CN115747184A - 一种提高微藻中链甘油三酯产率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高微藻中链甘油三酯产率的方法。该方法包括在微藻中过表达蛋白质基因或提高所述蛋白质丰度或提高微藻中所述蛋白质活性，所述蛋白质基因为编码所述蛋白质的基因，所述蛋白质为下述任一种：b1)氨基酸序列为SEQ ID No.2的蛋白质；b2)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；b3)与b1)‑b2)中任一所限定的氨基酸序列具有80％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；b4)在b1)‑b3)中任一所限定的蛋白质的末端连接标签后得到的融合蛋白。该方法可实现所述微藻中链甘油三酯产率的提高。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种提高微藻中链甘油三酯产率的方法。
背景技术
中链甘油三酯(MCT)由1个极性甘油头部和3条8-12碳的脂肪酸(即中链脂肪酸，MCFA)分子组成，当前广泛应用于营养、个人护理和生物能源领域(Bach和Babayan,1982)。在人体消化过程中，MCT上的MCFA被水解下来，可以直接在门静脉系统中运输，从而避免了诸多健康风险(Bloom等,1951)。研究发现，摄入MCT可促进人体能量消耗和脂肪氧化，并提供饱腹感，从而降低后续的能量摄入(Scalfi等,1991；Binnert等,1998)，因此，MCT食品常被当做健康膳食，推荐给专业运动员以及肥胖患者(St-Onge等,2003)。目前，MCT以棕榈油和椰子油为原料进行工业生产，但这些作物只能在热带和亚热带地区种植(Arkcoll,1988；Basiron等,2007；Kinsella等，2017)。而且，通常只有大约3％的植株质量才以油脂的形式储存(Chisti等,2007)，因此导致现有MCT的供给非常低效，进而限制了MCT食品工业的发展。
许多微藻可以利用光和二氧化碳来生产甘油三酯(TAG)，具有较高的光合生长潜力，其油脂可占总干重的50％以上，效率远高于陆生高等植物(胡强等,2008；Wijffels和Barbosa,2010)。然而现存的问题是，微藻中MCT含量仅有0.01％-0.05％(王勤涛等,2021)，因此无法用于MCT的工业化生产。据研究，在微藻中，MCT通过一系列生化反应产生(Nakamura和Li-Beisson,2016)：MCFA-ACP中的ACP被硫酯酶水解成MCFA，随后溶血磷脂酸酰基转移酶将MCFA转化为中链溶血磷脂酸和中链磷脂酸，然后磷脂酸磷酸酶将中链溶血磷脂酸加入到中链甘油二酯中，最后，中链甘油二酯和酰基CoA通过二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)合成MCT，该步骤是整个MCT生成过程中的限速步骤(Kennedy,1957)。
微拟球藻作为工业产油微藻中的杰出代表，因而是应用该方法的理想物种。前期已在微拟球藻中发现了18种MCT分子，占TAG总数的10.3％(李敬等，2014)，表明其体内存在MCT组装机制。研究发现，微拟球藻含有目前已知生物中最多的11个DGAT2拷贝(王冬梅等,2014)。此外，微拟球藻的基因工程工具已有多篇报道(Kang等,2015；王勤涛等,2016；魏力等,2017；王勤涛等,2021)，为新型工业藻株的开发奠定了客观基础。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种提高微藻中链甘油三酯产率的方法。
本发明提供了一种蛋白质，所述蛋白质为下述任一种：
b1)氨基酸序列为SEQ ID No.2的蛋白质；
b2)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
b3)与b1)-b2)中任一所限定的氨基酸序列具有80％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；
b4)在b1)-b3)中任一所限定的蛋白质的末端连接标签后得到的融合蛋白。
本发明还提供了所述蛋白质的相关生物材料，所述相关生物材料为下述任一种：
c1)编码上述蛋白质的核酸分子
c2)含有c1)所述核酸分子的表达盒；
c3)含有c1)所述核酸分子的重组载体、或含有c2)所述表达盒的重组载体；
c4)含有c1)所述核酸分子的重组微藻、或含有c2)所述表达盒的重组微藻、或含有c3)所述重组载体的重组微藻。
可选地，根据上述的相关生物材料，c1)所述核酸分子为如下任一种
1)编码序列是序列表中SEQ ID No.1所示的DNA分子；
2)核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.3所示的DNA分子；
3)与1)或2)限定的核苷酸序列具有90％或90％以上同一性，来源于微藻且编码上述蛋白质的DNA分子；
4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述蛋白质的DNA分子。
SEQ ID No.1所示的DNA分子又被称为编码基因NoDGAT2H。
上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述蛋白质中，所述标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。
本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。
本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
本文中，所述90％以上的同一性可为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
所述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃条件下杂交并洗膜。
可选地，根据上述的相关生物材料，c3)所述的重组载体还包括选自溶磷脂酸酰基转移酶编码基因、WRINKLED1编码基因AtWR1和硫酯酶编码基因中的至少一种。
溶磷脂酸酰基转移酶编码基因可为序列如GenBank：Q42670.1所示的DNA分子，也可为序列如SEQ ID No.6所示的DNA分子。
WRINKLED1编码基因AtWR1可为序列如GenBank：NP_001325502.1所示的DNA分子，也可为序列如SEQ ID No.7所示的DNA分子。
硫酯酶编码基因可为序列如GenBank：MT085746所示的DNA分子，也可为序列如SEQID No.8所示的DNA分子。
c3)所述的重组载体例如为下述实施例制备的pXJ425和/或pXJ182-13。
上述蛋白质或上述相关生物材料的应用也属于本发明的保护范围之内。所述应用为在如下任一中的应用：
(1)制备中链甘油三酯；
(2)提高微藻中链甘油三酯的产量；
(3)构建产中链甘油三酯工程工程微藻。
本发明还提供了一种提高微藻中链甘油三酯产率的方法，包括在微藻中过表达上述蛋白质基因或提高微藻中上述蛋白质丰度或提高微藻中上述蛋白质活性，所述上述蛋白质基因为编码上述蛋白质的基因，实现所述微藻中链甘油三酯产率的提高。
可选地，根据上述的方法，还包括如下至少一步骤：
(1)在微藻中过表达溶磷脂酸酰基转移酶基因或提高微藻中溶磷脂酸酰基转移酶丰度或提高微藻中溶磷脂酸酰基转移酶活性，所述溶磷脂酸酰基转移酶基因为编码溶磷脂酸酰基转移酶的基因，
(2)在微藻中过表达WRINKLED1基因或提高微藻中WRINKLED1丰度或提高微藻中WRINKLED1，所述WRINKLED1基因为编码WRINKLED1的基因，
(3)在微藻中过表达硫酯酶基因或提高微藻中硫酯酶丰度或提高微藻中硫酯酶活性，所述硫酯酶基因为编码硫酯酶的基因。
可选地，过表达基因的实现方式包括：在微藻中导入基因或含有基因的质粒。含有基因的载体例如为下述实施例制备的pXJ425和/或pXJ182-13。
所述导入可为通过化学转化法或电击转化法等任何已知的转化方法将携带本发明DNA分子的载体转化宿主细胞。导入的DNA分子可以是单拷贝也可以是多拷贝。所述导入可以是将外源基因整合到宿主染色体中，也可以是由质粒在染色体外表达。
本文所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)或病毒载体。具体可为下述实施例所述pXJ015。
本发明还提供了一种构建产中链甘油三酯工程微藻的方法，所述方法包括将上述蛋白质基因导入微藻，得到所述产中链甘油三酯工程微藻。
可选地，根据上述的方法，还包括如下至少一步骤：
(1)将溶磷脂酸酰基转移酶基因导入微藻，
(2)将WRINKLED1基因导入微藻；
(3)将硫酯酶基因导入微藻。
本发明还提供了一种制备中链甘油三酯的方法，包括利用上述方法构建的产中链甘油三酯工程微藻生产中链甘油三酯。
编码基因NoDGAT2H及其编码的蛋白质氨基酸序列为微藻中的首次报道。
本发明实施例分离出NoDGAT2H基因的全长CDS，并利用微拟球藻的基因转化系统对其进行内源超表达，实验证明，超表达NoDGAT2H全长CDS能显著提高微拟球藻的MCT产率，表明其在利用基因工程手段提高生物体生产MCT方面的应用价值。
本发明实施例通过NoDGAT2H和其他3个高等植物基因的共表达，能够实现显著提升微拟球藻MCT产率之目的。涉及的多基因共表达方法也为微藻中的首次报道，能够高效提升微拟球藻的MCT产率，证明了其在工业化产油微藻种质改良方面的应用价值，而且在生物能源、保健品及医药行业均具有应用潜力。
附图说明
图1为本发明所用NoDGAT2H的基因结构。
图2为本发明所用NoDGAT2H的超表达载体。
图3为本发明所用的多基因共表达载体。
图4为本发明中实验组与对照组MCT产率的比较结果，星号表明t-test中p≤0.01。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
本发明所述的位于微拟球藻工业藻株IMET1(即，海洋微拟球藻(Nannochloropsisoceanica)IMET1，由美国马里兰大学馈赠获得，并可向公众用于研究方向发放该菌株)核基因组的编码基因NoDGAT2H序列如SEQ ID No.3所示，NoDGAT2H编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，其CDS序列如SEQ ID No.1所示。
下述实施例所用微拟球藻为微拟球藻工业藻株IMET1(即，海洋微拟球藻(Nannochloropsis oceanica)IMET1，由美国马里兰大学馈赠获得)。
实施例1：NoDGAT2H基因的克隆与分析
利用PCR技术从微拟球藻IMET1的cDNA中克隆NoDGAT2H基因，设计所用引物，交由上海生工合成。所用引物具体如下。
1)NoDGAT2H-for：
5’GGTACCACATAATGGCCACAACCTCGTCG 3’；
2)NoDGAT2H-rev：
5’GAATTCCTACCACAACTCCAACTTCGCCCCCT 3’。
所用PCR仪为Eppendorf公司的MasterCycler，反应体系50μL，包括4μL dNTP(2.5mM each，TAKARA)，正反向引物各2μL(10μM)，5μL 10×buffer(Mg2+plus，TAKARA)，0.4μL rTaq酶(5U/μL，TAKARA)，1μL野生IMET1 cDNA模板(50ng/μL)，以及超纯水35.6μL。反应体系如下：起始94℃预变性3min，然后94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃反应7min。
反应结束后，取5μL PCR产物与1μL 6×loading buffer(TAKARA)混匀，点入1％(w/v)的琼脂糖(BIOWEST)凝胶中，在北京六一仪器厂生产的电泳系统上以120V电泳25min后，使用UVP公司的UV凝胶成像仪BioChemiHR进行观察、拍照。用Omega公司的Cycle-PureKit或Gel Extraction Kit从PCR产物中纯化并回收目的片段，其操作完全按照说明书进行。
将得到的纯化片段连入TAKARA公司的pMD18-T载体中获得NoDGAT2H的pMD18-T载体，并使用热激转化的方式将其转入全式金公司的大肠杆菌感受态细胞Trans 5α中，阳性克隆送至Invitrogen公司测序，最终得到NoDGAT2H基因的全长编码序列，参见序列表SEQID NO 1所示序列。此外，通过与基因组序列的比对，得到了NoDGAT2H的基因结构，参见图1，该基因5’端和3’端各有一段侧翼序列(UTR)，基因内部存在3个内含子(intron)。
实施例2：在微拟球藻中的NoDGAT2H超表达及多基因共表达
(一)NoDGAT2H超表达载体pXJ425的构建
构建载体的具体方法如下：通过PCR方法(与实施例1的PCR条件相同)，以实施例1的NoDGAT2H的pMD18-T载体为模板，依据下述引物，扩增获得NoDGAT2H的全长CDS。为了构建克隆的需要，借助引物引入法，在NoDGAT2H的全长CDS 5’端加上酶切位点和保护碱基，并在其3’端加上酶切位点。
1)NoDGAT2H-oe-for：
5’CCGCTCGAGATGGCCACAACCTC 3’；
2)NoDGAT2H-oe-rev：
5’GGGGAATTCCTACCACAACTCCAACTTCG 3’。
将PCR扩增得到产物利用酶切位点定向克隆至前期构建的内源过表达载体pXJ004(记载于Wang Qintao,Lu Yandu,Xin Yi,Wei Li,Huang Shi,Xu Jian,Genome editing ofmodel oleaginous microalgae Nannochloropsis spp.by CRISPR/Cas9,The PlantJournal,2016,88(6):1071-1081)，再将包含β-tublin启动子、NoDGAT2H全长CDS和psbA终止子的片段亚克隆至前期构建的内源过表达载体pXJ015(记载于Wang Qintao,Lu Yandu,Xin Yi,Wei Li,Huang Shi,Xu Jian,Genome editing of model oleaginous microalgaeNannochloropsis spp.by CRISPR/Cas9,The Plant Journal,2016,88(6):1071-1081)中，得到图2所示的超表达载体pXJ425。pXJ425是将pXJ015ECoRI酶切位点和KpnI酶切位点之间的小片段替换为包含β-tublin启动子(序列如SEQ ID No.4所示)、NoDGAT2H全长CDS和psbA终止子(序列如SEQ ID No.5所示)的片段获得的载体。
(二)多基因共表达载体pXJ182-13的构建
本实施例除了NoDGAT2H，还同时采用了前期报道的Cocos nucifera的溶磷脂酸酰基转移酶编码基因CnLPAAT(GenBank：Q42670.1)、拟南芥的WRINKLED1编码基因AtWR1(GenBank：NP_001325502.1)、Cuphea palustris的硫酯酶编码基因mCpTE(GenBank：MT085746)。首先对上述基因进行微拟球藻密码子优化获得优化的CnLPAAT(序列如SEQ IDNo.6所示)、优化的AtWR1(序列如SEQ ID No.7所示)以及优化的mCpTE(序列如SEQ ID No.8所示)，随后将优化的mCpTE连接到PstI酶切过的pXJ182-CnLPAAT(记载于Wang Qintao,LuYandu,Xin Yi,Wei Li,Huang Shi,Xu Jian,Genome editing of model oleaginousmicroalgae Nannochloropsis spp.by CRISPR/Cas9,The Plant Journal,2016,88(6):1071-1081)上，得到pXJ182-2，然后将扩增出的NoDGAT2H全长CDS与NdeI酶切后的pXJ182-2连接形成pXJ182-8，最后将扩增的AtWR1与经EcoRI酶切后的pXJ182-8连接，构建出如图3所示的pXJ182-13。pXJ182-13是将pXJ182-CnLPAAT PstI酶切位点之后插入优化的mCpTE，NdeI酶切位点之后插入NoDGAT2H全场CDS，EcoRI酶切位点之后优化的AtWR1获得的载体。
(三)电穿孔法将载体pXJ425和pXJ182-13导入微拟球藻
在转化前1h，取浓度约为1-3×107cells/mL的对数生长期的微拟球藻藻液，4000g离心5min，弃上清，375mM山梨醇漂洗2次，用山梨醇调整细胞浓度到2×108cells/mL。将浓缩藻体分装为200μL的小份每份加入3μg以SacI内切酶分别处理pXJ425或pXJ182-13得到的线性化载体，以及1μL 95℃变性处理1min的鲑鱼精DNA(15μg/mL)，混匀后冰置10min，同时选取pXJ015空载体作为对照组。将混合物转移入2mm电击杯，以2200V(HV)，50μF进行电击，电击后立即将藻体转移入5mL新鲜f/2培养基。25℃摇床中100rpm，弱光复苏48h后，涂在含有5μg/mL zeocin的f/2平板上，以25℃，50μmol m-2s-1光照培养直至克隆长出。
(四)微拟球藻转化株油脂中MCT的产率分析
油脂提取参考Bligh和Dyer发明的氯仿-甲醇法。总脂的薄层层析分离参考Ghosal的方法。用Agilent气相色谱-四级杆质谱联用仪(GC-MS)分析MCT的流程如下：总脂薄层层析分离得到的甘油三酯用氯仿-甲醇溶解后，将下层氯仿溶液在氮吹仪下吹干后，加入1％硫酸-甲醇溶液(v/v)，并加入50uL正十九烷酸的甲醇溶液(2.25g/L)作为内标，充氮气后用封口膜密封，于70℃烘箱中反应60min进行甲酯化。待冷却后，用正己烷萃取甲酯化产物并用GC-MS分析。各脂肪酸链的量依据其与正十九烷酸的峰面积比值进行估定。
结果如图4所示，与对照组野生株相比，过表达NoDGAT2H的工程株pXJ425的MCT产率上调了16倍，多基因共表达株pXJ182-13的MCT产率上调了132倍，表明实验组的MCT产率显著高于对照组，这证明了上述藻株在MCT工业应用方面具有重要价值。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (10)
1.蛋白质，其特征在于：所述蛋白质为下述任一种：
b1)氨基酸序列为SEQ ID No.2的蛋白质；
b2)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
b3)与b1)-b2)中任一所限定的氨基酸序列具有80％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；
b4)在b1)-b3)中任一所限定的蛋白质的末端连接标签后得到的融合蛋白。
2.权利要求1所述蛋白质的相关生物材料，其特征在于：所述相关生物材料为下述任一种：
c1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子
c2)含有c1)所述核酸分子的表达盒；
c3)含有c1)所述核酸分子的重组载体、或含有c2)所述表达盒的重组载体；
c4)含有c1)所述核酸分子的重组微藻、或含有c2)所述表达盒的重组微藻、或含有c3)所述重组载体的重组微藻。
3.根据权利要求2所述的相关生物材料，其特征在于：c1)所述核酸分子为如下任一种
1)编码序列是序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA分子；
2)核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO.3所示的DNA分子；
3)与1)或2)限定的核苷酸序列具有90％或90％以上同一性，来源于微藻且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；
4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。
4.根据权利要求2所述的相关生物材料，其特征在于：c3)所述的重组载体还包括选自溶磷脂酸酰基转移酶编码基因、WRINKLED1编码基因AtWR1和硫酯酶编码基因中的至少一种。
5.权利要求1所述的蛋白质或权利要求1-4任一所述的相关生物材料在如下任一中的应用：
(1)制备中链甘油三酯；
(2)提高微藻中链甘油三酯的产量；
(3)构建产中链甘油三酯工程工程微藻。
6.一种提高微藻中链甘油三酯产率的方法，其特征在于：包括在微藻中过表达权利要求1所述蛋白质基因或提高微藻中权利要求1所述蛋白质丰度或提高微藻中权利要求1所述蛋白质活性，所述权利要求1所述蛋白质基因为编码权利要求1所述蛋白质的基因，实现所述微藻中链甘油三酯产率的提高。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：还包括如下至少一步骤：
(1)在微藻中过表达溶磷脂酸酰基转移酶基因或提高微藻中溶磷脂酸酰基转移酶丰度或提高微藻中溶磷脂酸酰基转移酶活性，所述溶磷脂酸酰基转移酶基因为编码溶磷脂酸酰基转移酶的基因，
(2)在微藻中过表达WRINKLED1基因或提高微藻中WRINKLED1丰度或提高微藻中WRINKLED1，所述WRINKLED1基因为编码WRINKLED1的基因，
(3)在微藻中过表达硫酯酶基因或提高微藻中硫酯酶丰度或提高微藻中硫酯酶活性，所述硫酯酶基因为编码硫酯酶的基因。
8.一种构建产中链甘油三酯工程微藻的方法，其特征在于：所述方法包括将权利要求1所述蛋白质基因导入微藻，得到所述产中链甘油三酯工程微藻。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：还包括如下至少一步骤：
(1)将溶磷脂酸酰基转移酶基因导入微藻，
(2)将WRINKLED1基因导入微藻；
(3)将硫酯酶基因导入微藻。
10.一种制备中链甘油三酯的方法，其特征在于：包括利用权利要求8或9所述方法构建的产中链甘油三酯工程微藻生产中链甘油三酯。
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