CN109321546A - 磷脂酶c及其编码基因 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及磷脂酶C及其编码基因。还涉及包含所述基因的载体以及宿主细胞。此外，还涉及所述生产所述磷脂酶C的方法以及所述磷脂酶C的用途。

Description

磷脂酶C及其编码基因
技术领域
本发明涉及一种新的磷脂酶C及其编码基因。还涉及包含所述基因的载体以及宿主细胞。此外，还涉及所述生产所述磷脂酶C的方法以及所述磷脂酶C的用途。
背景技术
在制造植物类食用油时，初步经过压榨和浸出等方法从油料种子种提取而得的毛油，一般含有蛋白质、甾醇、磷脂、色素、痕量金属、游离脂肪酸等杂质，影响食用油品质，通常无法食用。所以，需要进行油脂精炼。脱胶是植物油精炼过程中非常重要的一个环节。近年来，酶法脱胶技术由于其反应条件温和、精炼得率高、环保及适用范围广等特点，得到了市场的广泛关注。
磷脂酶是一类广泛存在于动物、植物和微生物中，能够特异性水解甘油磷脂的酶。根据磷脂酶与磷脂作用位点的不同，可将磷脂酶分为磷脂酶A1（PLA1），磷脂酶A2（PLA2），磷脂酶B（PLB），磷脂酶C（PLC）和磷脂酶D（PLD）。目前，在植物油脱胶过程中，主要使用的是PLA1、PLA2、PLB和PLC。PLA1和PLA2能特异性水解磷脂的Sn-1 或Sn-2 位酯键，生成相应的溶血磷脂；PLB能将Sn-1 和Sn-2 位的酯键都水解，生成相应的甘油酰磷脂。溶血磷脂和甘油酰磷脂都具有很强的亲水性，通过水合作用可以方便地除去。PLC能特异性水解磷脂Sn-3位上甘油磷酸酯键，生成相应的甘二酯（DAG）和磷酯酸，而DAG作为中性油在后续的精炼过程中不会被去除，因而能有效提高油脂精炼后的得率。
蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）的磷脂酰胆碱-磷脂酶C (BC-PC-PLC)，是研究较早的一种磷脂酶C。BC-PC-PLC全长为283个氨基酸，其中包含24个氨基酸的信号肽和14个氨基酸的前导肽，成熟肽为245个氨基酸(Johansen, T., Holm,T., Guddal, P.H.,Sletten, K., Haugli, F.B., Little, C.(1988). "Cloning and sequencing of thegene encoding the phosphatidylcholine-preferring phospholipase C of Bacilluscereus. " Gene 65(2):293-304)。BC-PC-PLC的晶体结构已经被报道，其由多个螺旋结构域组成，催化位点为55位天冬氨酸，并且含有至少三个Zn2+ 结合位点(Hough., E.,Hansen, L.K., Birknes, B., Jynge, K., Hansen, S., Hordvik, A., Little, C.,Dodson, E., Derewenda, Z. (1989) "High-resolution (1.5 A) crystal structureof phospholipase C from Bacillus cereus. " Nature. 338:357-60)。
在之前的研究中，专利CN104630174A中通过将BC-PC-PLC的三个糖基化位点即63位，131位和134位天冬酰胺分别突变为天冬氨酸，丝氨酸和天冬氨酸，从而使突变序列表现出的酶活相比于原始序列提高16倍；专利CN2016/110030中在糖基化位点突变序列的基础上再将第56位酪氨酸突变为组氨酸，从而提供一种在低硫酸锌条件下表现出高磷脂酶酶活的变体，相较糖基化位点突变序列，在10μM硫酸锌的条件下，酶活提高了7倍。为了进一步提高该磷脂酶C的脱胶效率，本申请的发明人继续对该磷脂酶C进行突变，希望能够得到酶活进一步提高的突变体，从而能够得到更高效的磷脂酶C，提高脱胶效率，增加脱胶过程中甘二酯(DAG)的得率。
发明内容
本发明在上述现有技术的所有突变的基础上再将BC-PC-PLC第10位的甘氨酸突变为天冬氨酸，其比酶活比突变前的序列提高了83%，且蛋白表达量和单位酶活的脱胶活性没有变化，从而进一步降低了生产成本。
具体地，本发明涉及磷脂酶C，其包含选自以下的序列或由选自以下的序列组成：(a)如SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列，以及(b)由(a)所述的序列经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸后得到的序列，所述取代优选为氨基酸保守性取代，并且所述序列仍然保持SEQ ID NO: 4的功能。
本发明还涉及源自蜡样芽孢杆菌的磷脂酶C，其氨基酸序列选自：
具有与SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列90%以上，优选95%以上，更优选96%以上、更优选97%以上，更优选98%以上，更优选99%以上同源性，且位点10为天冬氨酸；优选的，所述氨基酸序列的位点56为组氨酸、位点63为天冬氨酸、位点131为丝氨酸、和/或位点134为天冬氨酸。
本发明还涉及核酸分子，选自：(a)编码本发明的磷脂酶C的核苷酸序列；以及(b)与(a)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。在一个实施方案中，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
本发明进一步涉及载体，其包含上文所述的核酸分子。本发明还涉及包含上文所述核酸分子或载体的宿主细胞。所述宿主细胞可以选自细菌细胞、真菌细胞，优选酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞和植物细胞。在一个实施方案中，所述宿主细胞是毕赤酵母细胞。
本发明还涉及生产磷脂酶C的方法，包括在宿主细胞中表达编码本发明的磷脂酶C的核酸分子，并且回收得到的多肽。
本发明进一步涉及本发明的磷脂酶C在油脂脱胶中的用途。
本发明还涉及组合物，其包含本发明的磷脂酶C或本发明的宿主细胞的发酵液、发酵上清和/或发酵浓缩液。
本发明另外涉及本发明的宿主细胞的发酵液、发酵上清或发酵浓缩液。
本发明还涉及油脂脱胶的方法，其特征在于，所述方法将本发明的磷脂酶C或本发明的组合物或本发明的宿主细胞的发酵液、发酵上清和/或发酵浓缩液用于所述油脂脱胶。
附图说明
图1是磷脂酶C变体大豆磷脂筛选平板图。
图2是磷脂酶C变体等酶活SDS-PAGE蛋白电泳图。
图3显示磷脂酶mPLC、m2PLC和Purifine®的脱胶实验结果。
序列说明
SEQ ID NO: 1是引入了Y56H 、N63D、N131S、N134D突变的磷脂酶C，即mPLC的DNA编码序列。
SEQ ID NO: 2是引入了Y56H 、N63D、N131S、N134D突变的磷脂酶C，即mPLC的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 3是引入了G10D、Y56H 、N63D、N131S、N134D突变的磷脂酶C，即m2PLC的DNA编码序列。
SEQ ID NO: 4是引入了G10D、Y56H 、N63D、N131S、N134D突变的磷脂酶C，即m2PLC的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 5和6是引物对PLC-F/PLC-R的序列。
具体实施方式
本发明涉及磷脂酶C，其包含选自以下的序列或由选自以下的序列组成：
(a)如SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列，以及
(b)由(a)所述的序列经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸后得到的序列，所述取代优选为氨基酸保守性取代，并且所述序列仍然保持SEQ ID NO: 4的功能。
在一个实施方案中，本发明的磷脂酶C的序列如SEQ ID NO:4所示。此外，本发明的SEQ ID NO:4还可以具有氨基酸残基的一个或几个，例如1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3或1-2个缺失、插入或取代，这些改动产生沉默变化或者产生功能上等效的酶。在保持酶活性的情况下，被设计的氨基酸取代可以根据残基在极性、电荷、可溶性、亲水性、疏水性和/或双亲性质上的相似性。例如，带负电的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有相似的亲水性的具有不带电的极性头部的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。
保守取代可以根据下表来进行。在第二栏中属于同一个分区的氨基酸可以相互取代，在优选的情况下第三栏中同一行的氨基酸可互相取代：
本发明包括通过对SEQ ID NO:4进行删除、插入或保守取代得到的、仍然保留其活性的序列。其应该被视为SEQ ID NO:4的等同方案而得到保护。
本发明还涉及核酸分子，其选自：
(a)编码本发明的磷脂酶C的核苷酸序列；以及
(b)与(a)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列，互补可以是部分或完全互补。
在一个实施方案中，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示。
技术人员将会认为，由于遗传密码的简并性，多种不同的核苷酸序列可以编码同样的酶。另外，可以认识到，技术人员能够使用常规技术进行不影响本发明的核苷酸序列所编码的酶活性的核苷酸取代，这样可以反映表达本发明的酶所用的任何特定的宿主生物体的密码子偏倚性。
本发明也包括与本文列出的SEQ ID NO: 3和4具有一定同一性的序列。合适的核酸或氨基酸序列与本文报道的SEQ ID NO: 3和4具有至少约50%，优选至少60%，更优选至少70%，更优选至少80%，甚至更优选至少85%，甚至更优选至少90%，甚至更优选至少95%，最优选至少98%的同一性。其应该被视为SEQ ID NO:3和4的等同方案而得到保护。
具体地，本发明还涉及一种源自蜡样芽孢杆菌的磷脂酶C，其氨基酸序列选自：
具有与SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列90%以上，优选95%以上，更优选96%以上、更优选97%以上，更优选98%以上，更优选99%以上同源性，且位点10为天冬氨酸；优选的，所述氨基酸序列的位点56为组氨酸、位点63为天冬氨酸、位点131为丝氨酸、和/或位点134为天冬氨酸。
百分比同一性是两条或更多条多肽序列之间或两条或更多条多核苷酸序列之间的关系，该关系通过对序列进行比较确定。本领域中，“同一性”也指多肽或多核苷酸序列之间的序列相关性程度，根据具体情况，通过此类线性序列的匹配情况进行测定。“同一性”能够通过已知方法容易地计算，所述方法包括但不限于下述的那些方法：ComputationalMolecular Biology（Lesk，A. M.，Ed.） Oxford University Press，NY（1988）；Biocomputing:Informatics and Genome Projects（Smith，D. W.，Ed.） Academic Press，NY（1993）；Computer Analysis of Sequence Data，Part I（Griffin，A. M.，和Griffin，H.G.，Eds.） Humana Press，NJ（1994）；Sequence Analysis in Molecular Biology（vonHeinje，G.，ed.） Academic Press（1987）；以及Sequence Analysis Primer（Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.） Stockton Press，NY（1991）。确定同一性的方法在可公开获得的计算机程序中编成了代码。序列比对和同一性百分比计算可使用LASERGENE生物信息学计算软件包的Megalign程序（DNASTAR Inc.，Madison，WI）、Vector NTI v. 7.0的AlignX程序（Informax，Inc.，Bethesda，MD）、或EMBOSS Open Software Suite（EMBL-EBI；Rice等人，Trends in Genetics 16，（6）:276-277（2000））。序列多重比对可使用Clustal比对方法进行（即 CLUSTALW；例如1.83版）（Higgins和Sharp，CABIOS，5:151-153（1989）；Higgins等人，Nucleic Acids Res. 22:4673-4680（1994）；以及Chenna等人，Nucleic Acids Res 31（13）:3497-500（2003）），它们得自European Molecular Biology Laboratory via theEuropean Bioinformatics Institute），使用默认参数。
本发明还提供了包含所述核酸分子的载体，以及包含所述核酸分子或所述载体的宿主细胞。
“载体”是指通常携带有不属于细胞中心代谢的部分的基因的染色体外元件，并且常常是环状双链DNA分子的形式。此类元件可为得自任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列、线性或环状的单链或双链DNA或RNA，其中许多核苷酸序列已经被接合或重组到特定构建体中，该构建体能够将所选基因产物的启动子片段和DNA序列连同合适的3'非翻译序列一起导入细胞。
本发明序列的基因和基因产物可在异源宿主细胞，例如细菌细胞、真菌细胞，例如酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞和植物细胞。用于表达本发明的核酸分子的异源宿主细胞可以是存在于真菌或细菌家族中并在宽温度、pH值和溶剂耐受性范围内生长的微生物宿主。例如，预期任何细菌、酵母和丝状真菌可为表达本发明核酸分子的合适宿主。宿主菌株的实例包括但不限于细菌、真菌或酵母物种例如毕赤酵母属（Pichia）、曲霉属（Aspergillus）、木霉属（Trichoderma）、糖酵母属（Saccharomyces）、发夫酵母属（Phaffia）、克鲁维酵母属（Kluyveromyces）、耶氏酵母属（Yarrowia）、假丝酵母属（Candida）、汉逊酵母属（Hansenula）、沙门氏菌属（Salmonella）、芽孢杆菌属（Bacillus）、不动杆菌属（Acinetobacter）、发酵单胞菌属（Zymomonas）、土壤杆菌属（Agrobacterium）、赤细菌属（Erythrobacter）、绿菌属（Chlorobium）、着色菌属（Chromatium）、黄杆菌属（Flavobacterium）、噬纤维菌属（Cytophaga）、红细菌属（Rhodobacter）、红球菌属（Rhodococcus）、链霉菌属（Streptomyces）、短杆菌属（Brevibacterium）、棒状杆菌属（Corynebacteria）、分支杆菌属（Mycobacterium）、异常球菌属（Deinococcus）、埃希氏菌属（Escherichia）、欧文氏菌属（Erwinia）、泛菌属（Pantoea）、假单胞菌属（Pseudomonas）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、甲基单胞菌属（Methylomonas）、甲基细菌属（Methylobacter）、甲基球菌属（Methylococcus）、甲基弯菌属（Methylosinus）、甲基微菌属（Methylomicrobium）、甲基孢囊菌属（Methylocystis）、产碱菌属（Alcaligenes）、集胞蓝细菌属（Synechocystis）、聚球蓝细菌属（Synechococcus）、鱼腥蓝细菌属（Anabaena）、硫杆菌属（Thiobacillus）、甲烷杆菌属（Methanobacterium）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）和粘球菌属（Myxococcus）物种。在一个实施方案中，所述宿主细胞是毕赤酵母细胞。
可用于转化上述宿主细胞的载体是本领域熟知的。通常，载体包含指导相关基因转录和翻译的序列、可选标记和允许自主复制或染色体整合的序列。合适的载体包含含有转录起始控制的基因5'区域和控制转录终止的DNA片段3'区域。
本发明还涉及生产磷脂酶C的方法，包括在宿主细胞中表达编码本发明的磷脂酶C的核酸分子，并且回收得到的多肽。
可应用多种培养方法以制备本发明的酶。例如，从重组微生物宿主中大规模生产特定基因产物可通过分批、分批补料和连续培养方法进行。
分批和补料分批培养方法在本领域内是常用的且众所周知，并且实例可见于如下文献：Thomas D. Brock in Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology，第二版，Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA（1989）），以及Deshpande，Mukund V.，（Appl. Biochem. Biotechnol.，36:227-234（1992）。
本发明的酶的商业生产也可通过连续培养进行。连续培养是一种开放式系统，其中将设定好的培养基连续加入生物反应器中，并同时移出等量条件培养基用于加工。连续培养一般使细胞维持在其中细胞主要处于对数生长期的恒定高液相密度。或者，连续培养可以用固定化细胞来进行，其中连续添加碳和营养素，且连续从细胞团块中取出有价值的产物、副产物或废弃物。细胞固定可使用范围广泛的固体载体进行，所述固体载体由天然材料和/或合成材料组成。
从分批发酵、分批补料发酵、或连续培养中回收期望的酶可通过本领域技术人员已知的任何方法完成。例如，当在细胞内生产酶时，通过离心或膜过滤从培养基中分离细胞浆液，任选地用水或期望pH的含水缓冲液洗涤，然后将期望pH的含水缓冲液中的细胞浆液悬浮使其匀化，生产出包含需要的酶的细胞提取物。
本发明还涉及组合物，其包含本发明的磷脂酶C或本发明的宿主细胞的发酵液、发酵上清和/或发酵浓缩液。本发明的酶组合物可为任何适于使用的形式，例如，去除或未去除细胞的粗发酵液，含或不含细胞碎片的细胞裂解物，半纯化或纯化的酶组合物，或宿主细胞作为酶的来源。所述酶组合物可为干粉或颗粒、无粉尘的颗粒、液体、稳定化液体或稳定化受保护的酶。液体酶组合物可根据确立的工艺，例如通过添加稳定剂如糖、糖醇或其他多元醇，和/或乳酸或其他有机酸来稳定化。
本发明另外涉及本发明的宿主细胞的发酵液、发酵上清或发酵浓缩液。
本发明还涉及本发明的磷脂酶C在油脂脱胶中的用途。将本发明的磷脂酶C用于油脂脱胶时，相对于现有技术的磷脂酶C，比酶活提高了83%，但单位酶活的脱胶能力却没有降低，另外蛋白表达量也基本保持不变。总的来说，突变体大大提高了磷脂酶C的酶活收获总量，降低了生产成本。
本发明还涉及一种油脂脱胶的方法，其特征在于，所述方法将本发明的磷脂酶C或本发明的组合物或本发明的宿主细胞的发酵液、发酵上清和/或发酵浓缩液用于所述油脂脱胶。
当数量、浓度或其他数值或参数以范围、优选范围或优选上限数值和优选下限数值的列表形式给出时，其应理解为具体地公开由任何范围上限或优选数值和任何范围下限或优选数值的任何一对所构成的所有范围，而不管所述范围是否被单独地公开。凡在本文中给出某一数值范围之处，该范围均旨在包含其端点，以及位于该范围内的所有整数和分数，除非另行指出。当定义一个范围时，不希望范围限定于所列举的具体数值。
提供以下实施例以展示优选实施方案。本领域的技术人员应认识到下文实施例中公开的技术代表本发明人发现的在本文公开方法的实施中功能良好的技术，因此可认为其构成实施的优选模式。然而，按照本公开，本领域的技术人员将认识到在公开的具体实施方案中能进行不脱离本文公开方法的实质和范围的许多改变，并且仍然获得同样的或类似的结果。
实施例
实验材料
实验菌株和质粒
菌株：毕赤酵母SMD1168 (Invitrogen，货号C175-00)，大肠杆菌DH5a (TAKARA，货号D9057A)。
质粒：pAO815质粒 (Invitrogen，货号V180-20)，pAO-mPLC质粒(本文构建)，pAO-m2PLC质粒(本文构建)。
2.培养基和溶液
LB液体培养基：0.5% 酵母提取物，1% 胰化蛋白胨，1% NaCl，pH7.0。
LB固体培养基：在LB液体培养基中加入浓度1.5%的琼脂。
YPD液体培养基：1% 酵母提取物，2% 蛋白胨，2% 葡萄糖。
YPD固体培养基：在LB液体培养基中加入浓度2%的琼脂。
MGYS固体培养基：1.34% 酵母氮源碱（YNB）含硫酸铵不含氨基酸，1%甘油，1M 山梨醇，4×10-5%D-生物素，2%琼脂。
BMM-大豆磷脂筛选培养基：1.34% 酵母氮源碱（YNB）含硫酸铵不含氨基酸，4×10-5%D-生物素，0.5% 甲醇(灭菌后加入)，2% 大豆磷脂乳化液，0.1M 柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液pH6.6，2%琼脂，添加10uM的ZnSO4·7H2O。
2%大豆磷脂乳化液：2g大豆磷脂，100ml H2O，用高速匀浆机 8000rpm 匀浆 1min。
BMGY液体培养基：1% 酵母提取物，2% 蛋白胨，1.34% 酵母氮源碱（YNB）含硫酸铵不含氨基酸，1%甘油，4×10-5% D-生物素，0.1M 磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液 pH6.0。
BMMY液体培养基：1% 酵母提取物，2% 蛋白胨，1.34% 酵母氮源碱（YNB）含硫酸铵不含氨基酸，0.3% ZnSO4·7H2O，0.5%甲醇(灭菌后加入)，4×10-5% D-生物素(灭菌后加入)，0.1M 柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液 pH6.6。
对硝基苯基磷酸胆碱 (p-nitrophenylphosphorylcholine，pNPPC) 法检测检测PLC 活力反应缓冲液：0.1 M 硼酸-硼酸钠缓冲液（pH 7.6），20 mM pNPPC，1% Triton-X-100，1 mM CaCl2。
限制性内切酶HindIII，SalI，EcoRI (购自纽英伦生物技术（北京）有限公司)
PCR酶：TaKaRa Taq，PrimeSTAR®HS DNA聚合酶 (购自宝生物工程(大连)有限公司)
T4 DNA 连接酶(购自富酶泰斯有限公司)
实施例1：表达载体pAO-mPLC的构建
以全基因合成的方式（上海生工），合成引入了Y56H、N63D、N131S、N134D突变的变体BC-PC-PLC序列mPLC（见SEQ ID NO: 1）。使用PrimeSTAR®HS DNA聚合酶和引物对PLC-F/PLC-R（见表1），通过PCR扩增得到约750 bp片段。将该约750 bp片段通过HindIII和EcoRI酶切位点克隆至pAO815中，得到pAO-mPLC载体。
表1 引物序列
引物名称 序列
PLC-F CTGAAGCTTGGTCAGCTGAGGACAAGCAT（SEQ ID NO: 5）
PLC-R CCGGAATTCTTACCTGTCACCGTAAGTGTCGAACCATA（SEQ ID NO: 6）
实施例2：pAO-mPLC突变体文库构建及筛选
以pAO-mPLC载体为模板，使用TaKaRa Taq酶和引物对PLC-F/PLC-R（见表1）进行易错PCR (在PCR时额外添加0.3 mM的MnCl2)，得到大小为约755 bp的突变扩增子片段集合。通过HindIII和EcoRI酶切位点将得到的片段克隆至pAO815，并将得到的载体转化入大肠杆菌DH5α菌株，一共得到1×104个突变体。
将每1×103个pAO-mPLC突变体用2 ml的无菌水洗至8 ml的LB液体培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)中，37°C培养4 h。抽提质粒，用限制性内切酶SalI进行线性化，回收约8.5 kb的片段。取500 ng载体(使用尽量少的DNA，保证大多数阳性转化子含单拷贝PLC基因)，用电转化法将载体转化至毕赤酵母SMD1168菌株的感受态细胞中。将转化物接种于MGYS平板上，30°C培养3天，得到pAO-mPLC的毕赤酵母突变体文库。挑取平板上的单克隆，至BMM-大豆磷脂筛选平板上。选取白色沉淀圈大的克隆，该克隆编号m2，见图1。
实施例3：pAO-mPLC突变体序列分析
将m2菌株接种于3 ml YPD液体培养基中，30°C培养过夜，抽提基因组DNA。以m2菌株的基因组DNA为模板，使用PrimeSTAR®HS DNA聚合酶和引物对PLC-F/PLC-R（见表1）进行PCR扩增，得到m2菌株中PLC的DNA序列。将得到的序列送往上海生工生物工程公司，用引物对PLC-F/PLC-R（见表1）进行测序。m2的PLC的DNA测序结果有1个碱基发生了突变，第10位甘氨酸突变为天冬氨酸 (GGT→GAT)。
实施例4：表达载体pAO-m2PLC的构建
以全基因合成的方式（上海生工），合成引入了G10D、Y56H、N63D、N131S、N134D突变的变体BC-PC-PLC序列m2PLC（SEQ ID NO: 3）。使用PrimeSTAR®HS DNA聚合酶和引物对PLC-F/PLC-R（见表1），通过PCR扩增得到约750 bp片段。将该约750 bp片段通过HindIII和EcoRI酶切位点克隆至pAO815中，得到pAO-m2PLC载体。
实施例5：磷脂酶C变体的毕赤酵母表达菌株构建及筛选
表达载体构建过程见实施例1和实施例2。将表达载体用限制性内切酶SalI线性化，凝胶回收约8.5 kb片段。利用LiAC法制备毕赤酵母SMD1168菌株的感受态细胞，再通过电转化将500 ng线性化的表达载体转化至SMD1168感受态细胞。将转化物接种于MGYS平板上，30°C培养3天。挑取平板上的单克隆，至BMM-大豆磷脂筛选培养基平板上，选取白色沉淀圈大的克隆，从而获得相对应的磷脂酶C变体表达的菌株。
实施例6：磷脂酶C变体的毕赤酵母表达菌株的发酵及酶活检测
取两种磷脂酶C变体的表达菌株，先在液体YPD中活化，然后接种于BMGY培养基中，在30°C下，220 rpm振荡培养过夜。将培养物转至BMMY液体培养基中，初始OD600为6。用2% 甲醇进行诱导，在24 h和32 h后各补加1%甲醇，48 h和56 h后各补加1%甲醇，72 h取样。将获得的样品用截留分子量为10 kDa的超滤管进行超滤脱盐浓缩10倍。
蛋白浓度测定：取1μL浓缩酶液，50mM pH6.0 PBS缓冲液稀释到10倍。取10μL与Bradford试剂（上海生工）反应，室温放置10min后，测量OD600光吸收值增量。
pNPPC法磷脂酶C测定方法：取两支干净的离心管，其中一个做样品管，一个做空白对照管。每个离心管中加入600μL反应缓冲液，样品管加入25μL浓缩好的待测酶液，空白管不加。两管同时放在37 °C恒温水浴锅中反应15min，立即加入500μL 无水乙醇终止反应。空白管加入25μL待测酶液，405nm测定吸光度，用空白管校正零点。
脂肪酶酶活单位的定义：在温度为37 °C，pH值7.6的条件下，1 min催化底物释放出1 μmol磷酸胆碱的酶量为1个磷脂酶活力单位（U）。
用Bradford试剂测定突变菌株的摇瓶发酵液的蛋白浓度，从而得出比酶活。见表2，结果显示，m2PLC比mPLC的比酶活提高了83%，且蛋白表达量基本没有减低。
SDS-PAGE蛋白电泳：按照浓缩酶液的表观酶活活力，进行等酶活SDS-PAGE电泳，以mPLC酶液表观酶活为基准，将m2PLC酶液酶活用水稀释到与mPLC相同，再进行等体积上样。具体结果见图2。结果显示如果按照等酶活上样电泳，m2PLC的磷脂酶C目的条带浓度明显低于mPLC，与测定的比酶活数据基本一致。
表2 磷脂酶C变体比酶活对比
菌株 蛋白含量 mg/L 表观酶活 U 比酶活 U/mg
mPLC 19±1 10±2 0.53
m2PLC 18.5±0.9 18±3 0.97
实施例7：磷脂酶C变体的脱胶试验
取大豆毛油100g，加热至55°C，分别加入相同酶活单位的磷脂酶C变体酶液（以200ppmmPLC的酶活单位为基准），并以DSM的商品酶Purifine®作为对照。使得体系中的水相3%，用高速剪切机高速(10000rpm)剪切1min。在55°C下750rpm搅拌反应2h，升温至85°C，维持5min。样品12000rpm离心10min，取约10g上层油样，用HPLC检测其DAG含量。
mPLC样品和m2PLC及对照相对于毛油的DAG增量如图3所示，结果显示添加相同酶活的酶液（即存在更少量的m2PLC蛋白质）的情况下，m2PLC脱胶DAG增量与mPLC一致，略高于DSM的商品酶Purifine® 。
结论
m2PLC相较于突变前的序列，比酶活提高了83%，但单位酶活的脱胶能力却没有降低，另外蛋白表达量也基本保持不变。总的来说，突变体大大提高了磷脂酶C的酶活收获总量，降低了生产成本。
序列表
<110> 丰益（上海）生物技术研发中心有限公司
<120> 磷脂酶C及其编码基因
<130> CPCH1762920
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 738
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 磷脂酶C
<400> 1
tggtcagctg aggacaagca taaggaaggt gtgaatagtc acttatggat cgtgaaccgt 60
gccattgata taatgtctag gaatacaact ctggttaagc aagatagagt tgctcaattg 120
aatgaatggc gtacagagct agagaatggc atctacgctg ctgatcatga aaacccctat 180
tacgatgaca gtaccttcgc ttctcacttt tacgatccag acaacggaaa gacatatatc 240
ccattcgcca agcaagctaa ggagactgga gctaagtact tcaagttggc tggagagtca 300
tacaagaata aagacatgaa gcaggccttc ttttatcttg ggttgtcatt gcattatttg 360
ggcgatgtca accaacctat gcatgccgca tcctttacgg acctgtccta tccacagggt 420
tttcactcca agtacgagaa ctttgtcgat actattaaag acaactacaa agttaccgat 480
gggaacggat attggaattg gaaaggcacc aaccctgaag aatggattca cggtgcagca 540
gtagttgcaa aacaggacta ctctggaatt gtcaatgaca ataccaaaga ttggtttgtg 600
aaagccgcag tctcccagga atatgcagat aaatggagag ctgaagttac acctatgact 660
ggtaaacgac taatggatgc ccaaagagtt actgctggtt acattcaatt atggttcgac 720
acttacggtg acaggtaa 738
<210> 2
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 磷脂酶C
<400> 2
Trp Ser Ala Glu Asp Lys His Lys Glu Gly Val Asn Ser His Leu Trp
1 5 10 15
Ile Val Asn Arg Ala Ile Asp Ile Met Ser Arg Asn Thr Thr Leu Val
20 25 30
Lys Gln Asp Arg Val Ala Gln Leu Asn Glu Trp Arg Thr Glu Leu Glu
35 40 45
Asn Gly Ile Tyr Ala Ala Asp His Glu Asn Pro Tyr Tyr Asp Asp Ser
50 55 60
Thr Phe Ala Ser His Phe Tyr Asp Pro Asp Asn Gly Lys Thr Tyr Ile
65 70 75 80
Pro Phe Ala Lys Gln Ala Lys Glu Thr Gly Ala Lys Tyr Phe Lys Leu
85 90 95
Ala Gly Glu Ser Tyr Lys Asn Lys Asp Met Lys Gln Ala Phe Phe Tyr
100 105 110
Leu Gly Leu Ser Leu His Tyr Leu Gly Asp Val Asn Gln Pro Met His
115 120 125
Ala Ala Ser Phe Thr Asp Leu Ser Tyr Pro Gln Gly Phe His Ser Lys
130 135 140
Tyr Glu Asn Phe Val Asp Thr Ile Lys Asp Asn Tyr Lys Val Thr Asp
145 150 155 160
Gly Asn Gly Tyr Trp Asn Trp Lys Gly Thr Asn Pro Glu Glu Trp Ile
165 170 175
His Gly Ala Ala Val Val Ala Lys Gln Asp Tyr Ser Gly Ile Val Asn
180 185 190
Asp Asn Thr Lys Asp Trp Phe Val Lys Ala Ala Val Ser Gln Glu Tyr
195 200 205
Ala Asp Lys Trp Arg Ala Glu Val Thr Pro Met Thr Gly Lys Arg Leu
210 215 220
Met Asp Ala Gln Arg Val Thr Ala Gly Tyr Ile Gln Leu Trp Phe Asp
225 230 235 240
Thr Tyr Gly Asp Arg
245
<210> 3
<211> 738
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 磷脂酶C
<400> 3
tggtcagctg aggacaagca taaggaagat gtgaatagtc acttatggat cgtgaaccgt 60
gccattgata taatgtctag gaatacaact ctggttaagc aagatagagt tgctcaattg 120
aatgaatggc gtacagagct agagaatggc atctacgctg ctgatcatga aaacccctat 180
tacgatgaca gtaccttcgc ttctcacttt tacgatccag acaacggaaa gacatatatc 240
ccattcgcca agcaagctaa ggagactgga gctaagtact tcaagttggc tggagagtca 300
tacaagaata aagacatgaa gcaggccttc ttttatcttg ggttgtcatt gcattatttg 360
ggcgatgtca accaacctat gcatgccgca tcctttacgg acctgtccta tccacagggt 420
tttcactcca agtacgagaa ctttgtcgat actattaaag acaactacaa agttaccgat 480
gggaacggat attggaattg gaaaggcacc aaccctgaag aatggattca cggtgcagca 540
gtagttgcaa aacaggacta ctctggaatt gtcaatgaca ataccaaaga ttggtttgtg 600
aaagccgcag tctcccagga atatgcagat aaatggagag ctgaagttac acctatgact 660
ggtaaacgac taatggatgc ccaaagagtt actgctggtt acattcaatt atggttcgac 720
acttacggtg acaggtaa 738
<210> 4
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 磷脂酶C
<400> 4
Trp Ser Ala Glu Asp Lys His Lys Glu Asp Val Asn Ser His Leu Trp
1 5 10 15
Ile Val Asn Arg Ala Ile Asp Ile Met Ser Arg Asn Thr Thr Leu Val
20 25 30
Lys Gln Asp Arg Val Ala Gln Leu Asn Glu Trp Arg Thr Glu Leu Glu
35 40 45
Asn Gly Ile Tyr Ala Ala Asp His Glu Asn Pro Tyr Tyr Asp Asp Ser
50 55 60
Thr Phe Ala Ser His Phe Tyr Asp Pro Asp Asn Gly Lys Thr Tyr Ile
65 70 75 80
Pro Phe Ala Lys Gln Ala Lys Glu Thr Gly Ala Lys Tyr Phe Lys Leu
85 90 95
Ala Gly Glu Ser Tyr Lys Asn Lys Asp Met Lys Gln Ala Phe Phe Tyr
100 105 110
Leu Gly Leu Ser Leu His Tyr Leu Gly Asp Val Asn Gln Pro Met His
115 120 125
Ala Ala Ser Phe Thr Asp Leu Ser Tyr Pro Gln Gly Phe His Ser Lys
130 135 140
Tyr Glu Asn Phe Val Asp Thr Ile Lys Asp Asn Tyr Lys Val Thr Asp
145 150 155 160
Gly Asn Gly Tyr Trp Asn Trp Lys Gly Thr Asn Pro Glu Glu Trp Ile
165 170 175
His Gly Ala Ala Val Val Ala Lys Gln Asp Tyr Ser Gly Ile Val Asn
180 185 190
Asp Asn Thr Lys Asp Trp Phe Val Lys Ala Ala Val Ser Gln Glu Tyr
195 200 205
Ala Asp Lys Trp Arg Ala Glu Val Thr Pro Met Thr Gly Lys Arg Leu
210 215 220
Met Asp Ala Gln Arg Val Thr Ala Gly Tyr Ile Gln Leu Trp Phe Asp
225 230 235 240
Thr Tyr Gly Asp Arg
245
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物
<400> 5
ctgaagcttg gtcagctgag gacaagcat 29
<210> 6
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物
<400> 6
ccggaattct tacctgtcac cgtaagtgtc gaaccata 38

Claims (10)

1.磷脂酶C，其包含选自以下的序列或由选自以下的序列组成：
(a)如SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列，以及
(b)由(a)所述的序列经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸后得到的序列，所述取代优选为氨基酸保守性取代，并且所述序列仍然保持SEQ ID NO: 4的功能。
2.源自蜡样芽孢杆菌的磷脂酶C，其氨基酸序列选自：
具有与SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列90%以上，优选95%以上，更优选98%以上同源性，且位点10为天冬氨酸；优选的，所述氨基酸序列的位点56为组氨酸、位点63为天冬氨酸、位点131为丝氨酸、和/或位点134为天冬氨酸。
3.核酸分子，选自：
(a)编码权利要求1或2所述的磷脂酶C的核苷酸序列；
(b)与(a)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列；以及
(c)如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
4.载体，其包含权利要求3的核酸分子。
5.宿主细胞，其包含权利要求3的核酸分子，或权利要求4的载体；优选地，所述宿主细胞选自细菌细胞、真菌细胞，优选酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞和植物细胞；优选地，所述酵母细胞为毕赤酵母细胞。
6.生产磷脂酶C的方法，包括在宿主细胞中表达编码权利要求1的磷脂酶C的核酸分子，并且回收得到的多肽。
7.组合物，其包含权利要求1或2所述的磷脂酶C或权利要求5所述的宿主细胞的发酵液、发酵上清和/或发酵浓缩液。
8.权利要求5所述的宿主细胞的发酵液、发酵上清或发酵浓缩液。
9.权利要求1或2所述的磷脂酶C或权利要求7所述的组合物或权利要求5所述的宿主细胞的发酵液、发酵上清和/或发酵浓缩液在油脂脱胶中的用途。
10.油脂脱胶的方法，其特征在于，所述方法将权利要求1或2所述的磷脂酶C或权利要求7的组合物或权利要求5所述的宿主细胞的发酵液、发酵上清和/或发酵浓缩液用于所述油脂脱胶。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020135658A1 (zh) * 2018-12-28 2020-07-02 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 具有磷脂酶c活性的多肽及其用途
WO2023225459A2 (en) 2022-05-14 2023-11-23 Novozymes A/S Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015017045A1 (en) * 2013-07-03 2015-02-05 Keclon Sa Modified bacillus cereus phospholipase c protein and method of processing vegetable oil
CN104630174A (zh) * 2013-11-07 2015-05-20 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 磷脂酶c突变体及其用途
CN106884009A (zh) * 2015-12-16 2017-06-23 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 高效的不依赖锌离子的磷脂酶c突变体

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2451266T3 (es) * 2006-09-21 2014-03-26 Dsm Ip Assets B.V. Fosfolipasas, ácidos nucleicos que las codifican, y métodos para obtenerlas y usarlas
CN201610030U (zh) 2009-11-06 2010-10-20 福建新代实业有限公司 可调式削笔机滚刀组合

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015017045A1 (en) * 2013-07-03 2015-02-05 Keclon Sa Modified bacillus cereus phospholipase c protein and method of processing vegetable oil
CN104630174A (zh) * 2013-11-07 2015-05-20 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 磷脂酶c突变体及其用途
CN106884009A (zh) * 2015-12-16 2017-06-23 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 高效的不依赖锌离子的磷脂酶c突变体

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NINA M. ANTIKAINEN 等: "Altering Substrate Specificity of Phosphatidylcholine-Preferring Phospholipase C of Bacillus cereus by Random Mutagenesis of the Headgroup Binding Site", 《BIOCHEMISTRY》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020135658A1 (zh) * 2018-12-28 2020-07-02 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 具有磷脂酶c活性的多肽及其用途
WO2023225459A2 (en) 2022-05-14 2023-11-23 Novozymes A/S Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections

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