CN108118039A

CN108118039A - 一种磷脂酶c突变体

Info

Publication number: CN108118039A
Application number: CN201611063061.8A
Authority: CN
Inventors: 宣姚吉; 蔡南海; 牛其文
Original assignee: Wilmar Shanghai Biotechnology Research and Development Center Co Ltd
Current assignee: Wilmar Shanghai Biotechnology Research and Development Center Co Ltd
Priority date: 2016-11-28
Filing date: 2016-11-28
Publication date: 2018-06-05
Anticipated expiration: 2036-11-28
Also published as: CN108118039B

Abstract

本发明提供一种磷脂酶C突变体。具体而言，本发明提供一种分离的氨基酸序列，所述氨基酸序列含有：(1)SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列；或(2)在(1)所述的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，同时保留SEQ ID NO：8所具备的磷脂酶C活性的由(1)衍生的多肽。本发明也涉及所述氨基酸序列的编码序列、核酸构建体、宿主细胞以及相应的用途。

Description

一种磷脂酶C突变体

技术领域

本发明涉及磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C突变体及其用途，具体地涉及通过分子生物学中的突变筛选方法获得的磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C突变体及其用途。

背景技术

脱胶是油脂精炼的一个重要步骤，而传统的水化脱胶法经济成本高，物料能耗大，环境污染重，所以近些年，很多努力致力于将酶法脱胶用于油脂精炼中的脱胶环节，并取得了很大的进展。同传统方法相比,酶法脱胶能够提高经济效益，做到节能减排，对生态环境污染少，在环保、经济、质量等方面具有较大的优势。油脂脱胶所用的酶即为磷脂酶。磷脂酶具备水解一个或多个甘油磷脂酯键的能力，它代表着一类脂肪酶、酰基水解酶和磷酸酯酶。磷脂酶根据该酶在磷脂分子上作用位点的不同，可以分为磷脂酶A1(PLA1)、磷脂酶A2(PLA2)、磷脂酶C(PLC)和磷脂酶D(PLD)。

磷脂酶C(Phospholipase C，简称PLC)，是一种能够水解甘油磷脂C3位点磷脂酰键生成甘油二酯和磷酸胆碱、磷酸肌醇、磷酸乙醇胺等的脂类水解酶。磷脂酶C广泛存在于动植物和微生物中，动植物来源PLC一般位于细胞膜上，结构较为复杂，属于内源性磷脂酶C，难以分离。同其他脱胶酶相比，磷脂酶C(PLC)表现出更大的优势，比如，增加甘二酯(DAG)的得率，以及减少得油量的损失。

微生物来源的磷脂酶C结构一般较为简单，这些酶已经从各种微生物中分离得到，细菌来源的较多包括产气荚膜梭菌Clostridium perfringens〔Yun T,Siebel C.Cloningand expression of the PLC gene from Clostridium perfringens and Clostridiumbifermentants[J].Infection and immunity,1989,2:468-476〕、双酶梭菌C.bifermentans、Burkholderia pseudomallei、Bacillus cereus、蕈状芽孢杆菌Bacillusmycoiddes、苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis、单核细胞增多性李斯特氏菌Listeria monocytogenes、铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa、荧光假单胞菌P.fluorescens、葡萄球菌Straphylococus aureus、鲍氏不动杆菌Acinetobacterbaumannii、链霉菌Streptomyces clavuligerus、伯克氏菌属Burkholderi等等。来自放线菌的有八丈岛链霉菌Streptomyces hachijyoensis等。还有来自酵母菌的白色念珠菌Candia albicans〔Analuz E,Juan-Jose R,Rosario Cueva.Sequencing of a 4.3kbpregion of chromosome 2of Candida albicans reveals the presence of homologuesof SHE9from Saccharomyces cerevisiae and of bacterial phosphatidylinostiol-phospholipase C[J].Yeast,2001,18(8):711-721〕、酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae〔Payne W,Fitzgerald-Hayes M.A mutation in PLC1,a candidate phosphoinositidespecific phospholipase C gene from Saccharomyces cerevisiae,causes aberrantmitotic chromosome segregation[J].Molecular and Cellular Biology,1993,13:4351-4364〕等。

Bacillus cereus的PC-PLC(BC-PC-PLC)，是研究较早的一种磷脂酶C。BC-PC-PLC全长为283个氨基酸，其中包含24个氨基酸的信号肽和14个氨基酸的前导肽，成熟肽为245个氨基酸(Johansen,T.、Holm,T.、Guddal,P.H.、Sletten,K.、Haugli,F.B.、Little,C，1988，"Cloning and sequencing of the gene encoding the phosphatidylcholine-preferring phospholipase C of Bacillus cereus"，Gene 65(2)：293-304)。BC-PC-PLC的晶体结构已经被报道，其由多个螺旋结构域组成，催化位点为55位天冬氨酸，并且含有至少三个Zn²⁺结合位点(Hough.,E.、Hansen,L.K.、Birknes,B.、Jynge,K.、Hansen,S.、Hordvik,A.、Little,C.、Dodson,E.、Derewenda,Z.，1989，"High-resolution(1.5A)crystal structure of phospholipase C from Bacillus cereus"，Nature，338:357-60)。BC-PC-PLC的异源表达研究较少目前只在Bacillus subtilis和pichia pastoris中进行表达(Durban,M.A.、Silbersack,J.、Schweder,T.、Schauer,F.、Bornscheuer,U.T.，2007，High level expression of a recombinant phospholipase C from Bacilluscereus in Bacillus subtilis，Appl Microbiol Biotechnol 74(3):634-639；Seo,K.H、Rhee J.I.，2004，High-level expression of recombinant phospholipase C fromBacillus cereus in Pichia pastoris and its characterization，Biotechnol Lett26(19):1475-1479)。

目前，磷脂酶C主要应用于酶法脱胶。在制造大豆、菜籽等食用油时，未经精炼的毛油主要含有甘油三酯、磷脂、甾醇、生育酚、游离脂肪酸、痕量金属以及其它微量化合物的复杂混合物。其中磷脂会造成色泽及口味变差、保质期变短并且影响后续的精炼效果。目前，主要的脱胶方式有水化脱胶、深度脱胶和酶法脱胶。酶法脱胶由于条件温和、无污染、油耗低，越来越受到人们的青睐。

由于磷脂酶C作用于甘油磷脂可以生成甘油二酯，因此，在酶法脱胶过程中使用磷脂酶C可以显著提升油脂的得率，从而提高生产经济效益。因此，提升磷脂酶C的脱胶性能具有非常重要的生产实践意义。

但本领域仍然需要具有更高酶活的BC-PC-PLC。

发明内容

本发明人通过将DSM-PLC的第56位的酪氨酸突变为组氨酸，得到了突变后的磷脂酶DSM-PLC-Y56H(SEQ ID NO：8)，与DSM-PLC相比，突变后的磷脂酶的酶活得到明显提高。

本发明因此提供一种更高效的磷脂酶C，可用于油脂精炼、磷脂改性、饲料改良剂、食品工业和医药工业等多个方面，从而完成本发明。

因此，本发明第一方面提供一种分离的氨基酸序列，所述氨基酸序列含有：

(1)SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列；或

(2)在(1)所述的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，同时保留SEQ ID NO：8所具备的磷脂酶C活性的由(1)衍生的多肽。

在一个或多个实施方案中，所述氨基酸序列含有信号肽(如前导肽)、末端延伸、GST、麦芽糖E结合蛋白、蛋白A、如6His或Flag的标签、和/或Xa因子或凝血酶或肠激酶的蛋白水解酶位点。

在一个或多个实施方案中，所述氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

在一个或多个实施方案中，所述氨基酸序列由SEQ ID NO:8所示氨基酸序列与用于促进SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的表达、分泌和/或纯化的氨基酸序列组成。

本发明第二方面提供分离的多核苷酸序列，选自：

(1)编码本发明分离的多肽的多核苷酸序列；

(2)(1)所述多核苷酸序列的互补序列；和

(3)(1)或(2)所述序列的长15－30个碱基的片段。

在一个或多个实施方案中，所述多核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。

本发明第三方面提供一种核酸构建体，该核酸构建体包含本发明所述的多核苷酸序列。

在一个或多个实施方案中，所述核酸构建体是克隆载体或表达载体。

本发明还提供一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞：

(1)表达本发明的氨基酸序列；和/或

(2)含有本发明所述的多核苷酸序列或核酸构建体。

本发明还提供一种组合物，所述组合物含有本发明的多肽和任选的辅料，优选的，所述辅料为选自活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃的吸附材料。

本发明还提供本发明所述氨基酸序列、多核苷酸序列、核酸构建体、遗传工程化的宿主细胞和/或组合物在油脂精炼、磷脂改性、饲料改良剂、食品工业和医药工业中的应用。

本发明还提供一种酶法脱胶方法，所述方法包括在55～75℃的温度下孵育磷脂酶C，然后将该磷脂酶C加到毛油中，进行脱胶。

在一个或多个实施方案中，所述磷脂酶C具有本发明所述的氨基酸序列。

在一个或多个实施方案中，在60～70℃的温度下孵育磷脂酶C，尤其是本发明所述氨基酸序列。

在一个或多个实施方案中，孵育时间为15～45分钟。

在一个或多个实施方案中，以毛油重量计，酶的添加量为50～1000ppm，优选为100～500ppm，更优选为100～300ppm。

在一个或多个实施方案中，孵育酶的水溶液。

在一个或多个实施方案中，在将酶加入毛油前，先将毛油加热至50～70℃，优选50～60℃。

在一个或多个实施方案中，脱胶包括在50～60℃下搅拌1～3小时，然后升温至80～90℃保持1～10分钟。

本发明还提供一种提高磷脂酶C脱胶性能的方法，所述方法包括，在55～75℃的温度下孵育磷脂酶C，然后将该磷脂酶C加到毛油中，进行脱胶。

在一个或多个实施方案中，在60～70℃的温度下孵育磷脂酶C，尤其是所述氨基酸序列。

在一个或多个实施方案中，孵育时间为15～45分钟。

在一个或多个实施方案中，孵育酶的水溶液。

在一个或多个实施方案中，所述毛油包括但不限于：大豆油、葵花籽油、花生油、菜籽油、米糠油、玉米油、橄榄油、棕榈油、棕榈仁油、棕榈软脂、卡诺拉油、蓖麻油、椰子油、芫荽油、棉籽油、榛子油、大麻籽油、亚麻籽油、芒果仁油、白芒花油、牛蹄油、红花油、山茶花油、妥尔油、椿油和其他植物油。

附图说明

图1显示TLC检测结果，其中，泳道1显示DSM-PLC商品酶制剂产生的DAG，泳道2显示本发明DSM-PLC-Y56H产生的DAG，泳道3显示阴性对照(即不加入磷脂酶C)时的DAG产生量。

图2显示的是利用ImageJ2x软件对图1中的DAG斑点进行光密度扫描得到的DAG的相对生成量。

具体实施方式

具有磷脂酶C活性的多肽

本发明提供氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示的多肽。本发明还包括在SEQ ID NO：8的基础上具有一个或多个(通常为1-10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸缺失、插入和/或取代，尤其是在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为8以内)氨基酸的多肽。这些变异形式仍然具有本发明磷脂酶C的活性。

优选是保守性变异形式。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行保守性取代时，通常不会改变蛋白质或多肽的功能。“性能相近或相似的氨基酸”包括例如，具有相似侧链的氨基酸残基的家族，这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，在本发明多肽中用来自同一侧链类的另一氨基酸残基替换一个或几个位点，将不会在实质上影响其活性。

此外，本领域技术人员公知，在基因克隆操作中，常常需要设计合适的酶切位点，这势必在所表达的蛋白末端引入了一个或多个不相干的残基，而这并不影响目的蛋白的活性。又如为了构建融合蛋白、促进重组蛋白的表达、获得自动分泌到宿主细胞外的重组蛋白、或利于重组蛋白的纯化，常常需要将一些氨基酸添加至重组蛋白的N-末端、C-末端或该蛋白内的其它合适区域内，例如，包括但不限于，适合的接头肽、信号肽、前导肽、末端延伸、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白、蛋白A、如6His或Flag的标签，或Xa因子或凝血酶或肠激酶的蛋白水解酶位点。应理解，这些氨基酸序列的存在不会影响到所得多肽的活性。因此，本发明也包括在本发明多肽的C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸(例如前述接头肽、信号肽、前导肽、末端延伸、GST、麦芽糖E结合蛋白、蛋白A、如6His或Flag的标签，或Xa因子或凝血酶或肠激酶的蛋白水解酶位点等)所得的多肽，这些多肽仍具有本文所述的磷脂酶C活性。

根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。

本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。

多核苷酸

本申请包括编码本发明多肽的核苷酸序列或其互补序列或简并变异体。SEQ IDNO：7显示了本发明多肽的编码序列例子。如本文所用，“简并变异体”在本发明中是指编码相同的氨基酸序列，但核苷酸序列有差别的核苷酸序列。

编码本发明多肽的序列包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的片段、类似物、衍生物和变异形式。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的蛋白的功能。

本发明也包括编码本发明多肽的核酸序列的片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码本发明多肽的多核苷酸。因此，在某些实施例中，核酸片段的长度在15－30个碱基。可采用现有技术从本发明的核酸序列中挑选出适当的核酸片段，用作引物或探针。

本发明的多肽的编码序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

核酸构建体

本发明也涉及包括与指导编码序列在合适宿主细胞中，在与该调控序列相适合的条件下表达的一个或多个调控序列可操作连接的本发明的分离多核苷酸的核酸构建体。编码本发明多肽的多核苷酸可以多种方式被操作以保证该多肽的表达。在其插入载体之前该多核苷酸序列的操作可能根据该表达载体而是合乎需要或必需的。利用重组DNA方法来改变多核苷酸序列的技术是本领域已知的。

调控序列可以是合适的启动子序列，由用于表达编码本发明多肽的多核苷酸的宿主细胞识别的核苷酸序列。启动子序列包含接到多肽表达的转录调控序列。启动子可以是在所选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。

用于指导本发明的核酸构建体，特别是在细菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从噬菌体T7启动子、大肠杆菌lac操纵子、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂糖酶基因、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因等中获得的启动子序列。

用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞正转录的合适启动子的实例是从米曲霉TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定的α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉糖化酶(glaA)、里氏木霉纤维二糖水解酶I、氏木霉纤维二糖水解酶II、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、里氏木霉葡聚糖内切酶等基因获得的启动子及其突变、截短和杂合(hybrid)启动子。

在酵母宿主中，有用的启动子可获得自酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母乙醇脱氢酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶、酿酒酵母磷酸丙糖异构酶、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶的基因、巴斯德毕赤酵母醇氧化酶基因。用于酵母宿主细胞的其它有用启动子由Romanos et al.，1992，Yeast 8:423-488描述。

调控序列也可以是合适的转录终止子序列，由宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列与编码该多肽的核苷酸序列的3′末端可操作连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明。

用于细菌宿主的优选终止子可以是来自T7噬菌体的终止子。

用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子获得自米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡萄糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡萄糖苷酶的基因。

用于酵母宿主细胞的优选终止子获得自酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C、酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶、巴斯德毕赤酵母醇氧化酶基因等。

调控序列也可以是合适的前导序列，对宿主细胞翻译重要的mRNA的非翻译区。签到序列与编码该多肽的核苷酸序列的5′末端可操作连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何前导序列都可用于本发明。

调控序列也可以是编码与多肽的氨基酸末端连接的氨基酸序列并且指导该编码的多肽进入细胞分泌途径的信号肽编码区。核苷酸序列编码序列的5′端可固有地包含天然连接具有编码分泌多肽的编码区节段的翻译阅读框的信号肽编码区。备选地，编码序列的5′端可包含与该编码区外源的信号肽编码区。当编码序列非天然地包含信号肽编码区时，可能需要外来的信号肽编码区。备选地，外来的信号肽编码区可简单地替换天然的信号肽编码区以增强多肽的分泌。然而，指导表达的多肽进入选择的宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码区，即分泌进入培养基，都可用于本发明。

载体

本发明也涉及包括本发明多核苷酸序列的载体，包括但不限于表达载体和克隆载体。例如，在某些实施方案中，本发明所述的核酸构建体为表达载体或克隆载体。

表达载体中，各种核酸和调控序列可被连接在一起以产生可能包括一个或多个容许在这种位点插入或取代该编码多肽的核苷酸序列的方便限制性位点的重组表达载体。备选地，本发明的核苷酸序列可通过插入核苷酸序列或包括进入适当表达载体的序列的核酸构建体而被表达。在制造表达载体时，编码序列位于载体中以使得该编码序列可操作地连接用于表达适当调控序列。

重组表达载体可以使能够方便地经受重组DNA方法并且可导致感兴趣的核苷酸序列表达的任何载体(如质粒或病毒)。载体的选择一般取决于载体与其中被导入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是线性或闭合的环形质粒。

载体可以是自主复制的载体，即作为染色体外实体存在，其复制不依赖于染色体复制的载体，例如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可包含用于保证自我复制的任何方式。备选地，载体可以是当被导入宿主细胞时，整合到基因组中并且与其已经被整合进入的染色体一起复制的载体。此外，可使用一起包含将被导入宿主细胞基因组的总DNA的单个载体或质粒或两个或多个载体或质粒，或转座子。

本发明的载体优选包含一个或多个容许容易选择转化、转染、转导等细胞的可选择标记。可选择的标记是基因，其产物提供对抗生素或病毒的抗性、对重金属的抗性、原养型至营养缺陷型等。

本发明的载体优选包含容许该载体整合进入宿主细胞基因组或该载体在细胞中独立于基因组自主个复制的元件。

一个以上拷贝的本发明的多核苷酸可被插入宿主细胞以增加该基因产物的产量。多核苷酸拷贝数的增加可通过将至少一个附加拷贝的序列整合进入宿主细胞基因组或通过包括可扩增的选择标记基因和该多核苷酸来获得，其中包含扩增拷贝的选择标记基因并且由此包含附加拷贝多核苷酸的细胞可通过在存在适当的选择剂时培养该细胞来筛选。

本发明的载体优选包含人工合成的一段序列，含有多个限制内切酶识别位点，能为外源DNA提供多种可插入的位置或插入方案。

本发明的表达载体更为优选地选择可用于毕赤酵母中表达的载体。本发明的载体优选商品化的毕赤酵母中使用的载体如pPIC、pPICZ、pAO、pGAP或pGAPZ等一系列的载体。

含有本发明多核苷酸序列的克隆载体可用于复制足够多的目标质粒。因此，本发明的克隆载体带有较强的自我复制元件，如复制起始位点等。通常，本发明的克隆载体不具有表达元件。

宿主细胞

本发明也涉及包括被用于重组生产多肽的本发明多核苷酸的重组宿主细胞。包括本发明多核苷酸的载体被导入宿主细胞以使得该载体如早先说明的作为染色体的组成部分或作为染色体外的自我复制载体来维持。宿主细胞的选择很大程度上取决于编码多肽的基因及其来源。

宿主细胞可以是单细胞微生物或非单细胞微生物。单细胞微生物例如革兰氏阳性细菌，包括但不限于芽孢杆菌细胞，例如，嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌等；或链霉菌细胞，例如钱青紫链霉菌；或革兰氏阴性细菌，例如大肠杆菌和假单胞菌属。在优选的方面，细菌宿主是枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌和大肠杆菌细胞。

宿主细胞也可以是真核生物，例如哺乳动物、昆虫、植物、酵母或真菌细胞。在优选的方面，宿主细胞是真核细胞，如在此使用的“真核”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门等。

在更优选的方面，宿主细胞是子囊菌门的细胞如酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、耶氏酵母属(Yarrowia)、假丝酵母属(Candida)以及Komagataella属等。

在最优选的方面，宿主细胞是巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)等。在另外最优选方面，宿主细胞是巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞。

生产方法

在获得多肽的编码序列后，可采用如下方法生产本发明多肽，该方法包括：(a)在有助于生产多肽的条件下培养含表达该多肽的表达载体的宿主细胞；以及(b)回收该多肽。

本发明的生产方法中，细胞可以利用本领域已知的方法在适于生产多肽的培养基中培养。例如，细胞可通过在实验室或工业发酵罐中进行的摇瓶培养和小规模或大规模的发酵(包括连续的、分批的、分批补料或固态发酵)，在合适的培养基和容许该多肽表达和/或分离的条件下进行培养。培养发生在利用本领域已知的方法包括碳源和氮源和无机盐的合适培养基中。合适的培养基可获得自商业供应者或可根据公开的组合物来制备。如果该多肽分泌进入培养基，该多肽可从培养基直接回收。如果该多肽不分泌进入培养基，它可从细胞裂解物回收。

或者，也可采用本领域已知的化学合成方法来合成本发明的多肽。多肽化学合成方法包括固相合成法和液相合成法，其中以固相合成法常用。固相合成方法包括但不限于Fmoc和tBoc两种常用方法。通常，使用树脂作为不溶性的固相载体，通常从C端(羧基端)向N端(氨基端)逐个将氨基酸连接在肽链上，每个氨基酸连接循环由以下三步反应构成：1)脱保护：被保护的氨基酸必须用一种脱保护溶剂去除氨基的保护基团；2)活化：待连接的氨基酸的羧基被活化剂所活化；和3)偶联：活化的羧基与前一个氨基酸裸露的氨基反应，形成肽键。反复循环直到肽链延伸至所需长度时即可完成。最后用切割液切割肽链和固相载体之间的连接，就可获得所需的氨基酸序列。可以在程序控制的自动化多肽合成仪上进行上述化学合成，这类仪器包括但不限于Protein Technologies公司推出的Tribute双通道多肽合成仪、C S Bio公司的UV Online Monitor系统、Aapptec公司推出的Focus XC三通道合成仪等。

本发明所描述的多肽可利用本领域已知的方法来回收。例如，多肽可通过常规方法，包括但不限于离心、过滤、超滤、萃取、层析、喷雾干燥、冷冻干燥、蒸发或沉淀等从培养基回收。

本发明的多肽可通过本领域已知的多种方法来纯化，包括但不限于色谱法(如离子交换、亲和性、疏水性、色谱聚焦、分子排阻)，电泳法(例如等电聚焦)、差异溶解度(如盐析沉淀)、SDS-PAGE或萃取法以获得基本上纯的多肽。

多肽的性能及用途

本发明的多肽具有磷脂酶C活性，可应用于油脂精炼、磷脂改性、饲料改良剂、食品工业和医药工业等多个方面，包括但不限于用于烘烤、用于洗涤剂、改善水溶液或糖浆的过滤性等。

本发明的多肽可以纯的酶制品的形式提供，也可以组合物的形式提供。组合物可以是粉末组合物，也可以是液体组合物，或糊状组合物。以组合物形式提供时，根据该含酶组合物的不同用途，该组合物可含有不同的辅料。可将本领域已知的辅料添加到本发明的组合物中，这类辅料包括但不限于山梨醇、山梨酸钾、苯甲酸甲酯、苯甲酸乙酯、蔗糖、甘露糖、海藻糖、淀粉、氯化钠、氯化钙等稳定剂或其他物质中的一种或多种。

本发明方法中使用的本发明多肽的量可根据实际情况加以确定。

酶法脱胶

如前所述，本发明的多肽可用于油脂制备中的酶法脱胶。因此，本发明提供一种脱胶方法，所述方法包括在脱胶过程中将本发明的多肽加入到毛油中，进行脱胶。

可直接将本发明的多肽加到待脱胶的毛油中，然后按常规的脱胶条件进行脱胶。或者，优选的是，先在55～75℃、优选60～70℃的温度下孵育本发明的多肽，然后再将其加到毛油中，进行脱胶。孵育时间通常为15～45分钟，优选为20～40分钟。

通常，先将毛油加热至50～70℃，优选50～60℃，然后再加入孵育或未孵育的酶。

酶通常以水溶液的形式加入。以毛油重量计，酶的添加量为50～1000ppm，优选为100～500ppm，更优选为100～300ppm。

脱胶条件一般包括：在50～60℃下搅拌1～3小时，然后升温至80～90℃保持1～10分钟。

本发明另一方面还提供一种提高磷脂酶C脱胶性能的方法，所述方法包括，先在55～75℃、优选60～70℃的温度下孵育磷脂酶C，然后再将其加到毛油中，进行脱胶。如前文所述，所述磷脂酶C可以是本发明的多肽。孵育时间通常为15～45分钟，优选为20～40分钟。通常，先将毛油加热至50～70℃，优选50～60℃，然后再加入孵育或未孵育的酶。酶通常以水溶液的形式加入。以毛油重量计，酶的添加量为50～1000ppm，优选为100～500ppm，更优选为100～300ppm。脱胶条件一般包括：在50～60℃下搅拌1～3小时，然后升温至80～90℃保持1～10分钟。

适用于本发明方法脱胶的毛油包括但不限于大豆油、葵花籽油、花生油、菜籽油、米糠油、玉米油、橄榄油、棕榈油、棕榈仁油、棕榈软脂、卡诺拉油、蓖麻油、椰子油、芫荽油、棉籽油、榛子油、大麻籽油、亚麻籽油、芒果仁油、白芒花油、牛蹄油、红花油、山茶花油、妥尔油、椿油和其他植物油。

下文将以具体实施例的方式阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等，《分子克隆：实验室指南》(美国纽约州：冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，1989)所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。对于试剂的用法和用量，除非另有说明，否则按照常规的用法和用量使用。

实验材料

1、实验菌株和质粒

菌株：毕赤酵母SMD1168(Invitrogen,货号C175-00)。

质粒pmAO-PLC构建方法详见CN 201510946696.1实施例1中描述。

2、培养基和溶液

YPD液体培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖。

MGYS固体平板：1.34％酵母氮源碱(YNB)含硫酸铵不含氨基酸，1％甘油，1M山梨醇，4×10^-5％D-生物素，2％琼脂。

BMM-大豆磷脂筛选培养基：1.34％酵母氮源碱(YNB)含硫酸铵不含氨基酸，4×10^-5％D-生物素，0.5％甲醇(灭菌后加入)，2％大豆磷脂乳化液，0.1M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液pH6.6，2％琼脂，添加10uM的ZnSO₄·7H₂O。

大豆磷脂乳化液：含2％大豆磷脂，25mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液pH 6.6，10uMZnSO4。

BMGY液体培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％酵母氮源碱(YNB)含硫酸铵不含氨基酸，1％甘油，4×10^-5％D-生物素，0.1M磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液pH6.0。

BMMY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％酵母氮源碱(YNB)含硫酸铵不含氨基酸，0.3％ZnSO₄·7H₂O，0.5％甲醇(灭菌后加入)，4×10^-5％D-生物素(灭菌后加入)，0.1M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液pH6.6。

大豆磷脂来源：购自北京美亚斯磷脂技术有限公司，FPLA级，

本发明中未特别说明的化学品均购自国药，为分析级。

限制性内切酶HindIII，EcoRI(购自纽英伦生物技术(北京)有限公司)；

PCR酶：HS DNA Polymerase(购自宝生物工程(大连)有限公司)，KOD fx(购自东洋纺(上海)生物科技有限公司)。

实施例1：DSM-PLC序列进行第56位氨基酸突变

根据CN200580014667.6中公开的PLC的氨基酸序列，选取其中的成熟肽序列(如本文SEQ ID NO:2所示)根据毕赤酵母密码子偏好性，设计得到DSM-PLC的DNA序列(如SEQ IDNO:1所示)，将序列提供给上海生工生物有限公司进行全基因合成，得到含DSM-PLC序列的克隆载体pUC57-DSM-PLC。

以pUC57-DSM-PLC载体为模板，使用HS DNA聚合酶和引物对DSMPLC-1(如SEQ ID NO:3所示)/DPLC56H-2(如SEQ ID NO:4所示)，通过PCR扩增得到约180bp片段。以pUC57-DSM-PLC载体为模板，使用HS DNA聚合酶和引物对DPLC56H-3(如SEQ ID NO:5所示)/DSMPLC-1，通过PCR扩增得到约570bp片段。再以前两步PCR得到的约180bp片段和约570bp片段混合作为第三步PCR的模板，使用引物对DSMPLC-1/DSMPLC-2(如SEQ ID NO:6所示)和HS DNA聚合酶，通过PCR扩增得到约755bp片段，如SEQ ID NO:7所示。将该约755bp片段通过HindIII和EcoRI酶切位点克隆至pmAO-PLC中，得到pmAO-DSM-PLC-Y56H载体。将pmAO-DSM-PLC-Y56H用SalI线性化，凝胶回收8.5kb片段。利用LiAC法(SX Wu，GJ Letchworth High efficiency transformation byelectroporation of Pichia pastoris pretreated with lithium acetate anddithiothreitol.Biotechniques,2004,36(1):152-4)制备毕赤酵母SMD1168菌株的感受态细胞，再通过电转化将线性化的pmAO-DSM-PLC-Y56H转化至SMD1168感受态细胞。将转化物接种于MGYS平板上，30℃培养3天。挑取平板上的单克隆，至BMM-大豆磷脂筛选平板上。30℃培养过夜，选取白色沉淀圈大的克隆，得到DSM-PLC-Y56H菌株。利用引物对DSMPLC-1/DSMPLC-2和KOD fx进行菌落PCR，得到的PCR产物送测序验证正确。

实施例2：DSM-PLC-Y56H和DSM-PLC活性比较

取DSM-PLC-Y56H菌株，先在液体YPD中活化，然后接种于BMGY培养基中，在30℃下，220rpm振荡培养过夜。将培养物转至BMMY培养基中，初始OD600为6。

首先，用2％甲醇进行诱导，在24h和32h后各补加1％甲醇，48h和56h后各补加1％甲醇，72h取样。将获得的样品用截留分子量为10kDa的超滤管进行超滤脱盐浓缩20倍。将处理后的样品加入缓冲液中(20mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH6.6)，10uM ZnSO₄)，得到DSM-PLC-Y56H酶液。

取DSM-PLC-Y56H酶液以及等蛋白量的DSM PLC商品酶(蛋白量为100ug)至600μl大豆磷脂乳化液中，50℃振荡孵育4h，用500ul氯仿：甲醇95:5进行萃取，12000rpm离心，取下层有机相，烘干后用50ul正己烷重溶，取3ul样品进行上样，进行TLC(JM Nzai，A ProctorPhospholipids determination in vegetable oil by thin-layer chromatography andimaging densitometry.Food Chemistry,1998,63(4):571-576)，结果如图1所示，1号为DSM-PLC商品酶制剂，2号为DSM-PLC-Y56H，3号为阴性对照。DSM-PLC-Y56H产生的DAG明显多于DSM-PLC商品酶制剂产生的DAG。利用ImageJ2x软件对图1中的DAG斑点进行光密度扫描，比较DAG的相对生成量，结果如图2所示，DSM-PLC-Y56H的DAG生成量是DSM-PLC商品酶的1.5倍。

实施例3

取大豆毛油100g，加热至55℃；将实施例2制备得到的DSM-PLC-Y56H样品稀释；分别加入1ml纯水和2ml稀释后的DSM-PLC-Y56H样品(加水量3％、酶添加量200ppm)；高速剪切(10000r/min)1分钟；在55℃条件下搅拌(750r/min)反应2小时；升温至85℃保持5分钟；12000rpm离心10分钟，取约10g上层油样，检测其DAG含量(检测方法：AOCS OfficialMethod Cd 11d-96)。

实施例4

将实施例2制备得到的DSM-PLC-Y56H样品置于50℃水浴孵育0.5小时。

取大豆毛油100g，加热至55℃；将孵育后的DSM-PLC-Y56H样品稀释；分别加入1ml纯水和2ml稀释后的DSM-PLC-Y56H样品(加水量3％、酶添加量200ppm)；高速剪切(10000r/min)1分钟；在55℃条件下搅拌(750r/min)反应2小时；升温至85℃保持5分钟；12000rpm离心10分钟，取约10g上层油样，检测其DAG含量(检测方法：AOCS Official Method Cd 11d-96)。

实施例5

将实施例2制备得到的DSM-PLC-Y56H样品置于60℃水浴孵育0.5小时。

实施例6

将实施例2制备得到的DSM-PLC-Y56H样品置于70℃水浴孵育0.5小时。

实施例7

将实施例2制备得到的DSM-PLC-Y56H样品置于80℃水浴孵育0.5小时。

序列表

<110> 丰益（上海）生物技术研发中心有限公司

<120> 一种磷脂酶C突变体

<130> 168253

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 738

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 根据毕赤酵母密码子偏好性设计得到DSM-PLC的DNA序列

<400> 1

tggtctgctg aagataagca caacgaaggt atcaactctc atctgtggat tgtcaacaga 60

gctattgaca tcatgtcccg taacactacc attgtcaatc ctaacgagac tgccttgctg 120

aacgagtgga gagctgactt ggagaatggt atctactccg ctgactacga gaacccatat 180

tacgacgatt ctacctatgc atctcacttc tacgaccctg atactggtac tacctacatt 240

ccatttgcta agcatgccaa ggagactgga gctaagtact tcaacttggc tggtcaggct 300

taccagaacc aagacatgca gcaagccttc ttctaccttg gattgtccct tcactacttg 360

ggtgatgtca atcaaccaat gcatgcagcc tcctttaccg acttgtccta cccaatgggt 420

ttccattcta agtacgagaa cttcgttgac actatcaaga ataactacat tgtttctgat 480

tccaatggtt actggaactg gaaaggtgct aaccctgaag attggatcga aggagccgct 540

gttgctgcca agcaagacta tccaggagtc gttaacgaca ccactaagga ttggttcgtc 600

aaagctgccg tgtctcaaga gtatgctgac aagtggagag ctgaggttac tccagttact 660

ggtaagagac ttatggaagc tcaacgtgtt accgcaggat acattcactt gtggttcgac 720

acttacgtca acagataa 738

<210> 2

<211> 245

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> DSM-PLC的氨基酸序列

<400> 2

Trp Ser Ala Glu Asp Lys His Asn Glu Gly Ile Asn Ser His Leu Trp

1 5 10 15

Ile Val Asn Arg Ala Ile Asp Ile Met Ser Arg Asn Thr Thr Ile Val

20 25 30

Asn Pro Asn Glu Thr Ala Leu Leu Asn Glu Trp Arg Ala Asp Leu Glu

35 40 45

Asn Gly Ile Tyr Ser Ala Asp Tyr Glu Asn Pro Tyr Tyr Asp Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ala Ser His Phe Tyr Asp Pro Asp Thr Gly Thr Thr Tyr Ile

65 70 75 80

Pro Phe Ala Lys His Ala Lys Glu Thr Gly Ala Lys Tyr Phe Asn Leu

85 90 95

Ala Gly Gln Ala Tyr Gln Asn Gln Asp Met Gln Gln Ala Phe Phe Tyr

100 105 110

Leu Gly Leu Ser Leu His Tyr Leu Gly Asp Val Asn Gln Pro Met His

115 120 125

Ala Ala Ser Phe Thr Asp Leu Ser Tyr Pro Met Gly Phe His Ser Lys

130 135 140

Tyr Glu Asn Phe Val Asp Thr Ile Lys Asn Asn Tyr Ile Val Ser Asp

145 150 155 160

Ser Asn Gly Tyr Trp Asn Trp Lys Gly Ala Asn Pro Glu Asp Trp Ile

165 170 175

Glu Gly Ala Ala Val Ala Ala Lys Gln Asp Tyr Pro Gly Val Val Asn

180 185 190

Asp Thr Thr Lys Asp Trp Phe Val Lys Ala Ala Val Ser Gln Glu Tyr

195 200 205

Ala Asp Lys Trp Arg Ala Glu Val Thr Pro Val Thr Gly Lys Arg Leu

210 215 220

Met Glu Ala Gln Arg Val Thr Ala Gly Tyr Ile His Leu Trp Phe Asp

225 230 235 240

Thr Tyr Val Asn Arg

245

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 3

cccaagcttg gtctgctgaa gataag 26

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 4

ggttctcatg gtcagcggag tagataccat 30

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 5

tccgctgacc atgagaaccc atattacgac ga 32

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 6

ccggaattct tatctgttga cgtaag 26

<210> 7

<211> 738

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DSM-PLC-Y56H的编码序列

<400> 7

tggtctgctg aagataagca caacgaaggt atcaactctc atctgtggat tgtcaacaga 60

gctattgaca tcatgtcccg taacactacc attgtcaatc ctaacgagac tgccttgctg 120

aacgagtgga gagctgactt ggagaatggt atctactccg ctgaccatga gaacccatat 180

tacgacgatt ctacctatgc atctcacttc tacgaccctg atactggtac tacctacatt 240

ccatttgcta agcatgccaa ggagactgga gctaagtact tcaacttggc tggtcaggct 300

taccagaacc aagacatgca gcaagccttc ttctaccttg gattgtccct tcactacttg 360

ggtgatgtca atcaaccaat gcatgcagcc tcctttaccg acttgtccta cccaatgggt 420

ttccattcta agtacgagaa cttcgttgac actatcaaga ataactacat tgtttctgat 480

tccaatggtt actggaactg gaaaggtgct aaccctgaag attggatcga aggagccgct 540

gttgctgcca agcaagacta tccaggagtc gttaacgaca ccactaagga ttggttcgtc 600

aaagctgccg tgtctcaaga gtatgctgac aagtggagag ctgaggttac tccagttact 660

ggtaagagac ttatggaagc tcaacgtgtt accgcaggat acattcactt gtggttcgac 720

acttacgtca acagataa 738

<210> 8

<211> 245

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> DSM-PLC-Y56H的氨基酸序列

<400> 8

Trp Ser Ala Glu Asp Lys His Asn Glu Gly Ile Asn Ser His Leu Trp

1 5 10 15

Ile Val Asn Arg Ala Ile Asp Ile Met Ser Arg Asn Thr Thr Ile Val

20 25 30

Asn Pro Asn Glu Thr Ala Leu Leu Asn Glu Trp Arg Ala Asp Leu Glu

35 40 45

Asn Gly Ile Tyr Ser Ala Asp His Glu Asn Pro Tyr Tyr Asp Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ala Ser His Phe Tyr Asp Pro Asp Thr Gly Thr Thr Tyr Ile

65 70 75 80

Pro Phe Ala Lys His Ala Lys Glu Thr Gly Ala Lys Tyr Phe Asn Leu

85 90 95

Ala Gly Gln Ala Tyr Gln Asn Gln Asp Met Gln Gln Ala Phe Phe Tyr

100 105 110

Leu Gly Leu Ser Leu His Tyr Leu Gly Asp Val Asn Gln Pro Met His

115 120 125

Ala Ala Ser Phe Thr Asp Leu Ser Tyr Pro Met Gly Phe His Ser Lys

130 135 140

Tyr Glu Asn Phe Val Asp Thr Ile Lys Asn Asn Tyr Ile Val Ser Asp

145 150 155 160

Ser Asn Gly Tyr Trp Asn Trp Lys Gly Ala Asn Pro Glu Asp Trp Ile

165 170 175

Glu Gly Ala Ala Val Ala Ala Lys Gln Asp Tyr Pro Gly Val Val Asn

180 185 190

Asp Thr Thr Lys Asp Trp Phe Val Lys Ala Ala Val Ser Gln Glu Tyr

195 200 205

Ala Asp Lys Trp Arg Ala Glu Val Thr Pro Val Thr Gly Lys Arg Leu

210 215 220

Met Glu Ala Gln Arg Val Thr Ala Gly Tyr Ile His Leu Trp Phe Asp

225 230 235 240

Thr Tyr Val Asn Arg

245

Claims

1.一种分离的氨基酸序列，所述氨基酸序列含有：

(1)SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列；或

(2)在(1)所述的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，同时保留SEQID NO：8所具备的磷脂酶C活性的由(1)衍生的多肽。

2.如权利要求1所述的分离的氨基酸序列，其特征在于，

所述氨基酸序列含有信号肽(如前导肽)、末端延伸、GST、麦芽糖E结合蛋白、蛋白A、标签序列(如6His或Flag)、和/或Xa因子或凝血酶或肠激酶的蛋白水解酶位点；或

所述氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；或

所述氨基酸序列由SEQ ID NO:8所示氨基酸序列与用于促进SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的表达、分泌和/或纯化的氨基酸序列组成。

3.一种分离的多核苷酸序列，选自：

(1)编码权利要求1或2所述的分离的多肽的多核苷酸序列；

(2)(1)所述多核苷酸序列的互补序列；和

(3)(1)或(2)所述序列的长15－30个碱基的片段。

4.如权利要求3所述的分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸序列选自：

(1)如SEQ ID NO:7所示的多核苷酸序列；

(2)SEQ ID NO:7所示的多核苷酸序列的互补序列；和

(3)(1)或(2)所述序列的长15－30个碱基的片段。

5.一种核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体包含权利要求3或4所述的多核苷酸序列；优选地，所述核酸构建体是克隆载体或表达载体。

6.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞：

(1)表达权利要求1或2所述的氨基酸序列；和/或

(2)含有权利要求3或4所述的多核苷酸序列或权利要求5所述的核酸构建体。

7.一种组合物，其特征在于，所述组合物含有权利要求1或2所述的多肽和任选的辅料；

优选的，所述辅料为选自活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃的吸附材料。

8.权利要求1或2所述的氨基酸序列、利要求3或4所述的多核苷酸序列、权利要求5所述的核酸构建体、权利要求6所述遗传工程化的宿主细胞或权利要求7所述的组合物在油脂精炼、磷脂改性、饲料改良剂、食品工业和医药工业中的应用。

9.一种酶法脱胶方法，所述方法包括在55～75℃、优选60～70℃的温度下孵育权利要求1或2所述的氨基酸序列，然后将该氨基酸序列加到毛油中，进行脱胶。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下一项或多项特征：

孵育时间为15～45分钟；

以毛油重量计，酶的添加量为50～1000ppm，优选为100～500ppm，更优选为100～300ppm；

孵育酶的水溶液；

在将酶加入毛油前，先将毛油加热至50～70℃，优选50～60℃；

脱胶包括在50～60℃下搅拌1～3小时，然后升温至80～90℃保持1～10分钟；和

所述毛油包括但不限于：大豆油、葵花籽油、花生油、菜籽油、米糠油、玉米油、橄榄油、棕榈油、棕榈仁油、棕榈软脂、卡诺拉油、蓖麻油、椰子油、芫荽油、棉籽油、榛子油、大麻籽油、亚麻籽油、芒果仁油、白芒花油、牛蹄油、红花油、山茶花油、妥尔油、椿油和其他植物油。