RU2818353C2 - Мутант фосфолипазы С с высокой ферментативной активностью - Google Patents
Мутант фосфолипазы С с высокой ферментативной активностью Download PDFInfo
- Publication number
- RU2818353C2 RU2818353C2 RU2021120463A RU2021120463A RU2818353C2 RU 2818353 C2 RU2818353 C2 RU 2818353C2 RU 2021120463 A RU2021120463 A RU 2021120463A RU 2021120463 A RU2021120463 A RU 2021120463A RU 2818353 C2 RU2818353 C2 RU 2818353C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- oil
- polypeptide
- sequence
- nucleic acid
- seq
- Prior art date
Links
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 title claims abstract description 24
- ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trimethyl-N-[3-(trifluoromethyl)phenyl]benzenesulfonamide Chemical compound CC1=CC(C)=CC(C)=C1S(=O)(=O)NC1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 title description 4
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 title description 4
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 title description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 101
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 94
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 94
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims abstract description 50
- 102000014384 Type C Phospholipases Human genes 0.000 claims abstract description 28
- 108010079194 Type C Phospholipases Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 12
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims abstract description 11
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims abstract description 10
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims abstract description 10
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims abstract description 10
- 235000014593 oils and fats Nutrition 0.000 claims abstract description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 33
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 28
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 28
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 28
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 28
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 22
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 22
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 15
- 239000010779 crude oil Substances 0.000 claims description 11
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 10
- 239000003921 oil Substances 0.000 claims description 9
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 claims description 9
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims description 6
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000010495 camellia oil Substances 0.000 claims description 6
- 239000000828 canola oil Substances 0.000 claims description 6
- 235000019519 canola oil Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 6
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 5
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 4
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 claims description 4
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000004936 Bromus mango Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000019487 Hazelnut oil Nutrition 0.000 claims description 3
- 241001072282 Limnanthes Species 0.000 claims description 3
- 240000007228 Mangifera indica Species 0.000 claims description 3
- 235000014826 Mangifera indica Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000019482 Palm oil Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000019774 Rice Bran oil Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000009184 Spondias indica Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000019486 Sunflower oil Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000004359 castor oil Substances 0.000 claims description 3
- 235000019438 castor oil Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 claims description 3
- 239000003240 coconut oil Substances 0.000 claims description 3
- 235000019864 coconut oil Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000010636 coriander oil Substances 0.000 claims description 3
- 235000005687 corn oil Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000002285 corn oil Substances 0.000 claims description 3
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000002385 cottonseed oil Substances 0.000 claims description 3
- ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N glycerol triricinoleate Natural products CCCCCC[C@@H](O)CC=CCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](COC(=O)CCCCCCCC=CC[C@@H](O)CCCCCC)OC(=O)CCCCCCCC=CC[C@H](O)CCCCCC ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N 0.000 claims description 3
- 239000010468 hazelnut oil Substances 0.000 claims description 3
- 239000010460 hemp oil Substances 0.000 claims description 3
- 210000000003 hoof Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000000944 linseed oil Substances 0.000 claims description 3
- 235000021388 linseed oil Nutrition 0.000 claims description 3
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 claims description 3
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000003346 palm kernel oil Substances 0.000 claims description 3
- 235000019865 palm kernel oil Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000002540 palm oil Substances 0.000 claims description 3
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 claims description 3
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000008165 rice bran oil Substances 0.000 claims description 3
- 235000005713 safflower oil Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000003813 safflower oil Substances 0.000 claims description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 3
- 239000002600 sunflower oil Substances 0.000 claims description 3
- 239000003784 tall oil Substances 0.000 claims description 3
- PHYFQTYBJUILEZ-IUPFWZBJSA-N triolein Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC)COC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC PHYFQTYBJUILEZ-IUPFWZBJSA-N 0.000 claims description 3
- 239000005909 Kieselgur Substances 0.000 claims description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 claims description 2
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 claims description 2
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 16
- 150000001982 diacylglycerols Chemical class 0.000 abstract description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 51
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 49
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 49
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 33
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 23
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 23
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 20
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 18
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 16
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 16
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 16
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 16
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 16
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 15
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 15
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 14
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 11
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 9
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 9
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 8
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 7
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 7
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 7
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 7
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 7
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 description 7
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 6
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- FSXRLASFHBWESK-UHFFFAOYSA-N dipeptide phenylalanyl-tyrosine Natural products C=1C=C(O)C=CC=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FSXRLASFHBWESK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N glycyl-L-tyrosine hemihydrate Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 6
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 6
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 5
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 5
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 5
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 5
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 5
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 239000008347 soybean phospholipid Substances 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 description 5
- JLPULHDHAOZNQI-ZTIMHPMXSA-N 1-hexadecanoyl-2-(9Z,12Z-octadecadienoyl)-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/C\C=C/CCCCC JLPULHDHAOZNQI-ZTIMHPMXSA-N 0.000 description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 240000006439 Aspergillus oryzae Species 0.000 description 4
- 235000002247 Aspergillus oryzae Nutrition 0.000 description 4
- 239000011665 D-biotin Substances 0.000 description 4
- 235000000638 D-biotin Nutrition 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 4
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 4
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 4
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 4
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 4
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 4
- YYSWCHMLFJLLBJ-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ala-Ser Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YYSWCHMLFJLLBJ-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 3
- LSLIRHLIUDVNBN-CIUDSAMLSA-N Ala-Asp-Lys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN LSLIRHLIUDVNBN-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 3
- BEMGNWZECGIJOI-WDSKDSINSA-N Ala-Gly-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O BEMGNWZECGIJOI-WDSKDSINSA-N 0.000 description 3
- REWSWYIDQIELBE-FXQIFTODSA-N Ala-Val-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O REWSWYIDQIELBE-FXQIFTODSA-N 0.000 description 3
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 3
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 3
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 3
- PEFFAAKJGBZBKL-NAKRPEOUSA-N Arg-Ala-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O PEFFAAKJGBZBKL-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 3
- PBSQFBAJKPLRJY-BYULHYEWSA-N Asn-Gly-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(=O)N)N PBSQFBAJKPLRJY-BYULHYEWSA-N 0.000 description 3
- SUIJFTJDTJKSRK-IHRRRGAJSA-N Asn-Pro-Tyr Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 SUIJFTJDTJKSRK-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 3
- GWTLRDMPMJCNMH-WHFBIAKZSA-N Asp-Asn-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O GWTLRDMPMJCNMH-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- XACXDSRQIXRMNS-OLHMAJIHSA-N Asp-Asn-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N)O XACXDSRQIXRMNS-OLHMAJIHSA-N 0.000 description 3
- RYEWQKQXRJCHIO-SRVKXCTJSA-N Asp-Asn-Tyr Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 RYEWQKQXRJCHIO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- CRNKLABLTICXDV-GUBZILKMSA-N Asp-His-Glu Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N CRNKLABLTICXDV-GUBZILKMSA-N 0.000 description 3
- LDLZOAJRXXBVGF-GMOBBJLQSA-N Asp-Ile-Met Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N LDLZOAJRXXBVGF-GMOBBJLQSA-N 0.000 description 3
- PLOKOIJSGCISHE-BYULHYEWSA-N Asp-Val-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O PLOKOIJSGCISHE-BYULHYEWSA-N 0.000 description 3
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 3
- LJEPDHWNQXPXMM-NHCYSSNCSA-N Gln-Arg-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O LJEPDHWNQXPXMM-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 3
- OFPWCBGRYAOLMU-AVGNSLFASA-N Gln-Asp-Tyr Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N)O OFPWCBGRYAOLMU-AVGNSLFASA-N 0.000 description 3
- JHPFPROFOAJRFN-IHRRRGAJSA-N Gln-Glu-Tyr Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N)O JHPFPROFOAJRFN-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 3
- YJSCHRBERYWPQL-DCAQKATOSA-N Gln-Pro-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](CCC(=O)N)N YJSCHRBERYWPQL-DCAQKATOSA-N 0.000 description 3
- QYPKJXSMLMREKF-BPUTZDHNSA-N Glu-Glu-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N QYPKJXSMLMREKF-BPUTZDHNSA-N 0.000 description 3
- IRXNJYPKBVERCW-DCAQKATOSA-N Glu-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O IRXNJYPKBVERCW-DCAQKATOSA-N 0.000 description 3
- WGYHAAXZWPEBDQ-IFFSRLJSSA-N Glu-Val-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O WGYHAAXZWPEBDQ-IFFSRLJSSA-N 0.000 description 3
- JBRBACJPBZNFMF-YUMQZZPRSA-N Gly-Ala-Lys Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN JBRBACJPBZNFMF-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 3
- GGEJHJIXRBTJPD-BYPYZUCNSA-N Gly-Asn-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O GGEJHJIXRBTJPD-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- CLNSYANKYVMZNM-UWVGGRQHSA-N Gly-Lys-Arg Chemical compound NCCCC[C@H](NC(=O)CN)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N CLNSYANKYVMZNM-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 3
- JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N H-Gly-Phe-OH Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RVKIPWVMZANZLI-UHFFFAOYSA-N H-Lys-Trp-OH Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)CCCCN)C(O)=O)=CNC2=C1 RVKIPWVMZANZLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YADRBUZBKHHDAO-XPUUQOCRSA-N His-Gly-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O YADRBUZBKHHDAO-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 3
- ZYVTXBXHIKGZMD-QSFUFRPTSA-N Ile-Val-Asn Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N ZYVTXBXHIKGZMD-QSFUFRPTSA-N 0.000 description 3
- KKXDHFKZWKLYGB-GUBZILKMSA-N Leu-Asn-Glu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N KKXDHFKZWKLYGB-GUBZILKMSA-N 0.000 description 3
- HYIFFZAQXPUEAU-QWRGUYRKSA-N Leu-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C HYIFFZAQXPUEAU-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 3
- SQUFDMCWMFOEBA-KKUMJFAQSA-N Leu-Ser-Tyr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 SQUFDMCWMFOEBA-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 3
- LFXSPAIBSZSTEM-PMVMPFDFSA-N Leu-Trp-Phe Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)N[C@@H](CC3=CC=CC=C3)C(=O)O)N LFXSPAIBSZSTEM-PMVMPFDFSA-N 0.000 description 3
- PHHYNOUOUWYQRO-XIRDDKMYSA-N Lys-Asp-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N PHHYNOUOUWYQRO-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 3
- DFXQCCBKGUNYGG-GUBZILKMSA-N Lys-Gln-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN DFXQCCBKGUNYGG-GUBZILKMSA-N 0.000 description 3
- GGNOBVSOZPHLCE-GUBZILKMSA-N Lys-Gln-Asp Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O GGNOBVSOZPHLCE-GUBZILKMSA-N 0.000 description 3
- WGLAORUKDGRINI-WDCWCFNPSA-N Lys-Glu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O WGLAORUKDGRINI-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 3
- YFQSSOAGMZGXFT-MEYUZBJRSA-N Lys-Thr-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O YFQSSOAGMZGXFT-MEYUZBJRSA-N 0.000 description 3
- RIPJMCFGQHGHNP-RHYQMDGZSA-N Lys-Val-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CCCCN)N)O RIPJMCFGQHGHNP-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 3
- UZVWDRPUTHXQAM-FXQIFTODSA-N Met-Asp-Ala Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O UZVWDRPUTHXQAM-FXQIFTODSA-N 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 3
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 3
- MYQCCQSMKNCNKY-KKUMJFAQSA-N Phe-His-Ser Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N MYQCCQSMKNCNKY-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 3
- RAGOJJCBGXARPO-XVSYOHENSA-N Phe-Thr-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@H](O)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 RAGOJJCBGXARPO-XVSYOHENSA-N 0.000 description 3
- JSGWNFKWZNPDAV-YDHLFZDLSA-N Phe-Val-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 JSGWNFKWZNPDAV-YDHLFZDLSA-N 0.000 description 3
- RGMLUHANLDVMPB-ULQDDVLXSA-N Phe-Val-Lys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)N RGMLUHANLDVMPB-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 3
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 description 3
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 3
- ZPPVJIJMIKTERM-YUMQZZPRSA-N Pro-Gln-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 ZPPVJIJMIKTERM-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 3
- QGLFRQCECIWXFA-RCWTZXSCSA-N Pro-Met-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@@H]1CCCN1)O QGLFRQCECIWXFA-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 3
- ZUZINZIJHJFJRN-UBHSHLNASA-N Pro-Phe-Ala Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1NCCC1)C1=CC=CC=C1 ZUZINZIJHJFJRN-UBHSHLNASA-N 0.000 description 3
- 241000169446 Promethis Species 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- FCRMLGJMPXCAHD-FXQIFTODSA-N Ser-Arg-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O FCRMLGJMPXCAHD-FXQIFTODSA-N 0.000 description 3
- IOVHBRCQOGWAQH-ZKWXMUAHSA-N Ser-Gly-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O IOVHBRCQOGWAQH-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 3
- MOQDPPUMFSMYOM-KKUMJFAQSA-N Ser-His-Phe Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)NC(=O)[C@H](CO)N MOQDPPUMFSMYOM-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 3
- IUXGJEIKJBYKOO-SRVKXCTJSA-N Ser-Leu-His Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N IUXGJEIKJBYKOO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- HKHCTNFKZXAMIF-KKUMJFAQSA-N Ser-Tyr-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CO)CC1=CC=C(O)C=C1 HKHCTNFKZXAMIF-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 3
- TYVAWPFQYFPSBR-BFHQHQDPSA-N Thr-Ala-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O TYVAWPFQYFPSBR-BFHQHQDPSA-N 0.000 description 3
- LXWZOMSOUAMOIA-JIOCBJNQSA-N Thr-Asn-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N)O LXWZOMSOUAMOIA-JIOCBJNQSA-N 0.000 description 3
- AHOLTQCAVBSUDP-PPCPHDFISA-N Thr-Ile-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O AHOLTQCAVBSUDP-PPCPHDFISA-N 0.000 description 3
- WVVOFCVMHAXGLE-LFSVMHDDSA-N Thr-Phe-Ala Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O WVVOFCVMHAXGLE-LFSVMHDDSA-N 0.000 description 3
- BBPCSGKKPJUYRB-UVOCVTCTSA-N Thr-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O BBPCSGKKPJUYRB-UVOCVTCTSA-N 0.000 description 3
- PELIQFPESHBTMA-WLTAIBSBSA-N Thr-Tyr-Gly Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 PELIQFPESHBTMA-WLTAIBSBSA-N 0.000 description 3
- 241000499912 Trichoderma reesei Species 0.000 description 3
- HOJPPPKZWFRTHJ-PJODQICGSA-N Trp-Arg-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)N HOJPPPKZWFRTHJ-PJODQICGSA-N 0.000 description 3
- PNHABSVRPFBUJY-UMPQAUOISA-N Trp-Arg-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)N)O PNHABSVRPFBUJY-UMPQAUOISA-N 0.000 description 3
- YTYHAYZPOARHAP-HOCLYGCPSA-N Trp-Lys-Gly Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)O)N YTYHAYZPOARHAP-HOCLYGCPSA-N 0.000 description 3
- SUEGAFMNTXXNLR-WFBYXXMGSA-N Trp-Ser-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O SUEGAFMNTXXNLR-WFBYXXMGSA-N 0.000 description 3
- VCXWRWYFJLXITF-AUTRQRHGSA-N Tyr-Ala-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 VCXWRWYFJLXITF-AUTRQRHGSA-N 0.000 description 3
- BEIGSKUPTIFYRZ-SRVKXCTJSA-N Tyr-Asp-Asp Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N)O BEIGSKUPTIFYRZ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- NRFTYDWKWGJLAR-MELADBBJSA-N Tyr-Asp-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)N)C(=O)O NRFTYDWKWGJLAR-MELADBBJSA-N 0.000 description 3
- LOOCQRRBKZTPKO-AVGNSLFASA-N Tyr-Glu-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 LOOCQRRBKZTPKO-AVGNSLFASA-N 0.000 description 3
- AXWBYOVVDRBOGU-SIUGBPQLSA-N Tyr-Ile-Gln Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)N AXWBYOVVDRBOGU-SIUGBPQLSA-N 0.000 description 3
- DWAMXBFJNZIHMC-KBPBESRZSA-N Tyr-Leu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O DWAMXBFJNZIHMC-KBPBESRZSA-N 0.000 description 3
- PSALWJCUIAQKFW-ACRUOGEOSA-N Tyr-Phe-Lys Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)N PSALWJCUIAQKFW-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 3
- YMZYSCDRTXEOKD-IHPCNDPISA-N Tyr-Trp-Asn Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC3=CC=C(C=C3)O)N YMZYSCDRTXEOKD-IHPCNDPISA-N 0.000 description 3
- IZFVRRYRMQFVGX-NRPADANISA-N Val-Ala-Gln Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N IZFVRRYRMQFVGX-NRPADANISA-N 0.000 description 3
- RUCNAYOMFXRIKJ-DCAQKATOSA-N Val-Ala-Lys Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN RUCNAYOMFXRIKJ-DCAQKATOSA-N 0.000 description 3
- 108010005233 alanylglutamic acid Proteins 0.000 description 3
- 108010044940 alanylglutamine Proteins 0.000 description 3
- 108010050025 alpha-glutamyltryptophan Proteins 0.000 description 3
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 3
- 108010019832 glycyl-asparaginyl-glycine Proteins 0.000 description 3
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 3
- 108010044374 isoleucyl-tyrosine Proteins 0.000 description 3
- 108010003700 lysyl aspartic acid Proteins 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- 108010074082 phenylalanyl-alanyl-lysine Proteins 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- XPFJYKARVSSRHE-UHFFFAOYSA-K trisodium;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylate;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O.[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O XPFJYKARVSSRHE-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 108010051110 tyrosyl-lysine Proteins 0.000 description 3
- 108010020532 tyrosyl-proline Proteins 0.000 description 3
- 108010003137 tyrosyltyrosine Proteins 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- -1 variant Proteins 0.000 description 3
- JAQNUEWEJWBVAY-WBAXXEDZSA-N Ala-Phe-Phe Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@@H](N)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 JAQNUEWEJWBVAY-WBAXXEDZSA-N 0.000 description 2
- 108010025188 Alcohol oxidase Proteins 0.000 description 2
- 241000235349 Ascomycota Species 0.000 description 2
- 101000757144 Aspergillus niger Glucoamylase Proteins 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 2
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 description 2
- 108010008885 Cellulose 1,4-beta-Cellobiosidase Proteins 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 241000193385 Geobacillus stearothermophilus Species 0.000 description 2
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 2
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- MSSJHBAKDDIRMJ-SRVKXCTJSA-N Met-Lys-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O MSSJHBAKDDIRMJ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- BQVUABVGYYSDCJ-UHFFFAOYSA-N Nalpha-L-Leucyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 BQVUABVGYYSDCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- CICQXRWZNVXFCU-SRVKXCTJSA-N Ser-His-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O CICQXRWZNVXFCU-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 108010008685 alanyl-glutamyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 2
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 2
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 2
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 2
- MTZQAGJQAFMTAQ-UHFFFAOYSA-N ethyl benzoate Chemical compound CCOC(=O)C1=CC=CC=C1 MTZQAGJQAFMTAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 2
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- QPJVMBTYPHYUOC-UHFFFAOYSA-N methyl benzoate Chemical compound COC(=O)C1=CC=CC=C1 QPJVMBTYPHYUOC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 238000007670 refining Methods 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 2
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- CHHHXKFHOYLYRE-UHFFFAOYSA-M 2,4-Hexadienoic acid, potassium salt (1:1), (2E,4E)- Chemical compound [K+].CC=CC=CC([O-])=O CHHHXKFHOYLYRE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 3-phospho-D-glyceric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)COP(O)(O)=O OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 4-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 108010037870 Anthranilate Synthase Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- FTSAJSADJCMDHH-CIUDSAMLSA-N Asn-Lys-Asp Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N FTSAJSADJCMDHH-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- VWADICJNCPFKJS-ZLUOBGJFSA-N Asn-Ser-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O VWADICJNCPFKJS-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- BPTFNDRZKBFMTH-DCAQKATOSA-N Asp-Met-Lys Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N BPTFNDRZKBFMTH-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- 102000035101 Aspartic proteases Human genes 0.000 description 1
- 108091005502 Aspartic proteases Proteins 0.000 description 1
- 101000961203 Aspergillus awamori Glucoamylase Proteins 0.000 description 1
- 241000351920 Aspergillus nidulans Species 0.000 description 1
- 101000690713 Aspergillus niger Alpha-glucosidase Proteins 0.000 description 1
- 241000193744 Bacillus amyloliquefaciens Species 0.000 description 1
- 101000775727 Bacillus amyloliquefaciens Alpha-amylase Proteins 0.000 description 1
- 241000193755 Bacillus cereus Species 0.000 description 1
- 241000193749 Bacillus coagulans Species 0.000 description 1
- 101000695691 Bacillus licheniformis Beta-lactamase Proteins 0.000 description 1
- 108010029675 Bacillus licheniformis alpha-amylase Proteins 0.000 description 1
- 241000194107 Bacillus megaterium Species 0.000 description 1
- 101900040182 Bacillus subtilis Levansucrase Proteins 0.000 description 1
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000221198 Basidiomycota Species 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 241000193764 Brevibacillus brevis Species 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 1
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 1
- 241000233652 Chytridiomycota Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 1
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000701867 Enterobacteria phage T7 Species 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 101150108358 GLAA gene Proteins 0.000 description 1
- 102000048120 Galactokinases Human genes 0.000 description 1
- 108700023157 Galactokinases Proteins 0.000 description 1
- NUMFTVCBONFQIQ-DRZSPHRISA-N Gln-Ala-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O NUMFTVCBONFQIQ-DRZSPHRISA-N 0.000 description 1
- HJIFPJUEOGZWRI-GUBZILKMSA-N Glu-Asp-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N HJIFPJUEOGZWRI-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- YDIDLLVFCYSXNY-RCOVLWMOSA-N Gly-Val-Asn Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)CN YDIDLLVFCYSXNY-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- VGYOLSOFODKLSP-IHPCNDPISA-N His-Leu-Trp Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(O)=O)C1=CN=CN1 VGYOLSOFODKLSP-IHPCNDPISA-N 0.000 description 1
- JUIOPCXACJLRJK-AVGNSLFASA-N His-Lys-Glu Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N JUIOPCXACJLRJK-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- SYPULFZAGBBIOM-GVXVVHGQSA-N His-Val-Glu Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)N SYPULFZAGBBIOM-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- 241001043155 Komagataella sp. Species 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241000233654 Oomycetes Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000235061 Pichia sp. Species 0.000 description 1
- 241000255969 Pieris brassicae Species 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 241000589774 Pseudomonas sp. Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 241000235403 Rhizomucor miehei Species 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 101900354623 Saccharomyces cerevisiae Galactokinase Proteins 0.000 description 1
- 101900084120 Saccharomyces cerevisiae Triosephosphate isomerase Proteins 0.000 description 1
- 241000235088 Saccharomyces sp. Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- PCMZJFMUYWIERL-ZKWXMUAHSA-N Ser-Val-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O PCMZJFMUYWIERL-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 241000187432 Streptomyces coelicolor Species 0.000 description 1
- 241000187398 Streptomyces lividans Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 102000005924 Triose-Phosphate Isomerase Human genes 0.000 description 1
- 108700015934 Triose-phosphate isomerases Proteins 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- JLFKWDAZBRYCGX-ZKWXMUAHSA-N Val-Asn-Ser Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N JLFKWDAZBRYCGX-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- 241000235015 Yarrowia lipolytica Species 0.000 description 1
- 241000490645 Yarrowia sp. Species 0.000 description 1
- 241000758405 Zoopagomycotina Species 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 108010045649 agarase Proteins 0.000 description 1
- 108010066829 alanyl-glutamyl-aspartylprolyine Proteins 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 229940054340 bacillus coagulans Drugs 0.000 description 1
- 229940097012 bacillus thuringiensis Drugs 0.000 description 1
- 235000015173 baked goods and baking mixes Nutrition 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000011098 chromatofocusing Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 235000008504 concentrate Nutrition 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 1
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229940095102 methyl benzoate Drugs 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 108090000021 oryzin Proteins 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 108010073128 phosphatidylcholine-specific phospholipase C Proteins 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004302 potassium sorbate Substances 0.000 description 1
- 229940069338 potassium sorbate Drugs 0.000 description 1
- 235000010241 potassium sorbate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 108010048818 seryl-histidine Proteins 0.000 description 1
- 238000010563 solid-state fermentation Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 229960002920 sorbitol Drugs 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- KMZJRCPGGAQHGC-UHFFFAOYSA-N trisodium boric acid borate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].OB(O)O.[O-]B([O-])[O-] KMZJRCPGGAQHGC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантным полипептидам с активностью фосфолипазы С, и может быть использовано для дегуммирования масел и жиров. Предложен мутантный полипептид фосфолипазы С, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 4 и характеризуется при этом наличием пролина, валина, серина и серина в положениях аминокислотных остатков, соответствующих положениям 6, 8, 10 и 104 в SEQ ID NO: 4 соответственно. Изобретение обеспечивает получение мутантной фосфолипазы C с высокой ферментативной активностью, что позволяет улучшить эффективность дегуммирования и увеличить выход диацилглицерина (DAG) во время дегуммирования. 7 н. и 5 з.п. ф-лы, 3 ил., 1 табл., 4 пр.
Description
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к мутанту фосфолипазы С с высокой ферментативной активностью.
Предшествующий уровень техники
Дегуммирование является важной стадией в очистке масел и жиров. Традиционный способ дегуммирования путем гидратации подразумевает большие финансовые затраты, большой расход материалов и энергии и серьезное загрязнение окружающей среды. Поэтому в последние годы много усилий было приложено для применения ферментативного дегуммирования в процессе дегуммирования при очистке масел и жиров, и был достигнут большой прогресс. По сравнению с традиционными способами ферментативное дегуммирование может увеличивать экономическую выгоду, уменьшать энергетические затраты, снижать выбросы, уменьшать экологическое загрязнение окружающей среды, то есть имеет огромные преимущества в отношении защиты окружающей среды, экономической целесообразности и качества. Ферментом, используемым в дегуммировании масел и жиров, является фосфолипаза. По сравнению с другими ферментами для дегуммирования, фосфолипаза С (PLC) обладает существенными преимуществами, такими как увеличение выхода диацилглицерина (DAG) и уменьшение потерь выхода масел.
PC-PLC из Bacillus cereus (BC-PC-PLC) представляет собой фосфолипазу С, которую изучали ранее. Полная длина BC-PC-PLC составляет 283 аминокислоты, включая сигнальный пептид из 24 аминокислот и лидерный пептид из 14 аминокислот. Зрелый пептид BC-PC-PLC имеет 245 аминокислот (Johansen et al. 1988). Известно, что кристаллическая структура BC-PC-PLC состоит из множественных спиральных доменов с каталитическим сайтом D55 и по меньшей мере тремя сайтами связывания Zn2+ (Hough et al. 1989). Менее изучена гетерологичная экспрессия BC-PC-PLC за исключением таковой в Bacillus subtilis и Pichia pastoris (Durban et al.2007; Seo et al. 2004).
В предыдущих исследованиях авторы настоящего изобретения получили мутант со значительно повышенной по сравнению с диким типом специфической ферментативной активностью путем введения мутаций в N56, N63, N131 и N134 BC-PC-PLC с заменой на Н, D, S и D, соответственно. Для дополнительного повышения специфической ферментативной активности фосфолипазы С и эффективности дегуммирования с использованием фосфолипазы С авторы настоящего изобретения выбрали аминокислоты по положениям 6, 8, 10, 104 и 205 в BC-PC-PLC для случайного насыщающего мутагенеза. Полагают, что путем направленного развития существующей мутантной фосфолипазы С специфическая ферментативная активность может быть дополнительно повышена, с тем чтобы получить более эффективную фосфолипазу С, улучшить эффективность дегуммирования и увеличить выход диацилглицерина (DAG) в процессе дегуммирования.
Краткое изложение сущности изобретения
В настоящем изобретении предложен выделенный полипептид, выбранный из группы, состоящей из:
(1) полипептида, представленного в SEQ ID NO: 7; и
(2) полипептида, имеющего идентичность последовательности SEQ ID NO: 7 по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, более предпочтительно по меньшей мере на 97%, более предпочтительно по меньшей мере на 98%, более предпочтительно по меньшей мере на 99%, где аминокислотные остатки полипептида, соответствующие по меньшей мере одной из аминокислот 6, 8, 10 и 104 в SEQ ID NO: 7, являются такими же как аминокислоты 6, 8, 10 и/или 104 в SEQ ID NO: 7, соответственно, и полипептид обладает активностью фосфолипазы С с SEQ ID NO: 7.
В одном или более чем одном воплощении аминокислота 6 в SEQ ID NO: 7 представляет собой пролин или триптофан; аминокислота 8 представляет собой аланин, лейцин или изолейцин; каждая из аминокислот 10 и 104 независимо представляет собой серии или треонин.
В одном или более чем одном воплощении выделенный полипептид является таким, как представлено в SEQ ID NO: 4.
В данном изобретении дополнительно предложен выделенный полипептид, имеющий идентичность последовательности SEQ ID NO: 4 по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, более предпочтительно по меньшей мере на 97%, более предпочтительно по меньшей мере на 98%, более предпочтительно по меньшей мере на 99%, где аминокислотные остатки выделенного полипептида, соответствующие аминокислотам 6, 8, 10 и 104 в SEQ ID NO: 4, представляют собой пролин, валин, серии и серии, соответственно; предпочтительно, полипептид получен из Bacillus subtilis.
Также в настоящем изобретении предложена полинуклеотидная последовательность, выбранная из группы, состоящей из:
(1) полинуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид согласно любому из воплощений, изложенных здесь; и
(2) последовательности, комплементарной полинуклеотидной последовательности (1); и
(3) фрагмента от 15 до 30 п. о. (пар оснований) последовательности (1) или (2); предпочтительно, полинуклеотидная последовательность является такой, как
представлено в SEQ ID NO: 3.
Также в настоящем изобретении предложена конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая полинуклеотидную последовательность согласно любому из воплощений, изложенных здесь, и одну или более чем одну регуляторную последовательность, функционально связанную с данной полинуклеотидной последовательностью.
В одном или более чем одном воплощении конструкция нуклеиновой кислоты представляет собой вектор.
В одном или более чем одном воплощении вектор представляет собой экспрессионный вектор или клонирующий вектор.
Также в настоящем изобретении предложена генетически сконструированная клетка-хозяин, содержащая полинуклеотидную последовательность или конструкцию нуклеиновой кислоты согласно любому из воплощений, изложенных здесь.
Также в настоящем изобретении предложена композиция, содержащая полипептид согласно любому из раскрытых здесь воплощений и возможно адъюванты, предпочтительно адъюванты представляют собой адсорбирующие вещества, выбранные из группы, состоящей из: активированного угля, оксида алюминия, диатомовой земли, пористых керамических веществ и пористого стекла.
Также в настоящем изобретении предложено применение полипептида, полинуклеотидной последовательности, конструкции нуклеиновой кислоты, клетки-хозяина или композиции согласно любому из раскрытых здесь воплощений, в очистке масел и жиров, модификации фосфолипидов, модификации пищевых продуктов, пищевой промышленности и фармацевтической промышленности.
Также в настоящем изобретении предложен способ ферментативного дегуммирования, включающий дегуммирование с использованием полипептида согласно любому из раскрытых здесь воплощений; предпочтительно способ включает стадию приведения в контакт полипептида с неочищенным маслом; предпочтительно эта стадия включает приведение в контакт полипептида с неочищенным маслом при 50-70°С.
В одном или более чем одном воплощении способ включает один или более чем один из следующих признаков:
(1) исходя из массы неочищенного масла, полипептид добавляют в количестве от 10 до 1000 миллионных долей (м.д.), предпочтительно от 50 до 500 м.д., более предпочтительно от 100 до 300 м.д.;
(2) дегуммирование включает перемешивание при 50-60°С в течение 1-3 часов и затем повышение температуры до 80-90°С и выдерживание в течение 1-10 минут; и
(3) неочищенное масло выбрано из группы, состоящей из соевого масла, подсолнечного масла, арахисового масла, рапсового масла, масла из рисовых отрубей, кукурузного масла, оливкового масла, пальмового масла, пальмоядрового масла, пальмового олеина, масла канола, касторового масла, кокосового масла, кориандрового масла, хлопкового масла, масла лесного ореха, конопляного масла, льняного масла, масла из косточек манго, масла пенника лугового, копытного масла, сафлорового масла, масла камелии (camellia), талового масла и масла камелии (tsubaki).
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1: Специфическая ферментативная активность мутантов.
Фиг. 2: Результаты теста дегуммирования в небольшом объеме.
Фиг. 3: Стандартная кривая для определения активности фосфолипазы.
Подробное описание изобретения
Следует понимать, что в объеме настоящего изобретения вышеизложенные технические признаки изобретения и технические признаки, специально описанные далее (например, в Примерах), можно комбинировать друг с другом, тем самым образуя предпочтительное(ые) техническое(ие) решение(я).
В настоящем изобретении предложен выделенный полипептид с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 7, или выделенный полипептид, имеющий идентичность последовательности SEQ ID NO: 7 по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, более предпочтительно по меньшей мере на 97%, более предпочтительно по меньшей мере на 98%, более предпочтительно по меньшей мере на 99%, где аминокислотные остатки полипептида, соответствующие по меньшей мере одной из аминокислот 6, 8, 10 и 104 в SEQ ID NO: 7, являются такими же как аминокислоты 6, 8, 10 и/или в 104 SEQ ID NO: 7, соответственно, и полипептид обладает активностью фосфолипазы С с SEQ ID NO: 7.
Здесь термин «выделенный» означает форму или вещество, которые не существуют в природе. Неограничивающие примеры выделенных веществ включают любое не встречающееся в природе вещество и любое вещество, которое по меньшей мере частично отделено от одного или более чем одного или всех из встречающихся в природе компонентов, ассоциированных с ним в природе, включая любой фермент, вариант, нуклеиновую кислоту, белок, пептид или кофактор, но не ограничиваясь ими. Для SEQ ID NO: 7 аминокислотные остатки (Хаа) в положениях 6 и 8 могут представлять собой аминокислотные остатки, имеющие неполярную боковую цепь, включая аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин и триптофан, но не ограничиваясь ими; аминокислотные остатки (Хаа) в положениях 10 и 104 могут представлять собой аминокислоты, имеющие незаряженную полярную боковую цепь, включая глицин, аспарагин, глутамин, серии, треонин, тирозин или цистеин, но не ограничиваясь ими. Предпочтительно аминокислота 6 в SEQ ID NO: 7 представляет собой пролин или триптофан; аминокислота 8 представляет собой аланин, лейцин или изолейцин; каждая из аминокислот 10 и 104 независимо представляет собой серии или треонин. Аминокислотная последовательность репрезентативного полипептида показана в SEQ ID NO: 4.
Также настоящее изобретение включает полипептиды, имеющие одну или более чем одну (обычно от 1 до 10, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10) аминокислотную мутацию (делецию, вставку и/или замену) на основе SEQ ID NO: 7, в то же время сохраняя активность фосфолипазы С, присущей аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 4. В некоторых воплощениях аминокислотная мутация представляет собой добавление одной или нескольких (обычно в пределах 20, предпочтительно в пределах 10, более предпочтительно в пределах 8) аминокислот на С-конце и/или N-конце SEQ ID NO: 7. Следует понимать, что одна или более чем одна аминокислотная мутация обычно не включает случай, где все аминокислоты (Хаа) в положениях 6, 8, 10 и 104 в SEQ ID NO: 7 мутированы.
Предпочтительно мутация представляет собой консервативную замену. Например, в данной области техники консервативная замена с использованием аминокислот с близкими или похожими свойствами обычно не изменяет функцию данного полипептида или белка. Выражение «аминокислоты с близкими или похожими свойствами» включает, например, семейство аминокислот, имеющих похожие боковые цепи. Эти семейства включают аминокислоты с основной боковой цепью (например, лизин, аргинин, гистидин), аминокислоты с кислотной боковой цепью (например, аспартат, глутамат), аминокислоты с незаряженной полярной боковой цепью (например, глицин, аспарагин, глутамин, серии, треонин, тирозин, цистеин), аминокислоты с неполярной боковой цепью (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), аминокислоты с β-разветвленной боковой цепью (например, треонин, валин, изолейцин) и аминокислоты с ароматической боковой цепью (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Следовательно, замена одного или нескольких аминокислотных остатков в полипептиде по настоящему изобретению на другой аминокислотный остаток из семейства аминокислот того же класса боковых цепей не будет существенно изменять активность полипептида.
В настоящем изобретении термин «случайный насыщающий мутагенез» относится к процессу использования NNK вырожденных кодонов в ПЦР-праймерах для введения мутаций в сайт, который может охватывать все 20 аминокислот для достижения насыщающего мутагенеза. Между тем, поскольку множественные сайты выбраны для мутагенеза, комбинация является случайной. В настоящем описании этот способ обозначают как случайный насыщающий мутагенез.
Дополнительно, насколько известно специалистам в данной области техники, процесс генетического клонирования часто требует конструирования подходящих сайтов для эндонуклеаз, которые в итоге вводят один или более чем один нерелевантный остаток на конце белка, подлежащего экспрессии, но это не влияет на активность исследуемого белка. В другом примере для конструирования слитого белка, для стимуляции экспрессии рекомбинантного белка, для получения рекомбинантного белка, который автоматически секретируется из клетки-хозяина, или для облегчения очистки рекомбинантного белка часто желательно иметь добавленные на N-конце, С-конце или других подходящих участках рекомбинантного белка некоторые аминокислотные последовательности, например, включая линкерные пептиды, сигнальные пептиды, лидерные пептиды, концевые удлинения, глутатион-S-трансферазу (GST), связывающий мальтозу белок Е, Белок А, метки, такие как 6His или Flag, или подходящие сайты расщепления протеазами, но не ограничиваясь ими. Следует понимать, что присутствие этих аминокислотных последовательностей не влияет на активность получаемого полипептида. Следовательно, настоящее изобретение также включает полипептид, имеющий одну или более чем одну аминокислоту на С-конце и/или N-конце полипептида по настоящему изобретению или в подходящем участке белка по изобретению, которая облегчает конструирование вектора, экспрессирующего полипептид, экспрессию и/или очистку полипептида. При этом эти полипептиды по-прежнему обладают активностью фосфолипазы С, как описано здесь.
Следовательно, в определенных воплощениях настоящего изобретения предложена аминокислотная последовательность, имеющая идентичность последовательности SEQ ID NO: 7 по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, более предпочтительно по меньшей мере на 96%, более предпочтительно по меньшей мере на 97%, более предпочтительно по меньшей мере на 98%, более предпочтительно по меньшей мере на 99%. Кроме того, в настоящем изобретении предложена аминокислотная последовательность, имеющая идентичность последовательности SEQ ID NO: 4 по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, более предпочтительно по меньшей мере на 96%, более предпочтительно по меньшей мере на 97%, более предпочтительно по меньшей мере на 98%, более предпочтительно по меньшей мере на 99%. В аминокислотных последовательностях, имеющих такую идентичность с последовательностями SEQ ID NO: 4 и 7, не все аминокислотные остатки в положениях, соответствующих аминокислотам 6, 8, 10 и 104 в SEQ ID NO: 4 и 7, мутированы; предпочтительно аминокислотные последовательности имеют такие же аминокислотные остатки как в SEQ ID NO: 4 и 7 в положениях, соответствующих аминокислотам 6, 8, 10 и 104 в SEQ ID NO: 4 и 7, например, имеют пролин, валин, серии и серии в положениях, соответствующих аминокислотам 6, 8, 10 и 104 в SEQ ID NO: 4. Более предпочтительно аминокислотная последовательность, имеющая такую идентичность последовательности, получена из Bacillus subtilis. Здесь понятие «идентичность последовательности» используют для описания соответствия между двумя аминокислотными последовательностями или между двумя нуклеотидными последовательностями. Методы, известные в данной области техники, можно использовать для расчета идентичности последовательностей. Например, идентичность последовательности между двумя аминокислотными последовательностями можно определить с помощью алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, Journal of Molecular Biology, 48:443-453), входящего в программу Needle пакета EMBOSS (EMBOSS: European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends in Genetics, 16:276-277). Альтернативно, можно использовать BLASTP на сайте NCBI для расчета идентичности последовательности между двумя аминокислотными последовательностями.
В зависимости от хозяина, используемого для рекомбинантной продукции, полипептид по настоящему изобретению может быть гликозилированным или негликозилированным.
Полинуклеотид
В настоящем изобретении предложена нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид по настоящему изобретению, или комплементарная ей последовательность. SEQ ID NO: 3 представляет собой пример кодирующей последовательности полипептида по настоящему изобретению. Термин «кодирующая последовательность» включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид по настоящему изобретению (особенно SEQ ID NO: 7). Последовательность, кодирующая полипептид по настоящему изобретению, может быть идентична, например, последовательности кодирующей области как показано в SEQ ID NO: 3 или ее вырожденному варианту. Как его используют здесь, термин «вырожденный вариант» в настоящем описании относится к нуклеотидной последовательности, которая кодирует такую же аминокислотную последовательность, но отличается по нуклеотидной последовательности.
Последовательность, кодирующая полипептид по настоящему изобретению, включает кодирующую последовательность, кодирующую только зрелый полипептид; кодирующую последовательность зрелого полипептида и различные дополнительные кодирующие последовательности; кодирующую последовательность зрелого полипептида (и возможно дополнительную кодирующую последовательность) и некодирующую последовательность.
Также настоящее изобретение относится к варианту вышеописанных полинуклеотидов, который кодирует фрагменты, аналоги, производные и варианты той же самой аминокислотной последовательности по настоящему изобретению. Эти варианты нуклеотидов включают варианты с заменами, варианты с делециями и варианты со вставками. Как известно в данной области техники, аллельный вариант представляет собой альтернативную форму полинуклеотида, которая может быть обусловлена одной или более чем одной нуклеотидной заменой, делецией или вставкой, но существенно не изменяет функцию кодируемого белка.
Также в настоящее изобретение включен фрагмент последовательности нуклеиновой кислоты (такой как SEQ ID NO: 3 или комплементарная ей последовательность), кодирующей полипептид по настоящему изобретению. Длина «фрагмента нуклеиновой кислоты», как используют здесь, составляет по меньшей мере 15 нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 30 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 50 нуклеотидов и наиболее предпочтительно по меньшей мере 100 или более чем 100 нуклеотидов. Фрагмент нуклеиновой кислоты можно использовать в методах амплификации нуклеиновой кислоты (например, ПЦР) для определения и/или выделения полинуклеотидов, кодирующих полипептиды по настоящему изобретению. Следовательно, в некоторых воплощениях фрагмент нуклеиновой кислоты имеет длину от 15 до 30 оснований. Известные методы можно использовать для выбора подходящих фрагментов нуклеиновых кислот из последовательности нуклеиновой кислоты по изобретению, которые используют в качестве праймеров или зондов.
Обычно кодирующие последовательности полипептидов по настоящему изобретению или их фрагменты можно получить с помощью методов ПЦР-амплификации, рекомбинации или искусственного синтеза. Для ПЦР-амплификации праймеры могут быть сконструированы в зависимости от соответствующей нуклеотидной последовательности, раскрытой в настоящем изобретении, в частности, последовательности открытой рамки считывания. Доступную в продаже библиотеку кДНК или библиотеку кДНК, полученную с использованием рутинных методов специалистом в данной области техники, можно использовать в качестве матрицы для амплификации соответствующей последовательности. Для более длинных последовательностей обычно требуются две или более индивидуальных ПЦР-амплификации, после которых следует лигирование амплифицированных по отдельности фрагментов друг с другом в соответствующем порядке.
Конструкция нуклеиновой кислоты
Также настоящее изобретение относится к конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей выделенный полинуклеотид по настоящему изобретению, функционально связанный с одной или более чем одной регуляторной последовательностью, которая управляет экспрессией кодирующей последовательности в подходящей клетке-хозяине в условиях, подходящих для регуляторных последовательностей. Термин «функционально связанный» означает, что регуляторные последовательности расположены в соответствующих положениях, так чтобы контролировать и направлять экспрессию данной полинуклеотидной последовательности. С полинуклеотидом, кодирующим полипептид по настоящему изобретению, можно проводить различные манипуляции для обеспечения экспрессии полипептида.
Регуляторная последовательность может представлять собой подходящую промоторную последовательность, нуклеотидную последовательность, распознаваемую клеткой-хозяином для экспрессии полинуклеотида, кодирующего полипептид по настоящему изобретению. Промоторная последовательность содержит последовательности для регуляции транскрипции, которые опосредуют экспрессию полипептида. Промотор может представлять собой любую нуклеотидную последовательность, обладающую транскрипционной активностью в выбранной клетке-хозяине, включая мутантные, укороченные и гибридные промоторы, и может быть получен из гена, кодирующего внеклеточный или внутриклеточный полипептид, который является гомологичным или гетерологичным для данной клетки-хозяина.
Примеры подходящих промоторов для управления транскрипцией конструкций нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, особенно в бактериальных клетках-хозяевах, представляют собой промоторные последовательности, имеющие происхождение от промотора фага Т7, lac-оперона Е. coli, гена агаразы Streptomyces coelicolor, гена левансахаразы Bacillus subtilis, гена альфа-амилазы Bacillus licheniformis, гена альфа-амилазы Bacillus amyloliquefaciens, гена пенициллиназы Bacillus licheniformis и так далее.
Примеры подходящих промоторов для управления транскрипцией конструкции нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению в хозяевах-клетках мицелиального гриба представляют собой промоторы, имеющие происхождение из генов: ТАКА-амилазы Aspergillus oryzae, аспарагиновой протеазы Rhizomucor miehei, нейтральной альфа-амилазы Aspergillus niger, кислотно-стабилизированной альфа-амилазы Aspergillus niger, глюкоамилазы Aspergillus niger или Aspergillus awamori (glaA), целлобиогидролазы I Trichoderma reesei, целлобиогидролазы II Trichoderma reesei, щелочной протеазы Aspergillus oryzae, триозофосфатизомеразы Aspergillus oryzae, эндоглюканазы Trichoderma reesei и так далее, или мутантные, укороченные и гибридные формы этих промоторов.
В хозяевах-дрожжах полезные промоторы могут быть получены из генов енолазы Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), галактокиназы Saccharomyces cerevisiae (GAL1), алкогольдегидрогеназы Saccharomyces cerevisiae, глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы, триозофосфатизомеразы Saccharomyces cerevisiae, 3-фосфоглицераткиназы Saccharomyces cerevisiae, алкогольоксидазы Pichia pastoris. Другие подходящие промоторы для дрожжевых клеток-хозяев описаны в Romanos et al., 1992, Yeast 8:423-488.
Также регуляторная последовательность может представлять собой подходящий терминатор транскрипции, последовательность, распознаваемую клеткой-хозяином для остановки транскрипции. Терминатор функционально связан с 3'-концом нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид. Любой терминатор, который является функциональным в выбранной клетке-хозяине, может быть использован в настоящем изобретении.
Предпочтительный терминатор для бактериальных хозяев может представлять собой терминатор из фага Т7.
Предпочтительный терминатор для клеток-хозяев мицелиального гриба получен из генов ТАКА-амилазы Aspergillus oryzae, глюкоамилазы Aspergillus niger, антранилатсинтазы Aspergillus nidulans, альфа-глюкозидазы Aspergillus niger.
Предпочтительный терминатор для дрожжевых клеток-хозяев получен из генов енолазы Saccharomyces cerevisiae, цитохрома С Saccharomyces cerevisiae, глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы Saccharomyces cerevisiae, алкоголь оксидазы Pichia pastoris и им подобных.
Также регуляторная последовательность может представлять собой подходящую лидерную последовательность, нетранслируемый участок мРНК, который важен для трансляции в клетках-хозяевах. Лидерная последовательность функционально связана с 5'-концом нуклеотидной последовательностьи, кодирующей полипептид. Любой терминатор, который является функциональным в выбранной клетке-хозяине, можно использовать в настоящем изобретении.
Также регуляторная последовательность может представлять собой участок, кодирующий сигнальный пептид, который кодирует аминокислотную последовательность, связанную с концом полипептида и направляет кодируемый полипептид по секреторному пути клетки. 5'-Конец кодирующей нуклеотидной последовательности может неотъемлемо содержать участок, кодирующий сигнальный пептид, естественным путем связанный с трансляционной рамкой считывания, содержащей сегмент кодирующей области, кодирущий секретируемый полипептид. Альтернативно, 5'-конец кодирующей последовательности может содержать участок, кодирующий сигнальный пептид, который является экзогенным для кодирующей области. Когда кодирующая последовательность от природы не содержит участок, кодирующий сигнальный пептид, может потребоваться экзогенный участок, кодирующий сигнальный пептид. Альтернативно, экзогенный участок, кодирующий сигнальный пептид, может просто заменять природный участок, кодирующий сигнальный пептид, для усиления секреции полипептида. Однако, любой участок, кодирующий сигнальный пептид, который направляет экспрессированный полипептид по пути секреции в выбранной клетке-хозяине (то есть секреции в культуральную среду), можно использовать в настоящем изобретении.
В определенных воплощениях конструкция нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению представляет собой экспрессионную кассету. Термин «экспрессионная кассета» относится к полному набору элементов, необходимых для экспрессии гена, включающему промоторы, кодирующие последовательности и последовательности хвостов поли-А.
Вектор
Также настоящее изобретение относится к векторам, содержащим полинуклеотиды или конструкции нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, включая экспрессионные векторы и клонирующие векторы. Экспрессионный вектор может представлять собой любой вектор (такой как плазмида или вирус), к которым удобно применять технологии рекомбинантной ДНК, и может приводить к экспрессии интересуемой нуклеотидной последовательности. Клонирующий вектор обычно обладает способностью размножаться в клетке-хозяине после введения в данную клетку-хозяина.
Выбор вектора обычно зависит от совместимости вектора с клеткой-хозяином, в которую вводят вектор. Вектор может быть линейным или представлять собой замкнутую кольцевую плазмиду.
Вектор может представлять собой самореплицирующийся вектор, то есть вектор, который существует в экстрахромосомной форме, репликация которой не зависит от репликации хромосомы, такой как плазмида, экстрахромосомный элемент, мини-хромосомы или искусственная хромосома. Такой вектор может содержать любые средства для обеспечения саморепликации. Альтернативно, вектор может представлять собой вектор, который при введении в клетку-хозяина встраивается в геном и реплицируется с хромосомой, в которую он встроен. Кроме того, можно использовать один вектор или одну плазмиду, или два или более чем два вектора, или две или более чем две плазмиды, или два или более чем два транспозона, которые вместе содержат общую ДНК для введения в геном клетки-хозяина.
Предпочтительно вектор по настоящему изобретению содержит один или более чем один селектируемый маркер, позволяющий легко отбирать трансформированные, трансфицированные, трансдуцированные клетки и тому подобное. Селектируемые маркеры представляют собой гены, продукты экспрессии которых обеспечивают устойчивость к антибиотикам или вирусам, устойчивость к тяжелым металлам, прототрофию для ауксотрофов и так далее.
Предпочтительно вектор по настоящему изобретению содержит элементы, которые позволяют вектору встраиваться в геном клетки-хозяина или которые дают вектору способность к саморепликации в клетках независимо от генома.
Более чем одна копия полинуклеотидов по настоящему изобретению может быть введена в клетку-хозяина для увеличения выхода продукта гена. Множество копий полинуклеотидов можно получить путем встраивания по меньшей мере одной дополнительной копии последовательности в геном клетки-хозяина или путем включения полинуклеотида и селектируемого гена-маркера, способных к амплификации. Клетки, содержащие амплифицированную копию селектируемого гена-маркера и вследствие этого содержащие дополнительную копию полинуклеотида, могут быть отобраны путем культивирования клетки в присутствии подходящего агента селекции.
Вектор по настоящему изобретению предпочтительно содержит искусственно синтезированную последовательность, содержащую множественные сайты распознавания экдонуклеазами рестрикции, которая может обеспечивать разнообразие положений вставки или схем вставки для экзогенных ДНК.
Более предпочтительно вектор экспрессии по настоящему изобретению представляет собой вектор, который можно использовать для экспрессии в Pichia pastoris. Предпочтительно вектор по настоящему изобретению представляет собой таковой, используемый в доступных в продаже Pichia pastoris, таких как pPIC, pPICZ, pAO, pGAP или pGAPZ, или вектор из этих же видов.
Клетка-хозяин
Также настоящее изобретение относится к рекомбинантной клетке-хозяину, содержащей полинуклеотид или конструкцию нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, которую используют для рекомбинантной продукции полипептидов. Вектор, содержащий полинуклеотид по настоящему изобретению, вводят в клетку-хозяина, так что этот вектор поддерживается как часть хромосомы или как экстрахромосомный самореплицирующийся вектор, как описано ранее. Выбор клетки-хозяина во многом зависит от гена, кодирующего полипептид, и его источника.
Клетка-хозяин может представлять собой одноклеточный микроорганизм или не являющийся одноклеточным микроорганизм. Одноклеточные микроорганизмы, такие как грамположительные бактерии, включают клетку Bacillus, например, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus coagulans, Bacillus stearothermophilus, Bacillus thuringiensis и им подобные; или клетку Streptomyces, например, Streptomyces lividans; или грамотрицательные бактерии, такие как Е. coli и Pseudomonas sp., но не ограничиваясь ими. В предпочтительном аспекте бактериальный хозяин представляет собой Bacillus subtilis, Е. coli, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus и клетки E.coli.
Клетка-хозяин может представлять собой эукариотическую клетку, такую как клетка млекопитающего, насекомого, растения, дрожжей или гриба. В предпочтительном аспекте клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку. Как используют здесь, «эукариотический» включает Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota, Zygomycota, Oomycota и тому подобное.
В более предпочтительном аспекте клетка-хозяин представляет собой клетку Ascomycota, такую как Saccharomyces sp., Pichia sp., Yarrowia sp., Candida sp.и Komagataella sp.
В наиболее предпочтительном аспекте клетка-хозяин представляет собой Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica и им подобные. В другом наиболее предпочтительном аспекте клетка-хозяин представляет собой клетку Pichia pastoris.
Способ получения
После получения кодирующей последовательности полипептида можно использовать способ получения полипептида по настоящему изобретению, включающий: (а) культивирование клетки-хозяина, содержащей вектор для экспрессии полипептида, в условиях, подходящих для продуцирования полипептида; и (б) выделение полипептида.
В способе получения по настоящему изобретению клетки можно культивировать в среде, подходящей для продуцирования полипептида, с помощью методов, известных в данной области техники. Например, клетки можно культивировать во встряхиваемых колбах в лабораторных или промышленных ферментерах и в небольших объемах ферментации или в промышленных объемах ферментации (включая непрерывную, периодическую, периодическую с подпиткой или твердофазную ферментацию) и культивировать в подходящей среде и условиях, обеспечивающих экспрессию и/или выделение полипептида. Культивирование выполняют в подходящей среде, содержащей источники углерода и азота и неорганические соли, с использованием методов, известных в данной области техники. Подходящие среды могут быть приобретены у коммерческих поставщиков или могут быть изготовлены в соответствии с опубликованным составом. Если полипептид секретируется в среду, этот полипептид может быть выделен непосредственно из среды. Если полипептид не секретируется в среду, он может быть выделен из клеточных лизатов.
Альтернативно, полипептид по настоящему изобретению можно синтезировать методом химического синтеза, известным в данной области техники. Методы химического синтеза полипептида включают методы твердофазного синтеза и жидкофазного синтеза, где твердофазный синтез является наиболее широко применяемым. Методы твердофазного синтеза включают два общепринятых метода, Fmoc и tBoc, но не ограничиваясь ими. Обычно в качестве нерастворимого твердого носителя используют смолу, аминокислоты обычно соединяют друг с другом от С-конца (карбоксильный конец) к N-концу (амино-конец) в пептидную цепь, и цикл присоединения каждой аминокислоты состоит из следующих трех стадий: 1) снятие защиты: в защищенной аминокислоте защитную группу аминокислоты необходимо удалить с помощью растворителя для снятия защиты; 2) активация: карбоксильную группу присоединяемой аминокислоты активируют с помощью активатора; и 3) сочетание: активированный карбоксил подвергают взаимодействию с доступной аминогруппой предыдущей аминокислоты с образованием пептидной связи. Этот цикл повторяют до тех пор, пока пептидная цепь не удлинится до желаемой длины. Наконец, соединение между твердым носителем и пептидной цепью расщепляют раствором для расщепления, и желаемая аминокислотная последовательность может быть получена. Вышеописанный химический синтез можно проводить в автоматическом синтезаторе пептидов с программным управлением, и такие приборы включают двухканальный синтезатор пептидов Tribute от Protein Technologies, UV Online Monitor System from CS Bio Company, трехканальный синтезатор Focus XC от Aapptec и им подобные, но не ограничиваясь ими.
Описанный здесь полипептид может быть выделен способом, известным в данной области техники. Например, полипептид может быть выделен из среды традиционными способами, включая центрифугирование, фильтрование, ультрафильтрацию, экстракцию, хроматографию, сушку распылением, лиофильную сушку, упаривание, осаждение или им подобное, но не ограничиваясь этим.
Полипептид по настоящему изобретению можно очищать разнообразными методами, известными в данной области техники, включая метод хроматографии (например ионообменной, аффинной, гидрофобной, хроматофокусирующей, эксклюзионной), электрофореза (например изоэлектрофокусирования), метод на основе различия в растворимости (такой как осаждение высаливанием), SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) или экстракции, для получения по существу чистого полипептида, но не ограничиваясь ими. Свойства и применение полипептида
Полипептид по настоящему изобретению обладает активностью фосфолипазы С, которую можно использовать для очистки масел и жиров, модификации фосфолипидов, модификации пищевых продуктов и в различных аспектах пищевой промышленности и фармацевтической промышленности, включая выпечку, детергенты, улучшение фильтрования водных растворов или сиропа и тому подобное. При использовании для дегуммирования полипептид по настоящему изобретению может улучшать эффективность дегуммирования и увеличивать выход DAG во время процесса дегуммирования.
Полипептид по настоящему изобретению может быть представлен в форме чистого ферментативного препарата или в форме композиции. Эта композиция может представлять собой порошкообразную композицию, жидкую композицию и пастообразную композицию. Если полипептид представлен в форме композиции, такая композиция может содержать различные эксципиенты в соответствии с различным применением композиции, содержащей фермент. Эксципиенты, известные в данной области техники, можно добавлять в композиции по настоящему изобретению, и такие эксципиенты включают сорбит, сорбат калия, метилбензоат, этилбензоат, сахарозу, маннит, трегалозу, крахмал, хлорид натрия, хлорид кальция, другие стабилизаторы, но не ограничиваясь ими, или одно или более других веществ.
Количество полипептида по настоящему изобретению, используемого в способе по настоящему изобретению, может быть практически определено.
Ферментативное дегуммирование
Также в настоящем изобретении предложен способ ферментативного дегуммирования, включающий добавление полипептида по настоящему изобретению к неочищенному маслу для дегуммирования. Обычно неочищенное масло нагревают до 50-70°С, предпочтительно до 50-60°С, и затем добавляют полипептид по настоящему изобретению, а именно фосфолипазу С.
Фосфолипазу С по настоящему изобретению обычно добавляют в форме водного раствора. Исходя из массы неочищенного масла фермент добавляют в количестве от 10 до 1000 м.д., предпочтительно от 50 до 500 м.д., более предпочтительно от 100 до 300 м.д.
Условия дегуммирования обычно включают следующее: перемешивание при 50-60°С в течение 1-3 часов и затем нагревание до 80-90°С и выдерживание в течение 1-10 минут.
Неочищенное масло, подходящее для способа дегуммирования по настоящему изобретению, включает соевое масло, подсолнечное масло, арахисовое масло, рапсовое масло, масло из рисовых отрубей, кукурузное масло, оливковое масло, пальмовое масло, пальмоядровое масло, пальмовый олеин, масло канола, касторовое масло, кокосовое масло, кориандровое масло, хлопковое масло, масло лесного ореха, конопляное масло, льняное масло, масло из косточек манго, масло пенника лугового, копытное масло, сафлоровое масло, масло камелии (camellia), талловое масло, масло камелии (tsubaki) и другие растительные масла, но не ограничиваясь ими.
Далее настоящее изобретение проиллюстрировано конкретными примерами. Экспериментальные способы без уточнения конкретных условий в примерах ниже выполнены в общепринятых условиях, таких как изложено в Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor Laboratory Press), 1989), или в условиях, рекомендованных производителем. Использование и дозировка реагентов, если специально не оговорено, находятся в соответствии с традиционным использованием и дозировкой.
Экспериментальные материалы
1. Экспериментальные штаммы и плазмиды
Штаммы: Pichia pastoris SMD1168 (Invitrogen, номер по каталогу No. С17500), Е. coli DH5a (TAKARA, номер по каталогу No. D9057A).
2. Среды и растворы
Жидкая среда LB: 0,5% дрожжевого экстракта, 1% триптона, 1% NaCl, рН 7,0.
Твердая среда LB: 1,5% агара, добавленного в жидкую среду LB.
Жидкая среда YPD: 1% дрожжевого экстракта, 2% пептона, 2% глюкозы.
Твердая среда YPD: 2% агара, добавленного в жидкую среду LB.
Твердая среда MGYS: 1,34% основы азотного агара для дрожжей (YNB), содержащей сульфат аммония и не содержащей аминокислоты; 1% глицерина; 1 М сорбит; 4×10-5% D-биотина; 2% агара.
Среда ВММ для скрининга на основе фосфолипидов соевых бобов: 1,34% основы азотного агара для дрожжей (YNB), содержащей сульфат аммония, не содержащей аминокислоты; 4×10-5% D-биотина; 0,5% метанола (стерилизованного); 2% эмульсии фосфолипидов соевых бобов; 0,1М буфер лимонная кислота-цитрат натрия с рН 6,6; 2% агара; 10 мкМ ZnSO4×7 H2O.
2%-ная эмульсия фосфолипидов соевых бобов: 2 г фосфолипидов соевых бобов, 100 мл H2O, гомогенизировали в высокоскоростном гомогенизаторе при 8000 об/мин в течение 1 мин.
Жидкая среда BMGY: 1% дрожжевого экстракта; 2% пептона; 1,34% основы азотного агара для дрожжей (YNB), содержащей сульфат аммония и не содержащей аминокислоты; 1% глицерина; 4×10-5% D-биотина; 0,1 М буфер дигидрофосфат калия -гидроортофосфат калия с рН 6,0.
Жидкая среда BMMY: 1% дрожжевого экстракта; 2% пептона; 1,34% основы азотного агара для дрожжей (YNB), содержащей сульфат аммония и не содержащей аминокислоты; 0,3% ZnSO4⋅7H2O; 0,5% метанола (стерилизованного); 4×10-5% D-биотина (стерилизованного); 0,1 М буфер лимонная кислота-цитрат натрия с рН 6,6.
3. Определение ферментативной активности методом pNPPC Построение стандартной кривой для определения активности фосфолипазы: 0,01391 г пара-нитрофенола растворяли в 50 мл стерильной воды для получения 2 ммоль/л рабочего раствора. Количество каждого реагента показано в таблице ниже. Объем реакции и условия реакции для построения стандартной кривой согласуются с условиями для измерения ферментативной активности образца в эксперименте.
Вышеуказанные растворы смешивали и проводили их обработку при 37°С в течение 15 минут. Затем добавляли 500 мкл 0,5 н. NaOH и измеряли поглощение при 410 нм. Полученная в результате стандартная кривая представлена на фиг. 3.
4. Реакционный буфер
0,1 М буфер борная кислота-борат натрия (рН 7,6), 20 мМ pNPPC.
5. Расчет ферментативной активности
25 мкл ферментативного раствора для тестирования добавляли в 600 мкл вышеописанного реакционного буфера и проводили реакцию при 37°С в течение 15 мин. 500 мкл 0,5 н. NaOH добавляли для остановки реакции и измеряли поглощение при 410 нм.
Ферментативная активность образца (Ед/мл)=А (поглощение при 410 нм)×0,1935×фактор разведения 10/15.
Улучшенный набор реактивов для определения концентрации белка по методу Брэдфорда получали от Shanghai Sangon Bioengineering Co., Ltd.; фермент для ПЦР -ДНК-полимеразу PrimeSTAR®HS получали от TaKaRa (Dalian) Co., Ltd; ДНК-лигазу T4 получали от Fermentas Co., Ltd.
Пример 1: Конструирование и скрининг библиотеки насыщающих мутаций
Библиотека случайных насыщающих мутаций для аминокислот 6, 8, 10, 104 и 205 была сконструирована Synbio Technologies (Suzhou) Co., Ltd. с использованием вектора pmAO-PLC-N63DN131SN134D-Y56H (CN 201680072289.5, последовательность ДНК PLC-N63DN131SN134D-Y56H представлена в SEQ ID NO: 1, и его аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO: 2) в качестве матрицы. Этой плазмидной библиотекой трансформировали штамм DH5a Е. coli и все клоны Е. coli промывали жидкой средой LB (содержащей 100 мкг/мл ампициллина) и культивировали при 37°С в течение 4 ч. Плазмиды экстрагировали и линеаризовали SalI, и выделяли фрагмент примерно 8,5 т.п.о. Компетентные клетки Pichia pastoris SMD1168 трансформировали 500 нг вектора путем электро-трансформации. Трансформанты высевали на чашки MGYS и культивировали при 30°С в течение 3 суток для получения библиотеки мутантов Pichia pastoris PLC-N63DN131SN134D-Y56H. Моноклональные штаммы отбирали и переносили на чашку со средой ВММ для скрининга на основе фосфолипидов соевых бобов. Отбирали один из клонов с относительно большим белым кольцом преципитации и обозначали его как 31#.
Пример 2: Анализ последовательности мутанта 31#
Штамм 31# инокулировали в 3 мл жидкой среды YPD и культивировали в течение ночи при 30°С, затем из клеток экстрагировали геномную ДНК. Последовательность ДНК PLC штамма 31# амплифицировали методом ПЦР с использованием ДНК-полимеразы PrimeSTAR®HS, пары праймеров АОХ1-5/АОХ1-3 и геномной ДНК штамма 31# в качестве матрицы. Полученную последовательность секвенировали в Shanghai Sangon Biotech Co., Ltd. с использованием пары праймеров АОХ1-5/АОХ1-3:
Результат секвенирования ДНК PLC 31# представлен в SEQ ID NO: 3. Согласно этому результату 5 оснований последовательности ДНК PLC 31# мутированы. Аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO: 4, где аминокислоты в положениях 6, 8, 10 и 104 были мутированы с заменой лизина, лизина, глицина и лизина на пролин, валин, серии и серии, соответственно.
Пример 3: Ферментирование во встряхиваемой колбе мутанта 31# и определение его ферментативной активности
Штаммы 31# и исходные штаммы (то есть, SMD1168, трансфицированные вектором pmAO-PLC-N63DN131SN134D-Y56H) активировали в жидкой YPD и затем инокулировали в среду BMGY и подвергали встряхиванию при 220 об/мин при 30°С в течение ночи. Культуру переносили в среду BMMY с начальной OD600 равной 6.
Сначала проводили индукцию 2% метанолом с добавлением 1% метанола через 24 ч, 32 ч, 48 ч и 56 ч, соответственно, и отбирали образцы через 72 ч. Полученные образцы концентрировали в 40 раз методом обессоливания ультрафильтрацией с помощью ультрафильтрационных трубок с порогом отсечения молекулярной массы 40 кДа. Обработанные образцы добавляли в буфер (20 мМ буфер лимонная кислота-цитрат натрия (рН 6,6), 10 мкМ ZnSO4).
0,5 мкл концентрата ферментативного бульона добавляли в 600 мкл реакционного буфера pNPPC и проводили реакцию при 37°С в течение 15 мин. Добавляли 500 мкл 0,5 и. NaOH для остановки реакции и измеряли поглощение при 410 нм. Активность PLC для каждого образца ферментативного бульона рассчитывали по стандартной кривой. Концентрацию белка в ферментативном бульоне в колбе после встряхивания определяли с помощью реактива Брэдфорда для получения специфической ферментативной активности. Результаты представлены на фиг. 1. Специфическая ферментативная активность образца ферментативного бульона мутанта 31# была в 1,88 раз выше, чем таковая у образца ферментативного бульона исходного штамма.
Пример 4: Тест дегуммирования 31#
100 г неочищенного соевого масла нагревали до 55°С и добавляли в него 50 м.д. и 100 м.д. образца ферментативного бульона мутанта 31# и исходного штамма, полученных в Примере 3, соответственно. Водная фаза в полученной системе составляла 3%. Систему подвергали воздействию больших сдвиговых усилий (10000 об/мин) в течение 1 мин с помощью высокоскоростного миксера, перемешивали (750 об/мин) при 55°С в течение 2 ч, нагревали до 85°С и выдерживали в течение 5 мин и центрифугировали при 12000 об/мин в течение 10 мин. Примерно 10 г образца масла верхней фазы использовали для определения содержания DAG методом HPLC (высокоэффективная жидкостная хроматография). Увеличение количества DAG для образца ферментативного бульона мутанта 31# и образца ферментативного бульона исходного штамма по сравнению с неочищенным маслом показано на фиг. 2. Увеличение количества DAG в образце ферментативного бульона мутанта 31# при 50 м.д. фермента и в образце ферментативного бульона исходного штамма при 100 м.д. фермента является одинаковым. Следовательно, требуемое количество фермента образца ферментативного бульона мутанта 31# можно наполовину уменьшить по сравнению с образцом ферментативного бульона исходного штамма.
--->
Sequence Listing
<110> WILMAR (SHANGHAI) BIOTECHNOLOGY RESEARCH & DEVELOPMENT CENTER CO., LTD
<120> PHOSPHOLIPASE C MUTANT WITH HIGH ENZYME ACTIVITY
<130> 188686
<150> CN 201811620055.7
<151> 2018-12-28
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 738
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Последовательность ДНК PLC-N63DN131SN134D-Y56H
<400> 1
tggtcagctg aggacaagca taaggaaggt gtgaatagtc acttatggat cgtgaaccgt 60
gccattgata taatgtctag gaatacaact ctggttaagc aagatagagt tgctcaattg 120
aatgaatggc gtacagagct agagaatggc atctacgctg ctgatcatga aaacccctat 180
tacgatgaca gtaccttcgc ttctcacttt tacgatccag acaacggaaa gacatatatc 240
ccattcgcca agcaagctaa ggagactgga gctaagtact tcaagttggc tggagagtca 300
tacaagaata aagacatgaa gcaggccttc ttttatcttg ggttgtcatt gcattatttg 360
ggcgatgtca accaacctat gcatgccgca tcctttacgg acctgtccta tccacagggt 420
tttcactcca agtacgagaa ctttgtcgat actattaaag acaactacaa agttaccgat 480
gggaacggat attggaattg gaaaggcacc aaccctgaag aatggattca cggtgcagca 540
gtagttgcaa aacaggacta ctctggaatt gtcaatgaca ataccaaaga ttggtttgtg 600
aaagccgcag tctcccagga atatgcagat aaatggagag ctgaagttac acctatgact 660
ggtaaacgac taatggatgc ccaaagagtt actgctggtt acattcaatt atggttcgac 720
acttacggtg acaggtaa 738
<210> 2
<211> 245
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Аминокислотная последовательность PLC-N63DN131SN134D-Y56H
<400> 2
Trp Ser Ala Glu Asp Lys His Lys Glu Gly Val Asn Ser His Leu Trp
1 5 10 15
Ile Val Asn Arg Ala Ile Asp Ile Met Ser Arg Asn Thr Thr Leu Val
20 25 30
Lys Gln Asp Arg Val Ala Gln Leu Asn Glu Trp Arg Thr Glu Leu Glu
35 40 45
Asn Gly Ile Tyr Ala Ala Asp His Glu Asn Pro Tyr Tyr Asp Asp Ser
50 55 60
Thr Phe Ala Ser His Phe Tyr Asp Pro Asp Asn Gly Lys Thr Tyr Ile
65 70 75 80
Pro Phe Ala Lys Gln Ala Lys Glu Thr Gly Ala Lys Tyr Phe Lys Leu
85 90 95
Ala Gly Glu Ser Tyr Lys Asn Lys Asp Met Lys Gln Ala Phe Phe Tyr
100 105 110
Leu Gly Leu Ser Leu His Tyr Leu Gly Asp Val Asn Gln Pro Met His
115 120 125
Ala Ala Ser Phe Thr Asp Leu Ser Tyr Pro Gln Gly Phe His Ser Lys
130 135 140
Tyr Glu Asn Phe Val Asp Thr Ile Lys Asp Asn Tyr Lys Val Thr Asp
145 150 155 160
Gly Asn Gly Tyr Trp Asn Trp Lys Gly Thr Asn Pro Glu Glu Trp Ile
165 170 175
His Gly Ala Ala Val Val Ala Lys Gln Asp Tyr Ser Gly Ile Val Asn
180 185 190
Asp Asn Thr Lys Asp Trp Phe Val Lys Ala Ala Val Ser Gln Glu Tyr
195 200 205
Ala Asp Lys Trp Arg Ala Glu Val Thr Pro Met Thr Gly Lys Arg Leu
210 215 220
Met Asp Ala Gln Arg Val Thr Ala Gly Tyr Ile Gln Leu Trp Phe Asp
225 230 235 240
Thr Tyr Gly Asp Arg
245
<210> 3
<211> 738
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Кодирующая последовательность мутанта
<400> 3
tggtcagctg aggacccgca tgttgaatcg gtgaatagtc acttatggat cgtgaaccgt 60
gccattgata taatgtctag gaatacaact ctggttaagc aagatagagt tgctcaattg 120
aatgaatggc gtacagagct agagaatggc atctacgctg ctgatcatga aaacccctat 180
tacgatgaca gtaccttcgc ttctcacttt tacgatccag acaacggaaa gacatatatc 240
ccattcgcca agcaagctaa ggagactgga gctaagtact tcaagttggc tggagagtca 300
tacaagaatt ctgacatgaa gcaggccttc ttttatcttg ggttgtcatt gcattatttg 360
ggcgatgtca accaacctat gcatgccgca tcctttacgg acctgtccta tccacagggt 420
tttcactcca agtacgagaa ctttgtcgat actattaaag acaactacaa agttaccgat 480
gggaacggat attggaattg gaaaggcacc aaccctgaag aatggattca cggtgcagca 540
gtagttgcaa aacaggacta ctctggaatt gtcaatgaca ataccaaaga ttggtttgtg 600
aaagccgcag tctcccagga atatgcagat aaatggagag ctgaagttac acctatgact 660
ggtaaacgac taatggatgc ccaaagagtt actgctggtt acattcaatt atggttcgac 720
acttacggtg acaggtaa 738
<210> 4
<211> 245
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Аминокислотная последовательность мутанта
<400> 4
Trp Ser Ala Glu Asp Pro His Val Glu Ser Val Asn Ser His Leu Trp
1 5 10 15
Ile Val Asn Arg Ala Ile Asp Ile Met Ser Arg Asn Thr Thr Leu Val
20 25 30
Lys Gln Asp Arg Val Ala Gln Leu Asn Glu Trp Arg Thr Glu Leu Glu
35 40 45
Asn Gly Ile Tyr Ala Ala Asp His Glu Asn Pro Tyr Tyr Asp Asp Ser
50 55 60
Thr Phe Ala Ser His Phe Tyr Asp Pro Asp Asn Gly Lys Thr Tyr Ile
65 70 75 80
Pro Phe Ala Lys Gln Ala Lys Glu Thr Gly Ala Lys Tyr Phe Lys Leu
85 90 95
Ala Gly Glu Ser Tyr Lys Asn Ser Asp Met Lys Gln Ala Phe Phe Tyr
100 105 110
Leu Gly Leu Ser Leu His Tyr Leu Gly Asp Val Asn Gln Pro Met His
115 120 125
Ala Ala Ser Phe Thr Asp Leu Ser Tyr Pro Gln Gly Phe His Ser Lys
130 135 140
Tyr Glu Asn Phe Val Asp Thr Ile Lys Asp Asn Tyr Lys Val Thr Asp
145 150 155 160
Gly Asn Gly Tyr Trp Asn Trp Lys Gly Thr Asn Pro Glu Glu Trp Ile
165 170 175
His Gly Ala Ala Val Val Ala Lys Gln Asp Tyr Ser Gly Ile Val Asn
180 185 190
Asp Asn Thr Lys Asp Trp Phe Val Lys Ala Ala Val Ser Gln Glu Tyr
195 200 205
Ala Asp Lys Trp Arg Ala Glu Val Thr Pro Met Thr Gly Lys Arg Leu
210 215 220
Met Asp Ala Gln Arg Val Thr Ala Gly Tyr Ile Gln Leu Trp Phe Asp
225 230 235 240
Thr Tyr Gly Asp Arg
245
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Праймер
<400> 5
cgactggttc caattgacaa cg 22
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Праймер
<400> 6
ggcaaatggc attctgacat cctc 24
<210> 7
<211> 245
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Аминокислотная последовательность мутанта
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (6)..(6)
<223> Xaa представляет собой аланин, валин, лейцин,
изолейцин, пролин,фенилаланин, метионин или триптофан
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (8)..(8)
<223> Xaa представляет собой аланин, валин, лейцин,
изолейцин, пролин,фенилаланин, метионин или триптофан
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (10)..(10)
<223> Xaa представляет собой глицин, аспарагин, глутамин,
серин, треонин,тирозин или цистеин
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (104)..(104)
<223> Xaa представляет собой глицин, аспарагин, глутамин,
серин, треонин,тирозин или цистеин
<400> 7
Trp Ser Ala Glu Asp Xaa His Xaa Glu Xaa Val Asn Ser His Leu Trp
1 5 10 15
Ile Val Asn Arg Ala Ile Asp Ile Met Ser Arg Asn Thr Thr Leu Val
20 25 30
Lys Gln Asp Arg Val Ala Gln Leu Asn Glu Trp Arg Thr Glu Leu Glu
35 40 45
Asn Gly Ile Tyr Ala Ala Asp His Glu Asn Pro Tyr Tyr Asp Asp Ser
50 55 60
Thr Phe Ala Ser His Phe Tyr Asp Pro Asp Asn Gly Lys Thr Tyr Ile
65 70 75 80
Pro Phe Ala Lys Gln Ala Lys Glu Thr Gly Ala Lys Tyr Phe Lys Leu
85 90 95
Ala Gly Glu Ser Tyr Lys Asn Xaa Asp Met Lys Gln Ala Phe Phe Tyr
100 105 110
Leu Gly Leu Ser Leu His Tyr Leu Gly Asp Val Asn Gln Pro Met His
115 120 125
Ala Ala Ser Phe Thr Asp Leu Ser Tyr Pro Gln Gly Phe His Ser Lys
130 135 140
Tyr Glu Asn Phe Val Asp Thr Ile Lys Asp Asn Tyr Lys Val Thr Asp
145 150 155 160
Gly Asn Gly Tyr Trp Asn Trp Lys Gly Thr Asn Pro Glu Glu Trp Ile
165 170 175
His Gly Ala Ala Val Val Ala Lys Gln Asp Tyr Ser Gly Ile Val Asn
180 185 190
Asp Asn Thr Lys Asp Trp Phe Val Lys Ala Ala Val Ser Gln Glu Tyr
195 200 205
Ala Asp Lys Trp Arg Ala Glu Val Thr Pro Met Thr Gly Lys Arg Leu
210 215 220
Met Asp Ala Gln Arg Val Thr Ala Gly Tyr Ile Gln Leu Trp Phe Asp
225 230 235 240
Thr Tyr Gly Asp Arg
245
<---
Claims (19)
1. Выделенный полипептид, характеризующийся повышенной специфической ферментативной активностью фосфолипазы С, имеющий идентичность последовательности SEQ ID NO: 4 по меньшей мере на 95%, где аминокислотные остатки выделенного полипептида, соответствующие аминокислотам 6, 8, 10 и 104 в SEQ ID NO: 4, представляют собой пролин, валин, серин и серин соответственно.
2. Выделенный полипептид по п. 1, где аминокислотная последовательность выделенного полипептида является такой, как представлено в SEQ ID NO: 4, или он получен из Bacillus subtilis.
3. Нуклеиновая кислота, кодирующая мутантную фосфолипазу С с повышенной специфической ферментативной активностью и содержащая полинуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
(1) полинуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид по любому из пп. 1, 2; и
(2) последовательности, комплементарной полинуклеотидной последовательности (1); и
(3) полинуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 3.
4. Конструкция нуклеиновой кислоты для экспрессии мутантной фосфолипазы С с повышенной специфической ферментативной активностью, содержащая нуклеиновую кислоту по п. 3 и одну или более чем одну регуляторную последовательность, функционально связанную с полинуклеотидной последовательностью.
5. Конструкция нуклеиновой кислоты по п. 4, представляющая собой экспрессионный вектор или клонирующий вектор.
6. Генетически сконструированная клетка-хозяин для экспрессии мутантной фосфолипазы С с повышенной специфической ферментативной активностью, содержащая нуклеиновую кислоту по п. 3 или конструкцию нуклеиновой кислоты по п. 4 или 5.
7. Композиция, характеризующаяся повышенной специфической ферментативной активностью фосфолипазы С, содержащая полипептид по любому из пп. 1, 2 и адъювант.
8. Композиция по п. 7, где адъювант представляет собой адсорбирующее вещество, выбранное из группы, состоящей из активированного угля, оксида алюминия, диатомовой земли, пористых керамических веществ и пористого стекла.
9. Применение полипептида по любому из пп. 1, 2, нуклеиновой кислоты по п. 3, конструкции нуклеиновой кислоты по п. 4 или 5, клетки-хозяина по п. 6 или композиции по п. 7 или 8 для ферментативного дегуммирования.
10. Применение по п. 9, где указанное дегуммирование используют в очистке масел и жиров, модификации фосфолипидов или модификации пищевых продуктов.
11. Способ ферментативного дегуммирования, включающий дегуммирование с использованием полипептида по любому из пп. 1, 2, где указанный способ включает стадию приведения в контакт полипептида по любому из пп. 1, 2 с неочищенным маслом.
12. Способ по п. 11, где указанный способ включает один или более чем один из следующих признаков:
(1) полипептид добавляют в количестве от 10 до 1000 миллионных долей (м.д.) исходя из массы неочищенного масла;
(2) дегуммирование включает перемешивание при 50-60°C в течение 1-3 часов с последующим повышением температуры до 80-90°C и выдерживанием в течение 1-10 минут; и
(3) неочищенное масло выбрано из группы, состоящей из соевого масла, подсолнечного масла, арахисового масла, рапсового масла, масла из рисовых отрубей, кукурузного масла, оливкового масла, пальмового масла, пальмоядрового масла, пальмового олеина, масла канола, касторового масла, кокосового масла, кориандрового масла, хлопкового масла, масла лесного ореха, конопляного масла, льняного масла, масла из косточек манго, масла пенника лугового, копытного масла, сафлорового масла, масла камелии (camellia), таллового масла и масла камелии (tsubaki);
(4) указанная стадия включает приведение в контакт полипептида с неочищенным маслом при 50-70°C.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201811620055.7 | 2018-12-28 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2021120463A RU2021120463A (ru) | 2023-01-30 |
RU2818353C2 true RU2818353C2 (ru) | 2024-05-02 |
Family
ID=
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EA200401407A1 (ru) * | 2002-04-19 | 2006-02-24 | Дайверса Корпорейшн | Фосфолипазы, нуклеиновые кислоты, кодирующие их, и способы их получения и применения |
RU2500811C1 (ru) * | 2012-10-10 | 2013-12-10 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика") | Рекомбинантный штамм бактерий bacillus subtilis - продуцент фосфолипазы с |
WO2015140275A1 (en) * | 2014-03-19 | 2015-09-24 | Novozymes A/S | Polypeptides having phospholipase c activity and polynucleotides encoding same |
CN106459934A (zh) * | 2014-05-15 | 2017-02-22 | 诺维信公司 | 包括具有磷脂酶c活性的多肽的组合物及其应用 |
CN106884009A (zh) * | 2015-12-16 | 2017-06-23 | 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 | 高效的不依赖锌离子的磷脂酶c突变体 |
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EA200401407A1 (ru) * | 2002-04-19 | 2006-02-24 | Дайверса Корпорейшн | Фосфолипазы, нуклеиновые кислоты, кодирующие их, и способы их получения и применения |
RU2500811C1 (ru) * | 2012-10-10 | 2013-12-10 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика") | Рекомбинантный штамм бактерий bacillus subtilis - продуцент фосфолипазы с |
WO2015140275A1 (en) * | 2014-03-19 | 2015-09-24 | Novozymes A/S | Polypeptides having phospholipase c activity and polynucleotides encoding same |
CN106459934A (zh) * | 2014-05-15 | 2017-02-22 | 诺维信公司 | 包括具有磷脂酶c活性的多肽的组合物及其应用 |
CN106884009A (zh) * | 2015-12-16 | 2017-06-23 | 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 | 高效的不依赖锌离子的磷脂酶c突变体 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
YAMPOLSKY L.Y. et al. 1, The exchangeability of amino acids in proteins, Genetics, 2005, v.170, n. 4, p. 1459-1472. KESKIN O. et al. A new, structurally nonredundant, diverse data set of protein-protein interfaces and its implications, Protein Sci., 2004, v. 13, n. 4, p. 1043-1055. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US10738288B2 (en) | Efficient phospholipase C mutant that does not rely on zinc ions | |
US10144919B2 (en) | Phospholipase C mutant and use thereof | |
CN108239627B (zh) | 活性提高的脂肪酶及其应用 | |
CN105802951B (zh) | 固定化脂肪酶及其制备方法和用途 | |
CN108118039B (zh) | 一种磷脂酶c突变体 | |
US20040142441A1 (en) | Enzymes with lipase/acyltransferase activity, nucleic acids encoding the same and methods of use thereof | |
CN108239626B (zh) | 一种高酯化活力的脂肪酶突变体 | |
CN108251400B (zh) | 脂肪酶及其应用 | |
JPH10508475A (ja) | トリペプチジルアミノペプチダーゼ | |
WO2020135657A1 (zh) | 一种高酶活的磷脂酶c突变体 | |
CN111363734B (zh) | 脂肪酶突变体、其组合物及应用 | |
JP5438259B2 (ja) | カンジダ・アンタークティカ由来リパーゼbを細胞表層に提示する酵母 | |
US9416354B1 (en) | Ferulate esterase isolated from Lactobaccillus fermentum | |
CN108220267B (zh) | 磷脂酶及其应用 | |
KR20130018202A (ko) | 리파아제 활성이 증대된 양친매성 펩타이드-리파아제 결합체 및 이의 용도 | |
RU2818353C2 (ru) | Мутант фосфолипазы С с высокой ферментативной активностью | |
CN109136209B (zh) | 肠激酶轻链突变体及其应用 | |
CA3117735A1 (en) | Polypeptides having lipase activity and use thereof for wheat separation | |
CN105754981A (zh) | 一种碱性果胶酶及其编码基因和它们的应用 | |
CN106701714B (zh) | 磷脂酶、编码基因、制备方法及其应用 | |
WO2020135658A1 (zh) | 具有磷脂酶c活性的多肽及其用途 | |
CN113122520A (zh) | 一个新的甘油单-二酰酯脂肪酶 | |
CN113025595A (zh) | 耐酸脂肪酶 | |
WO2018174231A1 (ja) | 酵母におけるプロテアーゼの製造方法 | |
RU2819269C2 (ru) | Полипептид, обладающий активностью фосфолипазы С, и его применение |