferentemente al menos un 95%, más preferentemente al menos un 96%, más preferentemente al menos un 97%, más preferentemente al menos un 98%, más preferentemente al menos un 99%, más preferentemente al menos un 99,1%, más preferentemente al menos un 99,2%, más preferentemente al menos un 99,3%, más preferentemente al menos un 99,4%, más preferentemente al menos un 99,5%, más preferentemente al menos un 99,6%, más preferentemente al menos un 99,7%, más preferentemente al menos un 99,8% y aún más preferentemente al menos un 99,9% idéntica al SEQ ID NO relevante nominado.

Un polinucleótido de utilidad para la presente invención se puede hibridar selectivamente, bajo condiciones severas, con un polinucleótido definido en la presente memoria. Como se usa en la presente memoria, las condiciones severas son aquellas que (1) durante la hibridación emplean un agente desnaturalizante tal como formamida, por ejemplo, formamida 50% (volumen en volumen) con albúmina de suero bovino 0.1% (peso en volumen), Ficoll 0,1%, polivinilpirrolidona 0.1%, solución amortiguadora de fosfato de sodio 50 mM a pH 6.5 con NaCl 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42oC; o (2) emplean formamida 50%, SSC 5 x (NaCl 0.75 M, citrato de sodio 0.075 M), fosfato de sodio 50 mM (pH 6.8), pirofosfato de sodio 0.1%, solución de Denhardt 5 x, ADN de esperma de salmón sonicado (50 g/ml), SDS 0.1% y sulfato de dextrano 10% a 42oC en SSC 0.2 x y SDS 0.1% y/o (3) emplean una fuerza iónica baja y temperatura alta para el lavado, por ejemplo, NaCl 0.015 M/citrato de sodio 0,0015<m>/<s>DS 0.1% a 50oC.

Los polinucleótidos como se describe en la presente memoria pueden contener, en comparación con las moléculas naturales, una o más mutaciones que son supresiones, inserciones o sustituciones de residuos de nucleótidos. Los polinucleótidos que contienen mutaciones con relación a una secuencia de referencia pueden ser naturales (vale decir, aislados de una fuente natural) o sintéticas (por ejemplo, obtenidos mediante mutagénesis dirigida al sitio o entremezclado de ADN del ácido nucleico descrito precedentemente).

Polinucleótidos para Reducir la Expresión de Genes

Interferencia por ARN

La interferencia por ARN (ARNi) es particularmente útil reducir específicamente la expresión de un gen, lo cual da por resultado producción reducida de una proteína particular, si el gen codifica una proteína. A pesar de no desear de estar limitado por la teoría, Waterhouse y colaboradores. (1998) han provisto un modelo para el mecanismo por el cual se puede usar el ARNcd (dúplex de ARN) para reducir la producción de proteína. Esta tecnología se basa en la presencia de moléculas de ARNcd que contienen una secuencia que es esencialmente idéntica al ARNm del gen de interés o parte del mismo. Convenientemente, el ARNcd se puede producir a partir de un promotor único en un vector recombinante o célula hospedadora, en donde las secuencias sentido y antisentido están flanqueadas por una secuencia no relacionada que permite que las secuencias sentido y antisentido para formar la molécula de ARNcd con la secuencia no relacionada formando una estructura de bucle. El diseño y producción de moléculas de ARNcd adecuadas está dentro de la capacidad de una persona con experiencia en el arte, particularmente considerando Waterhouse y colaboradores. (1998), Smith y colaboradores. (2000), WO 99/32619, WO 99/53050, WO 99/49029, y WO 01/34815.

En un ejemplo, se introduce un ADN que dirige la síntesis de al menos un producto(s) ARN parcialmente de doble cadena con homología con el gen blanco a ser inactivado tal como, por ejemplo, un genSDP1, TGD, GPATplastidial,LPAATplastidial,PAPplastidial,AGPAasa.El ADN por lo tanto comprende las secuencias sentido y antisentido que, cuando se transcriben a ARN, pueden hibridar para formar la región de ARN de doble cadena. En una realización, las secuencias sentido y antisentido están separadas por una región espaciadora que comprende un intrón que, cuando se transcribe a ARN, se escinde. Se ha mostrado que este arreglo da como resultado una mayor eficacia en el silenciamiento de genes. La región de doble cadena puede comprender una o dos moléculas de ARN, transcriptas de una región de ADN o dos. La presencia de la molécula de doble cadena se piensa que inicia una respuesta de un sistema endógeno que destruye el ARN de doble cadena y también el transcripto de ARN homólogo del gen blanco, reduciendo eficazmente o eliminando la actividad del gen blanco.

La longitud de las secuencias de sentido y antisentido que se hibridan deben tener cada una al menos 19 nucleótidos contiguos de manera preferente, al menos 50 nucleótidos contiguos, de manera más preferente al menos 100 o al menos 200 nucleótidos contiguos. En general, se usa una secuencia de 100-1000 nucleótidos que corresponden a una región del ARNm del gen objetivo. Se puede usar la secuencia de longitud completa que corresponde al transcripto del gen entero. El grado de identidad de las secuencias sentido y antisentido con el transcripto que es blanco (y por lo tanto también la identidad de la secuencia anti-sentido al complemento del transcripto objetivo) debe ser al menos 85%, al menos 90%, o al menos entre 95 y 100%. La molécula de ARN puede comprender por supuesto secuencias no relacionadas que pueden funcionar para estabilizar la molécula. La molécula de ARN se puede expresar bajo el control de un promotor de ARN polimerasa II o ARN polimerasa III. Los ejemplos de estos últimos incluyen promotores de ARNt o ARNsn.

Las moléculas de ARN pequeño de interferencia preferidas (“ARNpi”) comprenden una secuencia de nucleótidos que es idéntica a aproximadamente 19-25 nucleótidos contiguos del ARNm blanco. Preferentemente, la secuencia de ARNpi comienza con el dinucleótido AA, comprende un contenido de GC de aproximadamente entre 30 y 70% (preferentemente, entre 30 y 60%, más preferentemente entre 40 y 60% y más preferentemente aproximadamente entre 45% y 55%), y no tiene un alto porcentaje de identidad con ninguna secuencia de nucleótidos diferente del blanco en el genoma del organismo en el cual se introduce, por ejemplo, determinado por búsqueda por BLAST estándar.

microARN

Los microARN (abreviados ARNmi) son generalmente moléculas de ARN no codificantes de entre 19 y 25 nucleótidos (comúnmente aproximadamente entre 20 y 24 nucleótidos en plantas) que derivan de precursores más largos que forman estructuras de tallo-bucle imperfectas. Los ARNmi se unen a secuencias complementarias en los transcriptos de ARN mensajero blanco (ARNm), usualmente dando como resultado la represión de la traducción o degradación del blanco y el silenciamiento del gen. Los ARNmis artificiales (ARNamis) se pueden diseñar basados en los ARNmis naturales para reducir la expresión de cualquier gen de interés, así como son bien conocidos en la técnica.

En las células vegetales, se cree que las moléculas precursoras de ARNmi que son procesadas extensamente en el núcleo. El ARNmi-pri (que contiene una o más regiones locales de doble cadena u “horquilla” así como el usual “extremo protector” 5' y la cola de poliadenilación de un ARNm) es procesado a una molécula precursora de ARNmi más corta que también incluye una estructura de tallo-bucle o plegada y es llamada “pre-ARNmi”. En las plantas, los pre-ARNmi son clivados por diferentes enzimas similares a DICER (DCL), dando dúplex ARNmi:ARNmi*. Antes de transportarlos hacia afuera del núcleo, estos dúplex son metilados. ;;En el citoplasma, la cadena de ARNmi del dúplex de ARNmi:ARNmi se incorpora selectivamente a un complejo de silenciamiento activo inducido por ARN (RISC) para el reconocimiento de blanco. Los complejos RISC contienen un subconjunto particular de proteínas Argonauta que ejercen represión de genes específica de secuencia (véase, por ejemplo, Millar y Waterhouse, 2005; Pasquinelli y colaboradores, 2005; Almeida y Allshire, 2005). ;;Co-supresión;;Los genes pueden suprimir la expresión de genes endógenos relacionados y/o transgenes ya presentes en el genoma, un fenómeno llamado silenciamiento de genes dependiente de homología. La mayor parte de los casos de silenciamiento de genes dependiente de homología cae dentro de dos clases - aquellos que funcionan al nivel de transcripción del transgen, y aquellos que operan post-transcripcionalmente. ;;El silenciamiento de genes dependiente de homología post-transcripcionalmente (es decir, co-supresión) describe la pérdida de expresión de un transgen y genes endógenos relacionados o virales en plantas transgénicas. La co-supresión con frecuencia, pero no siempre, se produce cuando los transcriptos de transgen son abundantes, y generalmente se cree que es iniciado a nivel del procesamiento del ARNm, localización, y/o degradación. Existen varios modelos para explicar cómo funciona la co-supresión (véase en Taylor, 1997). ;;La co-supresión involucra introducir una copia extra de un gen o un fragmento del mismo en una planta en la orientación sentido respecto al promotor para su expresión. Una persona con experiencia podría apreciar que el tamaño del fragmento sentido, su correspondencia con las regiones del gen blanco, y su grado de identidad de secuencia con el gen blanco se pueden determinar por aquellas personas expertas en la técnica. En algunos casos, la copia adicional de la secuencia del gen interfiere con la expresión del gen vegetal blanco. Se hace referencia a WO 97/20936 y EP 0465572 para métodos para implementar las estrategias de co-supresión. ;;Polinucleótidos antisentido;;El término “polinucleótido antisentido” se debe tomar como que hace referencia a una molécula de ADN o ARN, o combinación de las mismas, que es complementaria a al menos una porción de una molécula de ARNm específica que codifica para un polipéptido endógeno y que tiene la capacidad de interferir con un evento post-transcripcional tal como la traducción del ARNm. El uso de métodos con antisentido es bien conocido en el arte (véase, por ejemplo, G. Hartmann y S. Endres, Manual of Antisense Methodology, Kluwer (1999)). El uso de técnicas con antisentido en plantas ha sido revisado por Bourque (1995) y Senior (1998). Bourque (1995) lista un gran número de ejemplos de cómo las secuencias antisentido han sido utilizadas en sistemas vegetales como un método para la inactivación de genes. Bourque también afirma que alcanzar el 100% de inhibición de cualquier actividad enzimática puede no ser necesario ya que la inhibición parcial dará como resultado más que probablemente un cambio que se puede medir en el sistema. Senior (1998) afirma que los métodos con antisentido son ahora una técnica muy bien establecida para manipular la expresión de genes. ;;En una realización, el polinucleótido antisentido se hibrida bajo condiciones fisiológicas, es decir, el polinucleótido antisentido (que es completa o parcialmente de cadena simple) tiene al menos la capacidad para formar un polinucleótido de doble cadena con el ARNm que codifica un polipéptido endógeno, por ejemplo, SDP1, TGD, GPAT plastidial, LPAAT plastidial, PAP plastidial o AGPasa ARNm bajo condiciones normales en una célula. ;;Las moléculas antisentido pueden incluir secuencias que corresponden con los genes estructurales o para secuencias que afectan el control sobre la expresión de genes o eventos de corte y empalme. Por ejemplo, la secuencia antisentido puede corresponderse con la región codificante blanco del gen endógeno gene, o la región no traducida 5' (UTR) o la 3'-UTR o una combinación de estas. Puede ser complementaria en parte a las secuencias intrones, que pueden ser quitadas por corte y empalme durante o luego de la transcripción, preferentemente sólo a secuencias exones del gen blanco. En vista de la generalmente mayor divergencia de las UTR, el direccionamiento hacia estas regiones provee mayor especificidad de inhibición de genes. ;;La longitud de la secuencia antisentido debe ser de al menos 19 nucleótidos contiguos, preferentemente al menos 50 nucleótidos, y más preferentemente al menos 100, 200, 500 o 1000 nucleótidos. Se puede usar la secuencia de longitud completa complementaria al transcripto del gen completo. La longitud más preferentemente es de entre 100 y 2000 nucleótidos. El grado de identidad de la secuencia antisentido con el transcripto blanco debe ser de al menos 90% y más preferentemente entre 95 y 100%. La molécula de ARN antisentido puede por supuesto comprender secuencias no relacionadas que pueden funcionar para estabilizar la molécula. ;;Vectores recombinantes;;Una aspecto de la presente memoria incluye un vector recombinante, que comprende al menos un polinucleótido definido en la presente memoria, capaz de distribuir el polinucleótido en una célula hospedadora. Los vectores recombinantes incluyen vectores de expresión. Los vectores recombinantes contienen secuencias heterólogas de polinucleótidos, es decir, secuencias de polinucleótidos que no existen naturalmente adyacentes a un polinucleótido definido en la presente memoria, que, preferentemente, deriva de una especie diferente. El vector puede ser de ARN o ADN, ya sea procariota o eucariota, y típicamente es un vector viral, derivado de un virus, o un plásmido. Los vectores de plásmidos incluyen típicamente secuencias de ácidos nucleicos adicionales que proporcionan una manera fácil de selección, amplificación y transformación del casete de expresión en células procariotas, por ejemplo, vectores derivados de pUC, vectores derivados de pSK, vectores derivados de pGEM, vectores derivados de pSP, vectores derivados de pBS o vectores binarios que contienen una o más regiones de T-ADN. Las secuencias de ácidos nucleicos adicionales incluyen orígenes de replicación para proporciona una replicación autónoma del vector, genes marcadores seleccionables, que preferentemente codifican resistencia a antibióticos o herbicidas, múltiple sitios de clonación únicos que proporcionan múltiples sitios para insertar secuencias de ácidos nucleicos o genes codificados en la construcción de ácido nucleico, y secuencias que mejoran la transformación de células procariotas y eucariotas (en especial plantas). ;;El término “ ligado operativamente”, según se usa en la presente memoria, se refiere a una relación funcional entre dos o más segmentos de ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN). Típicamente, se refiere a la relación funcional de un elemento regulador de la transcripción (promotor) con una secuencia transcrita. Por ejemplo, un promotor está ligado operativamente a una secuencia codificante de un polinucleótido definido en la presente memoria, si estimula o modula la transcripción de la secuencia codificante en una célula apropiada. En general, los elementos promotores reguladores de la transcripción que están ligados operativamente a una secuencia transcrita se encuentran físicamente contiguos de la secuencia transcrita, es decir, actúan encis.Sin embargo, algunos de los elementos reguladores de la transcripción, tales como potenciadores, no necesitan ubicarse físicamente contiguas o muy próximas de las secuencias codificantes cuya transcripción mejoran. ;;Cuando se encuentran presentes múltiples promotores, cada promotor puede ser igual o diferente. ;;Los vectores recombinantes también pueden contener una o más secuencias de péptidos señal, para permitir la secreción de un polipéptido expresado definido en la presente memoria para ser retenido en el retículo endoplásmico (ER) de la célula o transferirlo a un plástido, y/o secuencias de fusión que conducen a la expresión de moléculas de ácidos nucleicos como proteínas de fusión. Los ejemplos de segmentos de señal adecuados incluyen cualquier segmento de señal capaz de dirigir la secreción o la localización de un polipéptido definido en la presente memoria. ;;Para facilitar la identificación de los transformantes, el vector recombinante comprende preferentemente un gen de un marcador seleccionable o rastreable. Un “gen marcador” se refiere a un gen que imparte un fenotipo distinto a las células que expresan dicho gen marcador y por consiguiente permite diferenciar dicha célula transformada de las células que no contienen al marcador. Un gen marcador seleccionable confiere una característica que se puede “seleccionar” basado en la resistencia a un agente selectivo (por ejemplo, un herbicida, un antibiótico). Un gen marcador rastreable (o gen informante) confiere un rasgo que se pueda identificar por observación o evaluación, es decir, mediante un “examen” (por ejemplo, p-glucuronidasa, luciferasa, GFP u otra actividad enzimática que no está presente en células no transformadas). Los ejemplos de marcadores seleccionables para la selección de transformantes de plantas incluyen, pero en un sentido no limitativo, un genhygque codifica resistencia a higromicina B; un gen de neomicina fosfotransferasa(nptII)que confiere resistencia a kanamicina, paromomicina, G418; un gen de glutatión-S-transferasa de hígado de rata que confiere resistencia a herbicidas derivados de glutatión como se describe, por ejemplo, en EP 256223; un gen de la glutamina sintetasa que confiere, con la sobreexpresión, resistencia a los inhibidores de la glutamina sintetasa tal como fosfinotricina como se describe, por ejemplo, en WO 87/05327, un gen de la acetiltransferasa deStreptomyces viridochromogenesque confiere resistencia al agente selectivo de fosfinotricina como se describe, por ejemplo, en EP 275957, un gen que codifica una 5-enolshiquimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) que confiere tolerancia a N-fosfonometilglicina como describen, por ejemplo, Hinchee y colaboradores, (1988), un genbarque confiere resistencia contra bialafos como se describe, por ejemplo, en WO91/02071; un gen de nitrilasa tal comobxndeKlebsiella ozaenaeque confiere resistencia a bromoxinilo (Stalker y colaboradores, 1988); un gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) que confiere resistencia a metotrexato (Thillet y colaboradores, 1988); un gen mutante de acetolactato sintasa (ALS), que confiere resistencia a imidazolinona, sulfonilurea u otras sustancias químicas inhibidoras de ALS (EP 154,204); un gen mutado de la antranilato sintasa que confiere resistencia a 5-metiltriptofano; o un gen de dalapón deshalogenasa que confiere resistencia al herbicida. ;;Preferentemente, el vector recombinante se incorpora de manera estable en el genoma de la célula, tal como la célula vegetal. Por consiguiente, el vector recombinante puede comprender elementos apropiados que permiten incorporar al vector en el genoma, o en un cromosoma de la célula. ;;Vector de expresión;;Como se usa en la presente memoria, un vector de expresión es un vector de ADN o ARN que tiene la capacidad de transformar una célula hospedadora y de lograr la expresión de uno o más polinucleótidos específicos. Los vectores de expresión como se describe en la presente memoria contienen secuencias reguladoras tales como secuencias de control de transcripción, secuencias de control de la traducción, orígenes de replicación y otras secuencias reguladoras que son compatibles con la célula hospedadora y que controlan la expresión de los polinucleótidos como se describe en la presente memoria. En particular, los vectores de expresión como se describe en la presente memoria incluyen secuencias de control de la transcripción. Las secuencias de control de la transcripción son secuencias que controlan el comienzo, la elongación y terminación de la transcripción. Las secuencias de control de la transcripción particularmente importantes son aquellas que controlan el comienzo de la transcripción, tales como secuencias promotoras, potenciadoras, operadoras y represoras. La elección de las secuencias reguladoras usadas depende del organismo blanco, tal como una planta y/u órgano blanco o tejido de interés. Dichas secuencias reguladoras se pueden obtener de cualquier organismo eucariota tal como plantas o virus de plantas, o se pueden sintetizar químicamente. Se han descrito numerosos vectores adecuados para una transfección estable de células vegetales o para establecer plantas transgénicas, por ejemplo, en Pouwelsy colaboradores, Cloning Vectors: A Laboratory Manual,1985, suplemento 1987; Weissbach y Weissbach,Métodos for Plant Molecular Biology,Academic Press, 1989; y Gelviny colaboradores, Plant Molecular Biology Manual,Kluwer Academic Publishers, 1990. Típicamente, los vectores de expresión en plantas incluyen, por ejemplo, uno o más genes vegetales clonados bajo el control de transcripción de secuencias reguladoras 5' y 3' y un marcador seleccionable dominante. Dichos vectores de expresión en plantas también pueden contener una región reguladora promotora (por ejemplo, una región reguladora que controla una expresión inducible o constitutiva, regulada por el medio ambiente o por el desarrollo o específica de células o tejidos), un sitio de inicio de la transcripción, un sitio de unión a ribosoma, una señal de procesamiento de ARN, un sitio de terminación de la transcripción y/o una señal de poliadenilación. ;;Se han descrito numerosos promotores constitutivos que son activos en células vegetales. Los promotores adecuados para una expresión constitutiva en plantas incluyen, pero en un sentido no limitativo, el promotor 35<s>del virus en mosaico de la coliflor (CaMV), el promotor del 35S virus en mosaico de la escrofularia (FMV), el promotor del virus baciliforme de la caña de azúcar, el promotor del virus moteado amarillo de la comelina, el promotor inducible por luz de la subunidad pequeña de la ribulosa-1,5-bi-fosfatocarboxilasa, el promotor de la triosafosfato isomerasa citosólica de arroz, el promotor de la adenina fosforibosiltransferasa deArabidopsis,el promotor del gen de la actina 1 de arroz, los promotores de la manopina sintasa y octopina sintasa, el promotor Adh, el promotor de la sacarosa sintasa, el promotor del complejo del gen R y el promotor del gen de la proteína de unión a clorofila a/p. Estos promotores se han usado para crear vectores de ADN que se han expresado en plantas; véase, por ejemplo, WO 84/02913. Todos estos promotores se han usado para crear diversos tipos de vectores de ADN recombinantes de expresión en plantas. ;;Con el fin de obtener expresión en los tejidos fuente de la planta, tal como hojas, semillas, raíz o tallo, se prefiere que los promotores utilizados en la presente invención sean de una expresión relativamente alta en estos tejidos específicos. Para este fin, se puede elegir entre una cantidad de promotores para genes con expresión específica o mejorada para tejidos o células. Los ejemplos de tales promotores informados en la literatura incluyen el promotor GS2 de la glutamina sintetasa de cloroplasto de chícharo, el promotor de la fructosa-1,6-bifosfatasa de cloroplastos de trigo, el promotor ST-LS1 fotosintética nuclear de papa, el promotor de serina/treonina quinasa y el promotor de glucoamilasa (CHS) deArabidopsis thaliana.También se informaron como activos en los tejidos fotosintéticamente activos al promotor de la ribulosa-1,5-bifosfato carboxilasa del alerce del este(Larix laricina),el promotor del genCab, Cab6,de pino, el promotor del genCab-1de trigo, el promotor del genCab-1de espinaca, el promotor del gen Cab 1R de arroz, el promotor del gen de piruvato, el promotor de ortofosfato diquinasa (PPDK) deZea mays,el promotor del genLhcb1*2de tabaco, el promotor Suc2 sacarosa-H30 symporter deArabidopsis thalianay el promotor de los genes de proteínas de la membrana tilacoide de espinaca (PsaD, PsaF, PsaE, PC, FNR, AtpC, AtpD, Cab, RbcS). También se pueden utilizar otros promotores de las proteínas de unión a clorofila a/p en la presente invención, tales como los promotores del gen LhcB y del gen PsbP de mostaza blanca(Sinapis alba).

Hay una variedad de promotores de genes vegetales que son regulados como respuesta a señales del medio ambiente, hormonales, sustancias químicas y/o del desarrollo que también se pueden usar para la expresión de genes de proteínas de unión a ARN en células vegetales, incluyendo promotores regulados por (1) calor, (2) luz (por ejemplo, el promotor RbcS-3A de chícharo, el promotor RbcS de maíz); (3) hormonas, tales como ácido abscísico, (4) lesiones (por ejemplo, WunI); o (5) sustancias químicas, tal como jasmonato de metilo, ácido salicílico, hormonas esteroides, alcohol, protectores (WO 97/06269) o también puede ser ventajoso emplear (6) promotores específicos de órganos.

Como se usa en la presente memoria, el término “promotor específico del órgano de almacenamiento de una planta” se refiere a un promotor que preferencialmente, en comparación con otros tejidos vegetales, dirige la transcripción de genes en un órgano de almacenamiento de una planta. Con el fin de obtener expresión en los tejidos de almacenamiento o reserva de la planta, tales como el tubérculo de la planta de papa, el fruto de tomate o las semillas de soja, canola, algodón,Zea mays,trigo, arroz y cebada, se prefiere que los promotores utilizados en la invención tengan una expresión relativamente alta en estos tejidos específicos. Se puede usar el promotor de la p-conglicinina u otros promotores específicos de semillas tales como los promotores de napina, zeína, linina y faseolina. También se pueden usar promotores específicos de raíces. Un ejemplo de un promotor tal es el promotor del gen de la ácido quitinasa. La expresión en los tejidos de la raíz también se podría lograr utilizando los subdominios específicos de la raíz del promotor CaMV 35S que han sido identificados.

En una realización particularmente preferida, el promotor dirige la expresión en tejidos y órganos en los cuales tiene lugar la biosíntesis de lípidos. Dichos promotores actúan en el desarrollo de las semillas en el momento adecuado para modificar la composición del lípido en las semillas.

En otra realización preferida particular, el promotor es promotor específico de los órganos y tejidos de la planta donde la biosíntesis de lípidos tiene lugar. . Los promotores preferidos para una expresión específica de semillas incluyen: 1) promotores de genes que codifican enzimas relacionadas con la biosíntesis y la acumulación en semillas de lípidos tales como desaturasas y elongasas, 2) promotores de genes que codifican proteínas de almacenamiento en semillas, y 3) promotores de genes que codifican enzimas relacionadas con la biosíntesis y acumulación en semillas de carbohidratos. Los promotores específicos de semillas que son adecuados comprenden el promotor del gen de napina de colza oleaginosa (US 5.608.152), el promotor de USP deVicia faba(Baumlein y colaboradores, 1991), el promotor de oleosina deArabidopsis(WO 98/45461), el promotor de faseolina dePhaseolus vulgaris(US 5,504,200), el promotor Bce4 deBrassica(W<o>91/13980) o el promotor de legumina B4 (Baumlein y colaboradores, 1992) y los promotores que conducen a la expresión específica de semillas en monocotiledóneas tales como maíz, cebada, trigo, centeno, arroz y semejantes. Los promotores adecuados más importantes son el promotor del gen lpt2 o lpt1 de cebada (WO 95/15389 y W<o>95/23230) o los promotores que se describen en WO 99/16890 (promotores del gen de la hordeína de cebada, el gen de glutelina de arroz, el gen de orizina de arroz, el gen de prolamina de arroz, el gen de gliadina de trigo, el gen de glutelina de trigo, el gen de zeína de maíz, el gen de glutelina de avena, el gen de kasirina de sorgo, el gen de secalina de centeno). Otros promotores incluyen los que se describen en Broun y colaboradores, (1998), Potenza y colaboradores, (2004), US 20070192902 y U<s>20030159173. En una realización, el promotor específico de semillas se expresa preferencialmente en partes definidas de las semillas tales como en los cotiledones o en el endospermo. Los ejemplos de promotores específicos de cotiledones incluyen, pero en un sentido no limitativo, el promotor de FP1 (Ellerstrom y colaboradores, 1996), el promotor de legumina de chícharo (Perrin y colaboradores, 2000) y el promotor de fitohemaglutinina de haba (Perrin y colaboradores, 2000). Los ejemplos de promotores específicos del endospermo incluyen, pero en un sentido no limitativo, el promotor de zeína-1 de maíz (Chikwamba y colaboradores, 2003), el promotor de glutelina-1 de arroz (Yang y colaboradores, 2003), el promotor de D-hordeína de cebada (Horvath y colaboradores, 2000) y los promotores de HMW glutenina de trigo (Alvarez y colaboradores, 2000). En una realización adicional, el promotor específico de semillas no se expresa, o solamente se expresa a un nivel bajo, en el embrión y/o después que germinó la semilla.

En otra realización, el promotor específico del órgano de almacenamiento vegetal es un promotor específico de frutos. Los ejemplos incluyen, pero en un sentido no limitativo, los promotores E8 y Pds de la poligalacturonasa de tomate, así como el promotor ACC oxidasa de manzana (por una revisión véase Potenza y colaboradores, 2004). En una realización preferida, el promotor dirige preferencialmente la expresión en las partes comestibles de la fruta, por ejemplo, la médula de la fruta, con relación a la piel de la fruta o las semillas dentro del fruto.

En una realización, el promotor inducible es el sistema alc deAspergillus nidulans.Los ejemplos de los sistemas de expresión inducible que se pueden usar en lugar del sistema alc deAspergillus nidulansse describen en una revisión de Padidam (2003) y Corrado y Karali (2009). En otra realización, el promotor inducible es un promotor inducible protector tal como, por ejemplo, el promotorln2-1oln2-2de maíz (Hershey y Stoner, 1991), el promotor inducible protector es el promotor GST-27 de maíz (Jepson y colaboradores, 1994), o el promotor GH2/4 de soja (Ulmasov y colaboradores, 1995).

En otra realización, el promotor inducible es un promotor inducible de senescencia tal como, por ejemplo, promotor inducible por senescencia SAG (gen asociado a senescencia) 12 y SAG 13 deArabidopsis(Gan, 1995; Gan y Amasino, 1995) y LSC54 deBrassica napus(Buchanan-Wollaston, 1994). Estos promotores muetran una expresesión aumentada en el inicio de la senescencia de los tejidos de la planta, particularmente las hojas.

Para la expresión en tejido vegetativo se pueden usar promotores específicos de hoja, tal como los promotores de ribulosa bifosfato carboxilasa (RBCS). Por ejemplo, los genes RBCS1, RBCS2 y RBCS3A de tomate se expresan en hojas y plántulas marrón claro (Meier y colaboradores, 1997). Se puede usar un promotor de ribulosa bisfosfato carboxilasa expresado casi exclusivamente en células del mesófilo en láminas de las hojas y vainas a niveles altos, descrito por Matsuoka y colaboradores. (1994). Otro promotor específico de hoja es el promotor del gen de la proteína de unión a clorofila a/b captadora de luz (véase, Shiina y colaboradores, 1997). El promotor del gen relacionado con myb deArabidopsis thaliana(Atmyb5) descrito por Li y colaboradores. (1996), es específico de hoja. El promotor Atmyb5 se expresa en tricomas de hojas en desarrollo, estípulas, y células epidérmicas en los márgenes de rosetas jóvenes y hojas caulinas, y en semillas inmaduras. También se puede usar un promotor de hoja identificado en maíz por Busk y colaboradores. (1997).

En algunos casos, por ejemplo, cuando se expresa recombinantemente LEC2 o BBM, puede ser deseable que el transgen no se exprese a niveles altos. Un ejemplo de un promotor que se puede usar en dichas circunstancias es un promotor de napina A truncado que retiene el patrón de expresión específico de semilla pero con un nivel de expresión reducido (Tan y colaboradores, 2011).

La secuencia directriz no traducida 5' puede derivar del promotor seleccionado para expresar la secuencia del gen heterólogo del polinucleótido como se describe en la presente memoria o puede ser heteróloga con respecto a la región codificante de la enzima a producir y se puede modificar específicamente, si se desea, para incrementar la traducción del ARNm. Por una revisión sobre la optimización de la expresión de transgenes, véase Koziel y colaboradores, (1996). Las regiones no traducidas 5' también se pueden obtener de los ARN virales de plantas (virus en mosaico del tabaco, virus del grabado de la hoja de tabaco, virus en mosaico enano de maíz, virus en mosaico enano de alfalfa, entre otros), de genes eucariotas adecuados, de genes vegetales (directriz del gen de la proteína de unión a clorofila a/b de trigo y maíz) o de una secuencia genética sintética. La presente memoria divulgación no se limita a las construcciones en donde la región no traducida deriva de la secuencia no traducida 5' que acompaña a la secuencia del promotor. La secuencia directriz también podría derivar de una secuencia codificante o de un promotor no relacionado. Las secuencias directrices de utilidad en el contexto de la presente invencióncomprenden la directriz Hsp70 de maíz (US 5.362.865 y US 5.859.347) y el elemento TMV omega.

La terminación de transcripción se efectúa con una secuencia de ADN no traducida 3' ligada operativamente en el vector de expresión al polinucleótido de interés. La región no traducida 3' de una molécula de ADN recombinante contiene una señal de poliadenilación cuya función en plantas causa la adición de nucleótidos adenilato al extremo 3' del ARN. La región no traducida 3' se puede obtener de diversos genes que se expresan en células vegetales. La región no traducida 3' de la nopalina sintasa, la región no traducida 3' del gen de la subunidad pequeña de Rubisco de chícharo, la región no traducida 3' de la proteína de almacenamiento 7S de soja en genes de semillas son de uso común en este sentido. También son adecuadas las regiones no traducidas transcritas 3', que contienen la señal de poliadenilato de los genes del plásmido inductor de tumores (Ti) deAgrobacterium.

Se pueden usar tecnologías de ADN recombinante para mejorar la expresión de un polinucleótido transformado mediante manipulación, por ejemplo, la eficacia con que se traducen los transcriptos resultantes por la optimización con codón de acuerdo con la especie de célula hospedadora o la supresión de secuencias que desestabilizan transcriptos y la eficacia de las modificaciones pos-traduccionales.

Ácidos nucleicos de transferencia

Se pueden usar ácidos nucleicos de transferencia para administrar un polinucleótido exógeno a una célula y comprende una, preferentemente dos, secuencias de bordes y o más polinucleótidos de interés. El ácido nucleico de transferencia puede codificar, o no, un marcador seleccionable. Preferentemente, el ácido nucleico de transferencia forma parte de un vector binario en la bacteria, donde dicho vector binario comprende además elementos que permiten la replicación del vector en la bacteria o permite la selección o conservación de células bacterianas que contienen al vector binario. Con la transferencia a una célula eucariota, el componente de ácido nucleico de transferencia del vector binario tiene la capacidad de integrarse en el genoma de la célula eucariota o, para experimentos de expresión transiente, simplemente de expresión en la célula.

Como se usa en la presente memoria, el término “ácido nucleico de transferencia extracromosómico” se refiere a una molécula de ácido nucleico que tiene la capacidad de poder ser transferida de una bacteria, tal comoAgrobacterium sp.,a una célula eucariota, tal como una célula foliar vegetal. Un ácido nucleico de transferencia extracromosómico es un elemento genético reconocido como un elemento que puede ser transferido con la subsiguiente integración de la secuencia de nucleótidos contenida dentro de sus bordes en el genoma de la célula receptora. En este sentido, un ácido nucleico de transferencia típicamente está flanqueado por dos secuencias de “bordes”, aunque en algunos casos se puede usar un solo borde por uno de los extremos y el segundo extremo del ácido nucleico transferido es generado aleatoriamente en el proceso de transferencia. Un polinucleótido de interés se ubica típicamente entre la secuencia tipo borde izquierdo y la secuencia tipo borde derecho de un ácido nucleico de transferencia. El polinucleótido contenido dentro del ácido nucleico de transferencia se puede ligar operativamente a una variedad de diferentes elementos reguladores promotores y terminadores que facilitan su expresión, es decir, la transcripción y/o traducción del polinucleótido. Los T-ADN deAgrobacterium sp.tal como deAgrobacterium tumefacienso deAgrobacterium rhizogenes,y variantes/mutantes de los mismos elaboradas por el hombre son probablemente los ejemplos mejor caracterizados de ácidos nucleicos de transferencia. Otro ejemplo es el ADN-P (“ADN de plantas”) que comprende secuencias tipo borde de T-ADN de plantas.

Como se usa en la presente memoria, “T-ADN” se refiere, por ejemplo, al T-ADN de un plásmido Ti deAgrobacterium tumefacienso de un plásmido Ri deAgrobacterium rhizogenes,o variantes de los mismos elaboradas por el hombre que funcionan para la transferencia de ADN en las células vegetales. El T-ADN puede comprender un T-ADN completo incluyendo ambas secuencias de bordes derecho e izquierdo, pero solamente es necesario que comprenda las secuencias mínimas requeridas encispara la transferencia, es decir, la secuencia del borde derecho y de T-ADN. En los T-ADN como se describe en la presente memoria se han insertado, en cualquier parte entre las secuencias de bordes derecho e izquierdo (si está presente), el polinucleótido de interés flanqueado por sitios blanco para una recombinasa específica del sitio. Las secuencias que codifican los factores requeridos entranspara la transferencia del T-ADN en una célula vegetal, tal como los genesvir,se pueden insertar en el T-ADN o pueden estar presentes sobre el mismo replicón que el T-ADN o preferentemente se encuentran entranssobre un replicón compatible en el hospedador deAgrobacterium.Dichos “sistemas de vectores binarios” son bien conocidos en el arte.

Como se usa en la presente memoria, el “ADN-P” se refiere a un ácido nucleico de transferencia aislado de un genoma vegetal, o variantes/mutantes del mismo elaboradas por el hombre, y comprende por cada extremo, o por un solo extremo, una secuencia tipo borde de T-ADN.

Como se usa en la presente memoria, la secuencia de “borde” de un ácido nucleico de transferencia se puede aislar de un organismo seleccionado, tal como una planta o bacteria, o puede ser una variante/mutante de la misma elaborada por el hombre. La secuencia del borde promueve y facilita la transferencia del polinucleótido con el cual está ligado y puede facilitar su integración en el genoma de la célula receptora. En una realización, una secuencia de borde tiene entre 10-80 pb de longitud. Las secuencias de bordes del T-AD<n>deAgrobacterium sp.son bien conocidas en el arte e incluyen los que se describen en Lacroix y colaboradores. (2008).

Si bien tradicionalmente sólo se ha usadoAgrobacterium sp.para transferir genes a células vegetales, existe ahora una gran cantidad de sistemas que fueron identificados/desarrollados y que actúan de una manera similar aAgrobacterium sp.Recientemente se han modificado genéticamente varias especies distintas deAgrobacteriumpara que sean competentes para la transferencia de genes (Chung y colaboradores, 2006; Broothaerts y colaboradores, 2005). Estas especies incluyenRhizobiumsp. NGR234,Sinorhizobium melilotiyMezorhizobium loti.

La transferencia directa de plásmidos de expresión eucariotas de bacterias a hospedadores eucariotas se logró por primera vez hace varias décadas por fusión de células de mamífero y protoplastos deEscherichia coliportadores de plásmidos (Schaffner, 1980). Desde entonces, ha ido aumentando de manera constante la cantidad de bacterias capaces de distribuir genes en células de mamífero (Weiss, 2003), habiendo sido descubiertos por cuatro grupos de forma independiente (Sizemore y colaboradores, 1995; Courvalin y colaboradores, 1995; Powell y colaboradores, 1996; Darji y colaboradores, 1997).

Como se usa en la presente memoria, los términos “transfección”, “transformación” y variaciones de los mismos en general se usan indistintamente. Las células “transfectadas” o “transformadas” pueden haber sido manipuladas para introducir el o los polinucleótidos de interés, o pueden ser células de la progenie derivadas de ellas.

Células recombinantes

La memoria también describe una célula recombinante, por ejemplo, una célula vegetal recombinante, que es una célula hospedadora transformada con uno o más polinucleótidos o vectores definidos en la presente memoria, o una combinación de los mismos. Las células adecuadas como se describe en la presente memoria incluyen cualquier célula que se pueda transformar con un polinucleótido o un vector recombinante como se describe en la presente memoria, que codifica, ARN, un polipéptido o una enzima descrita en la presente memoria. La célula es preferentemente una célula que de esa manera se pueda usar para producir lípidos. La célula recombinante puede ser una célula en cultivo, una célulain vitroo presente en un organismo, tal como por ejemplo una planta, o en un órgano, tal como por ejemplo una semilla o una hoja. Preferentemente, la célula se encuentra en una planta, más preferentemente en la semilla de una planta. En una realización, la célula recombinante es una célula no humana.

Las células hospedadoras en las cuales se introducen los polinucleótido pueden ser células no transformadas o células que ya fueron transformadas con al menos un ácido nucleico. Dichos ácidos nucleicos pueden estar relacionados, o no, con la síntesis de lípidos. Las células hospedadoras como se describe en la presente memoria pueden tener capacidad endógena (es decir, natural) para producir los polipéptidos definidos en la presente memoria, en cuyo caso la célula recombinante derivada de los mismos tienen una mayor capacidad para producir los polipéptidos, o pueden tener la capacidad de producir tales polipéptidos solamente después de su transformación con al menos un polinucleótido como se describe en la presente memoria. En una realización, la célula recombinante como se describe en la presente memoria tiene una capacidad mejorada para producir lípidos no polares.

Las células hospedadoras como se describe en la presente memoria pueden ser cualquier célula capaz de producir al menos una de las proteínas descritas en la presente memoria, e incluyen células fúngicas (incluyendo de levadura), de animales tales como artrópodos, y de plantas tales como células de algas. En una realización preferida, la célula vegetal es una célula de semilla, en particular una célula del cotiledón o endospermo de una semilla. La célula hospedadora puede ser de un organismo adecuado para el proceso de fermentación, tal como, por ejemplo,Yarrowia lipolyticau otras levaduras. En una realización, la célula es una célula animal. La célula animal puede ser de cualquier tipo de animal tal como, por ejemplo, una célula de un animal no humano, una célula de un vertebrado no humano, una célula de mamífero no humano o células de animales acuáticos tales como, peces o crustáceos, invertebrados, insectos, etc. Los ejemplos de células de algas de utilidad como células hospedadoras como se describe en la presente memoria incluyen, por ejemplo,Chlamydomonas sp(por ejemplo,Chlamydomonas reinhardtii), Dunaliella sp., Haematococcus sp.Chlorella sp., Thraustochytrium sp., Schizochytrium sp. y Volvox sp.

Plantas transgénicas

La memoria también describe una planta que comprende uno o más polinucleótidos exógenos y una o más modificaciones genéticas como se describe en la presente memoria, una célula como se describe en la presente memoria, un vector como se describe en la presente memoria o una combinación de los mismos. El término “planta” cuando se usa como un sujeto se refiere a plantas completas, en tanto el término “parte de la misma” se refiere a órganos vegetales (por ejemplo, hojas, tallos, raíces, flores, frutos), células individuales (por ejemplo, polen), semillas, partes de semillas tales como un embrión, endospermo, escutelo o recubrimiento de semillas, tejido vegetal tal como tejido vascular, células vegetales y la progenie de las mismas. Como se usa en la presente memoria, las partes de plantas comprenden células vegetales.

Como se usa en la presente memoria, los términos “en una planta” y “en la planta” en el contexto de una modificación a la planta significa que la modificación se ha presentado en al menos una parte de la planta, incluyendo donde la modificación se ha presentado por toda la planta, y no excluye donde la modificación se presenta en solo una o más pero no en todas las partes de la planta. Por ejemplo, un promotor específico de tejido se dice que se expresa “en una planta”, aunque se puede expresar solo en ciertas partes de la planta. Análogamente “un polipéptido de factor de transcripción que incrementa la expresión de uno o más genes glucolíticos y/o de la biosíntesis de ácidos grasos en la planta” significa que la expresión incrementada se presenta en al menos una parte de la planta.

Como se usa en la presente memoria, el término “planta” se usa en su sentido más amplio, incluyendo cualquier organismo en el Reino de las Plantas. También incluye algas rojas y marrones, así como algas verdes. Incluye, pero en un sentido no limitativo, cualquier especie de planta en florecimiento, pasto, planta ornamental o decorativa, cultivo o cereal (por ejemplo, semilla oleaginosa, maíz, soja), alimento o alimento, frutos o verduras, plantas herbáceas, plantas leñosas, plantas con flores o árboles. No pretende limitar una planta a ninguna estructura particular. También se refiere a una planta unicelular (por ejemplo, una microalga). El término “parte de la misma” con referencia a una planta se refiere a una célula vegetal y a la progenie de la misma, a una pluralidad de células vegetales, una estructura que está presente en cualquier etapa del desarrollo de una planta, o un tejido vegetal. Dichas estructuras incluyen, pero en un sentido no limitativo, hojas, tallos, flores, frutos, nueces, raíces, semillas, recubrimiento de semillas, embriones. El término “tejido vegetal” incluye tejidos vegetales diferenciados y no diferenciados incluyendo los que están presentes en hojas, tallos, flores, frutos, nueces, raíces, semillas, por ejemplo, tejido embrionario, endospermo, tejido dérmico (por ejemplo, epidermis, periderma), tejido vascular (por ejemplo, xilema, floema) o tejido básico (que comprende células de parénquima, colénquima y/o esclerénquima), así como células en cultivo (por ejemplo, células individuales, protoplastos, callos, embriones, etc.). El tejido vegetal puede estarin planta,en cultivo de órganos, en cultivo tisular o cultivo celular.

Como se usa en la presente memoria, el término “tejido vegetativo” o “parte vegetativa de la planta” es cualquier tejido de la planta, órgano o parte diferente a los órganos para la reproducción sexual de las plantas. Los órganos para la reproducción sexual de las plantas son específicamente órganos que llevan semillas, flores, polen, frutas y semillas. Los tejidos vegetativos y partes incluyen al menos hojas de la planta, tallos, (incluyendo rollos de tejido y vástagos, pero excluyendo las cabezas) tubérculos y raíces, pero excluye flores, polen, semillas incluyendo la cubierta de la semilla, embrión y endospermo, fruta incluyendo el tejido mesocarpiano, capullos que llevan semillas y cabezas que llevan semillas. En una realización, la parte vegetativa de la planta es una parte de la planta aérea. En otra realización adicional, la parte vegetativa de la planta es una parte verde tal como una hoja o tallo.

Una “planta transgénica”, una “planta modificada genéticamente” o variaciones de las mismas, se refieren a una planta que contiene un transgen que no se encuentra en una planta de tipo silvestre de la misma especie, variedad o cultivar. Las plantas transgénicas definidas en el contexto de la presente invención incluyen plantas y su progenie que han sido modificadas genéticamente usando técnicas recombinantes para producir al menos un polipéptido definido en la presente memoria en la planta o parte de la misma. Las partes de plantas transgénicas tienen un significado correspondiente.

Los términos “semilla” y “grano” se usan indistintamente en la presente memoria. Un “grano” se refiere a un grano maduro, tal como un grano cosechado o un grano que aún se encuentra sobre la planta pero que está listo para ser cosechado, y también se refiere a un grano después de embeberlo o hacerlo germinar, según el contexto. Los granos maduros comúnmente tienen un contenido de humedad menor que entre 18 y 20% aproximadamente. En una realización preferida, el contenido de humedad del grano está en un nivel que generalmente es considerado como seguro para el almacenamiento, preferentemente entre 5% y 15%, entre 6% y 8%, entre 8% y 10%, o entre 10% y 15%. Una “semilla en desarrollo”, según se usa en la presente memoria, se refiere a una semilla antes de la madurez, típicamente presente en las estructuras reproductoras de la planta después de la fertilización o antesis, pero también se refieren a las semillas antes de la madurez que se pueden aislar de la planta. La semilla madura tiene comúnmente un contenido de humedad menor que aproximadamente 12%.

Como se usa en la presente memoria, el término “órgano de almacenamiento de una planta” se refiere a una parte de una planta especializada en guardar energía en la forma de, por ejemplo, proteínas, carbohidratos, lípidos. Los ejemplos de órganos de almacenamiento de una planta son semillas, frutos, raíces tuberosas y tubérculos. Un órgano de almacenamiento preferido de una planta como se describe en la presente memoriaes la semilla.

Como se usa en la presente memoria, el término “fenotípicamente normal” se refiere a una planta o parte de la misma, en particular un órgano de almacenamiento tal como una semilla, tubérculo o fruto como se describe en la presente memoria modificada genéticamente que no tiene una capacidad significativamente reducida para crecer y reproducirse en comparación con una planta o parte de la misma no modificada. De manera preferente, la biomasa, velocidad de crecimiento, velocidad de germinación, tamaño de órganos de almacenamiento, tamaño de la semilla y/o el número de semillas viables producidas no es menor que 90% de aquella de una planta que carece de las modificaciones genéticas o polinucleótidos exógenos cuando se desarrollan bajo condiciones idénticas. Este término no abarca características de la planta que pueden ser diferentes a la planta de tipo silvestre pero que no afectan la utilidad de la planta para propósitos comerciales tales como, por ejemplo, un fenotipo de bailarina de las hojas de la plántula. En una realización, la planta o parte de la misma modificada genéticamente que es fenotípicamente normal comprende un polinucleótido recombinante que codifica un supresor por silenciamiento ligado operativamente a un promotor específico del órgano de almacenamiento de una planta y que tiene la capacidad de crecer o reproducirse, esencialmente igual que una planta o parte de la misma correspondiente que no que comprende a dicho polinucleótido.

Como se usa en la presente memoria, el término “comienzo del florecimiento” o “ inicio del florecimiento” con respecto a una planta se refiere al tiempo en que la primera flor en la planta se abre, o en el momento el inicio de la antesis.

Como se usa en la presente memoria, el término “establecimiento de la semilla” con respecto a una planta que lleva semillas se refiere al tiempo cuando la primera semilla de la planta alcanza la madurez. Esto es típicamente observable por el color de la semilla o su contenido de humedad, bien conocido en la técnica.

Como se usa en la presente memoria, el término “senescencia” con respecto a una planta entera se refiere a la etapa final del desarrollo de la planta que sigue después de la terminación del crecimiento, usualmente después de que la planta alcanza la biomasa aérea o altura máxima. La senescencia comienza cuando la biomasa aérea de la planta alcanza su máximo y comienza a disminuir en cantidad y en general termina con la muerte de la mayoría de los tejidos de la planta. Es durante esta etapa que la planta moviliza y recicla los componentes celulares de las hojas y otras partes que se acumularon durante el crecimiento a otras partes para completar su desarrollo reproductor. La senescencia es un proceso regulado, complejo que implica nueva expresión génica o incrementada de algunos genes. Frecuentemente, algunas partes de la planta son senescentes mientras que otras partes de la misma planta continúan desarrollando. Por lo tanto, con respecto a una hoja de la planta u otro órgano verde, el término “senescencia” como se usa en la presente memoria se refiere al tiempo cuando la cantidad de clorofila en la hoja u órgano comienza a disminuir. La senescencia se asocia típicamente con la desecación de la hoja u órgano, principalmente en la última etapa de la senescencia. La senescencia es usualmente observable por el cambio en el color de la hoja del verde hacia amarillo y eventualmente a café cuando se deseca completamente. Se cree que la senescencia celular subyace a la senescencia de la planta y órgano.

Las plantas suministradas o contempladas para su uso en la práctica de la presente invención incluyen tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas. En realizaciónes preferidas, las plantas como se describe en la presente memoria son plantas de cultivo (por ejemplo, cereales y legumbres, maíz, trigo, papa, tapioca, arroz, sorgo, mijo, mandioca, cebada) u otras legumbres tal como soja, frijoles y guisantes. Las plantas se pueden cultivar para la producción de raíces, tubérculos, hojas, tallos, flores o frutos comestibles. Las plantas pueden ser verduras cuyas partes vegetativas se usan como alimento. Las plantas pueden ser:Acrocomia aculeata(palma de macauba),Arabidopsis thaliana, Aracinis hypogaea(maní),Astrocaryum murumuru(murumuru),Astrocaryum vulgare(tucuma),Attalea geraensis(Indaiá-rateiro),Attalea humilis(palma de aceite americana),Attalea oleifera(andaiá),Attalea phalerata(uricuri),Attalea speciosa(babassu),Avena sativa(avena),Beta vulgaris(remolacha),Brassica sp.tal comoBrassica carinata, Brassica juncea, Brassica napobrassica, Brassica napus(canola),Camelina sativa(lino falso),Cannabis sativa(cáñamo),Carthamus tinctorius(canola),Caryocar brasiliense(pequi),Cocos nucifera(coco),Crambe abyssinica(col abisinio),Cucumis melo(melón),Elaeis guineensis(palma africana),Glicina max(soja),Gossypium hirsutum(algodón),Helianthus sp.tal comoHelianthus annuus(girasol),Hordeum vulgare(cebada),Jatropha curcas(coquito),Joannesia princeps(árbol de nuez de Brasil),Lemna sp.(lenteja de agua) tal comoLemna aequinoctialis, Lemna disperma, Lemna ecuadoriensis, Lemna gibba(lenteja de agua hinchada),Lemna japonica, Lemna minor, Lemna minuta, Lemna obscura, Lemna paucicostata, Lemna perpusilla, Lemna tenera, Lemna trisulca, Lemna turionifera, Lemna valdiviana, Lemna yungensis, Licania rigida(oiticica),Linum usitatissimum(lino),Lupinus angustifolius(lupino),Mauritia flexuosa(palma de moriche),Maximiliana maripa(inaja palm),Miscanthus sp.tal comoMiscanthus x giganteusyMiscanthus sinensis, Nicotiana sp.(tabaco) tal comoNicotiana tabacumoNicotiana benthamiana, Oenocarpus bacaba(milpesos de aceite),Oenocarpus bataua(pataua),Oenocarpus distichus(milpesos de leche),Oryza sp.(arroz) tal comoOryza sativa y Oryza glaberrima, Panicum virgatum(mijo),Paraqueiba paraensis(mari),Persea amencana(palta),Pongamia pinnata(haya india),Populus trichocarpa, Ricinus communis(ricino),Saccharum sp.(caña de azúcar),Sesamum indicum(sésamo),Solanum tuberosum(papa),Sorghum sp.tal comoSorghum bicolor, Sorghum vulgare, Theobroma grandiflorum(copoazú),Trifolium sp., Trithrinax brasiliensis(caranday brasileño),Triticum sp.(trigo) tal comoTriticum aestivum, Zea mays(maíz), alfalfa(Medicago sativa),centeno(Secale cerale),batata(Lopmoea batatus),mandioca(Manihot esculenta),café(Cofeaspp.), ananá(Anana comosus),árbol cítrico(Citrusspp.), cacao(Theobroma cacao),té(Camellia senensis),banana(Musaspp.), palta(Persea americana),higo(Ficus casica),guayaba(Psidium guajava),mango(Mangifer indica),oliva(Olea europaea),papaya(Carica papaya),castaña de cajú(Anacardium occidentale),macadamia(Macadamia intergrifolia)y almendra(Prunus amygdalus).

Otras plantas preferidas incluyen pastos C4 tales como, adicionalmente a aquellos mencionados anteriormente,Andropogon gerardi, Bouteloua curtipendula, B. gracilis, Buchloe dactyloides, Schizachyrium scoparium, Sorghastrum nutans, Sporobolus cryptandrus;pastos C3 tales comoElymus canadensis,las leguminosasLespedeza capitatayPetalostemum villosum,la hierbaAster azureus;y plantas leñosas tales comoQuercus ellipsoidalisyQ. macrocarpa.Otras plantas preferidas incluyen pastos C3.

Según la invención, la planta es una angiosperma.

En una realización, la planta es una planta oleaginosa, preferentemente una planta de cultivo de semillas oleaginosas. Como se usa en la presente memoria, una “planta oleaginosa” es una especie vegetal usada en la producción comercial de lípidos a partir de las semillas de la planta. La planta oleaginosa puede ser colza oleaginosa (tal como canola), maíz, girasol, alazor, soja, sorgo, lino (semillas de lino) o remolacha. Además, la planta oleaginosa puede ser otrasBrassicas,algodón, maní, amapola, rutabaga, mostaza, semillas de ricino, sésamo,Jatropha curcaso plantas productoras de nueces. La planta puede producir niveles altos de lípidos en sus frutos, tal como olivo, palma oleaginosa o coco. Las plantas de horticultura en las cuales se puede aplicar la presente invención son lechuga, endivia o verduras debrassicasincluyendo coles, brócoli o coliflor. La presente invención se puede aplicar en tabaco, cucurbitáceas, zanahorias, frutillas, tomate o pimiento.

En una realización preferida, la planta transgénica es homocigota para cada uno y todos los genes que fueron introducidos (transgen) de modo que su progenie no segregará el fenotipo deseado. La planta transgénica también puede ser heterocigota para los transgenes introducidos, preferentemente uniformemente heterocigotas para el transgen, tal como por ejemplo en la progenie F1 que fue cultivada a partir de semillas híbridas. Dichas plantas pueden ofrecer ventajas tales como el vigor híbrido, bien conocido en el arte.

Transformación de plantas

Las plantas transgénicas se pueden producir usando técnicas conocidas en el arte, tales como las que se describen en general en A. Slater y colaboradores,Plant Biotechnology - The Genetic Manipulation of Plants,Oxford University Press (2003), y Christou y Klee,Handbook of Plant Biotechnology,John Wiley y Sons (2004).

Como se usa en la presente memoria, los términos “transformación de manera estable”, “transformado de manera estable” y variaciones de los mismos se refieren a la integración del polinucleótido en el genoma de la célula de modo tal que son transferidas a las células de la progenie durante la división celular sin necesidad de seleccionar positivamente su presencia. Los transformantes estables, o la progenie de los mismos, se pueden identificar con cualquier medio conocido en el arte tales como transferencias Southern con ADN cromosómico o hibridaciónin situde ADN genómico, permitiendo su selección.

La transferencia mediada porAgrobacteriumes un sistema de amplia aplicación para introducir genes en células vegetales porque el ADN se puede introducir en las células en tejidos vegetales u órganos vegetales completos o en explantes en cultivo tisular, ya sea para una expresión transitoria o para una integración estable del ADN en el genoma de la célula vegetal. Por ejemplo, se pueden usar métodos de inmersión floral(en la planta).El uso de vectores de integración vegetales mediados porAgrobacteriumpara introducir ADN en células vegetales es bien conocido en el arte. La región de ADN a transferir está definida por las secuencias de los bordes, y el ADN que interviene (T-ADN) comúnmente se inserta en el genoma vegetal. Es el método de elección debido a la naturaleza fácil y definida de la transferencia de genes.

Los métodos de aceleración que se pueden usar incluyen, por ejemplo, bombardeo con microproyectiles y semejantes. Un ejemplo de un método para distribuir moléculas de ácidos nucleicos transformantes en células vegetales es el bombardeo con microproyectiles. Este método ha sido revisado por Yang y colaboradores,Particle Bombardment Technology for Gene Transfer,Oxford Press, Oxford, Inglaterra (1994). Se pueden recubrir partículas no biológicas (microproyectiles) con ácidos nucleicos y distribuirlas en las células, por ejemplo de embriones inmaduros, por una fuerza propulsora. Las partículas ejemplares incluyen aquellas comprendidas de tungsteno, oro, platino y similares.

En otro método, se pueden transformar plástidos de forma estable. Los métodos divulgados para la transformación de plástidos en plantas superiores incluyen distribución con pistola de partículas de ADN que contienen un marcador seleccionable y direccionamiento del ADN al genoma del plástido por medio de recombinación homóloga (US 451.513, US 5.545.818, US 5.877.402, US 5.932.479 y WO 99/05265). Otros métodos de transformación de células, los cuales incluyen, por ejemplo, la introducción de ADN en plantas mediante la transferencia directa de ADN en el polen, la inyección directa de<a>D<n>en los órganos reproductores de una planta o la inyección directa de ADN en las células de embriones inmaduros, seguida por la rehidratación de embriones desecados.

La regeneración, el desarrollo y el cultivo de plantas a partir de protoplastos transformantes de plantas individuales, o a partir de varios explantes transformados, son bien conocidos en el arte (Weissbach y colaboradores, en:Métodos for Plant Molecular Biology,Academic Press, San Diego, CA (1988). Este proceso de regeneración y desarrollo típicamente incluye los pasos de selección de las células transformadas, cultivo de aquellas células individualizadas a través de las etapas usuales del desarrollo embrionario, hasta la etapa de plántula con raíz. Los embriones y las semillas transgénicas se regeneran de forma similar. Luego se siembran los brotes con raíces resultantes en un medio apropiado para el cultivo de plantas, tal como tierra.

El desarrollo o la regeneración de plantas que contienen al gen exógeno extraño son bien conocidos en el arte. Preferentemente, las plantas regeneradas son autopolinizadas para proveer plantas transgénicas homocigotas. Por otro lado, puede cruzarse el polen obtenido de las plantas regeneradas con plantas cultivadas a partir de semillas de líneas de importancia agrícola. Por otro lado, se usa el polen de plantas de estas líneas importantes para polinizar plantas regeneradas. Una planta transgénica como se describe en la presente memoria que contiene un polinucleótido deseado se cultiva usando métodos bien conocidos por aquellos versados en la técnica.

Para confirmar la presencia de los transgenes en células y plantas transgénicas, se puede conducir una amplificación con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o un análisis de transferencia Southern usando métodos conocidos por los especialistas en el arte. Los productos de expresión de los transgenes se pueden detectar en cualquiera de una variedad de maneras, dependiendo de la naturaleza del producto e incluyen hibridación por transferencia Northern, transferencia Western y ensayos enzimáticos. Una vez que se obtuvieron las plantas transgénicas, se pueden cultivar para producir tejidos vegetales o partes de plantas con el fenotipo deseado. Se puede cosechar el tejido vegetal o las partes de plantas y/o se pueden recolectar las semillas. La semilla puede servir como una fuente para cultivar plantas adicionales con tejidos o partes que tienen las características deseadas. Preferentemente, las partes vegetativas de las plantas se cosechan en un momento cuando el rendimiento de lípidos no polares está en su máximo. En una realización, las partes vegetativas de las plantas se cosechan alrededor del tiempo de florecimiento, o después de que el florecimiento ha iniciado. De manera preferente, las partes de la planta se recolectan a aproximadamente en el tiempo en que se inicia la senescencia, usualmente indicada por amarillamiento y sequedad de las hojas.

Las plantas transgénicas formadas usando métodos de transformación conAgrobacteriumu otros métodos contienen típicamente un sololocusgenético sobre un cromosoma. Dichas plantas transgénicas pueden considerarse como hemicigotas para el o los genes agregados. Más preferida es una planta transgénica que es homocigota para el o los genes agregados; es decir, una planta transgénica que contiene dos genes agregados, un gen en el mismolocusde cada cromosoma de un par de cromosomas. Se puede obtener una planta transgénica homocigota por auto-fertilización de una planta transgénica hemicigota, germinación de algunas de las semillas producidas y análisis de las plantas resultantes para el gen de interés.

Se comprenderá asimismo que también se pueden cruzar (aparear) dos diferentes plantas transgénicas que contienen dos genes olociexógenos que segregan de forma independiente para producir una descendencia que contiene a ambos juegos de genes oloci.La autocruza de la progenie F1 apropiada puede producir plantas que son homocigotas para amboslocio genes exógenos agregados. También se contempla la retrocruza con una planta progenitora y la exocruza con una planta no transgénica, al igual que la propagación vegetativa. Similarmente, una planta transgénica se puede cruzar con una segunda planta que comprende una modificación genética tal como un gen mutante y progenie que contiene tanto el transgen como la modificación genética identificada.

Se pueden consultar descripciones de otros métodos de cruzamiento usados comúnmente para distintos caracteres y cultivos en Fehr, enBreeding Métodos for Cultivar Development,Wilcos J. ed.,American Society of Agronomy, Madison, Wis (1987).

TILLING

En una realización, se puede usar TILLING (siglas en inglés de lesiones locales inducidas dirigidas en genomas) para producir plantas en las cuales se han noqueado genes endógenos, por ejemplo genes que codifican una DGAT,sn-1 glicerol-3-fosfato aciltransferasa (GPAT), 1-acil-glicerol-3-fosfato aciltransferasa (LPAAT), acil-CoA:lisofosfatidilcolina aciltransferasa (LPCAT), ácido fosfatídico fosfatasa (PAP) o una combinación de dos o más de los mismos. En un primer paso, se inducen las mutaciones introducidas, tales como cambios de pares de bases individuales novedosos, en una población de plantas mediante tratamiento de semillas (o polen) con un mutágeno químico y luego avanzar las plantas hasta una generación donde las mutaciones serán heredadas de manera estable. Se extrae el ADN y las semillas se guardan separadas de todos los miembros de la población para crear una fuente al cual se puede acceder repetidamente en el tiempo. Para un ensayo TILLING, se pueden usar métodos heteroduplex usando endonucleasas específicas para detectar polimorfismos de nucleótidos individuales (SNPs). Alternativamente, la Secuenciación de Próxima Generación de ADN de acumulaciones de plantas mutagenizadas se puede usar para identificar mutantes en el gen de elección. Típicamente, se logra una frecuencia de mutación de un mutante por 1000 plantas en la población mutagenizada. Cuando se usa este enfoque, se pueden examinar miles de plantas para identificar cualquiera que tuviera un único cambio de base, así como inserciones o supresiones pequeñas (1-30 pb) en cualquier gen o región específica del genoma. El TILLING se describe además en Slade y Knauf (2005) y en Henikoff y colaboradores, (2004).

Además de permitir una detección eficiente de las mutaciones, la tecnología TILLING de gran rendimiento es ideal para la detección de polimorfismos naturales. Por ello, la búsqueda de un ADN homólogo desconocidos por formación de heterodúplex con una secuencia conocida revela la cantidad y posición de sitios polimórficos. Se identifican tanto cambios de nucleótidos como inserciones y supresiones pequeñas, incluyendo al menos algunos polimorfismos de número repetido. Esto se ha denominado Ecotilling (Comai y colaboradores, 2004).

Edición del genoma usando nucleasas específicas de sitio

La edición del genoma usa nucleasas modificadas tales como ADN endonucleasa guiadas por ARN o nucleadas compuesta de dominios de ligación a ADN específicos de secuencia fusionados a un módulo de escisión de ADN no específico. Estas nucleasas modificadas permiten las modificaciones genéticas eficientes y precisas al inducir rompimiento de doble hebra de ADN objetivo que estimulan los mecanismos de reparación del ADN celular endógenos de la célula para reparar el rompimiento inducido. Estos mecanismos incluyen, por ejemplo, unión de extremo no homóloga propensa a errores (NHEJ) y reparación dirigida a homología (HDR).

En presencia del plásmido donador con los brazos de homología extendidos, la HDR puede conducir a la introducción de transgenes individuales o múltiples para corregir o reemplazar los genes existentes. En ausencia del plásmido donador, la reparación mediada por NHEJ produce la inserción pequeña o supresión de mutaciones del objetivo que provocan la alteración del gen.

Las nucleadas modificadas útiles en los métodos de la presente invención incluyen dedo de zinc nucleasas (ZFNs), efector nucleasa similar a activador de transcripción (TAL) (TALEN) y nucleasas tipo CRISPR/Cas9.

Típicamente los genes codificados por nucleasas se suministran en las células por el ADN plásmido, vectores virales o ARNm transcriptoin vitro.

Una dedo de zinc nucleasa (ZFN) comprende un dominio de ligación a ADN y un dominio de escisión a ADN, donde el dominio de ligación a ADN está comprendido de al menos un dedo de zinc y se liga operativamente a un dominio de escisión de ADN. El dominio de ligación a ADN de dedo de zinc está en la N-terminal de la proteína y el dominio de escisión de ADN se sitúa en la C-terminal de la proteína.

Una ZFN debe tener al menos un dedo de zinc. En una realización preferida, una ZFN tendría al menos tres dedos de zinc a fin de tener especificidad suficiente para ser útil para la recombinación genética objetivo en un organismo pos-célula hospedadora. Típicamente, una ZFN que tiene más de tres dedos de zinc tendría progresivamente mayor especificidad con cada dedo de zinc adicional.

El dominio de dedo de zinc se puede derivar de cualquier clase o tipo de dedo de zinc. En una realización<particular, el dominio de dedo de zinc comprende el tipo Cis>2<His>2<de dedo de zinc que es el general muy representado,>por ejemplo, por los factores de transcripción de dedo de zinc TFIIIA o Sp1. En una realización preferida, el dominio de<dedo de zinc comprende tres dedos de zinc de tipo Cis>2<His>2<. El reconocimiento de ADN y/o la especificidad de ligación de>una ZFN se puede alterar a fin de lograr la recombinación genética objetivo en cualquier sitio elegido en el ADN celular. Otra modificación se puede lograr usando técnicas de biología molecular y/o síntesis química conocidas, (ver, por ejemplo, Bibikova y colaboradores, 2002).

El dominio de escisión ZFN ADN se deriva de una clase de dominios de escisión de ADN no específicos, por ejemplo, el dominio de escisión de ADN de una enzima de restricción tipio II tal como Fok1 (Kim y colaboradores, 1996). Otras endonucleasas útiles pueden incluir, por ejemplo,HhaI, HindIII,Nod,BbvCI, EcoRI, BglI,yAlwI.

Una nucleasa efectora similar al activador de transcripción (TAL) (TALEN) comprende un dominio de ligación a ADN efector TAL y un dominio endonucleasa.

Los efectores TAL son proteínas de bacterias patogénicas de planta que se inyectan por el patógeno en la célula de la planta, donde viajan al núcleo y funcionan como factores de transcripción para activar los genes de la planta específicos. La secuencia de aminoácidos primaria de un efector TAL dicta la secuencia de nucleótidos a la cual se liga. De esta manera, los sitios objetivos se pueden predecir para los efectores TAL, y los efectores TAL se pueden diseñar y generar para el propósito de ligarse a las secuencias de nucleótidos particulares.

Fusionadas a las secuencias de ácidos nucleicos que codifican el efector TAL son las secuencias que codifican una nucleasa o una porción de una nucleasa, típicamente un dominio de escisión no específico de una endonucleasa de restricción tipo II tal comoFokI(Kim y colaboradores, 1996). Otras endonucleasas útiles pueden incluir, por ejemplo,HhaI, HindIII, Nod, BbvCI,EcoRI,BglI,yAlwI.El hecho de que algunas endonucleasas (por ejemplo, FokI) solo funcionan como dímeros se pueden capitalizar en mejorar la especificidad objetivo del efector TAL. Por ejemplo, en algunos casos cada monómero se puede fusionar a una secuencia efectora TAL que reconoce una secuencia objetivo de ADN diferente, y solamente cuando los dos sitios de reconocimiento están en proximidad cercana los monómeros inactivos se juntan para crear una enzima funcional. Al requerir la ligación de ADN para activar la nucleasa, se puede crear una enzima de restricciones sumamente específica de sitio.

Una TALEN específica de secuencia puede reconocer una secuencia particular dentro de una secuencia de nucleótidos objetivo preseleccionada presente en una célula. De esta manera, en algunas realizaciónes, una secuencia de nucleótidos objetivo se puede escanear para los sitios de reconocimiento de nucleasa, y una nucleasa particular se puede seleccionar basada en la secuencia objetivo. En otros casos, una TALEN se puede modificar para fijar como objetivo una secuencia celular particular.

Edición del genoma usando ADN endonucleasas guiadas por ARN programables

Distintas de las nucleasas específica de sitio descritas en lo anterior, el sistema de repeticiones (CRISPR)/Cas palindrómicas cortas interespaciadas reguladoras acumuladas proporciona una alternativa a las ZFNs y TALENs para introducir alteraciones genéticas objetivo, a través de la escisión de ADN guiada por ARN.

Los sistemas CRISPR dependen de CRISPR ARN (ARNcr) y ARN quimérico de transactivación ARN (ARNtracr) para la escisión específica de secuencia del ADN. Tres tipos de sistemas CRISPR/Cas existente: en los sistemas tipo II, el Cas9 sirve como una ADN endonucleasa guiada por ARN que escinde el ADN en el reconocimiento objetivo ARNcr-ARNtracr. La base CRISPR ARN se parea con ARNtracr para formar una estructura de dos ARN que guía la Cas9 endonucleasa a los sitios de ADN complementarios para la escisión.

El sistema CRISPR puede ser portátil a las células de plantas por el co-suministro de plásmidos que expresan la Cas endonucleasa y los componentes de ARNcr necesarios. La Cas endonucleasa se puede convertir en una nicasa para proporcionar control adicional sobre el mecanismo de la reparación de ADN (Cong y colaboradores, 2013).

Las CRISPRs son típicamente secuencias palindrómicas parcialmente cortas de 24-40pb que contienen repeticiones invertidas interiores y terminales de hasta 11 pb. Aunque los elementos aislados se han detectado, se arreglan en general en agrupamientos (hasta de aproximadamente 20 o más por genoma) de unidades repetidas espaciadas por las secuencias de 20-58pb de intervención únicas. Las CRISPRs son en general homogéneas dentro de un genoma dado con la mayoría de ellas que son idénticas. Sin embargo, existen ejemplos de heterogeneidad en, por ejemplo, the Archaea (Mojica y colaboradores, 2000).

Biomasa vegetal

Un aumento en el contenido de lípidos totales de la biomasa vegetal es equivalente a un mayor contenido de energía, haciendo su uso como un alimento o alimento o en la producción de biocombustible más económico.

Los componentes principales de la biomasa vegetal son los hidratos de carbono (aproximadamente 75%, peso seco) y lignina (aproximadamente 25%), que puede variar con el tipo de planta. Los hidratos de carbono son principalmente fibras de celulosa o hemicelulosa, que imparten fuerza a la estructura de la planta, y lignina, que sostiene las fibras entre sí. La biomasa vegetal típicamente tiene una densidad de energía baja como resultado de su forma física y contenido de humedad. Esto también la hace inconveniente e ineficaz para almacenamiento y transporte, y también usualmente inadecuada para uso sin algún tipo de pre-procesamiento. Hay un rango de procesos disponibles para convertirla en una forma más conveniente que incluye: 1) pre-procesamiento físico (por ejemplo, molido) o 2) conversión por procesos térmicos (por ejemplo, combustión, gasificación, pirolisis) o químicos (por ejemplo, digestión anaeróbica, fermentación, elaboración de compost, transesterificación). En este sentido, la biomasa se convierte a lo que se puede describir como un combustible de biomasa.

Combustión

La combustión es el proceso por el cual los materiales inflamables se dejan arder en presencia de aire u oxígeno con la liberación de calor. El proceso básico es la oxidación. La combustión es el método más sencillo por el cual se puede usar la biomasa para energía, y ha sido usada para proveer calor. Este calor puede ser usado en un número de formas: 1) calentamiento de espacio, 2) calentamiento de agua (u otro fluido) para calefacción central o calefacción de distrito o calor de proceso, 3) vapor que sube para generación de electricidad o fuerza motriz. Cuando el material combustible inflamable es una forma de biomasa la oxidación es predominantemente del carbono (C) e hidrógeno (H) en la celulosa,<hemicelulosa, lignina, y otras moléculas presentes para formar dióxido de carbono (CO>2<) y agua (H>2<O). Las plantas como>se describe en la presente memoria proporcionan combustible mejorado para combustión en virtud del contenido incrementado de lípidos.

Gasificación

La gasificación es un proceso de oxidación parcial mediante el cual una fuente de carbono tal como la biomasa<vegetal, se separa en monóxido de carbono (CO) e hidrógeno (H>2<), más dióxido de carbono (CO>2<) y posiblemente molécula de hidrocarburo tal como metano (CH>4<). Si la gasificación tiene lugar a una temperatura relativamente baja, tal como entre>700°C y 1000°C, el gas producto tendrá un nivel relativamente alto de hidrocarburos en comparación a la gasificación a alta temperatura. Como resultado se puede usar directamente, ser quemado para la generación de calor o electricidad por medio de una turbina de vapor o, con un limpiado del gas adecuado, para hacer funcionar un motor de combustión interna para la generación de electricidad. La cámara de combustión para un hervidor simple puede estar acoplado cercano al gasificador, o el gas producido se puede limpiar de hidrocarburos de cadena más larga (alquitrán), transportar, almacenar y quemar remotamente. Un sistema de gasificación puede estar cercanamente integrado con una turbina de gas en ciclo combinado para la generación de electricidad (IGCC - ciclo combinado de gasificación integrada). La gasificación a temperaturas mayores (entre 1200°C y 1600°C) lleva a pocos hidrocarburos en el gas producto, y una mayor<proporción de CO y H>2<. Esto es conocido como gas de síntesis (syngas o biosyngas) que puede ser usado para sintetizar hidrocarburos de cadena más larga usando técnicas tal como la síntesis de Fischer-Tropsch (FT). Si la relación de H>2<a>CO es correcta (2:1) la síntesis de FT se puede usar para convertir syngas a biocombustible diésel sintético de alta calidad que es compatible con los diésel fósiles convencionales y los motores a diésel.

Pirólisis

Como se usa en la presente memoria, el término “pirólisis” hace referencia a un proceso que usa calentamiento lento en ausencia de oxígeno para producir productos gaseosos, aceite y carbón a partir de biomasa. La pirólisis es una conversión térmica o termoquímica de materiales basados en lípidos, particularmente basados en triglicéridos. Los productos de la pirólisis incluyen gas, líquido y un alquitrán sólido y carbón sólido, con las proporciones de cada uno dependiendo de los parámetros del proceso. Temperaturas inferiores (alrededor de 400°C) tienden a producir un carbón más sólido (pirólisis lenta), mientras que de cierto modo temperaturas mayores (alrededor de 500°C) producen una<proporción mucho mayor de líquido (bioaceite), dado que el tiempo de residencia del vapor se limita a alrededor de>1<s o>menos. Las temperaturas de aproximadamente 275°C a aproximadamente 375°C se pueden usar para producir bioaceite líquido que tiene una mayor proporción de hidrocarburos de cadena más larga. La pirólisis involucra el craqueo térmico directo de los lípidos o una combinación de craqueo térmico y catalítico. A temperaturas de aproximadamente entre 400 y 500oC, se produce el craqueo, produciendo hidrocarburos de cadena corta tal como alcanos, alquenos, alcadienos, aromáticos, olefinas y ácido carboxílico, así como monóxido de carbono y dióxido de carbono.

Se pueden usar cuatro tipos de catalizador principales que incluyen catalizadores de metales de transición, catalizadores tipo tamiz molecular, alúmina activada y carbonato de sodio (Maher y colaboradores, 2007). Los ejemplos se dan en US 4102938. La alúmina (AhOs) activada por ácido es un catalizador eficaz (US 5233109). Los catalizadores de tamiz molecular son estructuras porosas, altamente cristalinas que exhiben selectividad de tamaño, de modo que sólo las moléculas de ciertos tamaños pueden pasar. Estos incluyen catalizadores de zeolita tal como ZSM-5 o HZSM-5 que<son materiales cristalinos que comprenden A O>4<y SO>4<y otros catalizadores de sílice-alúmina. La actividad y selectividad>de estos catalizadores depende de la acidez, tamaño de poro y forma del poro, y típicamente operan entre 300 y 500oC. Los catalizadores de metales de transición se describen por ejemplo en US 4992605. El catalizador de carbonato de sodio ha sido usado en la pirólisis de aceites (Dandik y Aksoy, 1998).

Como se usa en la presente memoria, “procesamiento hidrotérmico”, “HTP”, también referido como “despolimerización térmica” es una forma de pirolisis que hace reaccionar la materia derivada de la planta, específicamente el material que contiene carbono en la materia derivada de la planta, con hidrógeno para producir un producto de bioaceite comprendido recombinantemente de hidrocarburos parafínicos junto con otros gases y sólidos. Un aventaja significativa de HTP es que el material de planta vegetativa no necesita ser secada antes de formar la composición para la reacción de conversión, aunque el material vegetativo de la planta se puede secar de antemano para ayudar en el transporte o almacenamiento de la biomasa. La biomasa se puede usar directamente como se cosecha del campo. El reactor es cualquier recipiente que puede soportar la alta temperatura y presión usada y es resistente a la corrosión. El solvente usado en el HTP incluye agua o es completamente agua, o puede incluir algunos compuestos de hidrocarburo en la forma de un aceite. En general, el solvente en el HTP carece de alcoholes agregados. La reacción de conversión puede presentarse en un medio ambiente oxidativo, reductor o inerte. “Oxidativo” como se usa en la presente memoria significa en presencia de aire, “reductor” significa en presencia de un agente reductor, típicamente gas hidrógeno<o metano por ejemplo 10-15% de H>2<con el resto del gas que es N>2<, e “ inerte” significa en presencia de un gas inerte tal>como nitrógeno o argón. La reacción de conversión se lleva a cabo de manera preferente bajo condiciones reductoras. Los materiales que contienen carbono que se convierte incluyen celulosa, hemicelulosa, lignina y proteínas así como<lípidos. El proceso usa una temperatura de conversión de entre 270°C y 400°C y una presión de entre 7x10>6<y>3.5x107Pa(70 y 350bar), típicamente 300°C a 350°C y una presión entre 1x107-1.7x107Pa(100-170bar).Como resultado del proceso, los vapores orgánicos, gases de pirolisis y carbón son producidos. Los vapores orgánicos se condensan para producir el bioaceite. La recuperación del bioaceite se puede lograr al enfriar el reactor y al reducir la presión a presión atmosférica, que permite que el biocombustible (orgánico) y las fases de agua se desarrollen y el bioaceite se extraiga del reactor.

El rendimiento del bioaceite recuperado se calcula como un porcentaje del peso seco de la biomasa de entrada sobre una base de peso seco. Se calcula de acuerdo con la fórmula: el peso del bioaceite x 100/peso seco de las partes vegetativas de la planta. El peso del bioaceite no incluye el peso de cualquier agua o sólidos que pueden estar presentes en una mezcla de bioaceite, que se remueven fácilmente por filtración u otros métodos reconocidos.

El bioaceite después se puede separar en fracciones por destilación fraccional, con o sin procesos de refinado adicionales. Típicamente, las fracciones que se condensan en estas temperaturas son llamadas: aproximadamente 370°C, fueloil; aproximadamente 300°C, diésel; aproximadamente 200°C, queroseno; aproximadamente 150°C, gasolina (petróleo). Las fracciones más pesadas se pueden craquear en fracciones más deseables, más ligeras, bien conocidas en la técnica. El combustible diésel está comprendido típicamente de compuestos de hidrocarburo C13-C22.

Como se usa en la presente memoria, “diésel de petróleo” (petrodiésel) significa un combustible diésel fabricado de combustible fósil y que se encuentra bajo las especificaciones descritas por ASTM D975 en los Estados Unidos en EN 590 en Europa. El término “diésel renovable” como se usa en la presente memoria significa un combustible diésel derivado de biomasa recientemente viva (combustible no fósil) que cumple con los estándares de ASTM D975 y no son ésteres de monoalquilo. Las características típicas del diésel renovable son: número de cetano de 75-90, densidad de energía de aproximadamente 44 MJ/kg, densidad de aproximadamente 0.78 g/ml, contenido de energía de aproximadamente 123 K BTU/gal, niveles de azufre menores que 10ppm, punto de turbidez por abajo de 0°C.

Transesterificación

La “transesterificación” como se usa en la presente memoria es la conversión de lípidos, principalmente triacilgliceroles, en ésteres de ácido graso metilo o etil ésteres mediante la reacción con alcoholes de cadena corta tal como metanol o etanol, en presencia de un catalizador tal como álcali o ácido. Se usa el metanol más comúnmente debido a su bajo costo y disponibilidad, pero también se pueden usar etanol, propanol o butanol o mezclas de los alcoholes. Los catalizadores pueden ser catalizadores homogéneos, catalizadores heterogéneos o catalizadores enzimáticos. Los catalizadores homogéneos incluyen sulfato férrico seguido por KOH. Los catalizadores heterogéneos incluyen CaO,<K>3<PO>4<, y WO>3</ZrO>2<. Los catalizadores enzimáticos incluyen Novozyme 435 producido de Candida antárctica.>

La transesterificación se puede llevar a cabo en el aceite extraído, o de manera preferente directamentein situen el material vegetativo de la planta. Las partes vegetativas de la planta se pueden secar y moler antes de ser usadas para preparar la composición para la reacción de conversión, pero no necesitan estar. La ventaja de la conversión directa a los ésteres de ácidos grasos, de manera preferente FAME, es que la conversión puede usar temperaturas y presiones más bajas y aún proporcionar buenos rendimientos del producto, por ejemplo, que comprenden al menos 50% de FAME en peso. El rendimiento del bioaceite recuperado por la trans-esterificación se calcula conforme al proceso HTP.

Producción de lípidos no polares

Se pueden emplear las técnicas que son de práctica rutinaria en el arte para extraer, procesar, purificar y analizar los lípidos tal como el TAG producidos por células, organismos o partes de los mismos, como se describe en la presente memoria. Dichas técnicas se describen y explican en la literatura, en fuentes tales como Fereidoon Shahidi,Current Protocols in Food Analytical Chemistry,John Wiley & Sons, Inc. (2001) D1.1.1-D1.1.11, y Perez-Vich y colaboradores. (1998).

Producción de aceite de partes vegetativas de la planta o semilla

Típicamente, las semillas de las plantas se cocinan, se prensan y/o se extraen para producir un aceite de semillas crudo, que luego es desgomado, refinado, blanqueado y desodorizado. En general, las técnicas para triturar semillas son conocidas en el arte. Por ejemplo, semillas oleaginosas se pueden temperar rociándolas con agua para elevar el contenido de humedad, por ejemplo, a un 8.5%, y cortar en copos usando un rodillo compactador liso con un ajuste de hueco definido en 0.23 a 0.27 mm. Según el tipo de semilla, se puede agregar agua, o no, antes de la trituración. La aplicación de calor desactiva las enzimas, facilita la ruptura celular posterior, coalesce las gotas de lípidos y aglomera las partículas de proteínas, todo lo cual facilita el proceso de extracción.

En una realización, la mayoría de los aceites de semillas se libera por medio de pasaje a través de una prensa de tornillo. Las tortas expulsadas de la prensa de tornillo son sometidas a extracción con solvente, por ejemplo, con hexano, usando una columna de temperatura controlada. Como alternativa, el aceite de semillas crudo producido por la operación de prensado se puede hacer pasar a través de un tanque de asentamiento con una vía de drenaje acanalada superior para remover los sólidos que se generan con el aceite de semillas durante la operación de prensado. El aceite de semillas clarificado se puede hacer pasar a través de un filtro tipo placa y marco para remover cualquier partícula sólida fina. Si se deseara, el aceite de semillas recuperado del proceso de extracción se puede combinar con el aceite de semillas clarificado para producir un aceite de semillas crudo mezclado.

Una vez que se extrajo el solvente del aceite de semillas crudo, se combinan las porciones prensadas y extraídas y luego son sometidas a los procedimientos normales de procesamiento de lípidos (es decir, desgomado, refinación cáustica, blanqueado y desodorización).

La extracción de lípidos de las partes vegetativas de la planta como se describe en la presente memoria usa métodos análogos a aquellos conocidos en la técnica para la extracción de aceite de semilla. Una forma es la extracción física, que no usa frecuentemente esta acción con solvente. La extracción prensada por expulsor es un tipo común, como son los métodos de extracción de prensado con torillo y prensado con ariete. La extracción mecánica es típicamente menos eficiente que la extracción con solvente donde un solvente orgánico (por ejemplo, hexano) se mezcla con al menos la biomasa de planta, de manera preferente después de que la biomasa se seca y se muele. El solvente disuelve lípido en la biomasa, la solución después se separa de la biomasa por acción mecánica (por ejemplo, con los procesos de prensado anteriores). Este paso de separación también se puede llevar a cabo por filtración (por ejemplo, con una prensa de filtro o dispositivo similar) o centrifugación etc. El solvente orgánico después se puede separar del lípido no polar (por ejemplo, por destilación). Este segundo paso de separación produce lípidos no polares de la planta y puede producir un solvente reutilizable si se emplea la recuperación de vapor convencional. En una realización, el aceite y/o contenido de proteína de la parte de la planta o semilla se analiza por espectroscopia de reflectancia de infrarrojo cercano como se describe por Horn y colaboradores (2007) antes de la extracción.

Si las partes vegetativas de la planta no se van a usar inmediatamente para extraer el lípido se procesa de manera preferente para asegurar que el contenido de lípidos se minimice tanto como sea posible (ver, por ejemplo, Christie, 1993), tal como al secar las partes vegetativas de la planta.

Desgomado

El desgomado es un paso temprano en el refinamiento de aceites y su propósito principal es la eliminación de la mayor parte de los fosfolípidos del aceite, que pueden estar presentes en aproximadamente entre 1 y 2% de los lípidos extraídos totales. El agregado de aproximadamente 2% de agua, típicamente que contiene ácido fosfórico, a entre 70 y 80°C al aceite en crudo da como resultado la separación de la mayor parte de los fosfolípidos acompañados por metales y pigmentos traza. El material insoluble que se elimina es principalmente una mezcla de fosfolípidos y triacilgliceroles y es conocido como lecitina. El desgomado se puede realizar por adición de ácido fosfórico concentrado al aceite de semillas crudo para convertir los fosfatidos no hidratables en una forma hidratable y para quelar los metales menores que están presentes en el aceite. La goma se separa del aceite de semillas por centrifugación. El aceite de semillas se puede refinar por adición de una cantidad suficiente de una solución de hidróxido de sodio para titular todos los ácidos grasos y remover los jabones así formados.

Refinamiento con álcali

El refinamiento con álcali es uno de los procesos de refinamiento para tratar aceite crudo, algunas veces referido como neutralización. Usualmente continúa luego del desgomado y precede al blanqueamiento. Luego del desgomado, el aceite de semillas puede ser tratado por adición de una cantidad suficiente de una solución alcalina para titular todos los ácidos grasos y ácidos fosfóricos, y eliminar los jabones así formados. Los materiales alcalinos adecuados incluyen hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, carbonato de sodio, hidróxido de litio, hidróxido de calcio, carbonato de calcio e hidróxido de amonio. Este proceso típicamente es realizado a temperatura ambiente y elimina la fracción de ácidos grasos libres. El jabón se elimina por centrifugación o por extracción en un solvente para el jabón, y el aceite neutralizado se lava con agua. Si se requiere, cualquier exceso de álcali en el aceite se puede neutralizar con un ácido adecuado tal como ácido clorhídrico o ácido sulfúrico.

Blanqueamiento

El blanqueamiento es un proceso de refinamiento en el cual los aceites se calientan a entre 90 y 120°C durante entre 10 y 30 minutos en presencia de una tierra de blanqueamiento (entre 0.2 y 2.0%) y en ausencia de oxígeno por operación con nitrógeno o vapor o en vacío. Este paso en el procesamiento de aceites es diseñado para eliminar pigmentos no deseados (carotenoides, clorofila, gosipol, etc.), y el proceso además elimina los productos de oxidación, metales traza, compuestos con azufre y trazas de jabones.

Desodorización

La desodorización es un tratamiento de aceites y grasas a una temperatura alta (entre 200 y 260°C) y presión baja (entre 0,1 y 1 mm Hg). Esto típicamente se logra por introducción de vapor dentro del aceite de semillas a una velocidad de aproximadamente 0,1 ml/minuto/100 ml de aceite de semillas. La desodorización se puede realizar calentando el aceite de semillas a 260°C bajo vacío e introduciendo lentamente vapor en el aceite de semillas a una velocidad de 0,1 ml/minuto/100 ml de aceite de semillas aproximadamente. Después de aproximadamente 30 minutos de burbujeo, se deja que el aceite de semillas se enfríe bajo vacío. El aceite de semillas es transferido típicamente a un recipiente de vidrio y se lava con argón antes de almacenarlo bajo refrigeración. Si la cantidad de aceite de semillas es limitada, el aceite de semillas se puede colocar bajo vacío, por ejemplo, en un reactor Parr y calentar a 260°C por el mismo tiempo que hubiera sido desodorizado. Este tratamiento mejora el color del aceite de semillas y remueve la mayoría de las sustancias volátiles o compuestos olorosos que incluyen cualquier ácido graso libre remanente, monoacilgliceroles y productos de oxidación.

Winterización

La winterización un proceso usado algunas veces en la producción comercial de aceites para la separación de aceites y grasas en fracciones sólida (estearina) y líquida (oleína) por cristalización a temperaturas más bajas que la ambiente. Se aplicó originalmente a aceite de semillas de algodón para producir un producto libre de sólidos. Típicamente se usa para disminuir el contenido de ácidos grasos saturados de los aceites.

Algas para la producción de lípidos

Las algas pueden producir entre 10 y 100 veces la masa que producen las plantas terrestres en un año y se pueden cultivar en estanques abiertos (tal como estanques de tipo carrera y lagos) o en fotobioreactores. Las algas productoras de aceites más comunes pueden generalmente incluir, o consistir esencialmente en, las diatomeas (bacilariófitas), algas verdes (clorófitas), algas azul-verdosas (cianófitas), y algas doradas marrones (crisófitas).

Adicionalmente se puede usar un quinto grupo conocido como haptófitas. Los grupos incluyen algas marrones y heterocontes. Los ejemplos no limitantes específicos de algas incluyen las Clases:Chlorophyceae, Eustigmatophyceae, Prymnesiophyceae, Bacillariophyceae.Las bacilariófitas con capacidad de producir aceite incluyen los génerosAmphipleura, Amphora, Chaetoceros, Cyclotella, Cymbella, Fragilaria, Hantzschia, Navicula, Nitzschia, Phaeodactylum,yThalassiosira.Los ejemplos no limitantes específicos de clorófitas con capacidad de producir aceite incluyenAnkistrodesmus, Botryococcus, Chlorella, Chlorococcum, Dunaliella, Monoraphidium, Oocystis, Scenedesmus,yTetraselmis.En un aspecto, las clorófitas pueden ser Chlorella o Dunaliella. Los ejemplos no limitantes específicos de cianófitas con capacidad de producir aceite incluyenOscilatoriaySynechococcus.Un ejemplo específico de crisófitas con capacidad de producir aceite incluyeBoekelovia.Los ejemplos no limitantes específicos de haptófitas incluyenIsochysisyPleurochysis.

Las algas específicas útiles en la presente invención incluyen, por ejemplo,Chlamydomonas sp.tal comoChlamydomonas reinhardtii, Dunaliella sp.tal comoDunaliella salina, Dunaliella tertiolecta, D. acidophila, D. bardawil, D. bioculata, D. lateralis, D. marítima, D. minuta, D. parva, D. peircei, D. polimorpha, D. primolecta, quartolecta. D. viridis, Haematococcus sp., Chlorella sp.tal comoChlorella vulgaris, Chlorella sorokiniana o Chlorella protothecoides, Thraustochytrium sp., Schizochytrium sp., Volvox sp, Nannochloropsissp.,Botryococcus brauniique puede contener más del 60% en peso de lípidos,Phaeodactylum tricornutum, Thalassiosira pseudonana, Isochrysissp.,Pavlovasp.,Chlorococcumsp,Ellipsoidionsp.,Neochlorissp.,Scenedesmussp.

Las algas como se describe en la presente memoria se pueden cosechar usandoMicroscreens,por centrifugación, por floculación (usando, por ejemplo, quitosán, alúmina y cloruro férrico) y por flotación con espuma. La interrupción del suministro de dióxido de carbono puede causar la floculación de las algas por sí solos, que se denomina “autofloculación”. En la flotación con espuma, el cultivador airea el agua formando una espuma, y luego se limpian las algas desde la superficie. El ultrasonido y otros métodos de cosecha se encuentran actualmente bajo desarrollo.

Los lípidos se pueden extraer de las algas por trituración mecánica. Cuando las algas se secan retienen su contenido de lípidos, que luego se puede extraer por “prensado” con una prensa para aceite. El choque osmótico para liberar componentes celulares tales como lípidos de algas y la extracción ultrasónica puede acelerar los procesos de extracción. Los solventes químicos (por ejemplo, hexano, benceno, éter de petróleo) se usan frecuentemente en la extracción de los lípidos de las algas. La extracción enzimática usando enzimas para degradar las paredes celulares<también se usan para extraer lípidos de algas. También se puede usar CO>2<supercrítico como solvente. En este método, se licúa CO>2<bajo presión y se calienta hasta el punto en que se vuelve supercrítico (con propiedades tanto de líquido>como de gas), permitiendo que actúe como solvente.

Como se usa en la presente memoria, un “organismo oleaginoso” es aquel que acumula al menos un 20% de su peso seco como triglicéridos. Como se usa en la presente memoria, una “ levadura” incluyeSaccharomycesspp.,Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlbergensis, Candidaspp.,Kluveromycesspp.,Pichiaspp.,Hansenulaspp.,Trichodermaspp.,Lipomyces starkeyyYarrowia lipolitica.Las levaduras preferidas incluyenYarrowia lipoliticau otras levaduras oleaginosas y cepas deSaccharomyces spp.

Usos de lípidos vegetales

Los lípidos producidos mediante los métodos descritos tienen diversos usos. En algunas realizaciónes, los lípidos se usan como aceites comestibles. En otras realizaciónes, los lípidos se refinan y usan como lubricantes o para otros usos industriales tal como en la síntesis de plásticos. En algunas realizaciónes preferidas, los lípidos se refinan para producir biodiésel. El biodiésel se puede fabricar de aceites derivados de las plantas, algas y hongos como se describe en la presente memoria. El uso de triacilgliceroles de planta para la producción de biocombustible se revisa en Durrett y colaboradores (2008). El combustible resultante es referido comúnmente como un biodiésel y tiene un intervalo de viscosidad dinámico de 1.9 a 6.0 mm2s-1 (ASTM D6751). El bioalcohol se puede producir de la fermentación de azúcares o la biomasa diferente al lípido sobrante de después de la extracción de lípidos. Los métodos generales para la producción de biocombustible se pueden encontrar en, por ejemplo, Maher y Bressler (2007), Greenwell y colaboradores (2010), Karmakar y colaboradores (2010), Alonso y colaboradores (2010), Liu y colaboradores (2010a). Gong y Jiang (2011), Endalew y colaboradores (2011) y Semwal y colaboradores (2011).

La presente memoria describe métodos para incrementar el contenido de aceite en los tejidos vegetativos. Las plantas como se describe en la presente memoria tienen un contenido de energía incrementado de hojas y/o tallos tal que las partes de la planta molidas anteriores completas se pueden recolectar y usar para producir biocombustible. Adicionalmente, el nivel del ácido oleico se incrementa significativamente mientras que se redujo el ácido alfa-linolénico de ácido graso poliinsaturado (ALA). Las plantas, algas y hongos como se describe en la presente memoria reducen de esta manera los costos de producción del biocombustible.

Biodiésel

La producción de biodiésel, o alquil ésteres, es bien conocida. Hay tres rutas básicas para la producción de ésteres a partir de lípidos: 1) transesterificación basada en bases de los lípidos con alcohol; 2) esterificación directa catalizada por ácido de los lípidos con metanol; y 3) conversión de los lípidos a ácidos grasos, y luego a alquil ésteres con catálisis ácida. Se puede usar cualquier método para preparar alquil ésteres y gliceril éteres de ácidos grasos (en los cuales uno, dos o tres de los grupos hidroxilos del glicerol son eterificados). Por ejemplo, los ácidos grasos se pueden preparar, por ejemplo, por hidrólisis o saponificación de TAG con catalizadores ácidos o básicos, respectivamente, o usando una enzima tal como una lipasa o una esterasa. Los alquil ésteres de ácidos grasos se pueden preparar por reacción de un ácido graso con un alcohol en presencia de un catalizador ácido. Los alquil ésteres de ácidos grasos también se pueden preparar por reacción de un TAG con un alcohol en presencia de un catalizador ácido o básico. Los éteres de glicerol se pueden preparar, por ejemplo, por reacción del glicerol con un haluro de alquilo en presencia de una base, o con una olefina o alcohol en presencia de un catalizador ácido. Los alquil ésteres se pueden mezclar directamente con combustible diésel, o lavarlo con agua u otras soluciones acuosas para eliminar impurezas, que incluye los catalizadores, antes de mezclarlos.

Combustible de Aviación

Para el desempeño mejorado de biocombustibles, se han desarrollado tecnologías de rompimiento de unión químicas térmicas y catalíticas (craqueo) que permiten la conversión de bioaceites en alternativas basadas en bio para el combustible diésel derivado de petróleo y otros combustibles, tales como combustible de aviones.

El uso de la fuente de ácido graso de cadena media, producido por una célula eucariota recombinante como se describe en la presente memoria, un organismo no humano transgénico o una parte del mismo como se describe en la presente memoria, una planta transgénica o parte de la misma como se describe en la presente memoria, una semilla como se describe en la presente memoria, o una planta transgénica o planta transgénica o parte de la misma como se describe en la presente memoria, omite la necesidad por craqueo de cadena de ácido graso de alta energía para lograr las moléculas más cortas necesarias para los combustibles de aviones y otros combustibles con requisitos de flujo de temperatura baja. Este método comprende escindir uno o más grupos de ácido graso de cadena media de los glicéridos para formar glicerol y uno o más de ácidos grasos libres. Además, el método comprende separar el uno o más ácidos grasos de cadena media del glicerol, y descarboxilar el uno o más ácidos grasos de cadena media para formar uno o más hidrocarburos para la producción de combustible de aviones.

Alimentos

La presente memoria describe composiciones que se pueden usar como alimentos. A los efectos de la presente invención, el término “alimentos” incluye cualquier alimento o preparación destinada al consumo de humanos o animales y que sirve para nutrir o aumentar los tejidos o suministrar energía; y/o mantiene, restablece o sustenta un estado nutricional o función metabólica adecuados. Los alimentos como se describe en la presente memoria incluyen composiciones nutricionales para bebés y/o niños.

Los alimentos como se describe en la presente memoria comprenden, por ejemplo, una célula como se describe en la presente memoria, una planta como se describe en la presente memoria, la parte de planta como se describe en la presente memoria, la semilla como se describe en la presente memoria, un extracto como se describe en la presente memoria, el producto de un método de la invención, el producto de un proceso de fermentación de la invención o una composición junto con uno o más vehículos adecuados. El término “vehículo” se usa en su sentido más amplio para abarcar cualquier componente que puede tener, o no, valor nutricional. Como podrá apreciar el especialista, el vehículo debe ser adecuado para su uso (o usado a una concentración suficientemente baja) en un alimento de modo tal que no tenga efectos nocivos sobre un organismo que consume el alimento.

El alimento como se describe en la presente memoria comprende un lípido producido directa o indirectamente mediante el uso de los métodos, células u organismos divulgados en la presente memoria. La composición se puede encontrar en la forma de un gel o de un líquido. Además, la composición puede incluir macronutrientes comestibles, vitaminas y/o minerales en las cantidades deseadas para un uso particular. Las cantidades de estos ingredientes varían dependiendo de si la composición se usará con individuos normales o si se usará con individuos que tienen necesidades especiales, tales como los individuos que sufren de trastornos metabólicos y semejantes.

Los ejemplos de vehículos adecuados con valor nutricional incluyen, pero en un sentido no limitativo, macronutrientes tales como grasas comestibles, carbohidratos y proteínas. Los ejemplos de tales grasas comestibles incluyen, pero en un sentido no limitativo, aceite de coco, aceite de borraja, aceite de hongos, aceite de grosellas, aceite de soja y mono y diglicéridos. Los ejemplos de dichos hidratos de carbono incluyen, a modo de ejemplo ilustrativo, glucosa, lactosa comestible y almidón hidrolizado. Además, los ejemplos de proteínas que se pueden utilizar en la composición nutricional como se describe en la presente memoria incluyen (pero en un sentido no limitativo) proteínas de soja, suero electrodializado, leche descremada electrodializada, suero de leche o los hidrolizados de estas proteínas.

Con respecto a las vitaminas y los minerales, se puede agregar lo siguiente a las composiciones de alimento como se describe en la presente memoria: calcio, fósforo, potasio, sodio, cloruro, magnesio, manganeso, hierro, cobre, zinc, selenio, iodo y las vitaminas A, E, D, C y el complejo B. También se pueden agregar otras vitaminas y minerales.

La composición alimenticia como se describe en la presente memoria también se puede agregar a un alimento aun cuando la dieta no requiera de suplementos. Por ejemplo, la composición se puede agregar a un alimento de cualquier tipo, incluyendo (pero en un sentido no limitativo): margarina, manteca modificada, quesos, leche, yogur, chocolate, caramelos, refrigerios, aceites para ensalada, aceites para cocinar, grasas para cocinar, carnes, pescado y bebidas.

Además, los lípidos producidos de acuerdo con la presente invención o células hospedadoras transformadas para contener y expresar los genes objeto de la presente memoria también se pueden usar como suplementos de alimentos para alterar el tejido de un animal o la composición de ácidos grasos de la lecha para uno que fuera más deseable para consumo humano o animal. Los ejemplos de dichos animales incluyen ovejas, ganado, caballos y semejantes. Además, los alimentos como se describe en la presente memoria se pueden usar en acuicultura para aumentar los niveles de ácidos grasos en los peces para consumo humano o de animales.

Los alimentos preferidos de la invención son las plantas, semillas y otras partes de plantas tales como hojas, frutas y tallos que se pueden usar directamente como alimento o alimento para humanos u otros animales. Por ejemplo, los animales pueden pastar directamente sobre tales plantas cultivadas a campo o pueden ser alimentados con cantidades más medidas en una alimentación controlada. La invención incluye el uso de dichas plantas y partes de plantas como un alimento para aumentar los niveles de ácidos grasos poliinsaturados en humanos y otros animales.

Para el consumo por animales no humanos el alimento puede estar en cualquier forma adecuada para tal como, pero no limitado a, alimento, heno, pastura que crece en un campo. En una realización, el alimento para consumo no humano es una planta leguminosa, o parte de la misma que es un miembro de la familia Fabaceae (o leguminosas), tal como alfalfa, trébol, guisantes, alfalfa, frijoles, lentejas, altramuces, mezquite, algarroba, soja y cacahuates.

Composiciones

La presente memoria también describe composiciones, en particular composiciones farmacéuticas, que comprenden uno o más lípidos producidos usando los métodos de la invención.

Una composición farmacéutica puede comprender uno o más de los lípidos, en combinación con un transportador, adyuvante o vehículo estándar, bien conocido, no tóxico, farmacéuticamente aceptable, tal como solución amortiguadora fosfato salina, agua, etanol, polioles, aceites vegetales, un agente humectante o una emulsión tal como una emulsión de agua/aceite. La composición estar tanto en forma líquida como sólida. Por ejemplo, la composición puede estar en la forma de una tableta, cápsula, líquido o polvo ingerible o ungüento tópico o crema. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, por mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones y por el uso de tensioactivos. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, cloruro de sodio y similares. Además de dichos diluyentes inertes, la composición también puede incluir adyuvantes, tales como agentes humectantes, agentes emulsificantes y de suspensión, agentes edulcorantes, agentes saborizantes y agentes aromatizantes.

Una dosificación típica de un ácido graso particular comprende entre 0.1 mg y 20 g, ingeridas una a cinco veces por día (hasta 100 g por día) y preferentemente se encuentra en el rango de entre aproximadamente 10 mg y aproximadamente 1, 2, 5 o 10 g diarios (tomado en una o múltiples dosis). Según es de conocimiento en el arte, resulta deseable un mínimo de aproximadamente 300 mg/día de ácidos grasos, en especial de ácidos grasos poliinsaturados. Sin embargo, se podrá apreciar que cualquier cantidad de ácidos grasos será beneficiosa para el sujeto.

Las posibles rutas de administración de las composiciones farmacéuticas como se describe en la presente memoria incluyen, por ejemplo, la vía enteral y parenteral. Por ejemplo, una preparación líquida se puede administrar por vía oral. Además, se puede dispersar por completo una mezcla homogénea en agua, mezclar bajo condiciones estériles con diluyentes, conservantes, soluciones amortiguadoras o propelentes fisiológicamente aceptables para formar un aerosol o inhalador.

La dosificación de la composición que será administrada al sujeto puede ser determinada por el especialista en el arte y depende de diversos factores tales como peso, edad del paciente, estado de salud general, antecedentes, estado inmune, etc. del sujeto.

Además, las composiciones como se describe en la presente memoria se pueden utilizar con fines cosméticos.

Las composiciones se pueden agregar a composiciones cosméticas pre-existentes de modo tal que se forma una mezcla o se puede usar un ácido graso producido de acuerdo con la presente invención como único ingrediente “activo” en una composición cosmética.

Polipéptidos

Los términos “polipéptido” y “proteína” generalmente se usan indistintamente en la presente memoria.

Un polipéptido o clase de polipéptidos se puede definir por el grado de identidad (% de identidad) de su secuencia de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos de referencia, o por tener un mayor % de identidad con una secuencia de aminoácidos de referencia que con otra. El % de identidad de un polipéptido con una secuencia de aminoácidos de referencia se determina típicamente mediante el análisis GAP (Needleman y Wunsch, 1970; programa GCG) con los parámetros de una penalidad por creación de hueco = 5 y una penalidad por extensión de hueco = 0.3. La secuencia de consulta es de al menos 100 aminoácidos de longitud, y el análisis GAP alinea las dos secuencias sobre una región de al menos 100 aminoácidos. Aún más preferentemente, la secuencia de consulta es de al menos 250 aminoácidos de longitud, y el análisis GAP alinea las dos secuencias sobre una región de al menos 250 aminoácidos. Más preferentemente aún, el análisis GAP alinea dos secuencias sobre su longitud completa. El polipéptido o la clase de polipéptidos pueden tener la misma actividad enzimática o una actividad diferente o una falta de actividad, con respecto al polipéptido de referencia. Preferentemente, el polipéptido tiene una actividad enzimática de al menos 10% de la actividad del polipéptido de referencia.

Como se usa en la presente memoria, un fragmento “fragmento biológicamente activo” es una porción de un polipéptido como se describe en la presente memoria que mantiene una actividad definida de un polipéptido de referencia de longitud completa, por ejemplo, actividad MGAT. Los fragmentos biológicamente activos, según se usan en la presente memoria, excluyen al polipéptido de longitud completa. Los fragmentos biológicamente activos pueden ser una porción de cualquier tamaño, siempre que conserven la actividad definida. Preferentemente, el fragmento biológicamente activo conserva al menos un 10% de la actividad del polipéptido de longitud completa.

Con respecto a un polipéptido o a una enzima definida, se podrá apreciar que las cifras de % de identidad mayores que las provistas en la presente memoria abarcarán realizaciónes preferidas. Por consiguiente, cuando fuera aplicable, a la luz de las cifras mínimas de % de identidad, se prefiere que el polipéptido/enzima comprenda un aminoácido que es al menos un 60%, más preferentemente al menos un 65%, más preferentemente al menos un 70%, más preferentemente al menos un 75%, más preferentemente al menos un 80%, más preferentemente al menos un 85%, más preferentemente al menos un 90%, más preferentemente al menos un 91%, más preferentemente al menos un 92%, más preferentemente al menos un 93%, más preferentemente al menos un 94%, más preferentemente al menos un 95%, más preferentemente al menos un 96%, más preferentemente al menos un 97%, más preferentemente al menos un 98%, más preferentemente al menos un 99%, más preferentemente al menos un 99.1%, más preferentemente al menos un 99.2%, más preferentemente al menos un 99.3%, más preferentemente al menos un 99.4%, más preferentemente al menos un 99.5%, más preferentemente al menos un 99.6%, más preferentemente al menos un 99.7%, más preferentemente al menos un 99.8% y aún más preferentemente al menos un 99.9% idéntica al SEQ ID NO relevante nominado.

Los mutantes de las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos definidos en la presente memoria se pueden preparar introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en un ácido nucleico definido en la presente memoria, o mediante síntesisin vitrodel polipéptido deseado. Tales mutantes incluyen, por ejemplo, supresiones, inserciones o sustituciones de residuos dentro de la secuencia de aminoácidos. Se puede efectuar una combinación de supresiones, inserciones y sustituciones para obtener la construcción final, siempre que el producto polipeptídico final posea las características deseadas.

Los polipéptidos mutantes (alterados) se pueden preparar usando cualquier técnica conocida en el arte, por ejemplo, usando estrategias de evolución dirigida o de diseño racional (véase más adelante). Los productos derivados de ADN mutado/alterado se pueden examinar fácilmente usando las técnicas que se describen en la presente memoria para determinar si poseen actividades de factor de transcripción aciltransferasa de ácidos grasos u OBC.

Al diseñar secuencias de aminoácidos mutantes, la ubicación del sitio de mutación y la naturaleza de la mutación dependerá de la o las características a modificar. Los sitios para la mutación se pueden modificar individualmente o en serie, por ejemplo, por (1) sustitución primero con las elecciones de los aminoácidos conservadores y luego con selecciones más radicales dependiendo de los resultados obtenidos, (2) suprimir el residuo de interés o (3) insertar otros residuos adyacentes al sitio ubicado.

Las supresiones de secuencia de aminoácidos varían en general en un rango entre 1 y 15 residuos aproximadamente, más preferentemente entre 1 y 10 residuos aproximadamente y típicamente entre 1 y 5 residuos contiguos aproximadamente.

Los mutantes de sustitución tienen al menos un residuo de aminoácido en el polipéptido removido y un residuo diferente en su lugar. Los sitios de mayor interés para la mutagénesis de sustitución para inactivar enzimas incluyen los sitios identificados como sitio(s) activo(s). Otros sitios de interés son aquellos en los cuales los residuos particulares obtenidos de diversas cepas o especies son idénticos. Estas posiciones pueden ser importantes para la actividad biológica. Estos sitios, en especial los que se encuentran dentro de una secuencia de al menos tres sitios idénticamente conservados adicionales, se sustituyen preferentemente de una manera relativamente conservadora. Tales sustituciones conservadoras se muestran en la Tabla 1 en la columna con el encabezado de “Ejemplos de sustituciones”.

Tabla 1.Ejemplos de sustituciones.

En una realización preferida un polipéptido mutante/variante tiene solo, o no más de, uno o dos o tres o cuatro cambios de aminoácidos conservadores cuando se compara con un polipéptido de origen natural. Los detalles de cambios de aminoácidos conservadores se proporcionan en la Tabla 1. Ya que la persona experta estaría enterada, tales cambios menores se pueden predecir razonablemente para no alterar la actividad del polipéptido cuando se exprese en una célula recombinante. Los mutantes con actividad deseada se pueden modificar usando procedimientos estándares en la técnica tal como llevar a cabo mutagénesis aleatoria, mutagénesis orientada, o mutagénesis por saturación en los genes conocidos de interés, o al someter diferentes genes al entrelazado de ADN.

EJEMPLOS

Ejemplo 1. Materiales y Métodos Generales

Expresión de genes en células vegetales en un sistema de expresión transitorio

Los genes se expresaron en células vegetales usando un sistema de expresión transitorio esencialmente como fue descrito por Voinnet y colaboradores, (2003) y Wood y colaboradores, (2009). Se introdujeron vectores binarios que contienen a la región de codificación a expresar por un fuerte promotor constitutivo e35S que contiene una región potenciadora duplicada en la cepa AGL1 deAgrobacterium tumefaciens.Además se introdujo por separado el vector binario quimérico, 35S:p19, para la expresión del supresor por silenciamiento viral p19 en a GL1, como se describe en WO2010/057246. Separadamente se introdujo un vector binario quimérico, 35S:V2, para la expresión del supresor por silenciamiento viral V2 en AGL1. Las células recombinantes se cultivaron hasta la fase estacionaria a 28°C en caldo LB suplementado con kanamicina 50 mg/l y rifampicina 50 mg/l. Las bacterias se agruparon luego en pélets por centrifugación a 5000 g durante 5 min a temperatura ambiente antes de resuspenderlas hasta una DO600 = 1,0 en una infiltración solución amortiguadora que contiene MES 10 mM pH 5.7, MgCh 10 mM y acetosiringona 100 pM. Las células se incubaron luego a 28°C con agitación por 3 horas después de lo cual se midió la DO600 y se agregó un volumen de cada cultivo, incluyendo la construcción del supresor viral 35S:p19 o 35S:V2, necesario para alcanzar una concentración final de DO600 = 0,125 en un tubo limpio. El volumen final se conformó con la solución amortiguadora anterior. Luego se infiltraron hojas con la mezcla de cultivo y las plantas se cultivaron típicamente por otros tres a cinco días después de la infiltración antes de recuperar discos de hoja para la preparación de lisados celulares purificados o para el aislamiento de lípidos totales.

Transformación deBrassica napus

Las semillas deBrassica napusse esterilizaron usando gas cloro como se describe por Kereszt y colaboradores (2007) y se germinaron en el medio de cultivo de tejido. Peciolos cotiledónicos con un tallo de 2-4 mm se aislaron como se describe por Belide y colaboradores (2013) y se usaron como explantes. Cultivos de AGL1 deA. tumefaciens(Lazo y colaboradores, 1991) que contienen el vector binario se prepararon y los peciolos cotiledónicos se inocularon con los cultivos como se describe por Belide y colaboradores (2013). Los peciolos cotiledónicos infectados se cultivaron en un<medio MS complementado con 1 mg/L de TDZ 0.1 mg/L de Na A 3 mg/L de AgNO>3<+ 250 mg/L de cefotaxima, 50>mg/L de timentina y 25 mg/L de kanamicina y se cultivaron durante 4 semanas a 24°C con un fotoperiodo de luz-oscuridad de 16hr/8hr con un subcultivo quincenal sobre el mismo medio. Los explantes con callo verde se transfirieron a el medio<de inicio de retoño (MS 1 mg/L de cinetina 3 mg/L de AgNO>3<+ 250 mg/L de cefotaxima 50 mg/L de timentina 25>mg/L de kanamicina) y se cultivó durante otras 2-3 semanas. Los retoños pequeños (~1 cm) se aislaron del callo resistente<y se transfirieron a un medio de alargamiento de retoño (medio MS con 0.1 mg/L de ácido giberélico 3 mg/L de AgNO>3<+>250 mg/L de cefotaxima 25 mg/L de kanamicina) y se cultivaron durante otras dos semanas. Los retoños sanos con una o dos hojas se seleccionaron y se transfirieron a medio de enraizamiento (1/2 MS con 1 mg/L de NAA 20 mg/L de ADS<+ 3 mg/L de AgNO>3<+ 250 mg/L de cefotaxima) y se cultivaron durante 2-3 semanas. El ADN se aisló de las hojas pequeñas>de los retoños resistentes usando el kit de aislamiento de ADN de planta (Bioline, Alexandria, NSW, Australia) como se describe por el protocolo del fabricante. La presencia de las secuencias de T-ADN se sometieron a prueba por amplificación de PCR en el ADN genómico. Los retoños transgénicos, positivos con las raíces se transfirieron a macetas que contienen mezcla de desarrollo de plántulas y se desarrollaron en un invernadero a 24°C diurno/16°C nocturno (condiciones estándares).

Ensayos de Lisados-Enzimas de hojas de purificados

Se molieron tejidos foliares deNicotiana benthamianainfiltradas previamente como se describió previamente en una solución que contiene solución amortiguadora de fosfato de potasio 0.1 M (pH 7.2) y sacarosa 0.33 M usando un homogeneizador de vidrio. El homogenato de hojas se centrifugó a 20.000 g durante 45 minutos a 4°C después de lo cual se recolectó cada sobrenadante. El contenido de proteínas en cada sobrenadante se midió de acuerdo con el método Bradford (1976) usando un contador multi-marca Wallac1420 y un reactivo colorante para ensayo de proteínas de Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU.). Los ensayos con aciltransferasa emplearon 100 |jg de proteína de acuerdo con Cao y colaboradores, (2007) con algunas modificaciones. El medio de reacción contenía Tris-HCl 100 mM<(pH 7.0), MgCl>2<5 mM, BSA 1 mg/ml (ácidos grasos, libres), sacarosa 200 mM, oleoil-CoA frío 40 mM, sn-2>monooleoilglicerol[14C] 16.4 jM (55 mCi/mmol, American Radiochemicals, Saint Louis, MO, EE.UU.) o [14C]glicerol-3-fosfato (G-3-P) sal disódica 6.0 jM (150 mCi/mmol, American Radiochemicals). Los ensayos se condujeron por 7, 5, 15 o 30 minutos.

Análisis de lípidos

Análisis de contenido de aceite en semillas de Arabidopsis

Cuando se determinó el contenido de aceite de semillas o composición de ácidos grasos total en las semillas pequeñas tales como semillas deArabidopsis,los ácidos grasos en las semillas se metilaron directamente sin triturar las semillas. Las semillas se secaron en un desecador durante 24 horas y se transfirieron aproximadamente 4 mg de semilla a un vial de vidrio de 2 ml con tapa a rosca revestida en Teflón. Se agregó 0,05 mg de triheptadecanoina (TAG con tres ácidos grasos C17:0) disuelta en 0.1 ml de tolueno al vial como estándar interno. Se metilaron ácidos grasos de semilla mediante agregado de 0.7 ml de HCl metanólico 1 N (Supelco) al vial con el material de las semillas. No fue necesaria la metilación completa con las semillas pequeñas tales como las semillas deArabidopsis.Se pasó la mezcla por vórtex brevemente y se incubó a 80°C durante 2 horas. Después de enfriar las mezclas a temperatura ambiente, se agregaron 0.3 ml de NaCl al 0.9% (p/v) y 0.1 ml de hexano al vial y se mezclaron bien durante 10 minutos en un Heidolph Vibramax 110. Se colectaron los fA m E en un inserto de vidrio de 0.3 ml y se analizaron mediante GC con un detector de ionización con llama (FID) como se describe a continuación.

Primero se corrigió el área de pico de los FAME individuales en base a la respuesta de área de pico de una cantidad conocida de los mismos FAME presentes en un estándar comercial GLC-411 (NU-CHEK PREP, INC., EE.UU.). El GLC-411 contiene cantidades iguales de 31 ácidos grasos (% en peso), en el rango entre C8:0 y C22:6. En el caso de los ácidos grasos que no estaban presentes en el estándar, se tomaron las respuestas de área de pico de los FAME más similares. Por ejemplo, se usó la respuesta de área de pico de los FAME de 16:1d9 para 16:1d7 y se usó la respuesta del FAME de C22:6 para C22:5. Se usaron las áreas corregidas para calcular la masa de cada FAME en la muestra por comparación con la masa del estándar interno. El aceite se almacena principalmente en forma de TAG y se calculó su peso en base al peso de los FAME. Se determinaron los moles totales de glicerol mediante el cálculo de los moles de cada FAME y dividiendo los moles totales moles de FAME por tres. El contenido de TAG se calculó como la suma de grupos glicerol y acil grasos usando una relación: % en peso de aceite = 100x ((41x moles totales de FAME/3)+(gramos totales de FAME- (15x moles totales de FAME)))/g de semilla, en donde 41 y 15 son los pesos moleculares del grupo glicerol y el grupo metilo, respectivamente.

Análisis del contenido de ácidos grasos en semillas de Camelina y semillas de canola

Para determinar la composición del ácido graso en las semillas individuales que fueron más grandes, tal como semillas de canola yCamelina,la metilación directa de ácidos grasos en la semilla se llevó a cabo conforme a las semillas deArabidopsisexcepto con el rompimiento de las cubiertas de la semilla. Este método extrajo suficiente aceite de la semilla para permitir el análisis de composición del ácido graso. Para determinar la composición del ácido graso del lípido extraído total de las semillas, las semillas se trituraron y los lípidos se extrajeron con CHCh/MeOH. Las alícuotas de lípido extraído se metilaron y se analizaron por GC. El contenido de lípidos de total de semillas acumuladas (contenido de aceite de semilla) de canola se determinó por dos extracciones de lípidos usando CHCh/MeOH de un peso conocido de semillas desecadas después de la trituración, seguido por metilación de las alícuotas de los lípidos junto con los ácidos grasos 17:0 como estándar interno. En el caso de laCamelina,el lípido de un conteo conocido de semillas se metiló junto con la cantidad conocida de ácidos grasos 17:0 ácido grasos conforme el análisis del aceite deArabidopsisy se analizaron el FAME por GC. Para la cuantificación de TAG, el TAG se fraccionó de lípido extraído usando TLC y se metiló directamente in silica usando TAG 17:0 como un estándar interno. Estos métodos se describen más completamente como sigue.

Después de cosechar en la madurez de la planta, se desecaron las semillas deCamelinao canola mediante almacenamiento de las semillas durante 24 horas a temperatura ambiente en un desecador con gel de sílice como desecante. El contenido de humedad de las semillas típicamente es de entre 6 y 8%. Se extrajeron los lípidos totales a partir de pesos conocidos de las semillas desecadas mediante rotura de las semillas usando una mezcla de cloroformo y metanol (2/1 v/v) en un tubo eppendorf usando un lisador de tejido Reicht (22 frecuencias/segundo durante 3 minutos) y una bola de metal. Se agregó un volumen de KCl 0.1 M y se agitó la mezcla durante 10 minutos. Se colectó la fase no polar inferior después de centrifugar la mezcla durante 5 minutos a 3000 rpm. Se lavó la fase superior remanente (acuosa) con 2 volúmenes de cloroformo mezclando durante 10 minutos. También se colectó la segunda fase no polar y se juntó con la primera. Se evaporó el solvente de los lípidos en el extracto bajo flujo de nitrógeno y se disolvieron los lípidos totales secos en un volumen conocido de cloroformo.

Para medir la cantidad de lípidos en el material extraído, se agregó una cantidad conocida de 17:0-TAG como estándar interno y se incubaron los lípidos de la cantidad conocida de semillas en HCl metanólico 1 N (Supelco) durante 2 horas a 80oC. Los FAME hechos de ese modo se extrajeron en hexano y se analizaron mediante GC. Se cuantificaron los FAME individuales en base a la cantidad de 17:0 TAG-FAME. Se convirtieron los pesos de los FAME individuales, después de la resta de los pesos de los grupos metilo esterificados de los FAME, a moles mediante la división por los pesos moleculares de los FAME individuales. Se dividieron los moles totales de todos los FAME por tres para calcular los moles de TAG y por lo tanto de glicerol. Luego, se convirtieron los moles de TAG a peso de TAG. Finalmente, se calculó el porcentaje de contenido de aceite en base al peso de la semilla usando los pesos de las semillas, asumiendo que todos los lípidos extraídos son TAG o equivalentes a TAG con el propósito del cálculo del contenido de aceite. Este método se basó en Li y colaboradores, (2006). También se pueden analizar mediante este método semillas distintas a las semillas de Camelina o canola que son de un tamaño similar.

También se puede medir el contenido de aceite de semillas de canola o de otras mediante técnicas de resonancia magnética nuclear (Rossell y Pritchard, 1991), por ejemplo, mediante un NMS 100 Minispec de onda pulsátil (Bruker Pty Ltd Scientific Instruments, Alemania), como se describe en el Ejemplo 14. El método NMR midió simultáneamente el contenido de humedad. El contenido de aceite de semilla también se puede medir mediante espectroscopia de reflectancia infrarroja cercana tal como usando un monocromador NIRSystems Model 5000. El método de NMR puede medir en forma simultánea el contenido de humedad. El contenido de humedad también se puede medir en una muestra a partir de un lote de semillas secando las semillas de la muestra durante 18 horas a aproximadamente 100oC, de acuerdo a Liy colaboradores,(2006).

Análisis de los lípidos de los ensayos de lisados de hojas

Los lípidos de los ensayos con lisados se extrajeron usando cloroformo:metanol:KCl 0.1 M (2:1:1) y se recuperaron. Las diferentes clases de lípidos presentes en las muestras se separaron sobre placas de cromatografía en capa delgada (TLC) de gel de sílice 60 (MERCK, Dermstadt, Alemania) impregnadas con ácido bórico 10%. El sistema de solventes usado para fraccionar TAG del extracto de lípidos consistió de cloroformo/acetona (90/10 v/v). Las clases individuales de lípidos se visualizaron por exposición de las placas a vapor de iodo y se identificaron corriendo estándares auténticos en paralelo sobre la misma placa de TLC. Las placas se expusieron a pruebas de obtención de imágenes con fósforo durante la noche y se analizaron con un equipo Fosforimager Fujifilm FLA-5000 antes del recuento de centelleo líquido para la cuantificación del DPM.

Aislamiento y fraccionamiento de lípidos total de los lípidos de los tejidos vegetativos

La composición de ácidos grasos de lípido total en la hoja y otras muestras de tejido vegetativo se determinó por metilación directa de los ácidos grasos en las muestras secadas por congelación. Para la cuantificación de lípidos total, los ácidos grasos en un peso conocido de muestra secas por congelación, con FFA 17:0, se metilaron directamente. Para determinar los niveles de TAG totales en las muestras de la hoja, el TAG se fraccionó por TLC de los lípidos totales de extraídos, y se metiló en presencia del estándar interno TAG 17:0, debido a la presencia de cantidades sustanciales de lípidos polares en las hojas. Eso se hizo como sigue. Los tejidos incluyendo las muestras de hojas se secaron por congelación, se pesaron (peso seco) y se extrajeron los lípidos totales como se describe en Bligh y Dyer (1959) o mediante el uso de cloroformo: metanol: KCl 0.1 M (CMK; 2:1:1) como solvente. Se extrajeron los lípidos totales a partir de muestras deN. benthamiana,después del secado por congelación, mediante agregado de 900 pL de una mezcla cloroformo/metanol (2/1 v/v) por cada 1 cm de diámetro de muestra de hoja. Se agregaron 0.8 pg de DAGE por cada 0.5 mg de peso de hoja seca como estándar interno cuando se llevó a cabo el análisis por TLC-FlD. Se homogeneizaron las muestras usando un lisador de tejido IKA ultra-turrax después de lo cual se agregaron 500 pL de KCl 0.1 M. Se agitaron las muestras con vórtex, se centrifugaron durante 5 minutos y se colectó la fase inferior. Se extrajo la fase superior remanente una segunda vez mediante el agregado de 600 pL de cloroformo, agitación con vórtex y centrifugación durante 5 minutos. Se recuperó la fase inferior y se juntó con lo recolectado previamente. Se secaron los lípidos bajo un flujo de nitrógeno y se resuspendieron en 2 pL de cloroformo por cada mg de peso de hoja seca. Se extrajeron los lípidos totales de hojas o de muestras de hojas deN. tabacumcomo se hizo previamente con algunas modificaciones. Cuando se combinaron 4 o 6 discos de hoja (cada uno de aproximadamente 1 cm2 de área superficial), se usó 1.6 ml de solvente de CMK, mientras que cuando se combinaron 3 o menos discos de hoja, se usó 1.2 ml de CMK. Se homogeneizaron los tejidos de hojas secados por congelación en un tubo eppendorf conteniendo una bolita metálica usando un lisador de tejidos Reicht (Qiagen) durante 3 minutos a 20 frecuencias/segundo.

Separación de lípidos neutros a través de TLC y transmetilación

Se cargaron volúmenes conocidos de extractos totales de hoja tales como, por ejemplo, 30 pL, en una placa de TLC de gel de sílice 60 (1x20 cm) (Merck KGaA, Alemania). Se fraccionaron en los diferentes tipos y se separaron los lípidos polares a través de TLC en un tanque de desarrollo equilibrado conteniendo un sistema de solventes de hexano/DEE/ácido acético (70/30/1 v/v/v/). Las bandas de TAG se visualizaron mediante rocío de primulina, etiquetado<bajo UV, se rasparon de la placa de TLC, se transfirieron a viales de GC de 2 ml y se secaron con N>2<. Se agregaron 750>pL de HCl metanólico 1N (Supelco analytical, EE.UU.) a cada vial junto con una cantidad conocida de C17:0 TAG como un estándar interno, dependiendo de la cantidad TAG en cada muestra. Típicamente, 30 pg del estándar interno se agregaron para las muestras de TAG bajo mientras que se usaron 200 pg de estándar interno en el caso de las muestras de TAG alto.

Se transmetilaron las muestras de lípidos para el análisis de composición de ácidos grasos mediante GC, mediante incubación de las mezclas a 80°C durante 2 horas en presencia del HCl metanólico. Después de enfriar las<muestras a temperatura ambiente, se detuvo la reacción mediante agregado de 350 pl de H>2<O. Se extrajeron los esteres>metílicos de ácidos grasos (FAME) de la mezcla mediante agregado de 350 pl de hexano, mezclado con vórtex y centrifugación a 1700 rpm durante 5 minutos. Se colectó la fase superior de hexano y se transfirió a viales de GC con insertos cónicos de 300 pl. Después de la evaporación, se resuspendieron las muestras en 30 pl de hexano. Se inyectó un pl en el GC.

Se cuantificó la cantidad de ácidos grasos individuales y totales (TFA) presentes en las fracciones lipídicas mediante GC mediante la determinación del área bajo cada pico y se calculó mediante comparación con el área de pico de la cantidad conocida de estándar interno. Se calculó el contenido de TAG en la hoja como la suma de grupos glicerol y acil grasos en la fracción de TAG usando una relación: % TAG en peso = 100x ((41x moles totales de FAME/3) (gramos totales de FAME- (15x moles totales de FAME)))/g de peso seco de hoja, en donde 41 y 15 son los pesos moleculares del grupo glicerol y el grupo metilo, respectivamente.

Cromatografía gas-líquida capilar (GC)

Se analizaron los FAME mediante GC usando un GC Agilent Technologies 7890A (Palo Alto, California, EE.UU.) equipado con una columna SGE BPX70 (70% cianopropil polisilfenileno-siloxano) (30 m x 0.25 mm de d.i., 0.25 pm de espesor de película), un FID, un inyector con divisor/sin divisor y un automuestreador e inyector Agilent Technologies 7693 Series. Se usó helio como gas transportador. Se inyectaron las muestras en modo con divisor (proporción 50:1) a una temperatura de horno de 150°C. Después de la inyección, se mantuvo la temperatura del horno a 150°C durante 1 minuto, luego se elevó a 210°C a 3°C.minuto-1 y finalmente a 240°C a 50°C.minuto-1. Se cuantificaron los picos con el programa Agilent Technologies ChemStation (Rev B0.40.3 (16), Palo Alto, California, EE.UU.) en base a la respuesta de la cantidad conocida del estándar externo GLC-411 (Nucheck) y del estándar interno C17:0-Me.

Cuantificación de TAG a través de latroscan

Se cargó un pL de extracto lipídico en un Chromarod-SII para TLC-FID latroscan™ (Mitsubishi Chemical Medience Corporation - Japón). Luego se transfirió el anaquel Chromarod a un tanque de desarrollo equilibrado con 70 ml de un sistema de solventes de hexano/CHCl3/2-propanol/ácido fórmico (85/10.716/0.567/00.567 v/v/v/v). Después de una incubación de 30 minutos, se secó el anaquel Chromarod durante 3 minutos a 100°C y se barrió inmediatamente en un analizador Iatroscan MK-6s TLC-FID (Mitsubishi Chemical Medience Corporation - Japón). Se integraron las áreas de pico del estándar interno de DAGE y de los TAG usando el programa de integración SIC-480II (Versión:7.0-E SIC System instruments Co., LTD - Japón).

La cuantificación de los TAG se llevó a cabo en dos pasos. Primero, se barrió el DAGE en todas las muestras para corregir los rendimientos de extracción después de los cual se seleccionaron y diluyeron las muestras de TAG concentrados. Luego, se cuantificaron los TAG en las muestras diluidas con un segundo barrido de acuerdo a la calibración externa usando trilinoleato de glicerilo como estándar externo (Sigma-Aldrich).

Cuantificación de TAG en muestras de hojas mediante GC

Primero se corrigieron las áreas de pico de los FAME individuales en base a las respuestas de área de pico de cantidades conocidas de los mismos FAME presentes en un estándar comercial GLC-411 (NU-CHEK PREP, Inc., EE.UU.). Las áreas corregidas se usaron para calcular la masa de cada FAME en la muestra por comparación con el estándar interno. Debido a que el aceite se almacena primariamente en forma de TAG, se calculó la cantidad de aceite en base a la cantidad de FAME en cada muestra. Se determinaron los moles totales de glicerol mediante el cálculo del número de moles de FAME y dividiendo los moles totales de FAME por tres. Se calculó la cantidad de TAG como la suma de los grupos glicerol y acil graso usando la fórmula: % en peso de aceite = 100x ((41x moles totales de FAME/3) (gramos totales de FAME-(15x moles totales de FAME)))/g de peso seco de hoja, en donde 41 y 15 fueron los pesos moleculares del grupo glicerol y el grupo metilo, respectivamente.

Ejemplo 2. Incremento del contenido de lípidos en las partes vegetativas deN ic o t ia n a b e n th a m ia n a

El constructo genético pJP3502 se usó para producir plantas establemente transformadas deNicotiana benthamianapor el protocolo de transformación mediado porAgrobacteriumcomo se describe paraNicotiana tabacumen WO2013/096993. Las plantas transgénicas se seleccionaron para resistencia a la kanamicina y se desarrollaron para madurez en el invernadero. Las muestras de la hoja se recolectaron en el establecimiento de la semilla y se secaron por congelación. El contenido de ácidos grasos total (TFA) (% de masa seca) y la composición después de la extracción de Dyer (1959) de lípidos totales de las muestras, y el contenido de fracción de triacilglicerol (TAG) y la composición, se determinaron. Los datos se muestran en la Tabla 2 y Tabla 3. La muestra de aceite de hoja más alta fue de la planta transgénica #16 que tuvo un contenido TFA de 33% en peso. Esta muestra contuvo 22.5% de TAG en peso (peso seco).

Se observó una fuerte correlación entre las alteraciones en la composición de ácido graso y los contenidos de TFA o TAG. El ácido oleico (C18: ln-9) se incrementó con contenidos de TFA y TAG de incremento, de modo que fue el ácido graso dominante en las hojas con alto contenido de TAG, por ejemplo que comprende 66.8% del TFA y 66.9% de los ácidos grasos TAG en las hojas con el contenido de TAG más alto. Las correlaciones similares se observaron para otros ácidos grasos, por ejemplo niveles de ALA se redujeron a 4.9% de TFA y 3.9% de TAG en las hojas con el contenido de TAG más alto. una fuerte correlación entre los niveles de C16:3 y los contenidos tanto de TFA como TAG también se observaron con C16:3 que disminuyó sustancialmente en las muestras de TFA y TAG altas.

Dos de las plantas de aceite altas, #14 y #16, también se analizaron durante la fase de senescencia de la hoja cuando las hojas habían comenzado a ponerse amarillas (Tabla 4 y Tabla 5). Mientras que hubo poco cambio en el contenido de ácidos grasos total de la muestra más alta (32.9% vs 33%) la cantidad de TAG había incrementado a 32.6%. En estas muestras el TAG comprendió casi de todos los lípidos de la hoja.

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Ejemplo 3. Incremento del contenido de lípidos en las partes vegetativas de la plantaN ic o t ia n a ta b a c u mEl constructo pJP3502 se había usado previamente para transformar laNicotiana tabacum(WO2013/096993). La semilla obtenida de una planta T1 homocigota transformada con el T-ADN de pJP3502 y que tiene un contenido de TFA y TAG alto se recolectó y se sembró para establecer una nueva generación de plantas de progenie T2, uniformemente homocigotas para los transgenes. Las macetas se arreglaron en el invernadero tal que las hojas de la planta madura ya sea se traslaparon en una formación de bóveda típica (“bóveda”) como se presentaría cuando se desarrolló en el campo, o se expuso máximamente a luz solar directa (“no de bóveda”). Las muestras de la hoja se tomaron de cada planta cuando se desarrollaron completamente, en la etapa de establecimiento de la semilla, y se secaron por congelación. El contenido de ácido graso se determinó para la fracción de TAG (Tabla 6) siguiendo la extracción de Bligh y Dyer (1959) de los lípidos totales de las muestras. Los niveles de TAG en el tejido de la hoja madura de las plantas no de bóveda fueron típicamente más altas que para las plantas en forma de bóveda, con el contenido de TAG de hoja observado más alto de 20.6% del peso seco de la hoja.

Tabla 6.Contenido de TAG (% de peso seco) en el tejido de la hoja madura de las plantas de progenie transgénicas T2 (Línea 49) transformadas con T-ADN de pJP3502, comparadas con el tipo silvestre (wt).

Planta Condición de Contenido de Planta Condición de Contenido de crecimiento TAG crecimiento TAG1 wt Cubierta 0.0 4 wt Sin Cubierta 0.0

2 wt Cubierta 0.1 5 wt No de cubierta 0.0

3 wt Cubierta 0.1 49.6 No de cubierta 5.1

49.1 Cubierta 6.4 49.7 No de cubierta 5.6

49.2 Cubierta 3.6 49.8 No de cubierta 14.7

49.3 Cubierta 3.7 49.9 No de cubierta 6.3

49.4 Cubierta 1.9 49.10 No de cubierta 6.7

49.5 Cubierta 2.2 49.11 No de cubierta 19.5

49.12 No de cubierta 16.4

49.13 No de cubierta 20.6

49.14 No de cubierta 15.7

49.15 No de cubierta 15.1

49.16 No de cubierta 6.3

49.17 No de cubierta 18.6

Ejemplo 4. Incremento del contenido de aceite en las partes vegetativas de las plantas monocotiledónea

Se diseñaron constructos de ADN quiméricos para incrementar el contenido de aceite en las plantas monocotiledóneas, por ejemplo la planta C4 S,bicolor(sorgo), al expresar una combinación de genes que codifican WRI1, LEC1 deZ. mays(Número de acceso AAK95562; SEQ ID NO: 155), DGAT y Oleosina en las plantas transgénicas. Varios pares de constructos para la co-transformación biolística se diseñaron y se produjeron por la clonación de ligación de enzimas de restricción, como sigue.

El constructo genético pOIL136 fue un vector binario que contiene tres casetes de expresión monocotiledóneas, particularmente un gen marcador seleccionable que codifica la fosfinotricina acetiltransferasa (PAT) para la selección de la planta, un segundo casete para expresar DGA<t>y un tercero para expresar Oleosina. pJP136 primero se produjo al amplificar un promotor de gen de actina deOryza sativa(McElroy y colaboradores, 1990) y al insertarlo como un fragmento romo-Cla1 en pORE04 (Coutu y colaboradores, 2007) para producir pOIL094. El pOIL095 después se produjo al insertar una versión del gen de Oleosina deSesamum indicumque había sido optimizado con codón para la expresión de monocotiledóneas en pOIL094 en el sitio KpnI. El pOIL093 se produjo al clonar una versión optimizada con codón de monocotiledónea del gen DGAT2a deUmbelopsis ramanniana(Lardizabal y colaboradores, 2008) como un fragmento deSmaI-KpnIen un vector que ya contiene un promotor de en de ubiquitinaZea mays.El pOIL134 después se produjo al clonar el casete de expresión pOIL093NotIde DGAT2a en el pOIL095 en los sitios NotI. El pOIL141 se produjo al insertar el gen marcador seleccionable que codifica para PAT como un fragmento deBamHI-SacIen un vector que contiene el promotor de UbiquitinaZ. mays.Finalmente, el pOIL136 se produjo al clonar el casete de expresión de ubiquitina::PAT deZ. mayscomo un fragmento de romo-AscI en elZraI-AscIde pOIL096. El constructo genético pOIL136 contuvo por lo tanto los siguientes casetes de expresión: promotor de ActinaO. sativa::Oleosina S.indicum,promotor Ubiquitina deZ. mays:: DGAT2aU ramannianay promotor Ubiquitina: :PAT deZ. mays.

Un vector similar pOIL197, que contiene NPTII en lugar de PAT se construyó por la subclonación del casete Ubiquitina: :NPTII deZ. mays depUKN como un fragmentoHindIII-SmaIen los sitios AscI (romos)HindIIIde pJP3343. El vector resultante, pOIL196, después se digirió conHindIII(romo) y AgeI. El fragmento 3358bp resultante se clonó en los sitios ZraI - AgeI de pOIL134, produciendo pOIL197.

Un conjunto de constructos que contienen los genes que codifican el WRI1 deZ. mays(ZmWRI) o los factores de transcripción LEC1 (ZmLEC1) bajo el control de diferentes promotores se diseñaron y se produjeron por cotransformación biolística en combinación con pOIL136 para probar el efecto de la resistencia del promotor y la especificidad celular en la función de WRI1 o LEC1, o ambos si se combinaron, cuando se expresaron en los tejidos vegetativos de una planta C4 tal como sorgo. Este conjunto separado de constructos no contuvo un gen marcador seleccionable, excepto para pOIL333 que contuvo NPTII como el marcador seleccionable. Los diferentes promotores sometidos a prueba fueron como sigue. El promotor del gen de Ubiquitina deZ. mays(pZmUbi) fue un promotor de monocotiledónea constitutivo potente mientras que el promotor CaMV 35S mejorado (e35S) que tiene una región potenciadora duplicada se reportó para dar por resultado los niveles de expresión de transgen inferiores (revisado en Girijashankar y Swathisree, 2009). Mientras que el promotor del gen de fosfoenolpiruvato carboxilasa deZ. mays(pZmPEPC) fue activo en las células de mesófilos de la hoja (Matsuoka y Minami, 1989), el sitio de la fotosíntesis en la especie de planta C4, el promotor del gen de subunidad pequeña Rubisco deZ. mays(pZmSSU) fue específico para la capa celular de cubierta roma (Nomura y colaboradores, 2000; Lebrun y colaboradores, 1987), las células donde la fijación del carbono se lleva a cabo en las plantas C4.

La expresión del genZ. maysque codifica la SEE1 cisteína proteasa (Número de acceso AJ494982) se identificó como similar a aquel del promotor específico de senescencia SAG12 deA. thalianadurante el desarrollo de la planta. Por lo tanto, un promotor 1970pb del gen SEE1 (SEQ ID NO:216) también se seleccionó para conducir la expresión de los genes que codifican los factores de transcripción WRI1 y LEC1Z. mays.Además, el promotor de gen que codifica la proteína de dedo de zinc A1SAP deAeluropus littoralis(Ben Saad y colaboradores, 2011; Número de acceso DQ885219; SEQ ID NO:217) y el promotor del genArRolCsensible a sacarosa deA. rhizogenes(Yokoyama y colaboradores, 1994; Número de acceso DQ160187; SEQ ID NO:218) también se seleccionó para la expresión de la expresión de ZmWRI1 en el tejido del tallo. Por lo tanto, cada uno de estos promotores se unión individualmente cadena arriba de las regiones de codificación ZmWRI1 o ZmLEC1, como sigue.

Un vector intermediario, pOIL100, primero se produjo al clonar la secuencia de codificación WRI1 deZ. maysy una región terminadora/poliadenilación de transcripción, flanqueada por los sitiosAscI-NcoI,en los mismos sitios en el vector binario pJP3343. Las diferentes versiones de los constructos para la expresión de WRI1 se basaron en este vector y se produjeron al clonar los diversos promotores en pOIL100. pOIL101 se produjo al clonar un fragmentoXhoI-SaIIque contiene el promotor e35S con la región potenciadora duplicada en el sitioXhoIde pOIL100. pOIL102 se produjo al clonar un fragmentoHindIII-AvríIque contiene el promotor del gen de Ubiquitina deZ. maysen los sitiosHindIII-XbaIde pOIL100. pOIL103 se produjo al clonar un fragmentoHindIII-NcoIque contiene un promotor del genPEPCdeZ. maysen los sitiosHindIII-NcoIde pOIL100. pOIL104 se produjo al clonar un fragmentoHindIII-AvríIque contiene un promotor del gen SSU deZ. maysen los sitiosHindIII-AvrIIde pOIL100.

Un fragmento sintético que contiene la región promotora SEE1 deZ. maysflanqueada por los sitios únicosHindIII-XhoIse sintetiza. Este fragmento se clonó cadena arriba de la región de codificación de proteína WRI1 deZ. maysusando los sitiosHindIII-XhoIen pOIL100. El vector resultante se designa pOIL329. Un fragmento sintético que contiene la región promotora AISAP deA. littoralisflanqueada por los sitios únicosXhoI-XbaIse sintetiza. Este fragmento se clonó cadena arriba de la región de codificación WRI1 deZ. maysusando los sitiosXbaI-XhoIen pOIL100. El vector resultante se designó pOIL330. Un fragmento sintético que contiene la región promotora ArRolC deA. rhizogenesflanqueada por los sitios únicosPspOMI-XhoI.Este fragmento se clonó cadena arriba de la región de codificación WRI1 deZ. maysusando los sitiosPspOMI-XhoIen pOIL100. El vector resultante se designó pOIL335. Finalmente, un vector binario (pOIL333) que contiene el casete de expresión SEE1 deZ. maysse obtuvo en tres pasos. Primero, un vector de expresión 35S::GUS se construyó al amplificar la región de codificación GUS con los cebadores de flanqueo que contienen los sitios AvrII yKpnI.El fragmento resultante se clonó subsecuentemente en los sitiosSpeI-KpnIde pJP3343. El vector resultante se designó pTV111. Después, la región promotora 35S de pTV111 se reemplazó por el promotor SEE1 deZ. mays.Para este fin, la secuencia SEE1 deZ. maysse amplificó usando cebadores de flanqueo que contienen los sitios únicosHindIIIy XhoI. El fragmento resultante se cortó con las enzimas de restricción respectivas y se subclonó en los sitiosSaII-HindIIIde pTV111. El vector resultante se designó pOIL332. Después la secuencia de codificación ZmLEC1 se amplificó usando los cebadores de flanqueo que contienen los sitiosNotIyEcoRV.Este fragmento resultante se subclonó en los sitios respectivos de pOIL332, produciendo pOIL333.

El ADN se preparó de transformación biolística al escindir las cadenas principales del vector de pOIL101, pOIL102, pOIL103, pOIL104, pOIL197, pOIL329, pOIL330, pOIL333 y pOIL335 por la digestión de restricción seguido por el aislamiento en gel. El pOIL197 ADN después se mezcló con ya sea pOIL101, pOIL102, pOIL103, pOIL104, pOIL329, pOIL330, pOIL333 o pOIL335 ADN y se transformó por transformación mediada biolística en los explantes de S.bicolor.Alternativamente, los constructos para la expresión de las mismas combinaciones de genes se transformaron separadamente o se co-transformaron por la transformación mediada porAgrobacterium(Gurel y colaboradores, 2009; Wu y colaboradores, 2014).

Las plantas transgénicas se generaron y se seleccionaron por resistencia a antibióticos. Donde los dos constructos se co-transforman en el mismo evento, se observó el contenido de aceite incrementado en los tejidos no de semilla de las plantas transgénicas.

Los constructos de ADN quiméricos para la transformación mediada porAgrobacteriumse usaron para transformarZea mays(maíz) como se describe por Gould y colaboradores, (1991). Brevemente, los explantes de ápice de retoño se co-cultivaron conAgrobacteriumtransgénico durante dos días antes de ser transferidos en un medio de sal MS que contiene kanamicina y carbenicilina. Después de varias rondas de sub-cultivo, los retoños y raíces transformadas se formaron espontáneamente y se trasplantaron al suelo. Los constructos se usaron similarmente para transformarHordeum vulgare(cebada) yAvena sativa(avenas) usando los métodos de transformación conocidos para estas especies. Brevemente, para la cebada, los cultivos deAgrobacteriumse usaron para transformar células en embriones inmaduros de cebada (cv. Golden Promise) de acuerdo con los métodos publicados (Tingay y colaboradores, 1997; Bartlett y colaboradores, 2008) con algunas modificaciones en esos embriones entre 1.5 y 2.5 mm en longitud se aislaron de cariópsides inmaduros y se removieron los ejes embriónicos. Los explantes resultantes se co-cultivaron durante 2-3 días con elAgrobacteriumtransgénico y después se cultivaron en la oscuridad durante 4-6 semanas en un medio que contiene timentina e higromicina para generar callo embriogénico antes de ser movidos al medio de transición en condiciones de luz baja durante 2 semanas. Los callos después se transfirieron al medio de regeneración para permitir la generación de retoños y raíces antes de la transferencia de las plántulas regeneradas al suelo. Las plantas transformadas se obtuvieron y se desarrollaron para madurez en el invernadero.

Ejemplo 5. Incremento del contenido de aceite en las plantas dicotiledóneas

El contenido de aceite en la especie de planta dicotiledóneaTrifolium repens(trébol), una leguminosa comúnmente usada como una especie de pastura, se incrementó al expresar la combinación de genes WRI1, DGAT y Oleosina en las partes vegetativas. Se usó el constructo pJP3502 para transformarT. repenspor transformación mediada porAgrobacterium(Larkin y colaboradores, 1996). Brevemente, el constructo genético pJP3502 se introdujo enA. tumefaciensa través de un procedimiento de electroporación estándar. El vector binario también contuvo un gen marcador seleccionable 35S:NptII dentro del T-ADN. Las células transformadas deAgrobacteriumse cultivaron sobre medio LB sólido suplementado con kanamicina (50 mg/l) y rifampicina (25 mg/l) y se incubaron a 28°C por dos días. Se usó una sola colonia para iniciar un cultivo fresco para cada construcción. Después de 48 horas de cultivo vigoroso, la célula deAgrobacteriumse usó para tratar cotiledones deT. repens(cv. Haifa) que habían sido disecadas de semillas embebidas como se describe en Larkin et al. (1996). Después de tres días de co-cultivo, los explantes fueron expuestos a 25 mg/l de kanamicina para seleccionar los brotes transformados y luego fueron transferidos a medio de enraizamiento para formar raíces, antes de su transferencia a tierra.

Seis plantas transformadas que contienen el T-ADN de pJP3502 se obtuvieron y se transfirieron al suelo en el invernadero. El contenido de aceite incrementado se observó en el tejido no de semilla de alguna de las plantas, con una planta que muestra mayor que un incremento de 4 veces en los niveles de TAG en las hojas. Tales plantas son útiles como alimento para animales, por ejemplo al desarrollar las plantas en pasturas, proporcionando alimentación con un contenido energético incrementado por peso unitario (densidad de energía) y dando por resultado velocidades de crecimiento incrementado en los animales.

El constructo pJP3502 también se usó para transformar otras plantas leguminosas tales como alfalfa(Medicago sativa)y carretón(Medicago truncatuld)mediante el método de Wright y colaboradores (2006) para obtener plantas transgénicas que tienen un contenido de TAG incrementado en las partes vegetativas. Se obtuvieron tres plantasM. truncatulatransgénicas putativas. Las plantas transgénicas son útiles como especie de pastura o como heno o ensilaje como una fuente de alimentación para animales tales como, por ejemplo, ganado, ovejas y caballos, proporcionando una densidad de energía incrementada en el alimento.

Para incrementar el contenido de aceite en las semillas leguminosas, se sintetizó un fragmento de ADN que contiene una combinación de dos genes quiméricos, particularmente (a) un primer gen quimérico que codifica un WRI1 deA. thalianaexpresado del promotor de proteínas de almacenamiento de faseolina de tipo beta dePhaseolus vulgarisy 5' UTR más (b) un segundo gen quimérico que codifica un DGAT1 deA. thalianaexpresado de un promotor de vicilina dePisum sativumy 5' UTR. El fragmento de ADN se insertó en un vector binario pORE04 que contiene un gen quimérico que codifica oleosina para generar un constructo de T-ADN que comprende los tres genes quiméricos y un gen marcador seleccionable (Figura 2) que se usó para transformarLupinus angustifolius,otra planta leguminosa, mediante el método como se describe por Pigeaire y colaboradores (1997). Brevemente, los explantes de ápice de retoños deL. angustifoliusse co-cultivaron conAgrobacteriumtransgénico antes de ser humedecidos completamente con solución de kanamicina (20 mg/ml) y se transfirieron en un medio de regeneración sin kanamicina. Los múltiples retoños axilares que se desarrollan de los ápices del retoño se escindieron en un medio que contiene 50 mg/L de kanamicina y los retoños sobrevivientes se transfirieron en un medio reciente que contiene 50 mg/L de kanamicina. Los retoños sanos después se transfirieron al suelo. Los genes en el T-ADN se expresaron en las células de las plantas transformadas, incrementando el contenido de aceite en los tejidos vegetativos y las semillas. Un promotor específico de semillas que conduce el gen WRI1 también se usó para incrementar el contenido de aceite en las semillas deLupinustransgénicas.

El constructo también se usó para transformar elGlycine maxcomo se describe por Zhang y colaboradores (1999) para obtener plantas de soja transgénicas que tienen un contenido de TAG incrementado en las semillas. Las plantas transgénicas se obtuvieron como es mostrado por PCR en el ADN obtenido de las muestras de las plantas. Las plantas se desarrollaron en la madurez y las semillas se recolectaron de las mismas. El contenido de aceite de las semillas se esperó que se incrementara como es determinado por la NMR no destructiva.

Un segundo constructo genético para incrementar el contenido de aceite de semilla en lupino y soja se construyó al sintetizar un inserto de ADN que comprende tres casetes de expresión génica, particularmente un primero que tiene un promotor de p-conglicinina deGlycine maxque expresa DGAT2A deUmbelopsis ramanniana,un segundo que tiene un promotor KTi3 deGlycine maxque expresa WRI1 deA. thalianay un tercero que tiene el promotor de p-conglicinina deGlycine max que expresaMGAT2 deMus musculus.El fragmentoSbfl-Pst\de este inserto se clonó en el vector binario pORE04 en el sitio Pst\ para producir pJP3569. Una versión sin el gen MGAT2 se hizo al clonar el fragmentoSbf\-Swa\más pequeño en pORE04 en los sitios at theEcoRV-Pst\para producir pJP3570. Las versiones que contienen solo el gen WRl1 y solamente el gen DGAT2A se produjeron similarmente. Estos vectores binarios se usaron para transformarGlycine maxpara generar una semilla transgénica. El contenido de aceite en la semilla de los transformantes primarios se analizó por NMR no destructiva antes de ser sembradas para producir la semilla T2.

Una versión de pJP3569 adecuado para la transformación de lupino se preparó por PCR amplificando los casetes de expresión WR\1 y DGAT2A en un amplicón individual adaptado con los sitos de restricciónNotl.El fragmentoNotlse clonó en pJP3416 en el sitioPspOMipara producir pJP3678, un vector binario que contiene el gen marcador seleccionable PAT.

Ejemplo 6. Experimento para incrementar el contenido de aceite en las partes vegetativas de la canola

Se usaron dos vectores de expresión binarios para transformarB. napus(cv. Oscar) a fin de investigar el efecto en la acumulación de TAG en la semilla y/o tejidos vegetativos. En primer lugar, el plásmido pJP3414 se construyó al insertar una secuencia de codificación de proteína WR\1 deA. thalianaoptimizada con codón en el vector binario 35S-pORE04 que contuvo un casete de expresión 35S vacío. El T-ADN de pJP3414 por lo tanto contiene una versión optimizada con codón del factor de transcripción WR\1 deA. thalianabajo el control del promotor 35S constitutivo. El tejido de la hoja de 11 plántulas T0B. napusindependientemente transformadas, transformadas con pJP3414 como se describe en el Ejemplo 1, cada una contuvo niveles de TAG comparados con las planas transformadas con el vector vacío (pORE04). Sin embargo, en ningún caso el nivel de TAG excedió 1%. Los niveles máximos se detectaron en la línea 31 que contuvo hasta 0.58% de TAG sobre una base de peso seco. El contenido de aceite en la semilla transgénica T1 no se elevó significativamente comparado con las semillas de control de vector vacío y de tipo silvestre (Oscar). Las semillas T1 de las tres líneas que muestran los niveles de TAG más alto en el tejido de la hoja germinaron en el medio MS que contiene 3% de sacarosa. No se observó diferencia en la germinación después de 5 y 8 días cuando se comparó con el control transformado (Oscar).

En un intento de incrementar adicionalmente los niveles de TAG en los tejidos vegetativos deB. napus,el segundo vector, pJP3502 (Vanhercke y colaboradores, 2014), se usó para transformarB. napus(cv. Oscar). Los niveles de TAG se cuantificaron en las hojas transgénicas muestreadas antes del florecimiento. Sin embargo, el contenido de TAG no se incrementó adicionalmente y la composición de ácido graso no difirió de las plantas de control transformadas en esta etapa de crecimiento.

Las observaciones paraB. napusdescritas en este Ejemplo, que proporcionan un contenido de TAG de menor que 1% en las hojas, estuvieron en contraste etiquetado con aquellos reportados en los Ejemplos 2 y 3 para la especieNicotiana,proporcionando aproximadamente 20-30% de TAG. Los inventores consideraron estas observaciones completamente, buscando una explicación para la diferencia entre las especies. Se identificaron varias diferencias entre las especies. Una diferencia que los inventores concibieron para proporcionar la diferencia esencial fue que laBrassica napuses una así llamada especie 16:3 mientras que la especieNicotianaes la así llamada especie 18:3. Esto se relaciona con la contribución relativa de las así llamadas rutas procariotas y eucariotas para la síntesis de lípidos plástidos (Figura 1), y por lo tanto, los inventores pensaron, que la cantidad de DAG que está disponible para la síntesis de TAG. Esto condujo a que los inventores concibieran el modelo de esa modificación de la relación de la síntesis de ácidos grasos a través de la ruta eucariota con respecto a la ruta procariota, por ejemplo al disminuir la acumulación de 16:3 con respecto a 18:3, alteraría el nivel de TAG que se acumula en las células de planta o células microbianas, fotosintéticas. Esperaron que tal modificación inclinada la balanza en favor de la ruta eucariota que sería ventajosa para los niveles de acumulación de TAG, especialmente en las así llamadas plantas 16:3. En resumen, convierten una célula “16:3” en más similar a una célula “18:3”.

Los inventores hicieron la hipótesis de que la presencia de C18:1-ACP en el plástido que inhibe la ACCasa por la inhibición de retroalimentación podría ser más fuerte en las plantas 16:3 debido a la síntesis y retención de los ácidos grasos en el plástido por la ruta procariota. En contraste, hicieron la hipótesis de que las plantas C18:3 son capaces de acumular niveles de TAG más altos en los tejidos vegetativos debido a la exportación de C18:1 incriminada de los plástidos para la provisión en la ruta eucariota. Como se muestra en los Ejemplos 2 a 4 en la presente memoria, esto se observó en las especies tales comoN. tabacumyN. benthamianaque tienen relaciones de lípidos plastidiales más altos C18:3/C16:3 con respecto a las especies tales comoB. napusque tienen bajos niveles de C18:3 en los lípidos plastidiales. Este modelo, los inventores hicieron la hipótesis, explicaría porque la transformación estable de los genes de expresión de WR\ DGAT Oleosina del vector pJP3502 en tantoN. tabacumcomoN. benthamianadieron por resultado niveles más altos de acumulación de TAG y cambios extensivos en la composición de ácido graso. En contraste, la transformación del mismo vector enB. napusdio por resultado solo un incremento menor en la acumulación de TAG y un pequeño cambio en la composición del ácido graso. Este modelo se examinó como se describe a continuación.

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Sobreexpresión de GPAT plastidial en las células de planta

Se llevó a cabo un número de experimentos para probar la hipótesis que la presencia de una ruta procariota 16:3 sumamente activa en una planta (es decir, una así llamada planta 16:3) proporcionaría niveles de TAG mucho más bajos en los tejidos vegetativos en la introducción de la combinación de genes en pJP3502, con respecto a las plantas 18:3. Estos experimentos se describen en los siguientes Ejemplos. Inicialmente, los inventores probaron si la acumulación de TAG de nivel alto observado en laN. benthamianatransgénica se podría alterar por la sobreexpresión de un GPAT plastidial, incrementando el flujo en la ruta procariota.

Una región de codificación para la expresión del GPAT plastidial deArabidopsis thaliana,ATS1 (Nishida y colaboradores, 1993), se amplificó por RT-PCR de ARN total deA. thalianay se clonó como un fragmentoEcoRI-PstIen el vector de expresión binario pJP3343 bajo el control del promotor 35S para producir el vector de expresión constitutivo pOIL098. El efecto de la sobreexpresión de un GPAT plastidial en un fondo de hoja de alto contenido de aceite se determina por la infiltración del vector quimérico pOIL098 en el tejido de hoja de aceite alto. El tejido de hoja de aceite alto se genera ya sea por co-infiltración de los vectores de expresión binarios WRI1 y DGAT (Ejemplo 1) o al infiltrar pOIL098 en las hojas de una plantaNicotianatransformada establemente con el T-ADN de pJP3502 u otro vector de aceita alto. El contenido de aceite se espera que se reduzca en las manchas de hojas infiltradas que co-expresan el gen que codifica ATS1. Esto se determina al analizar TFA y TAG como proporciones de masa seca de muestra. Esto también se determina al observar la incorporación del acetato etiquetado en los ácidos grasos producidos por microsomas o lisados de hojas preparados de manchas de hojas infiltradas.

Acumulación de aceite en un mutante GPAT plastidial deArabidopsis thaliana

El mutanteatsldeA. thalianatiene una mutación perjudicial en el gen que codifica el GPAT plastidial que redujo la actividad de GPAT plastidial a un nivel de solo 3.8% del tipo silvestre (Kunst y colaboradores, 1988). Los niveles de acumulación de TAG no de semilla, al menos en las hojas, tallos y raíces, en laA. thalianamutante tanto parental comoatslse somete a prueba y se compara. El T-ADN del constructo pJP3502 para la sobreexpresión de la combinación de genes que codifican WRI1, DGAT y Oleosina se introduce por la transformación en las plantas de ambos genotipos. La combinación génica en el T-ADN de pJP3502 incrementa la síntesis de ácidos grasos en ambos antecedentes de la planta. Sin embargo, la acumulación de TAG el mutanteats1se espera que sea significativamente más alta en promedio que en las plantas transgénicas derivadas del genotipo de tipo silvestre (precursor) debido a la reducción en la actividad de GPAT plastidial y por lo tanto el flujo reducido de ácidos grasos en la ruta procariota plastidial. La relación de los ácidos grasos C16:3 a C18:3 se reduce significativamente en las hojas del mutanteatsl,tanto transformado como no transformado.

Silenciamiento del gen que codifica GPAT plastidial en las células de planta

Además de modificar genéticamente una planta al introducir una mutación en un gen que codifica un GAPT plastidial, el flujo de ácidos grasos a través de la ruta 16:3 procariota se puede reducir e incrementar de esta manera el contenido de aceite en las partes vegetativas al silenciar el GPAT plastidial. Esto se muestra al producir un casete transgénico que tiene un promotor constitutivo o específico de hoja que expresa una horquilla de ARN que corresponde a una región del gen que codifica el GPAT plastidial de la especie seleccionada. Como ejemplo, un casete de expresión de horquilla de ARNi se produce usando el fragmento 581bpSall-EcoRVde la secuencia de ADNc GPAT plastidial deA. thaliana(NM_179407, SEQ ID NO: 177). Una región de cualquier gen que codifica un GPAT plastidial que tiene un alto grado de identidad de secuencia a la secuencia de nucleótidos de NM_179407 también se puede usar para construir un gen para la expresión de una ARN de horquilla para silenciar un gen GPAT plastidial endógeno. Un constructo ARNihp que contienen un fragmento 732bp (SEQ ID NO:219) del GPAT plastidial deN. benthamianaflanqueado por sitios únicos SmaI yKasIse diseñó para transformación estable enN. tabacum.El fragmento de GPAT plastidial deN. benthamianasintetizado se subclonó en los sitiosSmaI-KasIde pJP3303, dando por resultado pOIL113. Se espera que la reducción de la retención de ácido graso plastidial da por resultado un incremento en la acumulación de TAG, particularmente cuando se combiné con un componente “Empuje” tal como la sobreexpresión de un factor de transcripción tal como WRI1, o por un componente “de Extracción” tal como un DGAT o PDAT, y/o actividad reducida de SDP1 o TGD.

La inactivación del gen que codifica un GPAT plastidial o de hecho cualquier gen se puede lograr usando los métodos CRISPR/Cas9. Por ejemplo, la inactivación del gen que codifica un GPAT plastidial deA. thaliana(Número de Acceso NM_179407) se puede llevar a cabo por la alteración del gen mediado por CRISPR/Cas9/ARNsg y la mutagénesis subsecuente por la reparación de ADN de unión de extremo no homologa (NHEJ). Antes de la escisión del ADN objetivo, el Cas9 estimula la separación de la hebra de ADN y permite que un ARNsg se hibride con una secuencia de 20 nt específica en el gen objetivo. Esto coloca el ADN objetivo en el sitio activo de Cas9 en la orientación apropiada en relación con un sitio de ligación PAM (nucleótidos de guanosina en tándem). Este posicionamiento permite que los dominios de nucleasa separados de Cas9 escindan independientemente cada hebra de la secuencia de ADN objetivo en un punto 3-nt cadena arriba del sitio PAM. El rompimiento de la doble hebra después se somete a la reparación de ADN NHEJ propensa a errores durante lo cual las supresiones o inserciones de algunos nucleótidos se presentan y dan por resultado la inactivación del gen GPAT. Las secuencias ARNsg que fijan como objetivo el gen GAPT deA. thalianase identifican y se seleccionan a través del uso de la herramienta de la red CRISPRP (Xie y colaboradores, 2014). La secuencia objetivo 20nt puede ser cualquier secuencia 20nt dentro del gen objetivo, incluyendo dentro de las regiones no de codificación del gen tal como un promotor o intrón, con la condición de que sea una secuencia específica dentro del genoma. La secuencia se puede insertar en un vector binario que contiene el casete de expresión CRISPR/Cas9/ARNsg y el marcador seleccionable de planta de kanamicina (Jiang y colaboradores, 2013) y se transforme en las células de planta por la transformación mediada porAgrobacterium.Las plantas T1 transgénicas se pueden clasificar para mutaciones en el gen GPAT plastidial por amplificación de PCR y secuenciación de ADN.

Ejemplo 8. Incremento de la expresión de tioesterasa en células de planta

La síntesis de ácidos grasosde novose lleva a cabo en los plástidos de las células eucariotas donde los ácidos grasos se sintetizan mientras que se ligan a la proteína portadora de acilo como conjugados de acil-ACP. Después del alargamiento de la cadena a los grupos acilo C16:0 C18:0 y después de la desaturación a C18:1 mientras que se liga a ACP, los ácidos grasos se escinden del ACP por tioesterasas y entran a la ruta eucariota por la exportación de los plástidos y se transportan al ER donde participan en la biogénesis de lípidos de membrana y almacenamiento. En los cloroplastos, el proceso de exportación tiene dos pasos: en primer lugar, las cadenas de acilo se liberan como ácidos grasos libres por la actividad enzimática de las acil-ACP tioesterasas (acilo graso tioesterasa; FAT), en segundo lugar por la reacción con CoA para formar ésteres de acil-CoA que se cataliza por las acil-CoA sintetasas de cadena larga (LACS).A. thalianacontiene 3 acilo graso tioesterasas que se pueden distinguir basados en su especificidad de cadena de acilo. FATA1 y FATA2 hidrolizan de manera preferente los acil-ACPs insaturados mientras que las cadenas de acil-ACP saturadas se escinden típicamente por FATB.

Para explorar el efecto en el contenido de ácidos grasos totales, el contenido de TAG, la composición de ácidos grasos de la co-expresión de una tioesterasa y los genes que codifican los polipéptidos WRI1 y/o DGAT, se prepararon genes quiméricos para cada una de las tres tioesterasas deA. thalianamediante la inserción de regiones de codificación en el vector de expresión binario pJP3343 para la expresión transciente en células de hoja deN. benthamianadel promotor 35S. Las regiones de codificación de proteínas para la tioesterasas FATA1 (No. de Acceso. NP_189147.1, SEQ ID NO:202) y FATA2 (No. de Acceso. NP_193041.1, Se Q ID NO:203) deA. thalianase amplificaron de ADNc silicua usando cebadores que contienen los sitiosEcoRIy PstI y se clonaron subsecuentemente en pJP3343 usando los mismos sitios de restricción. Los vectores de expresión resultantes se diseñaron pOIL079 y pOIL080, respectivamente. La región de codificación de proteína del gen FATB deA. thaliana(No. de Acceso. NP_172327.1, SEQ ID NO: 204) se amplificó usando los cebadores que contienen los sitios de flanqueoNotIy SacI y se clonaron en los sitios de restricción correspondientes de pJP3343, dando por resultado pOIL081. Los constructos pOIL079, pOIL080 y pOIL081 se infiltraron en el tejido de la hoja deN. benthamiana,ya sea individualmente o en combinación con los constructos que contienen los genes para el factor de transcripción w R i1 deA. thaliana(AtWRI1) (pJP3414) y/o DGAT1 aciltransferasa (AtDGAT1) (pJP3352). Para comparación, los genes quiméricos que codifican el FatB1 deCocos nucifera(CnFATB1) (pJP3630), se introdujo el FatB2 deC. nucifera(CnFATB2) (pJP3629) en el tejido de la hoja deN. benthamianaen paralelo con las tioesterasas de hojaArabidopsis,para comparar el efecto de los polipéptidos FatB que tienen la especificidad de MCFA a las tioesterasas deArabidopsisque no tienen especificidad de MCFA. Todas las infiltraciones incluyeron un gen quimérico para la expresión del supresor de silenciamiento p19 como se describe en el Ejemplo 1. El control negativo infiltró solamente el T-ADN p-19.

Un efecto sinérgico se observó entre la expresión de tioesterasa y la sobreexpresión de WRI1 y/o DGAT en los niveles de TAG en las hojas deN. benthamiana.La expresión de los genes de tioesterasa sin los genes WRI1 o DGAT incrementó significativamente los niveles de TAG por arriba del nivel bajo en el control negativo (p19 solo). Por ejemplo, la expresión de la FATB2 tioesterasa de coco dio por resultado un incremento de 8.2 veces en los niveles de TAG en las hojas comparado con el control negativo. La co-expresión del factor de transcripción WRI1 deA. thalianacon cada una de las tioesterasas incrementaron adicionalmente los niveles de TAG comparado con el control AtWRI1. La co-expresión de cada una de las tioesterasas de coco CnFATB1 y CnFATB2 con WRI1 dio por resultado niveles de TAG más altos que cada una de las tres tioesterasas deA. thalianacon WRI1. Interesantemente, la conversión se observó cuando la DGAT 1 aciltransferasa deA. thalianase co-expresó en combinación con una tioesterasa y WRIT. Esto sugirió una mejor coincidencia en la especificidad de cadena de acilo de las tioesterasas deA. thalianay la DGAT1 aciltransferasa deA. thaliana,dando por resultado un mayor flujo de cadenas de acilo del acil-ACP en el TAG. Las tioesterasas no de MCFA también fueron considerablemente más efectivas en el elevar el porcentaje de ácido oleico en el contenido de ácidos grasos total en las hojas. La co-expresión del AtWRI1, AtDGAT1 y AtFATA2 dio por resultado el nivel más alto de TAG en las hojas, proporcionando un nivel que fue 1.6 veces mayor que cuando el AtWRI1 y AtDGAT1 se co-expresaron sin la tioesterasa. Estos experimentos confirmaron el incremento sinérgico en la síntesis del aceite y la acumulación cuando tanto WRI1 como DGAT se co-expresaron así como mostraron el incremento sinérgico adicional obtenido al agregar una tioesterasa a la combinación.

Se construyeron tres vectores de expresión binarios diferentes para aprobar el efecto de la co-expresión de los genes que codifican WRI1, DGAT1 y FATA en los niveles de TAG y la composición de ácido graso en las hojas deN. tabacumestablemente transformadas. El vector pOIL121 contuvo un gen SSU::AtWRI1 para la expresión de AtWRI1 del promotor SSU, un gen 35S::AtDGAT1 para la expresión de AtDGAT del promotor 35S, y un gen enTCUP2 : : AtFATA2 para la expresión de AtFATA2 del promotor enTCUP2 que es un promotor constitutivo. Estos constructos genéticos se derivaron de pOIL38 primero al digerir el ADN conNotIpara remover el gen que codifica para oleosina de S.indicum.La región de codificación de proteína del gen FATA2 deA. thalianase amplificó y se flanqueó con sitios JVM usando el pOIL80 ADN como plantilla. Este fragmento después se insertó en el sitioNotIde pOIL38. El pOIL121 después sirvió como un vector precursor para pOIL122 que contuvo un casete de ARN de horquilla enTCUP2::SDP1 adicional para el silenciamiento mediado por ARNi del gen SDP1 endógeno en las plantas transgénicas. Para hacer esto, el casete de horquilla SDP1 deN. benthamianacompleto se aisló de pOIL51 (Ejemplo 11) como un fragmento deSfoI-Smaly se clonó en el sitio SfoI de pOIL121, produciendo pOIL122 (Figura 3). Un tercer vector, pOIL123, que contiene los genes SSU::WRI1 y 35S::DGAT1 y el gen de ARN de horquilla enTCUP2::SDP1 se obtuvo en una manera similar mediante la clonación del casete de ARN de horquilla enTCUP2::SDP1 como un fragmento SfoI-SmaI en el sitio SfoI de pOIL36.

En resumen, los vectores contuvieron las combinaciones de genes:

pOIL121 : SSU::AtWRI1, 35S::AtDGAT1, enTCUP2::AtF ATA2.

pOIL122: SSU::AtWRI1, 35S::AtDGAT1, enTCUP2::AtFATA2, enTCUP2::SDP1 de horquilla.

pOIL123: SSU::AtWRI1, 35S::AtDGAT1, enTCUP2::SDP1 de horquilla.

Los tres constructos se usaron cada uno para producir plantas deN. tabacumtransformadas (cultivar Wi38) por la transformación mediada porAgrobacterium.La co-expresión de la FATA2 tioesterasa deA. thalianao silenciamiento de la SDP1 TAG lipasa endógena en combinación con la expresión de AtWRI1 y AtDGAT1 dio por resultado cada uno niveles de TAG elevados adicionales comparados con la expresión de AtWRI1 y AtDGAT1 en ausencia de tanto el gen de tioesterasa como el gen de silenciamiento SDP1. Se obtuvieron rendimientos de TAG más grandes usando pOIL122 por la acción combinada de los cuatro genes quiméricos.

Cabe destacar queN. benthamianaes una planta 18:3. Los mismos constructos pOIL079, pOIL080 y pOIL081 se usan para transformarA. thaliana,una planta 16:3.

Los inventores concibieron el modelo que incrementando la exportación de ácidos grasos plastidiales tal como mediante la actividad de acilo graso tioesterasa incrementada reduce la acumulación de acil-ACP en los plástidos, incrementando de esta manera la biosíntesis de ácidos grasos como resultado de la inhibición de retroalimentación reducida en la acetil-CoA carboxilasa (ACCasa) (Andre y colaboradores, 2012; Moreno-Perez y colaboradores, 2012). La sobreexpresión de la tioesterasa incrementa la exportación de las cadenas de acilo de los plástidos en el ER, proporcionando de esta manera una ligación eficiente entre las así llamadas estrategias de modificación metabólicas “Empuje” y “Extracción”.

Ejemplo 9. Producción de ácidos grasos de cadena media en las células de plantas vegetativas

Eccleston y colaboradores (1996) estudió la acumulación de ácidos grasos C12:0 y C14:0 en tanto las semillas como las hojas de las plantasBrassica napustransgénicas transformadas con un gen constitutivamente expresado que codifica la 12:0-ACP tioesterasa California Bay Laurel(Umbellularia californica).Ese estudio reportó que los niveles sustanciales de C12:0 acumulados en las semillas deB. napusmaduras pero solo se observaron niveles muy bajos de C12:0 en el tejido de la hoja, a pesar de los altos niveles de la expresión y actividad de 12:0-ACP tioesterasa. Los mismos resultados se obtuvieron cuando el gen se transformó enA. thaliana(Voelker y colaboradores, 1992). Esa investigación se extendió por la co-expresión del LPAAT deCocos nuciferay la tioesterasa deUmbellularia californicaque dio por resultado una acumulación incrementada de C12:0 total así como una fracción incrementada de trilaurina en las semillas de B, napus (Knutzon y colaboradores, 1999). La técnica anterior indicó por lo tanto que la síntesis de ácidos grasos de cadena media (MCFA) en las células de plantas vegetativas fue problemático.

Para probar el efecto de introducir tioesterasas que tienen especificidad para MCFA en combinación con otros genes descritos en la presente memoria, los ADNs quiméricos para expresar varias tioesterasas diferentes se sintetizaron y se introdujeron en las células de planta ya sea individualmente o en combinaciones. Las regiones de codificación de proteínas para tioesterasas de los organismos conocidos por producir MCFAs (Jing y colaboradores, 2011) se sintetizaron y se insertaron como fragmentos deEcoRIel vector binario pJP3343 que contuvo un casete de expresión promotor 35S (Vanhercke y colaboradores, 2013). Las tioesterasas fueron: 14:0-ACP tioesterasa deCinnamomum camphora(referida como Cinca-TE) (Yuan y colaboradores, 1995; No. de Acceso. Q39473.1; SEQ ID NO: 193), acil-ACP tioesterasa FatB1 deCocos nucifera(Cocnu-TE1; No. de Acceso. AEM72519.1 SEQ ID NO: 194), acil-ACP tioesterasa FatB2 deCocos nucifera(Cocnu-TE2; No. de Acceso. AEM72520.1; SEQ ID NO: 195), acil-ACP tioesterasa FatB3 deCocos nucifera(Cocnu-TE3; No. de Acceso. AEM72521.1; SEQ ID NO: 196), acil-(ACP) tioesterasa tipo B deCuphea lanceolata(Cupla-T<e>) (Topfer y colaboradores, 1995; No. de Acceso. CAB60830.1;<s>E<q>ID NO: 197), FatB2 deCuphea viscosissima(Cupvi-TE; No. de Acceso. AEM72522.1; SEQ ID NO: 198) y 12:0-ACP tioesterasa deUmbellularia californica(Umbca-TE) (Voelker y colaboradores, 1992; No. de Acceso. Q41635.1; SEQ ID NO: 199). Estas tioesterasas todas estuvieron en la clase FATb y tuvieron especificidad para MCFA. Las regiones de codificación de proteína para LPAAT deC. nucifera(Cocnu-LPAAT, tipo MCFA) (Knutzon y colaboradores, 1995; No. de Acceso. Q42670.1; SEQ ID NO: 200) y LPAAT1 plastidial deA. thaliana(Arath-PLPAAT; No. de Acceso. AEE85783.1; SEQ ID NO: 201), también se clonaron. El Cocnu-LPAAT había mostrado previamente que incrementa la incorporación de MCFA en la posición sn-2 de TAG en las semillas (Knutzon y colaboradores, 1995) mientras que el LPAAT plastidial deA. thaliana(Arath-PLPAAT) (Kim y colaboradores, 2004) se usó como un LPAAT de control para determinar el efecto de cualquier especificidad de MCFA que el Cocnu-LPAAT podría tener. El LPAAT anterior usa acil-CoA como un substrato y funciona en el ER en su contexto nativo, mientras que el PLPAAT posterior usa acil-ACP como substrato y funciona en el plástido.

Los genes de tioesterasa se introdujeron en las hojas deNicotiana benthamianapor infiltración mediada porAgrobacteriumcomo se describe en el Ejemplo 1 junto con el gen para la co-expresión del supresor de silenciamiento p19 y ya sea el Cocnu-LPAAT o Arath-PLPAAT para determinar si el MCFA se podría producir en el tejido de la hoja deN. benthamianahoja. Las zonas de la hoja infiltradas se recolectaron y se secaron por congelación cinco días después de la infiltración con las mezclas deAgrobacteriumdespués de lo cual el contenido de ácidos grasos total y la composición se determinaron por GC como se describe en el Ejemplo 1 (Tabla 7). Para los datos mostrados en la Tabla 7, los errores son la desviación estándar de las infiltraciones triplicadas. Las zonas infiltradas de las hojas de control contuvieron solo trazas (<0.1%) o niveles cero de ácidos grasos C12:0 y C14:0 mientras que el C16:0 estuvo presente en 14.9%+0.6 del TFA en los lípidos de la hoja totales. Los niveles de C12:0 se incrementaron solamente de manera significativa por la expresión del Cocnu-TE3 (1.2%±0.1) y Umbca-TE (1.6%±0.1). La expresión de cada una de las tioesterasas sometidas a prueba dio por resultado la acumulación de C14:0 en las hojas deN. benthamiana,con Cinca-TE que proporcionan el nivel más alto de 11.3%±1.0. Similarmente, la expresión de cada una de las tioesterasas con la excepción de Umbca-TE dio por resultado niveles de C16:0 incrementados. Este nivel más alto de la acumulación de C16:0 (35.4%±4.7) se observó con la expresión de Cocnu-TE1. Se observó la necrosis sustancial de las zonas infiltradas en las hojas cuando los genes FATB se expresaron solos, lo cual pareció que se correlaciona con el nivel de la producción de MCFA. Los inventores consideraron que la necrosis fue probablemente debido a los niveles de ácidos grasos libres (FFA) mayores que el óptimo, y también debido a la acumulación extensiva de MCFA en las acumulaciones de lípidos de fosfolípido en lugar de TAG.

Tabla 7. Composición de ácido graso de la hoja total (% de ácido graso de la hoja total) de ácidos grasos seleccionados en hojas deNicotiana benthamianainfiltradas con varias tioesterasas (TE) y LPAATs. Los resultados se agrupan por el gen co-infiltrado (genes individuales (diferentes a pl9 presente en todas las muestras), Arath-LPAAT varios TE, Cocnu-LPAAT varios TE). “Control” indica hoja deN. benthamianahoja infiltrada mientras que “p19 solamente” contiene el gen supresor de silenciamiento solo. 16:3 es 16:3a71013; 18:3 es 18:3ñ91215. Las identidades génicas se definen el texto.

12:0 14:0 16:0 16:3 18:3

Control0.2+0 0.1+0 14.0+0.2 8.1+0.1 57.2+0solo p190.2+0 0.1+0 14.9+0.6 7.0+0.8 53.1+0.7

Cinca-TE0.4+0 11.3+1.0 21.9+0.7 5.0+0.2 38.5+1.0Cocnu-TE10.2+0 6.3+0.6 35.4+4.7 4.2+1.4 29.9+5.5<(0>

<V>Cocnu-TE20.2+0 7.1+0.3 31.9+2.2 4.7+0.5 32.9+2.8

cVCocnu-TE31.2+0.1 7.2+1.3 19.6+1.6 5.7+0.5 44.8+2.9

®<DcmoCupla-TE0.2+0 1.1+0.2 21.8+2.9 6.0+0.6 48.2+3.1

■° 15 Cupvi-TE0.2+0 0.6+0.1 17.3+1.3 6.4+0.4 52.9+2.1 <»<3>Umbca-TE1.6+0.1 1.1+0.2 14.4+0.8 6.5+0.3 52.7+0.1

V >Arath-LPAAT0.2+0 0.4+0.5 17.4+1.0 6.2+0.3 51.4+1.3

QE.-.£oCocnu-LPAAT0.1+0.1 0.1+0 15.1 1.5 6.7+0.5 52.2+4.2

Cinca-TE0.2+0 7.8+0.1 24.6+0.4 5.3+0.2 39.2+1.5Cocnu-TE10.2+0 4.6+1.3 35.3+1.4 4.4+0.7 32.7+2.0 <Cocnu-TE2<<>0.2+0 6.1+0.4 32.5+1.8 4.7+0.1 34.1+0.6

Q.Cocnu-TE30.9+0.2 8.5+0.4 21.4+1.9 5.6+0.2 41.7+0.6

Cupla-TE0.2+0 1.0+0.1 23.4+2.7 5.9+0.5 47.3+1.2 reCupvi-TE0.2+0 0.6+0 19.0+0.2 6.3+0.1 51.4+1.0

<+Umbca-TE1.2+0.2 1.1+0.1 15.4+0.2 6.5+0.2 52.3+1.3

Cinca-TE0.7+0.2 14.9+1.6 23.0+3.7 4.8+1.4 35.4+3.3

<Cocnu-TE10.2+0 5.4+0.9 40.2+2.8 3.3+0 27.8+1.1

<<>Q.Cocnu-TE20.2+0 6.6+1.0 38.3+1.1 3.7+0.2 28.2+1.1

Cocnu-TE32.0+0.3 10.9+1.0 24.4+1.8 4.9+0.5 37.7+0.9Cupla-TE0.5+0.1 1.6+0.3 22.2+0.6 6.0+0.3 46.9+2.0 OOCupvi-TE0.5+0 1.1+0 19.6+0.8 6.0+0.2 49.8+0.3

O

+Umbca-TE3.3+0.5 1.2+0.1 13.9+0.4 6.4+0.2 51.3+1.7

La co-infiltración del gen quimérico para expresar Arath-PLPAAT con las tioesterasas tendió a reducir la acumulación de tanto C12:0 como C14:0 comparada con la ausencia del LPAAT, mientras que incrementa ligeramente la acumulación de C16:0. En contraste, la co-infiltración de los genes para expresar Cocnu-LPAAT o Umbca-TE incrementó la acumulación de C12:0 a 3.3%+0.5 mientras que C14:0 se encontró que se acumula a 14.9%±1.6 en la muestra de Cinca-TE Cocnu-LPAAT. Los niveles de C16:0 más alto se observaron después de la co-expresión de Cocnu-TE1 y Cocnu-LPAAT (40.2%±2.8). La adición de un LPAAT a cada zona inoculada disminuyó el grado de necrosis del tejido de la hoja. Sorprendentemente, los ácidos grasos tanto C8:0 como C10:0 también se produjeron en las células de planta en los estudios de expresión transcientes. La acumulación de C8:0 y C10:0 no se observó cuando la tioesterasa se expresó sola. Sin embargo, cuando la expresión de la tioesterasa se combinó con la co-expresión de CuphoFatB con CnLPAAT y AtWRI1, C8:0 se encontró que está presente en una concentración de 0.27±0.09% del contenido de ácidos grasos tota en las células de planta. Similarmente, cuando CuplaFatB se co-expresó con CnLPAAT y AtWRII, C10:0 se encontró que está presente en 0.54±0.16% del contenido de ácidos grasos total.

Estos resultados indicaron que las especificidades de acilo previamente reportadas de las tioesterasas, observadas de la expresión de la semilla, se mantuvieron esencialmente en las hojas deN. benthamianay que este sistema de expresión fue un sistema válido para probar la especificidad del acilo. La adición del PLPAATde A. thalianaplastidial no incrementó la acumulación de MCFAs aunque dio por resultado una acumulación ligeramente incrementada de C16:0 en las células deA. thaliana.En contraste, el LPAAT deC. nuciferaincrementó la acumulación de C12:0, C14:0 y C16:0 en las hojas deN. benthamiana,los ácidos grasos que se encuentran en el aceite deC. nucifera(Laureles y colaboradores, 2002). Esto indicó que el LPAAT deN. benthamiananativo fue ya sea no se expresó en gran medida en el tejido de la hoja o no tuvo actividad alta en los substratos C12:0, C14:0 y C16:0.

Producción de ácidos grasos de cadena media en las células de planta vegetativa que acumulan altos niveles de TAG

Los inventores obtuvieron previamente la producción de 15% de TAG en las hojas deN. tabacumpor la expresión coordinada de los genes quiméricos que codifican WRI1 deA. thaliana,DGAT1 deA. thalianay Oleosina de S.indicum(Vanhercke y colaboradores, 2014). Para probar si la acumulación de MCFA que se observó después de la expresión de las tioesterasas en combinación con un LPAAT también se presentaría o se incrementaría en las células de planta que producen altos niveles de TAG (Vanhercke y colaboradores, 2013), estos genes se co-expresaron. Las combinaciones de C12:0, C14:0 y C16:0 tioesterasa/LPAAT de mejor desempeño (Cocnu-LPAAT más Umbca-TE, Cinca-TE y Cocnu-TE2 tioesterasas, respectivamente) se infiltraron con y sin las combinaciones Arath-WRI1 DGAT previamente descritas (Vanhercke y colaboradores, 2013). Los datos se muestran en la Figura 4.

La acumulación del MCFA relevante (C12:0 para Umbca-TE, C14:0 para Cinca-TE y C16:0 para Cocnu-TE2) se incrementó consistente y sustancialmente la mayoría por la adición de Arath-WRI1 a las combinaciones: C12:0 comprendió de 9.5%±0.9 de ácidos grasos de hoja total en las muestras de Umbca-TE+Cocnu-LPAAT+Arath-WRI1, el nivel de C14:0 fue 18.5%+2.6 en las muestras de Cinca-TE+Cocnu-LPAAT+ Arath-WRI1 y el nivel de C16:0 fue 38.3%±3.0 en las muestras de Cocnu-TE2+Cocnu-LPAAT+Arath-WRI1. Se encontró que las infiltraciones de Arath-WRI1 más tioesterasa tienen un efecto significativamente mayor C12:0 en presencia de Umbca-TE, C14:0 en presencia de Cinca-TE y C16:0 en presencia de Cocnu-TE2 con respecto a la infiltración con tioesterasa más Cocnu-LPAAT en ausencia de WRI1 (Figura 5). La adición del Cocnu-LPAAT a las mezclas de tioesterasa más Arath-WRI1 tuvieron un efecto en la composición de ácidos grasos con incremento relativamente pequeños en C12:0 y C14:0 observados en los conjuntos Umbca-TE y Cinca-TE y una pequeña disminución en C16:0 en el conjunto Cocnu-TE2. Los niveles máximos observador fueron 8.8%±1.1 de C12:0 en los ácidos grasos de hoja totales observados en las muestras de Umbca-TE Arath-WRI1 Cocnu-LPAAT, 14.1%+3.5 de C14:0 en las muestras de Cinca-TE Arath-WRI1 Cocnu-LPAAT y 48.6%+3.7 de C16:0 en la muestra de Cocnu-TE2 Arath-WRI1.

Interesantemente, la única tioesterasa en la cual el Arath-WRI1 no incremento la acumulación de MCFA tanto como el Cocnu-TE2, aunque aún incrementó significativamente. La adición de este gen solo dio por resultado la acumulación incrementada de C16:0 de 16.0%±0.4 a 37.3%+0.6 mientras que la adición adicional de Arath-WRI1 solo incrementó esto a 48.6%±1.7. Esto puede haber sido debido a los intermediarios C12:0 C14:0 que son relativamente transcientes durante la síntesis de ácidos grasos plastidiales comparados con C16:0.

Otros efectos que se notaron incluyeron el incremento en C16:0 y C18:1ñ9y la disminución en los niveles de C18:3ñ91215 en presencia de Arath-WRI1. La adición adicional del Cinca-TE y Cocnu-TE2 disminuyó los niveles de C18:3ñ91215 aún más. En contraste, el C12:0 extra producido después de la adición de Arath-WRI1 a Umbca-TE pareció que proviene del costo de C16:0 en lugar del C18:3ñ91215 adicionales (Figura 5).

Un subconjunto de muestras también se analizó por LC-MS para ganar un mejor entendimiento de acumulación de MCFA. Los galactolípidos plastidiales monogalactosilo diacilglicerol (MGDG) y digalactosilo diacilglicerol (DGDG) contuvieron solo bajos niveles de C12:0 y C14:0 y niveles reducidos de C16:0 con respecto a la infiltración de control p19. Las especies MGDG que contienen C12:0 principales en las muestras de Umbca-TE fue 30:3 indicando que un C18:3 y un C12:0 se co-localizaron en la cadena principal de monogalactosilo. Las otras especies MGDG que contienen C12:0 principales fue 28:0, indicando que el segundo ácido graso fue C16:0. La especie MGDG que contiene C14:0 principal en las muestras Cinca-TE fueron 28:0 y 30:0, indicando que una proporción significativa del C14:0 en MGDG fue ya sea di-C14:0 o con C16:0. Las especies de MGDG que contienen C12:0 y que contienen C14:0 no se detectaron en la muestra de control p19. En contraste, las especies MGDG que contienen C16:0 tendieron a ser reducidas en las muestras de Cocnu-TE2. La especie MGDG mayor en las muestras de tipo silvestre (34:6 que contiene C16:3, 34:6 que contiene C18:3, y 36:6 que contiene C18:3) todos tendieron a ser reducidos por la expresión de los transgenes. Esta reducción fue más grande en presencia de la combinación WRI+DGAT.

Solo niveles trazas de especies DGDG que contienen C12:0 se observaron en las muestras de Umbca-TE. Las especies que contienen C14:0 principales observadas en las muestras Cinca-TE fueron 28:0 y 30:0, ambas de las cuales estuvieron ausentes en el control. Estas especies también se observaron en niveles elevados en las muestras de Cocnu-TE2 pero solo en los niveles traza en las muestras de Umbca-TE. Las especies DGDG principales en las muestras de tipo silvestre (34:3 que contiene C16:0, 34:3 que contiene C18:3, y 36:6 que contiene C18:3) tendieron a ser reducidos por la expresión de los trangenes. Esta reducción fue más alta en presencia de WRI.

Similarmente, las especies TAG se incrementaron en general considerablemente en todas las muestras que contienen WRI DGAT como se describe previamente (Vanhercke y colaboradores, 2013). Las especies C12:0 se encontraron que son dominantes en la muestra TAG Umbca-TE alta,<c>14:0 en la muestra TAG Cinca-TE alta y C16:0 en la muestra t Ag Cocnu-TE2 alta. El análisis LC-MS de la fracción de TAG mostró que el 36:0 que contiene C12:0 se encontró que la especie TAG dominante, dos veces el nivel de la especie T de TAG que contiene C18:3, en todas las muestras Umbca-TE que contiene el factor de transcripción de WRI. Similarmente, 42:0 que contiene C14:0 fue la especie de TAG dominante en las muestras Cinca-TE co-transformadas con ya sea LPAAT, DGAT, WRI o WRI+DGAT, aunque la respuesta fue considerablemente más alta en el caso de las muestras que contienen WRI. Varias especies de TAG que contienen C16:0 se elevaron significativamente en tanto las muestras de TAG Cinca-TE (por ejemplo 44:0 y 50:3) como Cocnu-TE2 (por ejemplo 46:0, 48:0, 50:2 y 50:3). Nuevamente los incrementos de C16:0 más altos se observaron en presencia de WRI.

Transformación estable para la producción de MCFA en tejidos vegetativos

Se hizo una serie de constructos genéticos en un vector binario a fin de transformar establemente plantas tales como tabaco con combinaciones de genes para la producción de MCFA en tejidos vegetativos, para identificar las combinaciones óptimas de los genes. Estos constructos incluyen un gen para la expresión de WRI1 bajo el control de ya sea el promotor SSU (ver Ejemplo 8, pOIL121) o el promotor SAG 12 específico de senescencia, un gen que codifica un DGAT de palma de aceite (posterior), un gen que codifica el LPAAT de coco (CocnuLPAAT, ver lo anterior) bajo el control de un promotor enTCUP y varios genes que expresan una variedad de acilo graso tioesterasas (FATB) expresadas de ya sea un promotor 35S o un promotor SAG 12. Esto se describe a continuación.

Clonación de un gen que codifica DGAT de Elaeis guineensis (palma de aceite)

A fin de en primer lugar probar diferentes enzimas de DGAT, incluyendo las enzimas DGAT1, DGAT2 DGAT3 representativas, las secuencias de DGAT de aceite de palma candidatas se identificaron del transcriptoma publicado (Dussert y colaboradores, 2013) y optimizado con codón para la expresión deNicotiana tabacum.Las regiones de codificación de proteína después se clonaron cada una individualmente en los vectores de expresión binarios bajo el control del promotor 35S para la prueba en los ensayos de la hoja deN. benthamianatransciente como se describe en el Ejemplo 1. Las combinaciones de genes probadas fueron como sigue:

1 P19 (control negativo)

2 P19+CnLPAAT+WRI1

3 P19+CnLPAAT+AtWRI1 AtDGAT 1

4 P19+CnLP AAT+AtWRI1 EgDGAT1

5 P19+CnLP AAT+AtWRI1 EgDGAT2

6 P19+CnLP AAT+AtWRI1 EgDG AT3

7 P19+CincaFatB

8 P19+CincaFatB+CnLP AAT+WRI1

9 P19+CincaFatB+CnLP AAT+AtWRI1 AtDGAT1

10 P19+CincaFatB+CnLP AAT+AtWRI1 EgDGAT1

11 P19+CincaFatB+CnLP AAT+AtWRI1 EgDGAT2

12 P19+CincaFatB+CnLP AAT+AtWRI1 EgDGAT3

Los resultados de los niveles TFA y TAG, y los niveles de MCFA total en los contenidos de TFA o TAG, se muestran en la Figura 6. Comparada con AtDGAT1, la expresión de EgDGAT1 condujo a una mayor acumulación de ácidos grasos totales y niveles de TAG incrementados. El contenido de MCFA total en el contenido de ácidos graso total se redujo con la expresión de EgDGAT1 con respecto a AtDGAT1, pero los niveles de MCFA presentes en el TAG permanecieron a aproximadamente los mismos (Figura 6).

Preparación de los constructos genéticos

Los constructos genéticos para la transformación estable (Tabla 8) se ensamblaron a través de la inserción secuencial de casetes de genes a través del uso de sitios de enzima de restricción compatibles. Los cuatro constructos de genes (Tabla 8) contuvo cada uno un gen que codifica el DGAT1 de palma de aceite (EgDGAT1) expresado del promotor 35S, un gen que codifica el LPAAT deC. nucifera(CnLPAAT) expresado del promotor enTCUP2 constitutivo, y un gen que codifica untWRI1 expresado de ya sea el promotor SSU o el promotor SAG12 de más de uno o una serie de genes que codifican las enzimas FATB.

Los cinco constructos de genes también contuvieron un gen para la expresión de un ARN de horquilla para reducir la expresión de un gen endógeno que codifica la enzima activadora de acilo (AAE). La horquilla se construyó basada en la similitud de secuencia con el AAE15 identificado deArabidopsis lyrata(EFH44575.1) y el genoma deN. benthamiana.El AAE había mostrado que se implica en la reactivación de MCFA, y por consiguiente el alargamiento adicional. Se consideró que el silenciamiento de AAE podría incrementar la acumulación de MCFA. El casete de horquilla se construyó en el vector pKLANNIBAL y después se subclonó en el vector de expresión pWBVec2 (Wang y colaboradores, 2004), con la expresión de la horquilla que se condujo por el promotor 35S.

Tabla 8.Resumen de los constructos genéticos ensamblados

Estos constructos genéticos se usaron para producir plantas de tabaco transformadas de cultivares Wisconsin 38 y una línea de aceite alta transformada con el T-ADN de pJP3502. Se observó que las plantas transformadas con los constructos FATB del gen individual expresados del promotor 35S fueron significativamente más pequeños que aquellos transformados con el constructo FATB correspondiente expresado del promotor SAG12 o de los cuatro constructos de genes. El tamaño de la planta más pequeña se consideró que es provocado por una acumulación de MCFA que no se incorporó eficientemente en el TAG.

Planteamiento

El presente estudio encontró que la producción C12:0 en las células de hoja fuer solo aproximadamente 1.6% del contenido de ácido graso total después de la expresión del Umbca-TE solo (Tabla 7). La adición de un gen para la expresión de Arath-WRI tuvo un efecto mucho más potente en la acumulación de C12:0 y C14:0 en el tejido de la hoja que la adición del LPAAT de coco (Figuras 4 y 5). Esto indicó que el WRI1 en combinación con la tioesterasa incrementó en gran medida la acumulación de MCFAen las células de hoja, actuando sinérgicamente. De manera importante, muchos del C12:0, C14:0 y C16:0 se encontró que se acumulan en las hojas en el TAG, ya que el lípido no se acumula en los niveles sustanciales en las hojas de tipo silvestre. Estos experimentos mostraron que las células en las partes vegetativas de las plantas se podrían modificar para producir MCFA, particularmente C12:0 y C14:0 en TAG en niveles altos. Los niveles de C16:0 también se incrementaron sustancialmente.

Ejemplo 10. El efecto de diferentes polipéptidos de factor de transcripción en la acumulación de TAG

Los experimentos previamente reportados con WRI1 y DGAT (Vanhercke y colaboradores, 2013) usaron un en sintético que codifica AtWRI1 deA. thaliana(No. de Acceso. AAP80382.1) y un gen sintético que codifica untDGAT1, también deA. thaliana(No. de Acceso. AAF19262; SEQ ID NO: 1). Para comparar los otros polipéptidos WRI con AtWRI1 por su capacidad de combinarse con DGAT para incrementar el contenido de aceite, se identificaron otras secuencias de codificación WRI y se usaron para generar constructos para la expresión en las hojas deN. benthamiana.Las secuencias de nucleótidos que codifican los factores de transcripción WRI3 (No. de Acceso. AAM91814.1, SEQ ID NO:205) y WRI4 (No. de Acceso. NPJ78088.2, SEQ ID NO:206) deA. thaliana(To y colaboradores, 2012) se sintetizaron y se insertaron como fragmentosEcoRIen pJP3343 bajo el control del promotor 35S. Los vectores de expresión binarios resultantes se designaron pOIL027 y pOIL028, respectivamente. La secuencia de codificación para el WRI1 de avena(Avena sativa)(AsWRI1, SEQ ID NO:207) se amplificó por PCR de un vector proporcionado por Prof. Sten Stymne (Swedish University of Agricultural Sciences) usando cebadores de flanqueo que contienen sitiosEcoRIadicionales. El fragmento amplificado se insertó en el pJP3343 dando por resultado pOIL055. Una secuencia candidato WRI1 de S.bicolor(No. de Acceso. XP_002450194.1, SEQ ID NO:208) se identificó por una búsqueda BLASTp en el servidor NCBI usando la secuencia de aminoácidos WRI1 deZea mays(No. de Acceso. NP_001 137064.1, s Eq ID NO:209) como consulta. La región de codificación de proteína del gen WRI2 de S.bicolor(SbWRI1) se sintetizó y se insertó como un fragmentoEcoRIen pJP3343, produciendo pOIL056. Un gen candidato que codifica un WRI1 se identificó del transcriptoma de cebo chino(Triadica sebifera;TsWRI1, SEQ ID NO:210) (Uday y colaboradores, presentadas). La región de codificación de proteínas se sintetizó y se insertó como un fragmentoEcoRIen pJP3343 dando por resultado pOIL070. Los vectores binarios pJP3414 y pJP3352 que contienen las secuencias de codificación para la expresión de los polipéptidos WRI1 y DGAT1 deA. thalianafueron como se describe por y colaboradores (2013).

Los plásmidos que contienen las diversas secuencias de codificación WRI se introdujeron en el tejido de la hoja deN. benthamianapara la expresión transciente usando un gen que codifica la proteína supresora viral p19 en todas las inoculaciones como se describe en el Ejemplo 1. Los genes que codifican los polipéptidos WRI ya sea se sometieron a prueba solos o en combinación con el gen de DGAT1 aciltransferasa, el último proporciona mayor biosíntesis de TAG y acumulación. El control positivo en este experimento fue la combinación de los genes que codifican el factor de transcripción WRI1 deA. thalianay AtDGAT1. Todas las infiltraciones se hicieron en triplicados usando tres plantas diferentes y niveles de TAG se analizaron como se describe en el Ejemplo 1. La expresión de la mayoría de los polipéptidos WRJ individuales en la ausencia del DGAT1 exógenamente agregado dio por resultado niveles de TAG incrementados, todavía aún bajos (< 0.23% sobre una base de peso seco) en manchas de hoja infiltradas, comparadas con el control que tuvo solamente el constructo p19 (Figura 7). La excepción fue TsWRI1 que, por sí sisma, no pareció que incrementa los niveles de TAG significativamente. Además, las diferencias en los niveles de TAG producidos por la expresión de los diferentes factores de transcripción WRI no fueron mayores. Tanto WRI1 como sbWRI1 produjeron niveles de TAG similares a At WRI1 solos. Los análisis de la composición de ácidos grasos de TAG revelaron solo menores cambios excepto para los niveles de C18:1A9 incrementados de la expresión de AtWRB en los tejidos de hoja infiltrada (Tabla 9).

En contraste, las diferencias en los rendimientos de TAG de la expresión de los diferentes polipéptidos WRI fueron más pronunciadas en la co-expresión con la AtDGAT1 aciltransferasa. Esta ganancia mostró el efecto sinérgico de la co-expresión de WRI1 y DGAT y la biosíntesis de TAG en el tejido de la hoja deN. benthamianainfiltrado, como es reportado por Vanhercke y colaboradores (2013). Los niveles de TAG intermedios se observaron en la co-expresión de DGAT1 con los vectores de expresión AtWRB, AtWRI4 y TsWRI1 mientras que los niveles obtenidos con AsWRI1 y AtWRI1 fueron significativamente más bajos. En un resultado que podría no haberse predicho de antemano, los rendimientos de TAG más altos se obtuvieron con la co-expresión de DGAT con SbWRI1, aunque el ensayo se hizo en las células dicotiledóneas. El análisis de composición de ácidos grasos de TAG reveló niveles incrementados de C18:ñ9 y niveles disminuidos de C18:3ñ91215 (ALA) en el caso de SbWRII, AsWRII y el control positivo AtWRII (Tabla 9). Diferente a AtWRII, sin embargo, la expresión de AsWRII y SbWRII ambos mostraron niveles de C16:0 incrementados comparados con el control negativo p19. Interesantemente, las muestras de hoja infiltradas con AtWRD mostraron un perfil de TAG distinto con C18:1ñ9 que se enriquece mientras que el C16:0 y ALA solo se afectaron ligeramente.

Este experimento mostró que el factor de transcripción WRI1 de S.bicolor,SbWRII, fue superior a AtWRII cuando se co-expresó con DGAT para incrementar los niveles de TAG en las partes vegetativas de la planta. Los inventores también concluyeron que un factor de transcripción, por ejemplo un WRI1, de una planta monocotiledónea podría funcionar bien en una célula de planta dicotiledónea, de hecho podría aún tener actividad superior comparado con un factor de transcripción correspondiente de una planta dicotiledónea. Del mismo modo, un factor de transcripción de una planta dicotiledónea podría funcionar bien en una célula de planta monocotiledónea.

Uso de otros factores de transcripción

Se prepararon constructos genéticos para la expresión de cada uno de los 14 factores de transcripción diferentes en las células de planta para probar su capacidad para funcionar para incrementar los niveles de TAG en combinación con otros genes implicados en la biosíntesis y acumulación de TAG. Estos factores de transcripción fueron candidatos como alternativas para WRI1 o para la adición a las combinaciones que incluyen uno o más de los factores de transcripción WRI1, LEC1 y LEC2 para el uso en las células de planta, particularmente en las partes vegetativas de la planta. Su selección se basó en gran medida en su implicación reportada en la embriogénesis (revisada en Baud y Lepiniec (2010), e Ikeda y colaboradores (2006)), similar a LEC2. Los experimentos por lo tanto se llevaron a cabo para someter a ensayo su función, usando el sistema de expresiónN. benthamiana(Ejemplo 1), como sigue.

Las secuencias de nucleótidos de las regiones de codificación de proteína de los siguientes factores de transcripción se optimizaron con codón para la expresión enN. benthamianayN. tabacum,se sintetizaron y se subclonaron como fragmentosNotI-SacIen los sitios respectivos de pJP3343: FUS3 deA. thaliana(pOIL164) (Luerssen y colaboradores, 1998; Número de acceso AAC35247; SEQ ID NO: 160), LEC1L deA. thaliana(pOIL165) (Kwong y colaboradores 2003; Número de acceso AAN15924; SEQ ID NO: 157), LEC1 deA. thaliana(pOIL166) (Lotan y colaboradores, 1998; Número de acceso AAC39488; SEQ ID NO: 149), MYB73 deG. m ax(pOIL167) (Liu y colaboradores, 2014; Número de acceso ABH02868; SEQ ID NO:221), bZIP53 deA. thaliana(pOIL168) (Alonso y colaboradores, 2009; Número de acceso AAM14360; SEQ ID NO:222), AGL15 deA. thaliana(pOIL169) (Zheng y colaboradores, 2009; Número de acceso NPJ96883; SEQ ID NO:223), MYB118 def\. thaliana(Número de acceso AAS58517; pOIL170; SEQ ID NO:224), MYB115 (Wang y colaboradores, 2002; Número de acceso AAS10103; pOIL171; SEQ ID NO:225), TANMEI deA. thaliana(pOIL172) (Yamagishi y colaboradores, 2005; Número de acceso BAE44475; SEQ ID NO:226), WUS deA. thaliana(pOIL173) (Laux y colaboradores, 1996; Número de acceso NP_565429; SEQ ID NO:227), BBM deA. thaliana(pOIL174) (Boutilier y colaboradores, 2002; Número de acceso AAM33893, SEQ ID NO: 145), GFR2al deB. napus(Número de acceso AFB74090; pOIL177; SEQ ID NO:228) y GFR2a2 (Número de acceso AFB74089; pOIL178; SEQ ID NO:229) (Liu y colaboradores (2012c)). Además, una versión optimizada con codón del factor de transcripción PHR1 deA. thalianaimplicado en la adaptación a las condiciones de inanición de fosfato alto-ligero se subclonó similarmente en pJP3343 (pOIL189) (Nilsson y colaboradores (2012); Número de acceso AAN72198; SEQ ID NO:230). Estos factores de transcripción se resumen en la Tabla 10.

Como un ensayo de clasificación para determinar la función de estos factores de transcripción, los constructos genéticos se introdujeron en las células de la hoja deN. benthamianacomo se describe en el Ejemplo 1, ya sea con o sin un gen que codifica DGAT1, u otras combinaciones de genes tal como WRI1, LEC2, hpSDp1 o FATA tioesterasa de codificación, y el contenido de lípido total y la composición de ácidos grasos de las células de la hoja se midieron. Los factores de transcripción que incrementaron los contenidos de lípidos totales se identificaron y se lesionaron significativamente.

Para la transformación estable de las plantas usando genes que codifican los factores de transcripción alternativos, se produjeron los siguientes constructos binarios. Los genes para la expresión de los factores de transcripción usan ya sea el promotor SSU o el promotor SAG12. La sobreexpresión de los factores de transcripción embriónicos tales como LEC1 y LEC2 han mostrado que inducen una variedad de efectos pleotrópicos, indeseables en el presente contexto, incluyendo la embriogénesis somática (Feeney y colaboradores (2012); Santos-Mendoza y colaboradores (2005); Stone y colaboradores (2008); Stone y colaboradores (2001); Shen y colaboradores (2010)). Para minimizar el posible impacto negativo en el desarrollo de la planta y el rendimiento de la biomasa, se prefieren los promotores específicos de tejido o de etapa de desarrollo sobre los promotores constitutivos para conducir la expresión ectópica de los reguladores principales de la embriogénesis.

Tabla 10. Factores de transcripción adicionales y los constructos genéticos para su expresión

Ejemplo 11. Silenciamiento de una TAG lipasa en las plantas que acumulan altos niveles de TAG en el tejido de la hoja

La TAG lipasa dependiente de azúcar 1 (SDP1) ha mostrado que desempeña una función en el cambio de TAG en los tejidos no de semilla de unaA. thalianaasí como durante la germinación de la semilla (Eastmond y colaboradores, 2006; Kelly y colaboradores, 2011; Kelly y colaboradores, 2013). El SDP1 se expresa en la semilla en desarrollo y el polipéptido SDP1 también está presente en la semilla madura en asociación con los cuerpos de aceite (pero no de recubrimiento). El silenciamiento del gen que codifica SDP1 dio por resultado un incremento pequeño pero significativo en los niveles de TAG en las raíces y tallos deA. thaliana(< 0.4% sobre una base de peso seco) mientras que se observó un incremento aún más pequeño en el tejido de la hoja (Kelly y colaboradores, 2013).

Para determinar si los niveles de TAG se podrían incrementar adicionalmente en los tejidos de la hoja y tallo con respecto a la co-expresión de AtWRI1 y AtDGAT1, se diseñó un experimento para silenciar un gen SDP1 endógenos en las plantas deN. tabacum,que fueron homocigotas para un T-ADN que tiene genes para la expresión transgénica de los polipéptidos WRI, DGAT1 y Oleosina (Vanhercke y colaboradores, 2014). Una búsqueda BLAST del transcriptoma deN. benthamiana(Nairn y colaboradores, 2012) usando la secuencia de nucleótidos AtSDP1 como consulta identificó un transcripto (Nbv5tr6385200, SEQ ID NO: 173) con homología para el gen SDP1 deA. thaliana.Una región 713pb (SEQ ID NO: 174) se seleccionó para el silenciamiento del gen mediado por horquilla. Se diseñó un fragmento sintético 3.903kb, basado en el vector pHELLSGATE12, que comprendió, en orden, el promotor constitutivo enTCUP2the el fragmento SDP1 deN. benthamiana713pb en la orientación de sentido flanqueado por los sitiosattBIyattB2,un intrón Pdk, una secuencia de intrones cat en la orientación inversa, un segundo fragmento SDP1 deN. benthamiana713pb flanqueado por los sitiosattBIyattB2en la orientación inversa (antisentido), y el sitio terminador/poliadenilación de región 3' OCS (Figura 8). El inserto se subclonó en pJP3303 usando los sitios de restricción SmaI yKasIy el vector de expresión resultante se designó pOIL051. Este ADN quimérico contiene un gen marcador seleccionable de resistencia a la higromicina.

El pOIL051 se usó para producir plantas deN. tabacumtransformadas por la transformación mediada porAgrobacterium.Las células de planta de partida fueron de plantas transgénicas que fueron homocigotas para el T-ADN de pJP3502 (Vanhercke y colaboradores, 2014). Las plantas transgénicas que contienen el T-ADN de pOIL051 se seleccionaron por resistencia a la higromicina y se transfirieron al suelo en el invernadero o en un gabinete de ambiente controlado para el crecimiento continuado. Las muestras de la hoja se recolectaron de los transformantes dobles confirmados (plantas T0) antes del florecimiento, en el florecimiento y en las etapas de establecimiento de la semilla del desarrollo de la planta, y el nivel de TAG en cada uno se determinó. Las plantas transgénicas que contienen solo bajos niveles de TAG de hoja, o TAG del mismo nivel como los controles, se identificaron por medio de la extracción de lípidos de las muestras de la hoja y el análisis por el TLC de mancha y se eliminaron. Los niveles de TAG en la población restante de los transformantes se identificaron por GC como se describe en el Ejemplo 1. Antes del florecimiento, la mayoría de estas plantas mostraron niveles de TAG en gran medida incrementados (> 5% de peso seco de la hoja) en su tejido de la hoja mientras que 4 plantas contuvieron niveles de TAG por arriba de 10% (Tabla 11). El nivel de TAG máximo observado en las hojas de estas plantas, antes del florecimiento, fue 11.3% en la planta 51-13. Como una comparación, las plantas transgénicas de la línea deN. tabacumparenteral que expresan AtWRI1, AtDGAT1 y Oleosina mostraron niveles de TAG de aproximadamente 2% antes del florecimiento y aproximadamente 6% durante el florecimiento (Vanhercke y colaboradores, 2014). La adición del constructo inhibidor de SDP1 a la combinación de AtWRI1 más AtDGAT1 por lo tanto fue sinérgico para el incremento de los niveles en estas plantas. Sorprendentemente, el contenido de TAG en las hojas recolectadas de las plantas doblemente transformadas en la etapa de florecimiento se incrementó en gran medida, observando 30.5% sobre una base de peso seco (Tabla 12), representando un incremento de 5 veces con respecto a las plantas no silenciadas para SDP1. Para gran sorpresa de los inventores, el nivel de TAG alcanzó un 70.7% sorprendente (% de peso seco) en las muestras de hojas de senescencia (verde y amarillas) en la etapa de establecimiento de la semilla (Tabla 13). Cuando la NMR se usó para medir el contenido de aceite de las hojas enteras de la planta de tabaco en la etapa de establecimiento de la semilla, el contenido de TAG en algunas hojas verdes que habían comenzado a envejecer fue de aproximadamente 43% y en algunas hojas desecadas, cafés fue 42%. Cuando tales hojas se prensaron entre dos filtros de papel café, el aceite exudado se empapó en el papel y se hizo translucido, mientras que las hojas de tabaco de control no lo hicieron, proporcionando un método de clasificación simple para detectar las plantas que tienen un alto contenido de aceite.

Dos transformantes primarios (#61, #69) que contienen cada uno los T-ADNs de pJP3502 y pOIL51 y que muestran niveles de TAG altos se analizaron por PCR digital (ddPCR) usando un par de cebadores específicos de genes de higromicina para determinar el número de inserciones de pOIL51 T-ADN. La planta designada #61 contuvo una inserción de T-ADN de pOIL51, mientras que la planta #69 contuvo tres inserciones de T-ADN de pOIL51. Las plantas de la progenie T1 de ambas líneas se clasificaron nuevamente por ddPCR para identificar las plantas homocigotas, heterocigotas y nulas. Las plantas de la progenie de la planta #61 que no contienen inserciones de pOIL51 (nulas; total de 7) o 2 inserciones T-ADN (es decir homocigotas para ese T-ADN; total de 12) se seleccionaron para análisis adicional. similarmente, las plantas de la progenie de la línea #69 que contienen inserciones de T-ADN cero de pOIL51 (nulas; total de 2) o 2 de las inserciones (total de 15) o 4 o 5 inserciones (total de 5) se mantuvieron par análisis adicional.

Tabla 11. Niveles de TAG (% de peso seco de la hoja) y composición de ácido graso de TAG en el tejido de la hoja de plantasN. tabacum(generación T0) que expresan los transgenesWRI1, DGAT1 y Oleosinay supertransformadas con un T-ADN que codifica un constructo de horquilla SDP1 (pOIL05), comparado con el tipo silvestre (no transformado). Las muestras de hoja se recolectaron durante la etapa vegetativa (antes del florecimiento). Las muestras de lípidos también contuvieron 0.0-0.2% de C16:3, 0.0-0.4% de C20:1; 0.0-0.1% de C20:2n-6.

C14:0 C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:1d11 C18:2 C18:3n3 C20:0 C22:0

2.5 20.2 0.0 8.6 5.6 0.0 18.9 44.2 0.0 0.0

0.0 66.0 0.0 0.0 34.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0

0.0 36.1 1.4 5.1 21.0 0.8 23.3 7.1 2.4 1.5

0.1 47.2 0.3 5.4 19.2 1.9 0.0 21.2 2.1 1.2

0.2 30.8 1.9 4.9 41.2 1.0 13.7 2.4 1.9 1.1

0.1 31.4 0.2 3.8 12.2 1.6 33.6 13.2 1.7 1.0

0.1 31.9 0.3 3.9 10.7 1.5 32.3 15.2 1.9 1.1

0.2 34.1 0.7 4.9 29.4 0.9 17.5 5.7 2.9 1.8

0.1 34.4 0.2 4.3 14.3 1.5 29.7 11.8 1.7 1.0

0.1 35.8 0.2 4.3 12.8 1.5 29.8 11.7 1.8 1.0

0.1 37.2 0.1 3.9 8.6 1.7 29.3 16.0 1.5 0.8

0.1 35.2 0.1 3.9 13.9 1.7 28.5 13.6 1.4 0.7

0.1 34.4 0.2 3.9 15.4 1.8 27.6 13.2 1.6 0.9

0.1 26.9 0.2 3.8 19.2 1.5 35.7 9.1 1.7 0.8

0.2 31.7 0.2 3.6 15.9 1.7 30.5 12.8 1.6 0.9

0.1 31.4 0.2 3.5 13.5 1.7 32.7 13.7 1.5 0.8

0.1 30.5 0.2 3.7 14.9 1.6 31.7 13.7 1.7 0.9

0.1 30.4 0.2 3.7 21.3 2.2 31.2 7.4 1.6 0.8

0.1 37.5 0.2 4.4 10.5 1.7 31.9 10.6 1.5 0.7

0.1 34.2 0.2 3.9 11.9 1.7 32.6 12.5 1.4 0.6

0.1 30.6 0.2 4.5 17.3 1.8 32.7 9.2 1.7 0.9

0.1 31.6 0.2 3.9 18.2 1.8 30.4 10.5 1.6 0.8

0.1 26.8 0.2 4.2 20.0 1.5 34.3 8.7 1.9 1.0

0.1 28.5 0.2 3.8 18.6 1.6 34.1 9.6 1.7 0.9

0.1 28.1 0.2 3.4 16.8 1.8 35.5 10.6 1.6 0.8

0.1 26.3 0.2 3.5 25.5 1.8 31.0 8.9 1.3 0.6

0.1 30.9 0.2 4.0 15.7 1.7 31.7 12.9 1.5 0.7

0.1 31.0 0.2 4.0 16.4 1.6 34.1 9.5 1.5 0.7

0.1 33.3 0.1 3.8 11.7 1.6 31.4 14.8 1.5 0.8

0.1 33.1 0.1 3.8 18.2 1.9 29.8 10.4 1.3 0.6

0.1 29.4 0.2 3.7 18.4 1.7 32.8 10.9 1.4 0.6

0.1 29.0 2.0 3.6 17.1 1.6 33.8 9.9 1.4 0.7

0.1 30.5 0.1 4.2 20.3 1.5 31.9 8.3 1.5 0.7

0.1 30.7 2.6 3.4 15.8 1.9 31.2 11.6 1.3 0.7

0.1 24.8 0.1 3.6 28.8 1.6 30.3 7.9 1.3 0.6

0.1 33.1 0.1 3.8 16.5 1.7 30.4 11.4 1.4 0.7

0.1 25.4 2.2 3.3 23.8 1.6 32.7 8.3 1.3 0.6Tabla 12. Niveles de TAG (% de peso seco de la hoja) y la composición TAG en el tejido de la hoja de plantasN. tabacum(generación T0) que expresan los transgenesWRI1, DGAT1 y Oleosinay supertransformados con un T-ADN que codifica un constructo de horquilla SDP1 (pOIL05). Las muestras de hoja se recolectaron durante el florecimiento.

Línea C14:0 C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:1 C18:2 C18:3n3 C20:0 C22:0 C24:0 %TAG d11

Tipo0.2 14.8 0.6 8.5 9.2 0.3 20.0 44.5 0.6 0.3 0.40.3 silvestre

210.1 25.7 2.1 3.7 21.2 1.0 31.0 11.7 1.5 0.8 0.68.8 560.1 33.2 1.4 4.9 20.7 1.0 26.3 7.4 2.1 1.3 0.99.2 650.1 24.7 1.5 3.8 28.5 1.0 29.0 7.5 1.7 0.9 0.612.0 420.1 34.0 1.5 4.4 16.8 1.1 29.4 7.6 2.2 1.4 1.113.1 280.1 29.5 2.4 3.5 16.4 1.2 28.7 14.6 1.5 1.0 0.613.2 300.1 19.1 1.9 3.3 31.8 1.0 30.6 9.3 1.3 0.7 0.413.6 200.1 22.4 1.8 3.7 27.4 0.9 29.0 10.8 1.7 0.9 0.714.6 190.1 20.9 1.7 3.1 28.4 1.0 31.6 10.0 1.4 0.8 0.515.7 120.1 24.4 1.6 3.6 22.1 0.9 35.1 8.9 1.4 0.8 0.515.8 160.1 21.5 1.8 3.4 34.9 1.0 26.2 7.9 1.4 0.7 0.516.4 570.1 25.0 1.7 4.1 27.7 1.0 28.4 8.4 1.6 0.9 0.617.2 260.1 22.5 1.6 3.5 28.4 1.1 31.2 7.6 1.7 1.0 0.718.0 390.1 30.0 2.2 3.7 22.7 1.6 24.3 11.6 1.5 0.9 0.718.1 700.1 22.1 2.1 3.6 36.3 1.0 24.2 7.2 1.4 0.7 0.518.3 450.1 21.4 1.8 3.7 34.4 1.0 27.5 6.9 1.4 0.8 0.519.1 320.1 23.3 1.6 3.2 24.4 1.1 33.6 9.0 1.5 0.9 0.619.5 180.1 23.4 2.1 3.3 26.4 0.9 30.2 10.3 1.4 0.7 0.520.6 20Y0.1 22.3 1.6 3.6 30.3 0.9 28.5 9.1 1.6 0.9 0.620.8 430.1 28.1 2.0 3.5 21.5 1.2 29.9 10.2 1.5 0.9 0.621.2 40.1 27.9 1.9 3.7 26.3 1.2 26.2 9.3 1.5 0.8 0.521.8 10.1 23.8 2.0 3.7 30.2 1.1 28.1 8.0 1.4 0.7 0.522.3 610.1 24.2 2.2 4.0 32.0 1.1 25.2 7.8 1.5 0.8 0.623.9 600.1 24.4 2.2 3.7 31.0 1.1 25.4 8.6 1.5 0.8 0.625.0 460.1 23.3 2.0 3.7 32.9 1.0 24.0 9.2 1.6 0.9 0.725.7 60.1 31.5 2.6 3.5 19.5 1.6 25.5 12.7 1.3 0.7 0.526.3 130.1 21.8 1.9 3.6 35.1 1.0 25.1 8.1 1.5 0.8 0.526.8 690.1 21.8 1.6 4.3 33.4 0.8 26.9 7.6 1.7 0.8 0.526.9 530.1 27.1 2.1 3.5 24.1 1.2 29.4 9.2 1.4 0.8 0.529.2 480.1 29.5 2.5 3.9 21.1 1.3 29.0 9.2 1.6 0.8 0.629.5 470.1 30.9 2.5 3.4 19.4 1.5 28.5 10.6 1.3 0.8 0.530.5Tabla 13. Niveles de TAG (% de peso seco de la hoja) y la composición TAG en el tejido de la hoja de plantasN. tabacum(generación T0) que expresan los transgenesWRI1, DGAT1 y Oleosinay supertransformados con un T-ADN que codifica un constructo de horquilla SDP1 (pOIL05). Las muestras de hoja se recolectaron en la etapa de establecimiento de la semilla. Y=hoja amarilla, G=hoja verde.

Muestr C1 C1 C1 16 C1 C1 C18: C1 C18: C2 C20: C2 C2 Contenido de TAG (% a 4:0 6:0 6:1 :3 8:0 8:1 1d11 8:2 3n3 0:0 1d11 2:0 4:0 de peso seco) Tipo0.0 13. 0.0 0. 8.4 7.0 0.0 24. 46.8 0.0 0.0 0.0 0.00.3

silvestr0 0 7

e

730.0 26. 1.7 0. 8.5 9.4 0.0 27. 25.6 1.1 0.0 0.0 0.00.6

6 0 0

180.1 15. 1.8 0. 4.8 14. 0.4 43. 16.3 1.7 0.4 0.7 0.53.3

0 0 4 9

410.1 22. 1.2 0. 4.4 24. 0.6 32. 10.8 1.7 0.3 0.8 0.55.2

3 3 0 8

190.1 14. 1.5 0. 3.0 21. 0.7 44. 10.6 1.4 0.4 0.7 0.47.2

5 3 6 8

200.1 26. 2.4 0. 4.3 24. 1.0 25. 11.3 1.9 0.3 1.0 0.89.6

7 1 9 2

300.1 18. 1.5 0. 3.5 24. 0.7 38. 8.9 1.4 0.3 0.7 0.49.9

6 3 8 9

650.1 22. 1.4 0. 3.5 30. 0.7 29. 8.1 1.7 0.3 1.0 0.611.3

2 3 9 1

420.1 23. 1.5 0. 4.1 29. 0.9 30. 5.9 2.0 0.4 1.3 0.812.0

6 2 0 3

320.1 21. 1.3 0. 3.3 21. 0.9 40. 7.1 1.7 0.3 1.0 0.613.7

3 3 4 7

390.1 25. 1.7 0. 3.6 27. 1.2 27. 8.2 2.0 0.4 1.4 0.914.0

8 3 2 2

450.1 23. 1.5 0. 3.8 28. 0.9 32. 6.3 1.8 0.3 1.0 0.614.4

0 1 0 6

130.1 26. 2.8 0. 3.7 32. 1.1 21. 7.6 1.6 0.3 0.8 0.714.6

9 1 6 6

R450.1 23. 1.5 0. 4.1 27. 0.9 32. 6.1 1.8 0.3 1.0 0.614.6

4 2 8 2

210.1 23. 1.6 0. 3.5 27. 0.8 31. 8.2 1.8 0.3 1.1 0.715.0

1 2 4 2

90.1 23. 1.4 0. 3.5 23. 0.8 35. 8.5 1.6 0.3 0.9 0.515.4

2 2 3 6

120.1 24. 1.4 0. 3.4 22. 0.8 36. 7.4 1.7 0.3 1.1 0.715.9

5 2 3 2

40.1 21. 1.8 0. 3.6 22. 0.9 35. 9.5 1.6 0.3 0.9 0.616.1

9 2 8 9

490.1 23. 1.4 0. 4.0 25. 0.8 34. 6.6 1.8 0.3 1.1 0.716.8

5 2 3 3

260.1 22. 1.3 0. 3.8 25. 0.8 35. 6.5 2.1 0.3 1.3 0.817.2

2 2 4 2

160.1 22. 1.8 0. 3.4 29. 0.8 30. 8.1 1.5 0.3 0.9 0.618.2

2 3 9 1

10.1 27. 2.7 0. 4.0 32. 1.2 22. 6.3 1.6 0.3 0.8 0.718.7

4 1 0 9

700.1 27. 2.7 0. 3.7 32. 1.0 21. 7.6 1.6 0.3 0.8 0.719.0

1 2 6 5

60.1 30. 2.6 0. 3.3 13. 1.4 32. 12.9 1.4 0.2 0.9 0.621.5

6 2 0 8

470.1 28. 2.1 0. 3.6 18. 1.3 33. 9.9 1.5 0.2 0.9 0.521.6

0 2 5 2

690.1 25. 2.3 0. 4.3 32. 0.9 23. 7.4 1.8 0.3 0.8 0.622.5

4 1 4 5

530.1 23. 2.1 0. 3.4 28. 1.1 30. 7.6 1.5 0.3 0.9 0.523.2

9 2 2 2

460.1 25. 2.7 0. 3.7 32. 1.1 22. 8.2 1.6 0.3 0.8 0.724.0

9 2 0 8

430.1 23. 1.6 0. 3.1 22. 0.9 37. 7.4 1.4 0.2 0.8 0.524.0

7 2 6 6

480.1 27. 2.2 0. 4.1 23. 1.1 31. 6.9 1.9 0.3 1.0 0.724.4

4 1 0 3

280.1 23. 1.4 0. 3.3 24. 1.0 35. 7.3 1.6 0.3 0.9 0.626.6

0 2 8 6

1Y 0.1 24. 2.5 0. 3.8 35. 1.1 22. 6.7 1.6 0.3 0.7 0.628.1

3 1 7 6

56G 0.1 25. 1.8 0. 3.7 26. 0.9 29. 7.3 1.8 0.3 1.1 0.733.9

5 2 7 8

57 0.1 25. 1.9 0. 3.2 20. 1.0 35. 10.0 1.5 0.3 0.9 0.635.4

1 2 1 2

56Y 0.2 24. 1.4 0. 4.1 27. 0.8 31. 6.0 2.0 0.4 1.2 0.839.6

8 2 2 0

69Y 0.1 24. 2.1 0. 4.1 32. 0.8 24. 7.8 1.9 0.3 0.9 0.746.5

7 2 0 3

R69Y 0.1 24. 2.1 0. 4.1 32. 0.8 24. 7.9 1.9 0.3 0.9 0.746.8

7 2 0 4

61 0.1 26. 2.7 0. 3.6 31. 1.1 23. 7.4 1.4 0.3 0.7 0.549.2

6 1 6 8

61Y 0.1 25. 2.4 0. 3.7 32. 1.1 24. 6.9 1.5 0.3 0.7 0.558.1

8 1 4 3

60 0.1 24. 2.4 0. 3.6 34. 1.0 24. 6.4 1.5 0.3 0.7 0.570.7

6 2 1 4

Las plantas T1 seleccionadas se desarrollaron en el invernadero al mismo tiempo y bajo las mismas condiciones como las plantas de control. Las muestras de tejido de hoja verde de las plantas T1 antes del florecimiento se secaron y el ácido graso total (TFA) y los contenidos de TAG se determinaron por el análisis GC. Los contenidos de TFA de las plantas que contienen tanto T-ADNs variaron de 4.6% a 16.1% sobre una base de peso seco incluyendo los niveles de TAG en las mismas hojas de 1.2% a 11.8% sobre una base de peso seco (Figura 9). Esto fue mucho mayor comparado con las plantas que contienen solo el T-ADN de pJP3502 y que se desarrollan juntas bajo las mismas condiciones y se analizaron en la misma etapa de crecimiento, nuevamente mostrando el sinergismo entre la actividad de la TAG lipasa reductora y la combinación de WRI1 más DGAT. Las plantas que contienen solo el pJP3502 T-ADN contuvieron entre 4.2% y 6.8% de TFA incluyendo los niveles de TAG de 1.4% a 4.1% sobre una base de peso seco (Figura 9). Las plantas de tipo silvestre contuvieron, en promedio, aproximadamente 0.8% de TFA incluyendo menor que 0.5% de TAG sobre una base de peso seco. La composición de ácido graso en el contenido de ácido graso total y el contenido de TAG de las hojas de cada una de las líneas #61 y #69 fueron similares a la composición en las hojas que contienen solo el T-ADN de pJP3502 (precursor). Comparadas con las hojas de control de tipo silvestre, las plantas que contienen ambos de los T-ADNs de pOIL51 y pJP3502 mostraron niveles incrementados de ácidos grasos C16:0, C18:1 y C18:2. Este cambio significativo en la composición de ácidos grasos provino en gran medida a expensa de C18:3 que se redujo de aproximadamente 50-55% a aproximadamente 20-30% como un porcentaje del contenido de ácidos grasos total.

El incremento sustancial en los niveles de TFA incluyendo los niveles de TAG entre las plantas que contienen solo el pJP3502 T-ADN y las plantas que contienen el T-ADNs de tanto pOIL51 como pJP3502 se mantuvo por todo el desarrollo de la planta. Las plantas de control que contienen solo el T-ADN de pJP3502 contuvieron 7.7% a 17.5% de TAG durante el florecimiento mientras que los niveles de TAG variaron de 14.1% a 20.7% sobre una base de peso seco durante el establecimiento de la semilla. El contenido de TAG en las hojas de las plantas que contienen tanto pJP3502 como pOIL51 T-ADNs variaron entre 6.3% y 23.3% durante el florecimiento y 12.6% y 33.6%o durante el establecimiento de la semilla. Se detectaron cambios similares en la composición de ácidos grasos de la fracción rasos de la fracción de TAG en ambas etapas como se describe en lo anterior para la etapa de crecimiento vegetativo.

Para los niveles de TAG también se encontró que se incrementaron adicionalmente en otros tejidos vegetativos de las plantas transgénicas tales como raíces y tallo. Algunos tejidos de la raíz de las plantasN. tabacumtransgénicas transformadas con el T-ADN de pOIL051 contuvieron 4.4% de t Ag , y en algunos tejidos de tallo de 7.4% de TAG, sobre una base de peso seco (Figura 10). Las plantas de tipo silvestre yN. tabacumque contienen solo el T-ADN de pJP3502 mostraron niveles de TAG mucho más bajos en ambos tejidos. La adición del constructo de SDP1 de horquilla para disminuir la expresión de la TAG lipasa endógena fue claramente sinérgica con los genes que codifican el factor de transcripción y la biosíntesis de TAG (WRI1 y DGAT) para incrementar el contenido de TAG en los tallos y raíces. Cabe destacar, que los niveles de TAG en las raíces fueron más bajos comparados con el tejido de tallo dentro de la misma planta mientras que se observó una tendencia inversa en las plantas de tipo silvestre yN. tabacumque contienen solo el T-ADN de pJP3502. La composición de TAG de los tejidos de la raíz y tallo mostraron cambios similares en los ácidos grasos C18:1 y C18:3 como se observó previamente en el tejido de hoja transgénica. Los niveles de C18:2 en el TAG se redujeron en el tejido del tallo transgénico mientras que los ácidos grasos C16 se redujeron típicamente en los tejidos de la raíz transgénica cuando se compararon con el control de tipo silvestre.

Por lo tanto, los inventores concluyeron que la adición de un gen exógeno para silenciar el gen SDP1 endógeno a la combinación de WRI1 y DGAT incrementó el contenido de ácidos grasos total, incluyendo el contenido de TAG, en todas las etapas del crecimiento de la planta, y actuó sinérgicamente con WRI1 y DGAT, particularmente en los tallos y raíces. Las semillas T1 de las plantas transgénicas se colocaron en placas en un medio de cultivo del tejidoin vitro atemperatura ambiente para probar el grado y tiempo de germinación. La germinación de la semilla T1 de tres líneas independientemente transformadas fue la misma comparada con la semilla de las plantas transgénicas transformadas con el T-ADN de pJP3502. Adicionalmente, el vigor de la plántula temprana pareció que estuvo sin efecto. Esto fue sorprendente dado que la función de SDP1 en la germinación en las semillas deA. thalianay los defectos observados en la germinación en los mutantes SDP1 (Eastmond y colaboradores, 2006). Para superara cualquiera de los defectos de germinación sí tales se hubieran presentado, se diseñó un segundo constructo en el cual el<a>R<n>inhibidor de SDP1 se expresa de un promotor que no se expresa esencialmente, o en niveles bajos, en la semilla, tal como por ejemplo un promotor de un gen fotosintético tal como SSU. Los inventores consideraron que es beneficioso reducir el riesgo de los efectos perjudiciales en la germinación de la semilla o el vigor de la plántula temprano para evitar un promotor constitutivo, o al menos evitar un promotor expresado en las semillas, para conducir la expresión del ARN inhibidor de SDP1.

Se observó que las plantas T0 con los niveles de TAG más altos se habían desarrollado bajo condiciones de luz altas en la habitación de ambiente controlado (500 micro moles de intensidad de luz, ciclo de luz de 16 horas/26°C-de oscuridad de 8 horas/18°C de día) y parecieron más pequeños (aproximadamente 70% en altura con respecto a las plantas transformadas con el T-ADN de pJP3502) que las plantas de control de tipo silvestre. Los inventores concluyeron que la combinación de los transgenes y/o modificaciones genéticas para los procedimientos “de empuje”, “de extracción”, “de protección” y “empaque” fueron particularmente favorables para lograr altos niveles de TAG en las partes vegetativas de la planta. En este ejemplo, el WRI1 proporcionó el “empuje”, el DGAT proporcionó el “extracción”, el silenciamiento de SFP1 proporcionó la “protección” y la Oleosina proporcionó el “empacado” de TAG.

Ejemplo 12. Expresión específica de senescencia de un factor de transcripción

La expresión ectópica de reguladores principales del desarrollo de embriones y semillas tal como LEC2 se habían reportado para incrementar los niveles de TAG en los tejidos no de semilla (Santos-Mendoza y colaboradores, 2005; Slocombe y colaboradores, 2009; Andrianov y colaboradores, 2010). Sin embargo, la sobreexpresión constitutiva de LEC2 en las plantas transformadas con el gen 35S-LEC2 dio por resultado efectos pleiotrópicos indeseados en el desarrollo y morfología de la planta incluyendo embriogénesis somática y de estructuras de la hoja normales (Stone y colaboradores, 2001; Santos-Mendoza y colaboradores, 2005). Para probar si la expresión de LEC2 limitante a la etapa de senescencia de la hoja del desarrollo de la planta, es decir después de que las plantas se habían desarrollado completamente y habían alcanzado su biomasa completa, minimizarían los efectos fenotípicos indeseables pero aun incrementarían los niveles de lípidos en las hojas, un ADN quimérico se diseñó y se preparó para la expresión de LEC2 bajo el control de un promotor específico de senescencia deA. thalianadel gen Sa g 12 (U37336; Gan y Amasino, 1995).

Para producir el constructo genético, se preparó un fragmento de ADN sintético 3.635kb que comprende, en orden, un promotor específico de senescencia SAG12 deA. thaliana,la secuencia de codificación de proteína LEC2 y una región terminadora/poliadenilación del gen de Lectina deGlycine max.Este fragmento se insertó entre los sitios de restricción SacI yNotIde pJP3303. Este constructo de designó pOIL049 y se sometió a prueba en las hojas de las plantas deN. tabacumque se transformaron establemente con los genes que codifican los polipéptidos WRI1, DGAT1 y Oleosina, que contienen el T-ADN de pJP3502. Usando los métodos de transformación mediados porAgrobacterium,el constructo pOIL049 se usó para transformar células de planta deN. tabacumque fueron homocigotas para el T-ADN de pJP3502 (Ejemplo 3). Las plantas transgénicas que comprenden los genes de pOIL049 se seleccionaron por resistencia a la higromicina y se desarrollaron a madurez en el invernadero. Las muestras se tomaron de tejido de hoja transgénica en diferentes etapas del crecimiento incluyendo una senescencia de hoja y contienen niveles de TAG incrementados comparados con la línea precursora pJP3502 deN. tabacum.

Un total de 149 plantas T0 independientes (es decir transformantes primarios) se obtuvieron. Las hojas verdes superiores de todas las plantas y las hojas completamente envejecidas, cafés inferiores de los eventos seleccionados se muestrearon en la etapa de establecimiento de la semilla del desarrollo de la planta y los contenidos de TAG se cuantificaron por TLC-Gc . El número de inserciones de pOIL49 T-ADN en las plantas seleccionadas se determinó por ddPCR usando un par de cebadores específicos de genes de higromicina. Un nivel de TAG de 30.2% sobre una base de peso seco se observó en el tejido de la hoja verde recolectada en la etapa de establecimiento de la semilla. Los niveles de TAG en las hojas cafés fueron más bajos en la mayoría de las plantas muestreadas. Sin embargo, tres plantas (#32b, #8b y #23c) mostraron mayores niveles de TAG en el tejido de la hoja envejecida café que en las hojas en expansión verdes. Las plantas contuvieron 1, 2 o 3 inserciones de T-ADN de pOIL49.

La progenie T1 de las plantas #23c y #32b se clasificó por ddPCR para identificar las plantas nulas, heterocigotas y homocigotas para el T-ADN de pOIL049. Las plantas de la progenie de la planta #23c que contienen cero inserciones de T-ADN de pOIL049 (nulas; total de 7) o dos inserciones de T-ADN del T-ADN de pOIL049 (homocigotas; total de 4) se seleccionaron para análisis adicional. Similarmente, las plantas de la progenie de la planta #32b que contiene cero inserciones (nulas; total de 6) o dos inserciones (homocigotas; total de 9) se mantuvieron para análisis adicional. El tejido de la hoja verde se muestreo antes del florecimiento y los contenidos de TFA y TAG se determinaron por GC. Las plantas de tipo silvestre y las plantas transformadas con T-ADN de pJP3502 fueron las mismas como en lo anterior (Ejemplo 11) y se desarrollaron juntos en el mismo invernadero. Los niveles de TFA en los niveles de los transformantes que contienen el T-ADN de pOIL049 variaron de 5.2% a 19.5% sobre una base de peso seco antes del florecimiento (Figura 12). Los niveles de TAG en los mismos tejidos variaron de 0.8% a 15.4% sobre una base de peso seco. Esto fue considerablemente mayor que en las plantas que contienen solo el T-ADN de pJP3502. Los niveles de TAG en las plantas que contienen los T-ADNs de pJP3502 y pOIL049 se incrementó adicionalmente a 38.5% y 34.9% durante el florecimiento y el establecimiento de la semilla, respectivamente. Cuando la composición de ácidos grasos del contenido de ácidos grasos total se analizó para las hojas homocigotas para el T-ADN de pOIL049, los niveles incrementados de C18:2 y los niveles reducidos de C18:3 se observaron (Figura 12) mientras que los porcentajes de C16:0 y C18:1 permanecieron a aproximadamente lo mismo con respecto a las hojas transformadas solo con el T-ADN de pJP3502. Estos datos mostraron que la adición de un segundo gen del factor de transcripción bajo el control de un promotor no constitutivo que proporciona la expresión desarrolladamente regulada fue capaz de incrementar adicionalmente los niveles de TAG en los tejidos vegetativos de una planta. Los datos también indicaron que el promotor específico de senescencia SAG12 tuvo alguna expresión en el tejido verde antes de la senescencia de las hojas.

Los niveles de TAG se incrementaron demasiado en el tejido del tallo cuando se compararon con tanto las plantas deN. tabacumde tipo silvestre como las plantas transgénicas que contienen el T-ADN de pJP3502 solo. Algunos tejidos del tallo de las plantasN. tabacumtransgénicas transformadas con el T-ADN de pOIL049 contuvieron 4.9% de TAG sobre una base de peso seco (Figura 11). Por otra parte, los niveles de TAG en el tejido de la raíz mostraron una gran variación entre las tres plantas de pOIL049 con algún tejido de raíz que contiene 3.4% de TAG. Cabe destacar, que los niveles de TAG en las raíces fueron menores comparados con el tejido del tallo dentro de la misma planta mientras que se observó una tendencia inversa en las plantas de tipo silvestre y elN. tabacumque contiene solo el T-ADN de pJP3502. La composición de TAG de los tejidos de la raíz y tallo mostraron cambios similares en los ácidos grasos C18:1 y C18:3 como es observado previamente en el tejido de la hoja transgénica. Los niveles de C18:2 en el TAG se redujeron en el tejido del tallo transgénico mientras que los ácidos grasos C16 se redujeron típicamente en los tejidos de la raíz transgénica cuando se compararon con el control de tipo silvestre.

Los constructos genéticos correspondientes se prepararon codificando otros factores de transcripción bajo el control del promotor SAG12 particularmente, LEC1, LEC1like, FUS3, ABI3, ABI4 y ABI5 y otros (Ejemplo 10). Por ejemplo, los constructos adicionales se prepararon para la expresión del LEC1 deZea maysde factor de transcripción monocotiledóneo (Shen y colaboradores, 2010) o LEC1 deSorghum bicolor(No. de Acceso de Genbank XM_002452582.1) bajo el control del homologo derivado de monocotiledónea del promotor SAG12 deA. thalianatal como el promotor SEE1 de maíz (Robson y colaboradores, 2004). Se prepararon constructos adicionales para la expresión de los factores de transcripción bajo los promotores desarrolladamente controlados, por ejemplo, que se expresan de manera preferente en el florecimiento (por ejemplo, promotores sensibles a la duración del día), promotores de Fitocromo, promotores de Criptocromo, o en los tallos de la planta durante el crecimiento secundario tal como un promotor del genCesA.Estos constructos se usaron para transformar plantas, y se seleccionaron plantas que producen al menos 8% de TAG en las partes vegetativas.

Niveles de almidón y azúcar

Se midieron los niveles de almidón y azúcar solubles en el tejido de la hoja muestreado de las plantas de tipo silvestre y transgénicas que contienen el T-a Dn de pJP3502, o los T-ADNs de tanto pJP3502 como pOIL51 o pJP3502 y pOIL049. En general, se encontró una correlación inversa entre los niveles de TAG y almidón en el tejido de la hoja sobre una base de peso seco en las hojas que tienen ambos T-ADNs (Figuras 13A-13B). En contraste, los niveles de azúcares solubles de la hoja fueron aproximadamente los mismos en las plantas transgénicas con respecto al tipo silvestre, sugiriendo que no hubo bloqueo significativo en la conversión de los azúcares TAG. Un efecto de la posición de la hoja en la planta se observó en las plantas de tipo silvestre donde los niveles de almidón tendieron a incrementarse de la hoja inferior a la posición de la hoja más alta. No se detectó tal efecto en las plantas transgénicas.

Ejemplo 13. Expresión específica de tallo de un gen que codifica un factor de transcripción

Las hojas de las plantasN. tabacumque expresan transgenes que codifican WRI1, DGAT y Oleosina contienen aproximadamente 16% de TAG en la etapa de establecimiento de la semilla del desarrollo. Sin embargo, los niveles de TAG fueron mucho más bajos en los tallos (1%) y las raíces (1.4%) de las plantas (Vanhercke y colaboradores, 2014). Los inventores consideraron si los niveles de TAG más bajos en los tallos y raíces fueron debido a la actividad promotora deficiente del promotor Rubisco SSU usado para expresar el gen que codifica WRI1 en las plantas transgénicas. El transgen DGAT en el T-ADN de pJP3502 se expresó por el promotor CaMV35S que se expresó más fuertemente en los tallos y raíces y por lo tanto fue improbable que sea el factor limitante para la acumulación de TAG en los tallos y raíces.

En un intento de incrementar la biosíntesis de TAG en el tejido del tallo, se diseñó un constructo en el cual el gen que codifica WRI1 se colocó bajo el control de un promotor SDP1 deA. thaliana.Se sintetizó un fragmento de ADN sintético A 3.156kb que comprende 1.5kb del promotor SDP1 deA. thaliana(SEQ ID NO: 175) (Kelly y colaboradores, 2013), seguido por la región de codificación para el polipéptido WRI1 deA. thalianay la región terminadora/poliadenilación de lectina deG. max.Este fragmento se insertó entre los sitios SacI yNotIde pJP3303. El vector resultante se designó pOIL050, que después se usó para transformar las células de las plantasN. tabacumhomocigotas para el T-ADN de pJP3502 por la transformación mediada porAgrobacterium.Las plantas transgénicas se seleccionaron para resistencia a la higromicina y un total de 86 plantas transgénicas independientes se desarrollaron a madurez en el invernadero. Las muestras se tomaron del tejido de las hoja y tallo transgénicos en la etapa de establecimiento de la semilla y contuvieron niveles de TAG incrementados comparados con las plantas precursoras deN. tabacumtransformadas con pJP3502.

Ejemplo 14. Incremento del contenido de aceite en las semillas

Varios grupos habían reportado niveles de TAG incrementados en el tejido de la semilla del maíz, canola oArabidopsis thalianaen la sobreexpresión de genes individuales que codifican WRI1 y DGAT1 (Shen y colaboradores, 2010; Liu y colaboradores, 2010; Weselake y colaboradores, 2008; Jako y colaboradores, 2001; revisado en Liu y colaboradores, 2012). Recientemente, van Erp y colaboradores. (2014) exploraron el efecto de la co-expresión de WRI1 y DGAT1 en el contenido de aceite de la semilla enthaliana.Los niveles de TAG absolutos se incrementaron de 38% en el control del vector vacío y tipo silvestre a 44% en las líneas transgénicas. El silenciamiento de la SDP1 TAG lipasa en combinación con la sobreexpresión de WR11 y DGAT1 incrementó adicionalmente los niveles de TAG hasta 45%. Cabe destacar, que mientras el peso de la semilla promedio se encontró que se incrementa, el número de semillas por planta se comparó más bajo con las platas de control.

Un fragmento de ADN sintético de aproximadamente 14.3 kb en longitud y que contiene los marcos de lectura abiertos para el MGAT2 deM. musculus,d Gt A 1 deA. thaliana,WRI1 deA. thalianay los polipéptidos GPAT4 deA. thalianabajo el control de los promotores específicos de semilla de los genes que codifican<f>AE1, Conlinin1 y Conlinin2 se sintetizó y se insertó como un fragmento AotI-PstI en pJP3416. El vector resultante se designó pTV55 (Figura 14). Una serie de vectores derivados se construyeron de pTV55 por la remoción secuencial de los casetes de expresión individuales, cada paso usando la digestión de enzimas de restricción seguido por la auto-ligación. El casete GPAT4 se suprimió por la digestión de PacI, dando por resultado pTV56. Una digestión subsecuente conSrñremovió el casete de expresión MGAT2, produciendo pTV57. El casete WRI1 se suprimió usando los sitios de restricciónSbfIde flaqueo, daño por resultado pTV58. Finalmente, el casete DGAT1 en pTV58 se intercambió para el casete WRI1 por la digestión con SrfI y PacI, seguido por el tratamiento y ligación de la T4 ADN polimerasa. El casete WRI1 se escindió de pTV57 usando SbfI y se trató con T4 polimerasa. La ligación del casete WRI de extremo romo en la cadena principal de pTV58 digerida conS if- PacI produjo pTV59. Cada vector contuvo el gen e35S (que contiene la región potenciadora doble)::PAT como el gen marcador seleccionable, proporcionando resistencia BASTA.

En resumen, los constructos contuvieron las siguientes combinaciones de genes:

pTV55: ProCnIl::MGAT2 ProCn12::DGAT1 ProCnIl ::GPAT4

ProFAE1::WRI1;

pTV56: ProCnIl::MGAT2 ProCn12::DGAT1 ProFAE1::WRI1;

pTV57: ProCn12::DGAT1 ProFAE1::WRI1;

pTV58; ProCn12::DGAT1;

pTV59: ProFAE1::WRI1.

Los constructos pTV55 - pTV59 se introdujeron separadamente en la cepa AGL1 deA. tumefaciensy se usó para transformarC. sativa(cv. Celine) por un método de inmersión floral adaptada de Liu y colaboradores (2012). Brevemente, los botones de flores recientemente abiertas se sumergieron en una solución deA. tumefaciensdurante 15 segundos, se envolvieron en película de plástico y se dejaron durante la noche en la oscuridad a 24°C después de lo cual el plástico se removió. Un total de 3-4 inmersiones florales se llevaron a cabo basado en la calidad de las flores disponibles. Las plantas se desarrollaron a madurez y se recolectaron las semillas T1. Después de la germinación de la semilla T1 en el suelo, las plántulas T1 establecidas (7-10 días) se rociaron con 0.1% de herbicida BASTA (250 g/L de amonio de glufosinato; Bayer Crop Science Pty Ltd, VIC Australia) para seleccionar las plantas que expresan el gen marcador seleccionable PAT. Las plántulas supervivientes se separaron y se transfirieron a macetas de suelo reciente y se desarrollaron a madurez en el invernadero a 22+1 °C (días) y 18±1°C (noches). Las semillas T2 se recolectaron y el contenido de aceite (que es al menos 95% de TAG) de 3 lotes independientes de 50mg de semillas de cada línea se midieron por NMR (MQC, Oxford Instruments). Las muestras de calibración se prepararon con papeles Kimwipes secos que contienen cantidades conocidas de aceite de semilla deC. sativunaen tubos de prueba NMR de 10 mm de diámetro, para generar un intervalo de contenido de aceite basado en los pesos del papel y el aceite. Las muestras de calibración se sellaron con parafina, y se mantuvieron en un bloque de calentamiento a 40°C mínimo 1 hora antes del uso para permitir que el aceite se distribuya uniformemente en el tejido. Las muestras de calibración se midieron tres veces con un imán Tesla 0.55 y una sonda de diámetro de 10 mm que opera en una frecuencia de resonancia de protones de 23.4 MHz durante 16 segundos. La temperatura del imán se mantuvo a 40°C. Las muestras de las semillas primero se secaron en un horno a 105°C durante la noche para asegurar que el contenido de humedad fuera menor que 5%. Las muestras se pesaron subsecuentemente, se transfirieron a un tubo de vidrio de 10 mm de diámetro y se incubaron a 40°C durante 1 hora antes del análisis de NMR. El contenido de aceite se midió en triplicado por NMR contra la calibración, basado en el peso de la masa.

El número de copias de los T-ADN(s) insertados en cada línea transformada se determinó por PCR (dPCR). El ADN genómico primero se digirió conEcoRIyBamHIpara asegurar la separación física de T-ADNs en caso de múltiples inserciones. El gen LEAFY deC. sativuna (ify)se eligió como un gen de referencia y el marcador seleccionable como el gen objetivo en una reacción multiplex de dPCR. Las sondas se etiquetaron con ya sea HEX (gen de referencia) o FAM (gen objetivo). Las condiciones de reacción de amplificación fueron como sigue: 95°C durante 10 minutos (aumento de 2.5°C/s), 39 ciclos de 94°C durante 30 s (aumento de 2.5°C/s) y 61°C durante 1 min (aumento de 2.5°C/s), 98°C durante 10 min. Después de la amplificación por PCR, la fluorescencia de las gotitas individuales se midió en un lector de gotitas QX100 (BioRad) y el número de copias se calculó usando el software QuantaSoft (versión 1.3.2.0, BioRad).

La transformación deC. sativaprodujo múltiples eventos transgénicos que muestran niveles de TAG incrementados en la segregación de semillas T2 comparado con el control de tipo silvestre no transformado (Figura 15). Interesantemente, los niveles de TAG más altos se obtuvieron con pTV57 que contiene los genes que codifican para WRI1 y DGAT1. La inserción adición adicional de MGAT2 (pTV56) y MGAT2+g Pa T4 (pTV55) dio por resultado niveles de TAG ligeramente más bajos comparado con el pTV55. La determinación del número de copias reveló 1 o 2 inserciones de T-ADN para las líneas pTV57 que muestran el segundo más alto y el contenido de aceite de semilla más alto, respectivamente (Tabla 14).

Las plantas T2 homocigotas transformadas con T-ADN de pTV057 también se cruzaron con plantasC. sativatransformadas con genes para la expresión de ácido graso desaturasa y elongasa requeridas para la síntesis de acumulación de DHA en la semilla (WO2013/185184). Las semillas F1 mostraron algún contenido de aceite incrementado como es medido por NMR comparadas con las semillas deC. sativatransformadas con el constructo de DHA y sin el T-ADN de pTV57. El contenido de DHA en las semillas se determina al medir los niveles de DHA en la fracción de TAG comparados con las plantas precursoras de DHAC. sativa.El contenido de DHA total de las semillas (mg DHA/g de las semillas) que contiene ambos T-ADNs se incrementa con respecto al contenido de DHA total de las semillas que contienen solo el constructo de DHA.

Tabla 14.El contenido de aceite (%) en la semilla T2 y número de copias (por PCR digital) de eventos transgénicos pTV57 deC. sativa

Línea pTV57 Aceite de semilla (%) Número de copias

CMD29-1 36.97 ?

CMD29-2 36.69 ?

CMD29-3 35.16 1.02

CMD29-4 28.47 6.6

CMD29-5 40.60 2

CMD29-6 37.86 4.68

CMD29-7 39.17 2.94

CMD29-8 39.88 0.947

CMD29-9 36.70 1.04

CMD29-10 37.19 0.935

CMD29-11 31.20 14.3

CMD29-20 33.08 6

Ejemplo 15. Efecto de la expresión de la proteína del cuerpo lipídico en la acumulación de TAG y cambio

Las plantas deN. tabacumtransformadas con el T-ADN de pJP3502 y que expresan transgenes que codifican WRI1 deA. thaliana,DGAT1 y Oleosina de S.indicumhabían incrementado los niveles de TAG en los tejidos vegetativos. Como se muestran en el Ejemplo 11 en lo anterior, cuando el gen endógeno que codifica la SDP1 TAG lipasa se silenció en esas plantas, los niveles de TAG en la hoja se incrementaron adicionalmente, lo cual indicó a los inventores que el cambio de TAG sustancial estuvo presentándose en las plantas que retuvieron la actividad de SDP1. Por lo tanto, el nivel de la expresión de los transgenes en las plantas se determinó. Mientras que el análisis de Northern blot hibridación confirmó la fuerte expresión de WRI1 y DGAT1 y alguna expresión de la ARNm de Oleosina, el análisis de expresión por la PCR digital y qRT-PCR detectó solo niveles muy bajos de transcriptos de Oleosina. El análisis de expresión reveló que el gen que codifica la Oleosina se expresó deficientemente comparado con los transgenes WRI1 y DGAT1. De estos experimentos, los inventores concluyeron que los cuerpos de aceite en el tejido de la hoja no se protegieron completamente del rompimiento de TAG debido a la producción inadecuada de la proteína Oleosina cuando se codificó con el T-ADN en pJP3502. Para mejora la acumulación estale de TAG por todo el desarrollo de la planta, se diseñaron varias modificaciones de pJP3502 en las cuales el gen de Oleosina se sustituyó. Estos constructos modificados fueron como sigue.

1. el pJP3502 contiene un gen (SEQ ID NO: 176 proporciona la secuencia de su complemento) que codifica la oleosina de S.indicumque se expresó deficientemente. Ese gen tiene un intrón UBQ10 interno que se podría reducir el nivel de expresión. Para probar esto, un fragmento de ADN sintético 502bp que contiene el gen de oleosina de S.indicumy que carece del intrón UBQ10 interno se sintetizó y se insertó en el pJP3502 como un fragmento NotI, para sustituir el gen de oleosina que contiene el intrón en pJP3502. El plásmido resultante se designó pOIL040.

2. El promotor de subunidad pequeña Rubisco (SSU) que conduce la expresión del gen de oleosina en pJP3502 se reemplazó por el promotor enTCUP2 constitutivo. Para este fin, un fragmento 2321bp que contiene le promotor enTCUP2, la región de codificación de proteína Oleosina, la región terminadora/poliadenilación de lectina deG. maxy el primer 643bp del promotor SSU cadena abajo que conduce la expresiónwrilse sintetizó y se clonó en los sitios AscI y SpeI de pJP3502 dando por resultado pOIL038.

3. Se siguió una estrategia similar para la expresión de una versión modificada del gen de oleosina de S.indicumque contiene 6 residuos de cisteína introducidos (o3-3) bajo el control del promotor enTCUP2 (Winichayakul y colaboradores, 2013). Un fragmento 2298bp que contienen el promotor enTCUP2, la región de codificación de proteína o3-3 de Oleosina, región terminadora/poliadenilación de lectinaG. maxy el primer 643bp del promotor SSU cadena abajo que conduce la expresiónwrilse sintetizó y se subclonó en los sitios AscI y SpeI de pJP3502 dando por resultado pOIL037.

4. Los sitiosNotlque flanquean el gen de oleosina de S.indicumen pJP3502 se usaron para intercambiar la región de codificación de proteína para uno que codifica la O1eosina3 de cacahuate (No. de Acceso AAU21501.1) (Parthibane y colaboradores, 2012a; Parthibane y colaboradores, 2012b). Un fragmento 528bp que contiene el gen de oleosina3 flanqueado por los sitios NotI, se sintetizó y se subclonó en el sitio respectivo de pJP3502. El vector resultante se designó pOIL041.

5. Similarmente, un fragmento flanqueado 1077bpNotIque contiene el gen que codifica para la esteroleosina deA. thaliana(Arab-1) (No. de Acceso. AAM10215.1) (Jolivet y colaboradores, 2014) se sintetizó y se subclonó en el sitioNotIde pJP3502, dando por resultado pOIL043.

6. Proteína de superficie de gotitas de lípidos deNannochloropsis oceanic(LDSP) (No. de Acceso. AFB75402.1) (Vieler y colaboradores, 2012) se sintetizó como un fragmento flanqueado porNotI504bp y se subclonó en el sitioNotIde pJP3502, produciendo pOIL044.

7. Finalmente, la caleosina deA. thaliana(CL03) (No. de Acceso. 022788.1) (Shimada y colaboradores, 2014) se sintetizó como un fragmento flanqueado con 612bpNotIy se subclonó en pJP3502, dando por resultado pOIL042.

Cada uno de estos constructos se introdujo en las células de hoja deN. benthamianacomo se describe en el Ejemplo 1. La expresión transciente de tanto pJP3502 como pOIL040 en el tejido de la hoja deN. benthamianadio por resultado niveles de TAG elevados y cambios similares en el perfil de ácidos grasos TAG pero el pOiL040 incrementó más el nivel de TAG (1.3% comparado con 0.9%). Cada uno de los constructos, pOIL038, pOIL041, pOIL042 y pOIL043 se usaron para transformar establemente plantasN. tabacum(cultivar W38) por los métodos mediados porAgrobacterium.Las plantas transgénicas se seleccionaron sobre la base de resistencia a la kanamicina y se desarrollaron a madurez en el invernadero. Las muestras se tomaron de tejido de hoja transgénica en diferentes etapas durante el desarrollo de la planta y contuvieron niveles de TAG incrementados comparados con las plantasN. tabacumde tipo natura yN. tabacumtransformadas con pJP3502.

Clonación y caracterización de polipéptidos LDAP de Sapium sebifera

Las oleosinas no se expresaron en gran medida en los tejidos de plantas de acumulación de aceite no de semilla tal como el mesocarpio de la oliva, palma de aceite, y aguacate (Murphy, 2012). En cambio, las proteínas asociadas a gotitas de lípidos (LDAP) se han identificado en estos tejidos que puede desempeñar una función similar a aquella de la oleosina en los tejidos de semilla (Horn y colaboradores, 2013). Los inventores por lo tanto consideraron posible que la oleosina pudiera no ser la proteína de empaque óptima para proteger el aceite acumulado de la TAG lipasa u otras actividades de enzimas citosólicas en los tejidos vegetativos de las plantas. Los polipéptidos LDAP por lo tanto se identificaron y se evaluaron para la mejora de la acumulación de TAG, como sigue.

La fruta del árbol de cebo chino,Sapium sebifera,un miembro de la familiaEuphorbiaceae,fue de interés particular para los inventores ya que contiene un tejido rico en aceite fuera de la semilla. Un estudio reciente (Divi y colaboradores, enviado para publicación) indicó que este tejido oleaginoso, llamado una capa de cebo, se podría derivar del mesocarpio de su fruta. Por lo tanto, los inventores pusieron en duda el transcriptoma de S.sebiferapara las secuencias LDAP. Un análisis comparativo de genes expresados en el recubrimiento de la fruta y los tejidos de semilla revelaron un grupo de tres genes LDAP previamente no identificados que se expresaron en gran medida en la capa de cebo.

Las secuencias de nucleótidos que codifican los tres LDAPs se obtuvieron por RT-PCR usando ARNs derivados del tejido de cebo usando tres pares de cebadores. Las secuencias cebadoras se basaron en las secuencias de ADN que flanquean la región de codificación completa de cada uno de los tres genes. Las secuencias cebadoras fueron: para LDAP1, 5'-TTTTAACGATATCCGCTAAAGG-3' (SEQ ID NO: 245) y 5-AATGAATGAACAAGAATTAAGTC-3' (SEQ ID NO: 246) AT-3'; LDAP2, 5-CTTTTCTCACACCGTATCTCCG-3' (SEQ ID NO: 247) y 5' - AGC ATGATATA CTTGTCGAGAAAGC-3' (SEQ ID NO: 248); LDAP3, 5-GCGACAGTGTAGCGTTTT -3' (SEQ ID NO: 249) y 5'-ATACATAAAATGAAAACTATTGTGC-3' (SEQ ID NO: 250).

El análisis del transcriptoma de S.sebiferareveló múltiples ortólogos para cada uno de los genes LDAP, incluyendo ocho genes LDAP1, seis LDAP2, y seis LDAP3, con menos de 10% de divergencia de secuencia dentro de cada familia de genes. Las secuencias de péptido putativa se alinearon y se construyó un árbol filogenético usando software Genious (Figura 16), junto con los homólogos LDAPs de otras especies de planta, incluyendo dos de aguacate (Pam), uno de palma de aceite, uno deParthenium argentatum(Par), dos de Arabidopsis(Ath), cinco deTaraxacum brevicorniculatum(Tbr), tres deHevea brasiliensis(Hbr), como es presentado en la Figura 16. El árbol filogenético reveló que el SsLDAP3 compartió mayor identidad de secuencia de aminoácidos a los polipéptidos LDAP1 y LDAP2 del aguacate y el LDAP de la palma de aceite, mientras que los polipéptidos SsLDAPl y SsLDAP2 fueron más divergentes.

Constructos genéticos para la sobreexpresión de LDAP

A fin de probar la función de los LDAPs de S.sebifera,se prepararon vectores de expresión para expresar cada uno de estos polipéptidos bajo el control del promotor 35S en las células de la hoja. Las secuencias de SsLDAp ADNc de longitud completa se insertaron en el vector de destino pDONR207 mediante reacciones de combinación, reemplazando las regiones CcdB y Cm(R) del vector de destino con los fragmentos SsLDAP ADNc. Después de la confirmación por el análisis de digestión de restricción y la secuenciación de ADN, los constructos se introdujeron en la cepa AGL1 deAgrobacterium tumefaciensy se usaron para tanto la expresión transciente en las células de la hoja deN. benthamianacomo a transformación estable deN. tabacum.

La expresión de cada uno de los tres genes SsLDAP bajo el control transcripcional del promotor 35S en las hojas deN. benthamianaen combinación con la expresión de 35S::AtDGAT1 y 35S::AtWRI1 produjeron sustancialmente niveles más altos de acumulación de TAG con respecto a las células infiltradas con los genes 35S::AtDGAT1 y 35S::AtWRI1 sin el constructo LDAP. El nivel de TAG se incrementó a aproximadamente 2 veces por arriba del nivel de TAG en las células de control. Un incremento significativo en el nivel de ácido a-linolénico (ALA) y un nivel reducido de ácidos grasos saturados se observó en las células que reciben la combinación de genes, con respecto a las células de control.

Co-localización de polipéptidos LDAP fusionados a YFP con gotitas de lípidos en las células de la hoja

A fin de caracterizar el SsLDAPsin vivoy observar su comportamiento dinámico, se prepararon constructos de expresión para la expresión de los polipéptidos de fusión que consisten de los polipéptidos LDAP fusionados a la proteína fluorescente amarilla (YFP). Para cada polipéptido de fusión, la YFP se fusionó dentro del marco a la C-terminal del SsLDAP. El marco de lectura abierto completo de cada uno de los tres genes LDAP sin un codón de detección, en su extremo 3', se fusionó la secuencia YFP y los genes quiméricos y se insertaron en pDONR207. Después de la confirmación de los constructos resultantes por la digestión de restricción y secuenciación de ADN, los constructos se introdujeron en la cepa AGL1 deA. tumefaciensy se usaron para tanto la expresión transciente en las células de la hoja deN. benthamianacomo la transformación estable deN. tabacum.Tres días después de la infiltración de las células de la hoja con los constructos LDAP-YFP, discos de hoja de las zonas infiltradas se tiñeron con Rojo Nilo, que tiñó positivamente las gotitas de lípidos, y se observó bajo un microscopio confocal para detectar tanto la tinción roja (gotitas de lípido) como fluorescencia del polipéptido YFP. Se observó la co-localización de LDAP-YFP con las gotitas de lípidos, indicando que el LDAP se asoció con las gotitas de lípidos en las células de la hoja.

Ejemplo 16. Modificación de ácidos grasos en diferentes acumulaciones de lípidos en las hojas que acumulan altos niveles de TAG

Los inventores han descrito la producción de niveles incrementados de TAG en las hojas deN. tabacumpor la co-expresión de transgenes que codifica WRI1 deA. thaliana,DGAT1 deA. thalianay Oleosina de S.indicum(Vanhercke y colaboradores, 2014). Para explorar si las modificaciones de ácidos graos en las acumulación de lípidos diferentes que existen en las hojas fueron posibles con la co-expresión del a combinación de genes WRI1 y DGAT1, los experimentos de la expresión transcientes se llevaron a cabo para ver si los ácidos grasos en las acumulaciones de acil-CoA y acil-PC podrían presentarse. En un experimento, la expresión de un transgen que codifica la ácido graso elongasa deA. thaliana(AtFael) que alarga C18:1-CoA a C20:1-CoA se combinó con los genes que codifican WRI1 y DGAT para probar la modificación en la acumulación de acil-CoA. En un segundo experimento, un transgen que codifica la ácido graso desaturasa 2 deA. thaliana(AtFAD2) que desatura C18: 1-PC a C18:2-PC se combinó con los genes WRI1 y DGAT para probar la modificación en la acumulación de PC. Estos experimentos se diseñaron para probar la capacidad de las sustancias de acilo en el ER de las células de la planta.

El gen que codifica untFAEl se expresó de un promotor CaMV35S en hojas deN. benthamianaseparadamente o en combinación con WRI1 y DGAT1 como se describen en el Ejemplo 1, en triplicado. Las muestras de hojas se recolectaron 5 días después de la infiltración con las células deAgrobacteriumque comprenden las diferentes combinaciones de genes. El lípido total se extrajo de las muestras de hoja y la fracción TAG se separó de cada uno por TLC. La composición de ácidos grasos de cada fracción de TAG se determinó y se cuantificó con GC usando una cantidad conocida de C17:0-TAG como un estándar interno. Como se muestra en la Tabla 15, la poción C20:1 en el TAG se incrementó significativamente cuando AtAFEI se expresó. La co-expresión de WRI1 y DGAT1 con AtFAEl también incrementó el nivel del producto C20:1 comparado con el control, mientras que la cantidad de TAG total se incrementó de 0.8 a 14.9 |jg/mg de la hoja. El producto C20:1 en el TAG se acumuló tan alto como 0.96 |jg por mg, comparado con 0.04 |jg por mg sin la combinación de WRI1 y DGAT1.

Tabla 15. Niveles de ácidos grasos modificados después de la expresión transgénica para modificar las enzimas en las hojas deN. benthamiana

Muestra C18:1 C20:1 TAG (pg/mg peso C20:1 (pg/mg peso (%) (%) seco) seco)

Control 6.9±1.5 0.4±0.4 0.4±0.3 0.01

WRI1 DGAT1 17.1±1.0 0.4±0.2 16.3±2.1 0.06

AtFAE1 7.0±3.0 4.7±3.1 0.8±0.8 0.04

WRI1±DGAT1 15.3±0.5 6.4±0.2 14.9±2.5 0.96

AtFAE1

Similarmente, el AtFAD2 se co-expresó del promotor CaMV35S en hojas de enN. benthamianaseparadamente o en combinación con WRI1 y DGAT1. La composición de ácidos grasos de la fracción TAG se determinó y se cuantificó como en lo anterior. El nivel de ácido graso C18:2 ácido graso en TAG se incrementó significativamente cuando el AtFAD2 se co-expresó con WRI1 y DGAT1, de 10.7% a 37.9%, y el nivel de C18:1 disminuyó de 19.5% a 7.6%. Además, los niveles sustanciales de TAG (13.4 pg/mg de hoja) se observaron cuando WRI DGAT1 AtFAD2 se co-expresaron en las hojas. Estos resultados mostraron claramente que la composición de ácido graso y la cantidad se podría modificar mediante la adición de enzimas de modificación de ácidos grasos en combinación con al menos WRI1 y DGAT, y por lo tanto se podrían usar para la acumulación incrementada de los productos de ácidos grasos modificados generados en cualquiera o ambos de las acumulaciones de acil-CoA y PC, y se almacenaron eventualmente en el TAG en las partes vegetativas de la planta.

Ejemplo 17. Silenciamiento de los genes TGD en las plantas

Li-Beisson y colaboradores (2013) estimaron que en las hojas de Arabidopsis (una planta 16:3), aproximadamente 40% de los ácidos grasos sintetizados en los cloroplastos entran a la ruta procariota, mientras que 60% se exportaron para entrar a la ruta eucariota. Después se desaturaron en el ER, aproximadamente la mitad de estos ácidos grasos exportados se regresaron al plástido para soportar la síntesis de galactolípidos para las membranas tilacoides. El transporte (importación) de los ácidos grasos como DAG o fosfolípidos en el plástido implicanTGD1,una proteína similar a permeasa de la envoltura de cloroplastos interior. El transportador de lípidos ABC deArabidopsisque comprende las proteínasTGD1,2, y 3 se identificó por Benning y colaboradores (2008 y 2009) y más recientemente por Roston y colaboradores (2012). Este complejo de proteínas se sitúa en la membrana de envoltura de cloroplasto interior y se propone para mediar la transferencia de fosfatidato a través de esta membrana. El polipéptido TGD2 es una proteína de ligación fosfatídica, y TGD3 de una ATPasa. Una proteínaArabidopsisnovedosa, TGD4, se identificó por un procedimiento genético (Xu y colaboradores, 2008) y la inactivación del gen TGD4 también bloqueó la transferencia de lípido del ER a los plástidos. Los recientes datos bioquímicos indican que el TGD4 es la proteína de ligación de fosfatidato que reside en la membrana de envoltura de cloroplasto exterior (Wang y Benning, 2012).

Xu y colaboradores (2005) describió alelosTGD1parciales en unaA. thalianadando por resultado el crecimiento reducido de la planta y alta ocurrencia del aborto de embrión. El tejido de la hoja de los mutantesTGD1 A. thalianacontuvo niveles de TAG incrementados, probablemente como gotitas de aceite de citosol. Además, los niveles elevados de TAG también se encontraron en las raíces de los mutantesTGD1.No se detectó diferencia en el contenido de aceite de semilla. Similar al TAG se había reportado la acumulación en el tejido de la hoja para los mutantestgd2deA. thaliana(Awai y colaboradores, 2006),tgd3(Lu y colaboradores, 2007) ytgd4(Xu y colaboradores, 2008). Todos los alelos del mutantetgdfueron ya sea suficientemente parciales o se deterioran gravemente en el desarrollo de la planta.

Silenciamiento de TGD1

Un constructo de silenciamiento dirigido contra el importador plastidialTGD1se generó basado en un transcripto de ARNm de longitud completa identificado en el transcriptoma deN. benthamiana.Un fragmento de 685 pb se amplificó del ADNc de la hoja deN. benthamianamientras que incorpora un sitioPmlIen el extremo 5'. El fragmento TGD1 primero se clonó en pENTR/D-TOPO (Invitrogen) y se insertó subsecuentemente en el vector de destino pHELLSGATE12 a través de la clonación LR (Gateway). El vector de expresión resultante se designó pOIL025 y se expresó transcientementeN. benthamianapara evaluar el efecto del silenciamiento del gen TGD1 en los niveles de TAG de la hoja. El constructo de horquilla TGD1 se colocó bajo el control del promotoralcAinducible deA. nigerpor la subclonación como un fragmentoPmll-EcoRVen los sitiosNhel(klenow)-SfoI de pOIL020 (posterior). El vector resultante, designado pOIL026, se supertransformó en una línea pJP3502 deN. tabacumhomocigota para incrementar adicionalmente los niveles de aceite de la hoja.

Los constructos adicionales se fabrican para expresar ARN de horquilla para reducir la expresión de los genes TGD-2, -3 y -4. Las plantas transformadas se produjeron usando esos constructos y se determinó el contenido de aceite en los transformantes. Las plantas transformadas se cruzaron con los transformantes generados con pJP3502 u otras combinaciones de genes como se describe en lo anterior.

Ejemplo 18. Expresión de las combinaciones de genes en los tubérculos de patata

Construcción de pJP3506

Un constructo genético que contiene tres genes para la expresión en los tubérculos de patata se preparó y se usó para la transformación de la papa. Este constructo se designó como pJP3506 y se basó en un vector existente pJP3502 (WO2013/096993) con el reemplazo de los promotores para proporcionar la expresión específica de tubérculo. El pJP3506 contuvo (i) un gen de resistencia a la kanamicina NPTII conducido por el promotor 35S con la región potenciadora duplicada (e35S) como el gen marcador seleccionable y tres casetes de expresión génica, que fueron (ii) 35S::AtDGAT1 que codifican el DGAT1 deArabidopsis thaliana,(iii) B33::AtWRI1 que codifica el WRI1 deArabidopsis thaliana,y (iv) B33::oleosina de ajonjolí, que codifica la oleosina deSesame indicum.Las secuencias de nucleótidos que codifican esos polipéptidos fueron como en pJP3502. El promotor de patatina B33 (B33) fue un promotor específico de tubérculo derivado deSolanum tuberosum,que se proporcionó por Dr Alisdair Fernie, Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology, Potsdam, Alemania. Un mapa de plásmido circulares de pJP3506 se presenta en la Figura 17.

La secuencia del promotor B33 de patatina de S.tuberosumusado en el constructo pJP3506 fue una versión truncada que tiene 183 nucleótidos suprimidos del extremo 5' y 261 nucleótidos suprimidos del 3' con respecto al número de Acceso de GenBank X14483. La secuencia de nucleótidos del promotor B33 de patatina como se usa en pJP3506 se proporciona como SEQ ID NO: 211.

Transformación de la patata

Plántulas de patata(Solanum tuberosum)del cultivar Atlantic que se había desarrollado asépticamente en el cultivo de tejido se adquirió de Toolangi Elite, Victorian Certified Seed Potato Authority (ViCSPA), Victoria, Australia. Los internodos del tallo se escindieron en piezas de aproximadamente 1 cm en una longitud bajo una suspensión de la cepa LBA4404 deAgrobacterium tumefaciensque contiene pJP3506. Las células deAgrobacteriumse habían desarrollado a un OD de 0.2 y se diluyeron con un medio MS de volumen igual. La suspensión deAgrobacteriumen exceso se removió al teñir brevemente las piezas de tallo en el papel del filtro estéril, que después se colocó en placas en el medio MS y se mantuvo a 24°C durante dos (co-cultivación). Los internodos después se transfirieron en el medio MS reciente complementado con 200 pg/L de NAA, 2 mg/L de BAP y 250 mg/L de Cefetaxima. La selección de los callos transgénicos se inició 10 días después cuando los internodos se transfirieron en el medio MS reciente complementado con 2 mg/L de BAP, 5 mg/L de GA3, 50 mg/L de kanamicina y 250 mg/L de Cefetaxima. Los retoños regenerados de los callos se escindieron y se colocaron en un medio MS simple para la inducción de la raíz antes del trasplante en una maceta de 15 cm de diámetro que contiene mezcla de maceta y se desarrolló en el invernadero hasta la madurez de la planta incluyendo el crecimiento de tubérculos.

Extracción del ADN e identificación molecular de las plantas transgénicas por PCR

Discos de aproximadamente 1 cm en diámetro se obtuvieron de hojas de patata de las plantas en el invernadero. Estas se colocaron en una placa de microtítulo de pocillo profundo y se secaron por congelación durante 48 horas. Las muestras de hojas secas por congelación después se molieron en polvo al agregar una bola de acero que lleva cada pocillo y se agitó la placa en un lizador de tejido Reicht (Qiagen) en una frecuencia máxima de 28/segundo durante 2 minutos cada lado de la placa de microtítulo. 375 pL de solución amortiguadora de extracción que contiene Tris-HCl 0.1 M pH8.0, EDTA 0.05 M y 1.25% de SDS se agregó a cada pocillo que contiene el tejido de la hoja en polvo. Después de 1 hora de incubación a 65°C, 187 pL de acetato de amonio 6M se agregó a cada pocillo y las mezclas se almacenaron a 4°C durante 30 minutos antes de la centrifugación de las placas durante 30 minutos a 3000 rpm. 340 pL de sobrenadante de cada pocillo se transfirieron en una placa de microtítulo de pocillo profundo nueva que contiene 220 pL de isopropanol y se mantuvo durante 5 minutos a temperatura ambiente antes de la centrifugación a 3000 rpm durante 30 minutos. Las pelotillas de ADN precipitadas se lavaron con 70% de etanol, se secaron con aire y se volvieron a suspender en 225 pL<de H>2<O por muestra.>

Dos pL de cada preparación de ADN de muestra de la hoja se agregó a 20 pL de mezcla de reacción de PCR usando el sistema de PCR HotStar (Qiagen). Un par de cebadores de oligonucleótidos basados en la secuencia 5' y 3' del gen WRI1 deArabidopsis thaliana,optimizado con codón para el tabaco, se usó en las reacciones de PCR. Sus secuencias fueron: Nt-Wri-P3: 5'- CACTCGTGCTTTCCATCATC -3' (SEQ ID NO: 212) y Nt-Wri-P1: 5'-GAAGGCTGAGCAACAAGAGG -3'(SEQ ID NO: 213). Un par de cebadores de oligonucleótidos basados en el gen DGAT1 seArabidopsis thaliana,optimizado con codón para el tabaco, también se usó en la reacción de PCR separada en cada muestra de ADN. Sus secuencias fueron: Nt-DGAT-P2: 5'- GGCGATTTTGGATTCTGC -3' (SEQ ID NO: 214) y Nt-DGAT-P3: 5'- CCCAACCCTTCCGTATACAT -3' (SEQ ID NO: 215). La amplificación se llevó a cabo con un ciclo inicial a 95°C durante 15 minutos, seguido por 40 ciclos de 95°C durante 30 segundos, 57°C durante 30 segundos y 72°C durante 60 segundos. Los productos de PCR se electroforaron en un gel de agarosa al 1% para detectar los productos de amplificación específicos.

Análisis de lípidos de tubérculos de patata

Rebanadas delgadas de tubérculos recolectadas de plantas de patata regeneradas, par pantas transgénicas confirmadas y controles no transformados, se secaron por congelación durante 72 horas y se analizaron para el contenido de lípidos y composición. Los lípidos totales se extrajeron de los tejidos de tubérculos secos usando cloroformo:metanol:KCl 0.1 M (2:1:1 v/v/v) como sigue. Los tejidos de tubérculos secados por congelación primero se homogenizaron en cloroformo:metanol (2:1, v/v) en un tubo eppendorf que contiene una bola metálica usando un lizador de tejido Reicht (Qiagen) durante 3 minutos en una frecuencia de 29 por segundo. Después de mezclar cada homogenado con un Vibramax 10 (Heidolph) a 2,000 rpm durante 15 minutos, 1/3 volumen de solución de KCl 0.1 M se agregó a cada muestra y se mezcló adicionalmente. Después de la centrifugación a 10,000g durante 5 minutos, los lípidos que contienen<una fase más baja de cada muestra se recolectaron y se evaporaron completamente usando el flujo de N>2<. Cada>preparación de lípido se disolvió en 3 pL de CHCh por miligramo de peso seco de tubérculo. Las alícuotas de las preparaciones de lípidos se cargaron sobre una placa de cromatografía de capa delgada (TLC) (20 cm x 20 cm, gel de sílice 60, Merck) y se desarrolló en hexano:éter dietílico:ácido acético (70:30:1, v/v/v). La placa de TLC se roció con Primulina y se visualizó bajo UV para mostrar las manchas de lípidos. TAG y PL se recuperaron al raspar la sílice de las bandas apropiadas y se convirtieron a ésteres de metilo de ácido graso (FAME) al incubar el material en HCl metanólico 1 N (Supelco, Bellefonte, PA) a 80°C durante 2 horas junto con una cantidad conocida de Triheptadecanoína (Nu-Chek PREP, Inc. EUA) como estándar interno para la cuantificación de lípidos. El FAME se analizó por GC-FID (7890A GC, Agilent Technologies, Palo Alto, CA) equipado con una columna de BPX70 de 30 m (diámetro interior de 0.25 mm, espesor de la película 0.25 mm, SGE, Austin, EUA) como se describe previamente (Petrie y colaboradores, 2012). Los picos se integraron con el software Agilent Technologies ChemStation (Rev B.04.03).

Entre las aproximadamente 100 líneas transgénicas individuales regeneradas, el análisis de los lípidos derivados de tubérculos de patata jóvenes de aproximadamente 2 cm en diámetro reveló niveles incrementados en los lípidos totales, TAG y fracciones de fosfolípidos en los tubérculos de muchas de las plantas transgénicas, con un intervalo observado sin incrementos a incrementos sustanciales. El primer análisis de los lípidos de tubérculos de patata indicó que un tubérculo de patata de tipo silvestre típico en su etapa temprana de desarrollo (aproximadamente 2 cm en diámetro) contuvo aproximadamente 0.03% de TAG sobre una base de peso seco.

El contenido de lípidos totales se incrementó a 0.5-4.7% en peso (peso seco) en los tubérculos de 21 plantas transgénicas individuales, representando 16 líneas independientemente transformadas (Tabla 16). Los tubérculos de la línea #69 mostraron la acumulación de TAG más alta en un promedio de 3.3% sobre una base de peso seco. Esto fue aproximadamente un incremento de 100 veces con respecto a los tubérculos de tipo silvestre en la misma etapa de desarrollo. Los tubérculos de la misma línea transgénica también acumularon los niveles observados más altos de fosfolípidos a 1.0% en peso en los tubérculos jóvenes sobre una base de peso seco (Tabla 18). La acumulación de lípidos mejorada también fue acompañada por una composición de ácidos grasos alterada en los tubérculos transgénicos. Los tubérculos transgénicos acumularon consistentemente con porcentajes más altos de ácidos grasos monosaturados y saturados (MUFA) y un nivel más bajo de ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) en tanto el contenido de ácido graso total como en la fracción de TAG del contenido de ácidos grasos total (Tabla 17), particularmente un nivel reducido de 18:3 (ALA) que se redujo de aproximadamente 17% en el tipo silvestre a menor que 10% en los tubérculos transgénicos. El nivel de ácido oleico (18:1) en el contenido de ácidos grasos total se incrementó de aproximadamente 1% en el tipo silvestre a más de 5% en muchas de las líneas y más de 15% en algunos de los tubérculos. Aunque se incrementaron los niveles de ácido palmítico, los niveles de ácido esteárico (18:0) disminuyeron en las mejores líneas transgénicas (Tablas 16 y 17).

Las plantas de patata transgénicas se mantuvieron en el invernadero para permitir el crecimiento continuado de los tubérculos. Los tubérculos más grandes de la línea #69 contuvieron mayores niveles de TFA y TAG que los tubérculos de aproximadamente 2cm en diámetro.

Los niveles incrementados adicionales TFA y TAG se obtuvieron en los tubérculos de patata mediante la adición de un gen quimérico que codifica un ARN de silenciamiento para regular por decremento la expresión del gen SDP1 endógeno, en combinación con los genes WRI1 y DGAT.

Combinaciones de genes adicionales para la transformación de la patata

El ARN total de tubérculos de patata en desarrollo recientes(Solatium tuberosumL. cv. Atlantic) se extrajo por el método TRIzol (Invitrogen). Las regiones seleccionadas de ADNcs que codifican la subunidad pequeña de AGPasa de patata y SDP1 se obtuvieron a través de RT-PCR usando los siguientes cebadores: st-AGPs1: 5' -ACAGACATGTCTAGACCC AGATG-3' (SEQ ID NO: 251), st-AGPa1: 5' -CACTCTCATCCCAAGTGAAGTTGC-3' (SEQ ID NO: 252); st-SDP1-s1: 5-CTGAGATGGAAGTGAAGCACAGATG-3' (SEQ ID NO: 253), y st-SDP1-a1: 5'-CCATTGTTAGTCCTTTCAGTC-3' (SEQ ID NO: 254). Los productos de PCR después se purificaron y se ligaron a pGEMT Easy.

ı22

Después de la verificación por la secuenciación de ADN, los productos de PCR clonados se usaron ya sea directamente como la secuencia de genes objetivo para preparar un constructo de ARNi de horquilla o se fusionaron por la PCR solapante. Tres fragmentos de PCR (SDP1, AGPasa, SDP+AGP) se clonaron subsecuentemente en el vector pKannibal que contuvo sitios de restricción específicos para clonar el fragmento deseado en la orientación de sentido y antisentido. Los sitios de restricción seleccionados fueronBamE\yHind\\\para la clonación del fragmento en la orientación de sentido yKpn\yXho\para insertar el fragmento en la orientación antisentido. Los conjuntos de cebadores usados para la amplificación de los tres fragmentos de genes objetivo se alteraron por la adición de sitio de restricción que dirigieron el fragmento en los sitios de clonación de pKannibal. Los casetes de expresión que contienen el fragmento de ADN objetivo entre el promotor 35S y el terminador OCS en pKannibal se liberaron conNot\y se clonaron en un vector binario pWBVec2 con higromicina como el marcador seleccionable de planta. Los vectores binarios se introdujeron en una cepa AGL1 deA. tumefaciensy se usaron para la transformación de la patata como se describe en lo anterior.

Ejemplo 19. Incremento del contenido de aceite en las plantas monocotiledónea

Expresión en el endospermo

El contenido de aceite en el endospermo de la especie de planta monocotiledóneaTriticum aestivum(trigo) y por lo tanto en el grano de las plantas se incrementó al expresar una combinación de genes que codifican WR\1, DGAT y Oleosina en el endospermo durante el desarrollo de grano usando promotores específicos de endospermo. El constructo (designado pO\L-Endo2) contuvo los genes quiméricos: (a) el promotor del genGlulde la región de codificaciónBrachypodium distachyon::proteínadel genZea maysque codifica el polipéptido ZmWR\1 (SEQ \D NO:35)::región terminadora/poliadenilación del gen de lectina dehe Glycine max,(b) el promotor del gen de glutenina Bx17 deTriticum aestivum::regiónde codificación de proteína del gen deA. thalianaque codifica el polipéptido AtDGATI (SEQ \D NO: l)::región terminadora/poliadenilación del gen Nos deAgrobacteriumtumefaciens, (c) el promotor del genGluB4de la región deOryzasativa::región de codificación de proteína del gen deSesame indicumque codifica el polipéptido Oleosina::región terminadora/poliadenilación del gen de lectina deGlycine maxy (d) un promotor 35S: región de codificación de resistencia a higromicina como un gen marcador seleccionable. El constructo se usó para transformar los embriones inmaduros deT. aestivum(cv. Fielder) por la transformación mediada porAgrobacterium.Los embriones inmaduros inoculados se expusieron a la higromicina para seleccionar los retoños transformados y después se transfirieron al medio de enraizamiento para formar raíces, antes de la transferencia al suelo.

Se obtuvieron treinta plantas transformadas que ajustaron la semilla T1 y contuvieron el T-ADN de pO\L-Endo2. Las semillas maduras se recolectaron de las 30 plantas, y las 6 semillas de cada familia se cortaron a la mitad. Las mitades que contienen el embrión se almacenaron para germinación posterior; la otra mitad que contiene principalmente el endospermo se extrajo y se sometió a prueba para el contenido de aceite. El T-ADN insertado en el genoma de trigo aún estuvo segregándose en las semillas T i de esas plantas, de modo que las semillas T1 fueron una mezcla de homocigotas transformadas, heterocigotas transformadas y nulas para el T-ADN. El contenido de aceite incrementado se observó en el endospermo de algunos de los granos, con alguno de los granos que muestran mayor que un incremento de 5 veces en los niveles de TAG. Las mitades de endospermo de los seis granos de tipo silvestre (cv. Fielder) tuvieron un contenido de TAG de aproximadamente 0.47% en peso (intervalo de 0.37% a 0.60%), comparado con un contenido de TAG de 2.5% en algunos granos. Algunas familias tuvieron seis granos con TAG en exceso de 1.7%; otros estuvieron evidentemente segregándose con tanto el tipo silvestre como el contenido elevado de TAG. En los endospermos con el contenido de TAG elevado la composición de ácido graso también estuvo alterada, mostrando incrementos en los porcentajes de ácido oleico y ácido palmítico, y una disminución en el porcentaje de ácido linoléico (Tabla 19). El grano T i germinó sin dificultad en la misma velocidad como el grano de tipo silvestre correspondiente y las plantas que representan tantos individuos de aceite alto y aceite bajo de las 14 familias T0 se desarrollaron a madurez. Estas plantas fueron completamente masculinas y femeninas fértiles.

El grano es útil para preparar productos alimenticios para el consumo humano o como alimento animal, proporcionando el grano con un contenido de energía incrementado por peso unitario (densidad de energía) y dando por resultado velocidades de crecimiento incrementadas en los animales tales como, por ejemplo, aves de corral, cerdos, ganado, ovejas y caballos.

Tabla 19. Composición de ácidos grasos (% de ácidos grasos totales) del contenido de TAG y el contenido de TAG total

El constructo pOIL-Endo2 también se usó para transformar el maíz(Zea mays)y arroz(Oryza sativa)para obtener las plantas transgénicas que tienen un contenido de TAG incrementado en el endospermo y por lo tanto en el grano.

Expresión en las hojas y tallos

Una serie de vectores de expresión binario se diseñaron para la transformación mediada porAgrobacteriumde sorgo(S. bicolor)y trigo(Triticum aestivum)para incrementar el contenido de aceite en los tejidos vegetativos. Los vectores de partida para las construcciones fueron pOIL093-095, pOIL134 y pOIL100-104 (ver Ejemplo 4). En primer lugar, un fragmento de ADN que codifica el polipéptido WRI1 deZ. maysse amplificó por PCR usando el pOIL104 como una plantilla y cebadores que contienen sitios de restricciónKpnI.Este fragmento se subclonó cadena abajo del promotor Actin1 deOryza sativaconstitutivo de pOIL095, usando el sitioKpnI.El vector resultante se designó pOIL154. El fragmento de ADN que codifica el DGAT2a deUmbelopsis ramannianabajo el control del promotor de ubiquitina deZ. mays(pZmUbi) se aisló de pOIL134 como un fragmento JVM y se insertó en el sitioNotIde pOIL154, dando por resultado pOIL155. Un casete de expresión que consiste de la región de codificación PAT bajo el control del promotor pZmUbi y flanqueado en el extremo 3' por la región terminadora/poliadenilación NOS deA. tumefaciensse construyó al amplificar la región de codificación PAT usando el pJP3416 como una plantilla. Los cebadores se diseñaron para incorporar los sitos de restricciónBamHIy SacI en los extremos 5' y 3', respectivamente. Después de la digestión doble deBamHI+ SacI, el fragmento de PAT se clonó en los sitios respectivos de pZLUbilcasNK. El intermediario resultante se designó pOIL141. Después, el casete marcador seleccionable PAT se introdujo en la cadena principal de pOIL155. Para este fin, el pOIL141 primero se cortó con NotI, se despuntó con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I y se digirió subsecuentemente con AscI. Este fragmento 2622pb después se subclonó en los sitios ZraI - AscI de pOIL155, dando por resultado pOIL156. Finalmente, el promotor Actin1 que conduce la expresión de WRI1 en pOIL156 se intercambió para el promotor de subunidad pequeño Rubisco deZ. mays(pZmSSU) dando por resultado pOIL157. Este vector se obtuvo por amplificación por PCR del promotor SSU deZ. maysusando un pOIL104 como una plantilla y los cebadores de flanqueo que contienen los sitios de restricciónAsiSIyPmlI.El amplicón resultante después se cortó con SpeIMluIy se subclonó en los sitios respectivos de pOIL156.

Estos vectores contuvieron por lo tanto los siguientes casetes de expresión:

pOIL156: promotor de Actina deO. sativa:: WRI1 deZ. mays,promotor de Ubiquitina deZ.mays::DGAT2a deU. rammanianay promotor de Ubiquitina deZ. mays::PAT

pOIL157: promotor SSU deZ.mays::WRI1 deZ. mays,promotor de Ubiquitina deZ.mays::DGAT2a deU. rammanianay Ubiquitina deZ.mays::PAT.

Una segunda serie de vectores de expresión binarios que contienen el promotor de senescencia SEE1 deZ. mays(Robson y colaboradores, 2004, ver Ejemplo 4), el factor de transcripción LEC1 deZ. mays(Shen y colaboradores, 2010) y un fragmento SDP1 hpRNAi de S.bicolorse construyeron como sigue. Primero, una región de unión de matriz (MAR) se introdujo en el pORE04 por digestión deAatII+SnaBIde pDCOT y se subclonó en los sitios AatII+EcoEV de pORE04. El vector intermediario resultante se designó pOIL158. Después, el gen marcador seleccionable PAT bajo el control del promotor de ubiquitina deZ. maysse subclonó en pOIL158. Para este fin, el pOIL141 primero se digirió con NotI, se trató con el fragmento Klenow del ADN polimerasa I y finalmente se digirió con AscI. El fragmento resultante se insertó en los sitiosAscI+ZraIde pOIL158, dando por resultado pOIL159. El origen de replicación RK2 oriV original en pOIL159 se intercambió para el origen RiA4 por la digestión de restricción SwaI+SpeI de pJP3416, seguido por subclonación en los sitiosSwaI+AvIIde pOIL159. El vector resultante se designó pOIL160. Un fragmento “de senescencia monocotiledóneo parte 1” 10.019kb que contiene los siguientes casetes de expresión se enfatiza: Actin1 deO.sativa::DGAT1 deA. thaliana,optimizado con codón para la expresión deZ mays,SEE1 deZ.mays::WRI1 de Z. mays, SEE1 de Z. mays::LEC1 de Z. mays. Este fragmento se subclonó como un fragmento SpeI-EcoEV en los sitios SpeI-StuI de pOIL160, dando por resultado pOIL161. Un segundo fragmento “senescencia de monocotiledóneo parte2” 7.967kb se sintetizó y contuvo los siguientes elementos: MAR, UbiquitinaZ.mays::fragmento de hpRNAi dirigido contra SDP1 de S.bicolor/T. aestivum,casete vacío bajo el control del promotor de Actina1 deO. sativa.Las secuencias de dos SDP1 TAG lipasas de S.bicolor(Nos. de Acceso XM_002463620; SEQ ID NO. 242 y XM_002458486; SEQ ID NO: 169) y una secuencia SDP1 deT. aestivum(No. de Acceso. AK334547) (SEQ ID NO: 243) se obtuvieron por una búsqueda BLAST con la secuencia SDP1 deA. thaliana(No. de Acceso. NM_120486). Un constructo de horquilla sintético (SEQ ID NO:244) se diseñó incluyendo cuatro fragmentos (67pb, 90pb, 50pb, 59pb) de la secuencia XM_002458486 de S.bicolorque mostró un grado más alto de identidad con la secuencia SDP1 deT. aestivum.Además, un fragmento 278pb que se origina de la XM_002463620 SDP1 lipasa de S.bicolorse incluyó para incrementar la eficiencia del silenciamiento contra ambas secuencias SDP1 de S.bicolor.El fragmento “de senescencia monocotiledónea parte2” se subclonó como un fragmentoBsiWI-EcoRVen los sitiosBsiWi-EspIde pOIL161. El vector resultante se designó pOIL162.

Los constructos genéticos pOIL156 pOIL157, pOIL162 y pOIL163 se usaron para transformar la S.bicoloryT. aestivumusando la transformación mediada porAgrobacterium.Las plantas transgénicas se seleccionaron para la resistencia a la higromicina y contuvieron niveles elevados de TAG y TFA en los tejidos vegetativos comparadas con las plantas de control no transformadas. Las plantas son útiles para proporcionar alimento para animales como heno o ensilaje, así como producir granos, o se pueden usar para extraer aceite.

Ejemplo 20. Extracción de aceite y producción de biodiésel

Extracción de lípidos de las hojas

Hojas de tabaco transgénicas que se habían transformado con el T-ADN de pJP3502 se recolectaron de plantas desarrolladas en un invernadero durante los meses de verano. Las hojas se secaron y después se molieron a piezas de tamaño de 1-3mm antes de la extracción. El material molido se sometió a una extracción soxhlet (reflujo) durante 24 horas con solventes seleccionados, como se describe a continuación. 5 g de material de hoja de tabaco seco y 250ml de solvente se usaron en cada experimento de extracción.

Extracción con solvente hexano

El hexano se usa comúnmente como un solvente comercialmente para la extracción de aceite de las semillas de aceite prensadas tales como canola, que extraen los lípidos neutros (no polares), y por lo tanto se trataron primero. La masa de lípidos extraída fue 1.47g de 5 g de material de hoja, una recuperación de lípidos de 29% en peso. Se llevó a cabo el análisis RMN-1H del lípido extraído con hexano en<d>M<s>O. El análisis mostró signos típicos para los ácidos grasos de triglicéridos de cadena larga, sin productos aromáticos que estén presentes. El lípido después se sometió a GCMS para identificación de los componentes principales. El análisis de GCMS directo del lípido extraído con hexano probó ser difícil ya que el punto de ebullición fue muy alto y el material se descompuso en el GCMS. En tales situaciones, una técnica de análisis común es primero producir ésteres de metilo de los ácidos grasos, que se hizo como sigue: 18mg de extracto de lípido se disolvieron en 1mL de tolueno, 3mL de HCL metanólico 3N seco se agregó y se agitó durante la noche a 60°C. 5mL de 5% de NaCl y 5mL de hexano se agregaron a vial enfriado y se agitaron. La capa orgánica se removió y la extracción se repitió con otros 5mL de hexano. Las fracciones orgánicas combinadas se neutralizaron con 8<mL de KHCO>3<al 2%, se separaron y se secaron con Na>2<SO>4<. El solvente se evaporó bajo una corriente de N>2<y después>se preparó a una concentración de 1mg/mL en hexano para el análisis GCMS. Los ácidos grasos principales presentes fueron 16:0 (palmítico, 38.9%) y 18:1 (oleico, 31.3%).

Extracción con solvente de cetona

La acetona se usó como un solvente de extracción debido a que sus propiedades disolventes deben extraer casi todos los lípidos de las hojas, es decir tanto lípidos no polares como polares. El aceite extraído con acetona pareció similar al lípido extraído con hexano. La masa de lípidos extraída fue 1.59g de 5 g de hoja de tabaco, es decir 31.8% en peso. Se llevó a cabo el análisis RMN-1H de lípido en DMSO. Se observaron las señales típicas de los ácidos grasos de triglicéridos de cadena larga, sin ninguna señal de productos aromáticos.

Extracción con solvente de agua caliente

El agua caliente se probó como un solvente de extracción para ver si fue adecuado para obtener aceite de las hojas de tabaco. El material extraído con agua fue un gel similar en apariencia y se gelificó cando se enfrió. La masa extraída fue 1.9 g, o 38% en peso. Este material fue similar a un gel espeso y fue similar por tener compuestos polares incluidos de las hojas tales como azúcares y otros carbohidratos. Se llevó a cabo el análisis RMN-1H del material en DMSO. El análisis mostró señales típicas para ácidos grasos de triglicéridos de cadena larga, sin productos aromáticos que se extraigan. El material sólido restante se extrajo con hexano, produciendo 20% de lípido en peso, indicando que la extracción con agua no había extraído eficientemente los lípidos no polares.

Extracción con solvente de etanol

El etanol se usó como un solvente de extracción para ver si fue adecuado para obtener aceite de las hojas de tabaco. El lípido extraído con etanol fue similar en apariencia para tanto el lípido extraído con agua como con hexano, siendo de color amarillo-rojo, tuvo una apariencia similar a gel y se gelificó cuando se enfrío. La masa de lípido extraída fue 1.88g de 5 g de tacaco, o 37.6% en peso. El solvente de etanol también había extraído algo de los compuestos polares en las hojas de tabaco.

Extracción con solvente de éter

El éter etílico se intentó como un solvente de extracción puesto que se pensó que podría extraer menos impurezas que otros solventes. La extracción produjo 1.4 g, o 28% en peso. El lípido extraído con éter fue similar al material extraído con hexano en apariencia, fue amarillento en color, y pareció un poco más limpio que el extracto de hexano. Mientras que la extracción con éter dietílico pareció que había proporcionado el aceite más limpio, el análisis de NMR mostró una mezcla de más compuestos orgánicos.

Producción de biodiésel de plantas de tabaco

Un lote de plantas de tabaco transgénicas se desarrolló durante el invierno (no su estación de crecimiento normal) para evaluar la producción de aceite en las hojas durante la estación más fría con menos luz natural. Las hojas de las plantas maduras tuvieron aproximadamente 10% de aceite sobre una base de peso seco; mucho menor que las plantas desarrolladas durante la estación de verano. No obstante, el lípido se extrajo y se convirtió a biodiésel como sigue. Las etapas en el proceso fueron: (a) extracción de lípido crudo, (b) purificación del TAG del lípido, y (c) conversión del TAG purificado a biodiésel.

Se usó el hexano (éter de petróleo 40-60C) como el solvente de extracción para obtener aceite que comprende la mayoría de lípido no polar. 500 g de material de hoja de tabaco se secaron, se pesaron y después se empaparon en hexano durante la noche con agitación. La mezcla se filtró y el extracto de hexano después se secó con sulfato de magnesio y se trató con carbón activado para decolorar el aceite. La solución se filtró y el líquido resultante se evaporó en un evaporador giratorio, dando por resultado aproximadamente 42 gramos de aceite crudo. Este fue amarillo/verde en color y tuvo una consistencia viscosa cuando se enfrío. Algo de este aceite se usó en un intento para preparar biodiésel directamente pero el número de impurezas y alta cantidad de ácidos grasos dio origen al a producción de un lote de jabón que impidió la reacción de metilación y la separación del producto. Por lo tanto, la purificación adicional de este aceite para enriquecer la fracción de TAG fue necesaria antes de la reacción de transesterificación para preparar el biodiésel.

Un problema con la muestra desarrollada en el invierno fue la presencia de niveles relativamente altos de ácidos grasos libres (FFAs) en el material extraído, dando por resultado jabón excesivo que se hizo con la separación impedida de los ésteres de metilo y los productos de glicerol. Para purificar el TAG en el aceite, se investigaron varios sistemas de solventes y una mezcla de hexano/acetato de etilo de 80:20 se eligió como adecuada para la cromatografía de columna. Se llevó a cabo la separación en la columna de sílice usando hexano:acetato de etilo (80:20). El TAG más hidrofóbico fue el primero en eluirse de la columna como un aceite anaranjado/amarillo. Después de eluído fue una banda verde oscura, que contiene una mezcla de componentes solubles de hexano en las hojas de tabaco incluyendo clorofila mezclada con algo de TAG y FFAs. El producto final se lavó de la columna con acetato de etilo puro y fue principalmente FFAs.

El TAG purificado que se enriqueció de los FFAs y fosfatos y otras impurezas ahora se podría preparar en biodiésel. Esto se hizo al hacer reaccionar el TAG con metanol en presencia de un catalizador base para producir el éster de metilo (biodiésel) y glicerol como un producto. Un método alternativo, esterificación catalizada con ácido, se puede usar para hacer reaccionar ácidos grasos con alcohol para producir biodiésel en presencia de FFAs, requiriendo menos TAG puro. Otros métodos tales como reactores de lecho fijo, reactores supercríticos y reactores ultrasónicos para olvidarse de, o disminuir el uso de catalizadores químicos y también se puede usar para la producción de biodiésel de lípidos. Sin embargo, los métodos catalizados base son los más económicos para convertir el TAG purificado, requiriendo solo bajas temperaturas y presiones y producir más de 98% de rendimientos de conversión con la condición de que el aceite de partida esté bajo en humedad y libre de ácidos grasos.

El TAG purificado se trató con solución de metóxido (NaOH y metanol mezclado hasta que se disolvió completamente) en una temperatura de aceite de 60°C. La mezcla se mantuvo a 60°C y se agitó durante 2 horas conforme la reacción de transesterificación se llevó a cabo. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y dos fases separadas que fueron una capa de biodiésel superior y una capa de glicerol inferior. Las fases después se separaron usando un embudo de separación y el biodiésel se recuperó.

Procesamiento hidrotérmico de los tejidos vegetativos de aceite altos

Otro, procedimiento más directo para convertir las partes vegetativas de la planta en los productos industriales tales como combustibles líquidos, es a través del procesamiento hidrotérmico (HTP). Esto se empleó para convertir el material de hoja de tabaco transgénico que contiene aproximadamente 30% de TFA en peso en un bioaceite renovable que se podría agregar a una materia prima de refinería de petróleo convencional para producir diésel renovable (diésel parafínico). El diésel de petróleo es una mezcla de muchos compuestos de hidrocarburos, particularmente alcanos, y se define por ser la fracción de la refinería entre 200-300°C, que comprende típicamente de manera predominante hidrocarburos C13-C22.En una conversión típica de hoja de tabaco transgénica a través de HTP, el material vegetativo de la planta de tabaco transgénicas sólidas se mezcló con agua para crear una concentración de sólidos entre 16-50%. Esta suspensión después se sometió a temperaturas entre 270-400°C y presión de 7x106-3.5x107Pa(70-350bar). Los tiempos de reacción variaron entre 1-60 minutos y los experimentos se condujeron con y sin NaOH y KOH como catalizador.

Una vez que el procesamiento de HTP había terminado y la reacción se enfrío, se separó en 3 corrientes de producto diferentes, particularmente gas, sólido y bioaceite líquido. Los rendimientos de bioaceite fueron entre 25-40 % sobre una base de peso seco con respecto a la cantidad de materia prima. La Figura 18 muestra que se obtuvieron rendimientos de bioaceite mucho mayores para el material de la hoja de tabaco transgénico con respecto al material de la hoja de tabaco de tipo silvestre correspondiente.

Conversión in situ directa de lípido in partes vegetativas de la planta a biodiésel

En otra serie de experimentos, el componente de agua de la reacción HTP se reemplazó con el metanol solvente. Hubo una variedad de razones para tratar el uso de metanol, una vez que se trata para convertir el aceite TAG en la hoja directamente(in situ)en un paso que produce los ésteres de metilo de los ácidos grasos (FAME) en el lípido de planta y producen biodiésel directamente. Usando las mismas condiciones de reacción y el equipo como los experimentos HTP previos, el agua se reemplazó con metanol, la temperatura de reacción fue 335°C en una presión de 2.4x107Pa(240 bar) con NaOH como catalizador. Las partes vegetativas de la planta de tabaco transgénicas produjeron 47% de bioaceite en peso con respecto al peso de entrada, mientras que el tabaco de tipo silvestre produjo 35% en peso de bioaceite. RMN-H1 de los dos bioaceites resultantes mostró solo una pequeña cantidad de FAME, mientras que la RMN del bioaceite de tabaco transgénico mostró una gran cantidad del FAMe de biodiésel.

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un proceso para producir un producto de aceite, el proceso caracterizado porque comprende los pasos de

(i) tratar, en un reactor, una composición que comprende

(a) partes vegetativas de una planta angiosperma, donde dichas partes vegetativas de la planta tienen un peso seco de al menos 2g y tienen un contenido de lípidos no polares total de al menos 5% en peso sobre una base de peso seco,

(b) un solvente que comprende agua, un alcohol, o ambos, y

(c) opcionalmente un catalizador,

en donde el tratamiento comprende calentar la composición a una temperatura de entre 50°C y 450°C y a una presión de entre 5 y 350 bar durante entre 1 y 120 minutos en un ambiente oxidante, reductor o inerte, y

(ii) recuperar el producto de aceite del reactor con un rendimiento de al menos 35% en peso con respecto al peso seco de las partes vegetativas de la planta,

produciendo de esta manera el producto de aceite.

2. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque uno o más de:

(i) las partes vegetativas de la planta tienen un peso seco de al menos 1kg,

(ii) las partes vegetativas de la planta tienen un contenido total de lípido no polar de al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, 25%, 30%, 35%, o entre 30% y 75% tomando como base el peso seco,

(iii) la composición tiene una concentración de sólidos de entre 5% y 90%,

(iv) el catalizador comprende NaOH o KOH o ambos, preferentemente a una concentración de 0.1M a 2M, (v) el tiempo de tratamiento es de entre 1 y 60 minutos, preferentemente entre 10 y 60 minutos, preferentemente entre 15 y 30 minutos,

(vi) si el solvente es agua el proceso produce un rendimiento del producto de aceite entre un mínimo de 36%, 37%, 38%, 39% o 40% y un máximo de 55% o 60% en peso con respecto al peso seco de las partes vegetativas de la planta,

(vii) si el solvente comprende un alcohol el proceso produce un rendimiento del producto de aceite entre un mínimo de 36%, 37%, 38%, 39% o 40% y un máximo de 65% o 70% en peso con respecto al peso seco de las partes vegetativas de la planta,

(viii) si el solvente comprende 80% de agua, el producto de aceite comprende 30% de compuestos de hidrocarburo C13-C22,

(ix) si el solvente comprende 50% metanol, el producto de aceite comprende 50% de ésteres de metilo de ácido graso (FAME),

(x) el producto de aceite recuperado tiene un contenido de agua de menos de 15% en peso, y

(xi) el rendimiento del producto de aceite es al menos 2% mayor en peso con respecto al correspondiente proceso usando las partes vegetativas de una planta cuyo contenido de lípidos no polares es menor que 2% tomando como base el peso seco, y

(xii) la parte vegetativa de la planta en el paso (i)(a) ha sido procesada físicamente por uno o más procesos de secado, picado, triturado, molienda, enrollado, prensado, estrujado o machacado.

3. El proceso de conformidad con la reivindicación 1 o 2, donde las partes vegetativas de la planta tienen un contenido total de lípido no polar de entre 30% y 75% tomando como base el peso seco.

4. El proceso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 3, queademás comprende uno o más de:

(i) hidrodesoxigenación del producto de aceite recuperado, y

(iii) producción de gas de síntesis de la parte recuperada del producto de aceite, y

(iv) fraccionar la parte recuperada del producto de aceite para producir uno o más de fueloil, gasóleo, keroseno o gasolina

5. Un proceso para extraer aceite vegetal, el proceso caracterizado porque comprende los pasos de:

(i) obtener una parte vegetativa de la planta de una angiosperma que tiene un contenido de lípidos no polares total de entre 30% y 75% (p/p de peso seco),

(ii) extraer aceite de la parte vegetativa de la planta

(iii) recuperar el aceite extraído,

extrayendo de esta manera el aceite vegetal.

6. El proceso de conformidad con la reivindicación 5, que comprende los pasos de:

(a) extraer al menos algún contenido de lípido no polar de la parte vegetativa de la planta como lípido no polar, y (b) recuperar el lípido no polar extraído.

7. El proceso de conformidad con la reivindicación 6, donde

(i) el lípido no polar extraído comprende triacilgliceroles, donde los triacilgliceroles comprenden al menos 90% (p/p) del lípido no polar extraído, y/o

(ii) el lípido no polar extraído comprende esteroles libres, ésteres esteroílicos, esteroil glicósidos, ceras o ésteres de ceras, o cualquier combinación de los mismos.

8. El proceso de conformidad con la reivindicación 6, que comprende uno o más de

a) recuperar el lípido no polar extraído, mediante su almacenamiento en un recipiente,

b) uno o varios de los procesos de desgomado, desodorización, decoloración, secado o fraccionamiento del lípido no polar extraído,

c) eliminar al menos algunas ceras y/o ésteres de ceras del lípido no polar extraído, y

d) analizar la composición de ácido graso del lípido no polar extraído.

9. El proceso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones6 a 8, en donde el volumen del lípido no polar extraído sea al menos 1 litro.

10. El proceso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones5 a 9, que comprende convertir el aceite vegetal en un producto industrial.

11. El proceso de conformidad con la reivindicación10,donde el producto industrial es un producto hidrocarbonado como ésteres de ácidos grasos, preferentemente ésteres de metilo de ácidos grasos y/o un éster de etilo de ácido graso, un alcano como metano, etano o alcanos de cadena más larga, una mezcla de alcanos de cadena más larga, un alqueno, biocombustible, monóxido de carbono y/o gas hidrógeno, un bioalcohol como etanol, propanol o butanol, biocarbón, o una combinación de monóxido de carbono, hidrógeno y biocarbón.

12. El proceso de conformidad con la reivindicación10 u 11, en el que al menos parte del lípido es convertido en producto industrial por medios químicos, donde

(i) los medios químicos comprenden reaccionar el lípido no polar con un alcohol, opcionalmente en la presencia de un catalizador, para producir ésteres de alquilo, y

(ii) opcionalmente, mezclar el éster de alquilo de la etapa i) con un combustible a base de petróleo.

13. El proceso de conformidad con la reivindicación12, caracterizado porque los ésteres de alquilo son ésteres de metilo.

14. El proceso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones1 a 13,donde la parte vegetativa de la planta comprende hojas, tallos o ambos.

15. El proceso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones1 a 14, donde la parte vegetativa de la planta tiene una o más o todas de las siguientes características:

(i) un contenido de lípidos no polares total de al menos 35% (p/p en peso seco),

(ii) un contenido de TAG total de al menos 35% (p/p en peso seco),

(iii) ácido oléico que comprende 19% del contenido de ácidos grasos total en el lípido no polar en la parte vegetativa de la planta,

(iv) ácido palmítico que comprende 20% del contenido de ácidos grasos total en el lípido no polar en la parte vegetativa de la planta,

(v) ácido linoléico que comprende al menos 15% del contenido de ácidos grasos total en el lípido no polar en la parte vegetativa de la planta, y

(vi) ácido a-linoléico que comprende menos del 15% del contenido de ácidos grasos total en el lípido no polar en la parte vegetativa de la planta.

16. El proceso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones1 a 15, donde la parte vegetativa de la planta se cosecha de la planta en un momento entre el momento de la floración de la planta y el momento en que ha comenzado la senescencia de la planta.