WO2018174231A1 - 酵母におけるプロテアーゼの製造方法 - Google Patents

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WO2018174231A1
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pro
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陶三 西山
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株式会社カネカ
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    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/58—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
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    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21004—Trypsin (3.4.21.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
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    • C07K2319/036—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif targeting to the medium outside of the cell, e.g. type III secretion
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a mold-derived trypsin-like protease in yeast, a mold-derived trypsin-like protease precursor, and the like.
  • an appropriate host for the expression of the protein is used.
  • hosts that can be used include animal cells such as CHO (Chinese Hamster Ovary) cells, insects and insect cells such as silkworms, animals such as chickens and cattle, and microorganisms such as Escherichia coli or yeast.
  • yeast is capable of large-scale high-density culture with an inexpensive medium, and can produce proteins at low cost.
  • secretory signal peptide or the like is used, secretory production into the culture solution is possible, and thus protein purification becomes easy.
  • Trypsin is a serine protease produced in the pancreas of mammals and has protease activity that cleaves the C-terminal side of arginine residue or lysine residue, for the production of protein pharmaceuticals such as insulin or cell dispersion It is used.
  • trypsin derived from mammals bovine, pig, human
  • trypsin-like protease derived from mold and fish is also known.
  • Patent Document 1 describes purification of trypsin-like protease from Fusarium oxysporum and cloning of the trypsin-like protease gene.
  • Non-Patent Document 1 describes the production of trypsin-like protease in Fusarium oxysporum.
  • Non-patent document 2 describes that trypsin derived from Streptomyces griseus is expressed by yeast (Pichia pastosis). Furthermore, Non-Patent Document 3 describes that porcine trypsin is expressed in yeast (Pichia pastosis).
  • the present invention aims to provide a method for producing a mold-derived trypsin-like protease with high productivity in a method for producing a mold-derived trypsin-like protease using yeast as a host.
  • a secretory signal sequence that functions in yeast a prosequence in which a mutation is introduced into a prosequence possessed by a trypsin-like protease derived from Fusarium oxysporum, and Fusarium -Fusarium oxysporum-derived trypsin-like protease can be produced with high productivity by expressing in yeast a gene encoding a fusion protein having the amino acid sequence of oxysporum-derived trypsin-like protease in this order from the N-terminal side to the C-terminal side As a result, the present invention has been completed.
  • protease according to (1) wherein the protease and a protease precursor composed of the pro sequence and the amino acid sequence of the protease are secreted into the yeast culture supernatant at an activity ratio of 1: 1 or more.
  • Method. (3) The method according to (1) or (2), wherein the protease precursor expressed in the culture supernatant is converted into a protease by the protease expressed in the culture supernatant.
  • the trypsin-like protease derived from Fusarium oxysporum is any one of the following (a) to (c): (A) a protease comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67; (B) a protease comprising an amino acid sequence having a sequence identity of 90% or more with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67 and having a trypsin-like protease activity equivalent to the protease comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67; or (c) SEQ ID NO: A protease having a trypsin-like protease activity equivalent to the protease consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67, comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, and / or added in the 67 amino acid sequence.
  • the method according to any one of (1) to (4), wherein the secretory signal sequence that functions in yeast is a yeast MF sequence.
  • the pro sequence is an amino acid sequence in which 1 to several amino acids are added, deleted or substituted to the amino acid sequence represented by Ala-Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Asn,
  • Pro sequence is Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb, Xcc-Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa- Xbb, Xdd-Xcc-Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa- Xbb, Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb, Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb, Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb, Ile-Pro-Xaa-Xbb, Pro-Xaa-Xbb, or Xaa-Xbb (In the formula, Xaa represents an arbitrary amino acid residue, Xbb represents an Arg or Lys residue, Xcc represents an arbitrary amino acid residue, and Xdd represents an arbitrary amino acid residue)
  • Xaa represents an arbitrary amino acid residue
  • Xbb represents
  • a protease precursor in which a prosequence having an arginine or lysine residue at the C-terminus is fused to the N-terminal side of the amino acid sequence of a Fusarium oxysporum-derived trypsin-like protease (I) When the protease precursor is expressed in the culture supernatant of yeast, the protease and the protease precursor composed of the pro sequence and the amino acid sequence of the protease are secreted at an activity ratio of 1: 1 or more. And (ii) the expressed protease allows the expressed protease precursor to be converted to a protease, Protease precursor.
  • the protease precursor according to (8), wherein the trypsin-like protease derived from Fusarium oxysporum is any of the following (a) to (c): (A) a protease comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67; (B) a protease comprising an amino acid sequence having a sequence identity of 90% or more with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67 and having a trypsin-like protease activity equivalent to the protease comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67; or (c) SEQ ID NO: A protease having a trypsin-like protease activity equivalent to the protease consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67, comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, and / or added in the 67 amino acid sequence.
  • the pro sequence is an amino acid sequence in which one to several amino acids are added, deleted or substituted to the amino acid sequence represented by Ala-Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Asn,
  • Pro sequence is Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb, Xcc-Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa- Xbb, Xdd-Xcc-Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa- Xbb, Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb, Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb, Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb, Ile-Pro-Xaa-Xbb, Pro-Xaa-Xbb, or Xaa-Xbb (In the formula, Xaa represents an arbitrary amino acid residue, Xbb represents an Arg or Lys residue, Xcc represents an arbitrary amino acid residue, and Xdd represents an arbitrary amino acid residue)
  • the protease precursor according to any one of (8) to (10), which is
  • the recombinant expression vector according to (12), wherein the trypsin-like protease derived from Fusarium oxysporum is any of the following (a) to (c): (A) a protease comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67; (B) a protease comprising an amino acid sequence having a sequence identity of 90% or more with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67 and having a trypsin-like protease activity equivalent to the protease comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67; or (c) SEQ ID NO: A protease having a trypsin-like protease activity equivalent to the protease consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67, comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, and / or added in the 67 amino acid sequence.
  • a prosequence is an amino acid sequence in which one to several amino acids are added, deleted or substituted to the amino acid sequence represented by Ala-Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Asn,
  • the prosequence is Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb, Xcc-Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa- Xbb, Xdd-Xcc-Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa- Xbb, Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb, Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb, Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb, Ile-Pro-Xaa-Xbb, Pro-Xaa-Xbb, or Xaa-Xbb (In the formula, Xaa represents an arbitrary amino acid residue, Xbb represents an Arg or Lys residue, Xcc represents an arbitrary amino acid residue, and Xdd represents an arbitrary amino acid residue)
  • the recombinant expression vector according to any one of (12)
  • a yeast culture-derived protease composition comprising a Fusarium oxysporum-derived trypsin-like protease expressed in yeast.
  • mold-derived trypsin-like protease can be produced in yeast with high productivity.
  • FIG. 1 shows the results of SDS-PAGE analysis of the culture supernatant obtained in Comparative Example 3.
  • Lane 1 shows MF-prosequence-protease and lane 2 shows MF-protease.
  • FIG. 2 shows the results of SDS-PAGE analysis of the samples before and after the autolysis treatment for the culture supernatant obtained in Example 6.
  • M is a marker
  • lane 1 is the culture supernatant before the conversion reaction (MF-APQEIPNK-trypsin)
  • lane 2 is the result after the self-digestion reaction.
  • protease in yeast a secretory signal sequence that functions in yeast and a pro sequence (more specifically, a pro sequence of a trypsin-like protease derived from Fusarium oxysporum are introduced with a mutation and an arginine or lysine residue at the C-terminal). And a gene encoding a fusion protein having, in this order, from the N-terminal side to the C-terminal side the amino acid sequence of Fusarium oxysporum-derived trypsin-like protease, the protease is produced in yeast.
  • the above fusion protein is used in yeast by using a recombinant expression vector having a DNA encoding a secretory signal sequence that functions in yeast, the above pro sequence, and the amino acid sequence of a trypsin-like protease derived from Fusarium oxysporum.
  • a protease precursor composed of a pro sequence and an amino acid sequence of a protease and a protease are first expressed.
  • the protease precursor expressed in the culture supernatant was converted into protease by the protease expressed in the culture supernatant. According to the above mechanism, in the present invention, it has become possible to efficiently produce (manufacture) a Fusarium oxysporum-derived trypsin-like protease having a desired protease activity in yeast.
  • the expression ratio of the protease and the protease precursor in the yeast culture supernatant is not particularly limited, but is preferably secreted at an activity ratio of 1: 1 or more, more preferably 1: It is secreted at an activity ratio of 10 or more, more preferably at an activity ratio of 1: 100 or more.
  • the activity ratio here refers to the amount of protease activity in the culture supernatant (the amount of protease activity in the culture supernatant before the conversion from the protease precursor to protease by self-digestion after cultivation) as the expression level of the protease, It shows the expression level ratio when the activity level obtained by subtracting the protease activity level in the culture supernatant from the protease activity level after self-digestion is used as the expression level of the protease precursor.
  • the trypsin-like protease derived from Fusarium oxysporum means a trypsin-like protease expressed by Fusarium oxysporum or a variant thereof.
  • the trypsin-like protease expressed by Zalium oxysporum is a protease consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67.
  • a modified trypsin-like protease expressed by Fusarium oxysporum (B) consisting of an amino acid sequence having a sequence identity of 90% or more (preferably 95% or more, more preferably 98% or more) with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67, which is equivalent to the protease comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67 A protease having trypsin-like protease activity; or (c) 1 or several (preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3) amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67 A protease comprising a substituted, deleted and / or added amino acid sequence and having a trypsin-like protease activity equivalent to a protease comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67. May be expressed. Examples include mutants in which the R104 residue (Arg residue which is the 104th amino acid residue) of SEQ ID NO: 67 described in
  • sequence identity of amino acid sequences is determined by the algorithm BLAST [Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993)] and FASTA [Methods Enzymol. , 183, 63 (1990)].
  • amino acid to be substituted is preferably an amino acid having similar properties to the amino acid before substitution (cognate amino acid).
  • amino acids within the same group of the following groups are considered homologous amino acids: (Group 1: neutral nonpolar amino acids) Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Met, Cys, Pro, Phe; (Group 2: neutral polar amino acids) Ser, Thr, Gln, Asn, Trp, Tyr; (Group 3: acidic amino acids) Glu, Asp; (Group 4: basic amino acids) His, Lys, Arg:
  • a DNA encoding the above-described modified trypsin-like protease can be obtained by a conventional method known to those skilled in the art, such as site-directed mutagenesis.
  • a commercially available mutagenesis kit for example, Mutant- K, Mutant-G, LA PCR in vitro Mutagenesis series kit (manufactured by TAKARA) can also be used.
  • the secretory signal sequence that functions in yeast used in the present invention is a sequence that directs the transport and localization of the protein biosynthesized in the cytoplasm to the endoplasmic reticulum, and is present at the N-terminus of the protein. It is a peptide having a function of secreting the expressed protein outside the host cell yeast.
  • the secretory signal sequence is usually removed by degradation by a signal peptidase when the secreted protein is secreted from the inside of the cell through the cell membrane to the outside of the cell.
  • the secretion signal sequence that functions in yeast used in the present invention may be any sequence that functions in yeast, and may be either a secretion signal sequence derived from yeast or a secretion signal sequence derived from organisms other than yeast. Preferably, it is a secretion signal sequence derived from yeast.
  • secretory signal sequences that function in yeast include mating Factor ⁇ (MF ⁇ ) prepro signal sequence (MF sequence) of yeast (Saccharomyces cerevisiae, etc.), Ogata Air polymorpha and Komagataella pastoris acid phosphatase (PHO1), and Saccharomyces.
  • MF ⁇ mating Factor ⁇
  • MF sequence prepro signal sequence
  • SUC2 S. cerevisiae invertase
  • Saccharomyces cerevisiae PLB1 can be mentioned, but is not particularly limited.
  • the pro sequence used in the present invention is obtained by introducing a mutation into the pro sequence of Fusarium oxysporum-derived trypsin-like protease, and preferably has an arginine or lysine residue at the C-terminus thereof. .
  • Ala-Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Asn can be mentioned as the amino acid sequence of the pro-sequence of Fusarium oxysporum-derived trypsin-like protease. Therefore, the pro sequence used in the present invention is 1 to several (preferably 1 to 7, more preferably 1 to 1) of the amino acid sequence represented by Ala-Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Asn. 6 (for example, 1, 2, 3, 4, 5 or 6) amino acid sequences added, deleted or substituted, and having an arginine or lysine residue at the C-terminus Can be mentioned.
  • the pro-sequence used in the present invention is an amino acid sequence that is cleaved at the C-terminus in yeast to produce a protease from a protease precursor.
  • the amino acid to be substituted is preferably an amino acid having a property similar to that of the amino acid before substitution (cognate amino acid).
  • the homologous amino acid is as described above in the present specification.
  • pro sequences include Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb, Xcc-Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa- Xbb, Xdd-Xcc-Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa- Xbb, Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb, Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb, Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb, Ile-Pro-Xaa-Xbb, Pro-Xaa-Xbb, or Xaa-Xbb (In the formula, Xaa represents an arbitrary amino acid residue, Xbb represents an Arg or Lys residue, Xcc represents an arbitrary amino acid residue, and Xdd represents an arbitrary amino acid residue) The amino acid sequence shown by either of these can be mentioned.
  • pro sequence 1 to several (preferably 1 to 7, more preferably 1 to the amino acid sequence represented by Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Asn-Arg)
  • Amino acid sequence substituted with 6 (for example, 1, 2, 3, 4, 5, or 6) amino acids, or Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Asn-Lys 1 to several (preferably 1 to 7, more preferably 1 to 6, for example 1, 2, 3, 4, 5, or 6) amino acids are substituted in the amino acid sequence.
  • Amino acid sequences can be mentioned.
  • Xaa, Xbb and Xcc each independently represent any amino acid residue, specifically, Asp, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Cys, Met, Ser, Thr, Tyr, Phe, Trp, Pro, Glu, Asn, Gln, Lys, Arg, or His is represented.
  • Asp, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Cys, Met, Ser, Thr, Tyr, Phe, Trp, Pro, Glu, Asn, Gln, Lys, Arg, and His are aspartic acid residues, Glycine residue, alanine residue, valine residue, leucine residue, isorocicin residue, cysteine residue, methionine residue, serine residue, threonine residue, tyrosine residue, phenylalanine residue, tryptophan residue, proline residue
  • Xaa is preferably Asn, Gly, Asp, Ser, Arg, Thr, Glu, Val, His, Ala, Tyr, Ile, Gln, or Met.
  • Xcc and Xdd are preferably neutral amino acid residues (Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Cys, Met, Ser, Thr, Tyr, Phe, Trp, Pro, Asn, Gln), more preferably fat Group amino acid residues (Gly, Ala, Val, Leu, Ile), more preferably Ala.
  • a secretory signal sequence that functions in yeast a prosequence of Fusarium oxysporum-derived trypsin-like protease introduced with mutations, a prosequence having an arginine or lysine residue at the C-terminus, and Fusarium oxysporum-derived trypsin-like Fusarium oxysporum-derived trypsin-like protease is expressed and secreted in yeast using a recombinant expression vector having a DNA encoding a fusion protein having the amino acid sequence of the protease in this order from the N-terminal side to the C-terminal side.
  • the recombinant expression vector in the present invention means a nucleic acid molecule having a function of expressing a gene in an expression cassette incorporated in a recombinant expression vector in a host cell after transformation.
  • the recombinant expression vector may have an integration homologous region, a selection marker gene such as an auxotrophic complementary gene or a drug resistance gene, an autonomously replicating sequence, and the like.
  • the vector after being transformed into the host may be incorporated in the chromosome of the transformant or may exist as an autonomously replicating type.
  • the expression vector may be a plasmid vector or an artificial chromosome.
  • a plasmid vector is preferable in that the preparation of the vector is easy and the transformation of yeast cells is easy.
  • the plasmid include plasmids derived from E. coli (eg, pBR322, pBR325, pUC118, pUC119, pUC119, pUC18, pUC19, pBluescript, etc.), plasmids derived from Bacillus subtilis (eg, pUB110, pTP5, etc.), yeast-derived plasmids (eg, YEp systems such as YEp13). , YCp series such as YCp50), and the like.
  • the “expression cassette” in the present invention is composed of a promoter and a target protein gene to be expressed, and may contain a terminator.
  • a terminator for example, it can be constructed on a plasmid such as pUC, or can be prepared by a PCR method. it can.
  • AOX1 promoter As the promoter, AOX1 promoter, AOX2 promoter, CAT promoter, DHAS promoter, FDH promoter, FMD promoter, GAP promoter, MOX promoter, TEF promoter, LEU2 promoter, URA3 promoter, ADE promoter, ADH1 promoter, PGK1 promoter, etc. should be used. However, it is not particularly limited.
  • AOX1 terminator As the terminator, AOX1 terminator, GAP terminator, ADH1 terminator and the like can be used, but are not particularly limited.
  • the integration homologous region in the present invention refers to a region in which the recombinant vector of the present invention is integrated by homologous recombination on the chromosome of the host cell after transformation.
  • a part of the chromosome of the host cell can be arbitrarily used, but an auxotrophic complementary gene, a promoter or a terminator in an expression cassette, etc. can also be used.
  • the auxotrophic complementary gene in the present invention is not particularly limited as long as it is a gene that complements auxotrophy such as amino acids and nucleic acids of host cells.
  • Specific examples include the URA3 gene, the LEU2 gene, the ADE1 gene, the HIS4 gene, etc., which can be selected by restoring the prototrophic phenotype in uracil, leucine, adenine, and histidine auxotrophic strains, respectively. .
  • the selection mer gene such as a drug resistance gene in the present invention is not particularly limited as long as it is a gene imparting drug resistance not possessed by a host cell. Specific examples include a G418 resistance gene, a zeocin resistance gene, a hygromycin resistance gene, and the like, which can be selected based on resistance on a medium containing G418, zeocin, and hygromycin, respectively.
  • the auxotrophic selection marker used when preparing the yeast host cannot be used when the selection marker is not destroyed. In this case, the selection marker may be recovered, and methods known to those skilled in the art can be used.
  • the autonomously replicating sequence in the present invention refers to a sequence that acts as a replication origin of the recombinant vector of the present invention and enables autonomous replication in a host cell.
  • a transformed yeast having the above-described recombinant expression vector of the present invention is provided.
  • the type of yeast is not particularly limited, but methanol-assimilating yeast is more preferable, and methanol-assimilating yeast belonging to the genus Ogataea and Komagataella is more preferable.
  • methanol-assimilating yeasts belonging to the genus Ogataea Ogataea polymorpha and Ogataea minuta are preferred, and in the methanol-assimilating yeast belonging to the genus Komagataera, Komagatastaella papori is preferred. .
  • the method for introducing the recombinant expression vector of the present invention into yeast is not particularly limited as long as it can introduce DNA into yeast.
  • transfection methods such as lithium method, spheroplast method, protoplast method, and microinjection method
  • a method for transformation into a chromosome or insertion type yeast using a vector such as a YIp system or a DNA sequence homologous to an arbitrary region in a chromosome can also be used.
  • the transformed yeast in the present invention means a yeast introduced with the recombinant vector of the present invention.
  • the transformed yeast of the present invention can be selectively obtained using the phenotype obtained by the auxotrophic complementary gene or drug resistance gene contained in the recombinant vector as an index.
  • telomere length is determined by telomere length and telomere length.
  • telomere length is determined by telomere length and telomere length.
  • amplification product is electrophoresed (agarose gel, polyacrylamide gel or capillary), and ethidium bromide, SYBR Green solution, etc. Transformation can be confirmed by staining and detecting the amplified product.
  • amplification products can be detected by performing PCR using primers previously labeled with a fluorescent dye or the like.
  • Any medium can be used as a medium for cultivating the transformed yeast as long as it contains a nutrient source that the yeast assimilate.
  • the nutrient source include sugars such as glucose, sucrose, and maltose, lactic acid, acetic acid, and citric acid.
  • Carbon sources such as organic acids such as propionic acid, alcohols such as methanol, ethanol and glycerol, hydrocarbons such as paraffin, oils and fats such as soybean oil and rapeseed oil, or mixtures thereof, ammonium sulfate, ammonium phosphate, urea
  • a normal medium in which nitrogen sources such as yeast extract, meat extract, peptone, corn steep liquor, and other nutrient sources such as other inorganic salts and vitamins are appropriately mixed and blended can be used.
  • nitrogen sources such as yeast extract, meat extract, peptone, corn steep liquor, and other nutrient sources such as other inorganic salts and vitamins are appropriately mixed and blended can be used.
  • the culture method can be any of batch culture, continuous culture, or dome culture.
  • Cultivation can usually be carried out under general conditions, for example, pH 2.5 to 10.0, preferably pH 4.0 to 8.0, temperature 10 ° C. to 48 ° C., preferably 20 ° C. to 42 ° C., more preferably It can be carried out by aerobically culturing at 25 ° C. to 37 ° C. for 10 hours to 10 days.
  • protease precursor in which a prosequence having an arginine or lysine residue at the C-terminus is fused to the N-terminal side of the amino acid sequence of a trypsin-like protease derived from Fusarium oxysporum.
  • the protease precursor of the present invention comprises (I) when the protease precursor is expressed in the culture supernatant of yeast, the protease and the protease precursor are secreted at a ratio of 1: 1 or more; and (ii) the expressed protease
  • the expressed protease precursor can be converted to a protease; It has the characteristics.
  • the protease precursor of the present invention can be produced by transformed yeast by culturing the above-described transformed yeast. Therefore, the protease precursor of the present invention can be obtained by secretory production in which the transformed yeast of the present invention is cultured and the protease precursor of the present invention is accumulated in the culture supernatant.
  • the secretory production in the present invention refers to liquid culture of transformed yeast and accumulation of a protease precursor and a protease not in the cells but in the culture supernatant.
  • a yeast culture-derived protease composition comprising a Fusarium oxysporum derived trypsin-like protease expressed in yeast.
  • the composition of the present invention is a yeast culture-derived protease composition and may contain a yeast culture-derived component.
  • the trypsin-like protease derived from Fusarium oxysporum in the present invention is expressed in yeast and may be subjected to translation word modification in yeast.
  • the Fusarium oxysporum-derived trypsin-like protease is preferably any of the following (a) to (c) as described above in the present specification.
  • A a protease comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67;
  • B consisting of an amino acid sequence having a sequence identity of 90% or more (preferably 95% or more, more preferably 98% or more) with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67, which is equivalent to the protease comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67 A protease having trypsin-like protease activity; or (c) 1 or several (preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3) amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67 A protease comprising a substituted, deleted and / or added amino acid sequence and having a trypsin-like protease activity equivalent to a protease comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67
  • the culture supernatant or culture after culturing the transformed yeast of the present invention contains Fusarium oxysporum-derived trypsin-like protease and its precursor (protease precursor).
  • protease precursor it is preferable to convert the protease precursor into a trypsin-like protease derived from Fusarium oxysporum by performing autolysis in the culture supernatant or culture.
  • Self-digestion can be performed by adjusting the culture supernatant or culture to a reaction solution under conditions suitable for the self-digestion reaction and incubating the resulting reaction solution.
  • the self-digestion reaction is preferably performed under the conditions of pH 6 to 10, more preferably pH 7 to 9, in the presence of Mg 2+ ions, and a temperature of 0 ° C. to 40 ° C., more preferably a temperature of 4 ° C. to 20 ° C. it can.
  • Isolation and purification of a trypsin-like protease derived from Fusarium oxysporum can be carried out by appropriately combining known protein purification methods. For example, after transforming yeast is cultured in a suitable medium, the cells are removed from the culture supernatant by centrifugation of the culture solution or filtration. Then, the obtained culture supernatant can be used for autolysis as desired.
  • Fusarium oxysporum-derived trypsin-like protease can be recovered by techniques such as hydrophobic chromatography, affinity chromatography, reverse phase chromatography, and ultrafiltration.
  • the Fusarium oxysporum-derived trypsin-like protease recovered as described above can be used as it is, but may be used after various preparation treatments.
  • the protease composition of the present invention can be used as a proteolytic enzyme.
  • the pH and temperature of the enzyme reaction may be within a range in which the trypsin-like protease in the protease composition of the present invention can exert trypsin activity.
  • the reaction can be performed under conditions of pH 6 to 12, more preferably pH 7 to 10, temperature 4 ° C. to 40 ° C., more preferably temperature 20 ° C. to 37 ° C.
  • yeast culture-derived protease composition of the present invention is not particularly limited.
  • the yeast culture-derived protease composition of the present invention includes, for example, detergents (detergents for medical equipment, dishwasher detergents, laundry detergents, etc.), feed processing, food processing (fish oil processing, meat processing, etc.), fiber It can be used for processing, wool processing, leather processing, contact lens cleaning, piping cleaning, medicine, etc., and may be blended in bathing agents and hair removal agents.
  • the plasmid used for yeast transformation is the constructed vector expressed by E. coli E. coli. This was introduced into E. coli DH5 ⁇ competent cell (manufactured by Takara Bio Inc.), and the resulting transformant was cultured and amplified. Preparation of the plasmid from the plasmid-carrying strain was performed using QIAprep spin miniprep kit (manufactured by QIAGEN).
  • the AOX1 promoter (SEQ ID NO: 2), AOX1 terminator (SEQ ID NO: 3), and HIS4 gene (SEQ ID NO: 4) used in the construction of the vector are the chromosomal DNA of Komagataela pastoris ATCC76273 (base sequence is EMBL (The European Molecular Biology Laboratory). ) ACCESSION No. FR839628 to FR839631) Prepared by PCR using the mixture as a template.
  • the wild type protease precursor gene (SEQ ID NO: 5) provided with the mating factor ⁇ prepro signal sequence (MF sequence) used in the construction of the vector was prepared based on the public sequence information.
  • MF sequence mating factor ⁇ prepro signal sequence
  • PCR Prime STAR HS DNA Polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) or the like was used, and the reaction conditions were as described in the attached manual.
  • Chromosomal DNA was prepared using Gen Toru-kun TM (manufactured by Takara Bio Inc.) from Komagataela pastoris ATCC 76273 strain under the conditions described therein.
  • Comparative Example 1 Construction of a secretory expression vector for a wild-type protease precursor A gene fragment (SEQ ID NO: 6) having a multiple cloning site of HindIII-BamHI-BglII-XbaI-EcoRI was fully synthesized, and this was synthesized with pUC19 (manufactured by Takara Bio Inc.). PUC-1 was constructed by inserting it between the HindIII-EcoRI sites of Code No. 3219).
  • a nucleic acid fragment added with a BamHI recognition sequence on both sides of the AOX1 promoter was prepared by PCR using primers 1 (SEQ ID NO: 7) and 2 (SEQ ID NO: 8), and inserted into the BamHI site of pUC-1 after BamHI treatment.
  • primers 1 SEQ ID NO: 7
  • 2 SEQ ID NO: 8
  • nucleic acid fragment added with an XbaI recognition sequence on both sides of the AOX1 terminator was prepared by PCR using primers 3 (SEQ ID NO: 9) and 4 (SEQ ID NO: 10). After XbaI treatment, the nucleic acid fragment was added to the XbaI site of pUC-Paox. Inserted to construct pUC-PaoxTaox.
  • a nucleic acid fragment having EcoRI recognition sequences added to both sides of the HIS4 gene was prepared by PCR using primers 5 (SEQ ID NO: 11) and 6 (SEQ ID NO: 12). After EcoRI treatment, the nucleic acid fragment was added to the EcoRI site of pUC-PaoxTaox. Inserted to construct pUC-PaoxTaoxHIS4.
  • a nucleic acid fragment having a BglII recognition sequence added to both sides of the protease precursor gene to which the MF sequence was added was prepared by PCR using primers 7 (SEQ ID NO: 13) and 8 (SEQ ID NO: 14), and treated with BglII. Later, it was inserted into the BglII site of pUC-PaoxTaoxHIS4 to construct pUC-PaoxTPTaoxHIS4. This pUC-PaoxTPTaoxHIS4 is designed so that the wild-type protease precursor gene is secreted and expressed under the control of the AOX1 promoter.
  • Comparative Example 2 Acquisition of transformed yeast Using the wild-type protease precursor expression vector constructed in Comparative Example 1, Komagataela pastoris was transformed as follows. A histidine-requiring strain derived from Komagataela pastoris ATCC76273 strain was inoculated into 3 ml of YPD medium (1% yeast extract bacto (manufactured by Difco), 2% polypeptone (manufactured by Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.), 2% glucose) overnight at 30 ° C. A preculture was obtained by shaking culture.
  • YPD medium 1% yeast extract bacto (manufactured by Difco), 2% polypeptone (manufactured by Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.), 2% glucose
  • the obtained preculture solution (500 ⁇ l) was inoculated into 50 ml of YPD medium, shake-cultured until OD600 was 1 to 1.5, collected (3000 ⁇ g, 10 minutes, 20 ° C.), and 250 ⁇ l of 1M DTT ( It was resuspended in 10 ml of 50 mM potassium phosphate buffer, pH 7.5 containing 25 mM final concentration).
  • This suspension was incubated at 30 ° C. for 15 minutes, and then collected (3000 ⁇ g, 10 minutes, 20 ° C.), and ice-cooled 50 ml of STM buffer (270 mM sucrose, 10 mM Tris-HCl, 1 mM magnesium chloride, pH 7) 5). The washings were collected (3000 ⁇ g, 10 minutes, 4 ° C.), washed again with 25 ml of STM buffer, and then collected (3000 ⁇ g, 10 minutes, 4 ° C.). Finally, it was suspended in 250 ⁇ l of ice-cold STM buffer, which was used as a competent cell solution.
  • STM buffer 270 mM sucrose, 10 mM Tris-HCl, 1 mM magnesium chloride, pH 7
  • Escherichia coli was transformed with the wild-type protease precursor expression vector pUC-PaoxTPTaoxHIS4 constructed in Comparative Example 1, and the resulting transformant was treated with 2 ml of ampicillin-containing 2YT medium (1.6% tryptone bacto (manufactured by Difco)). 1% yeast extract bacto (manufactured by Difco), 0.5% sodium chloride, 0.01% ampicillin sodium (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)), and QIAprep spin miniprep kit (QIAGEN) Was used to obtain pUC-PaoxTPTaoxHIS4. This plasmid was treated with SalI to prepare a linear vector cleaved with a SalI recognition sequence in the HIS4 gene.
  • the cells were resuspended in an appropriate amount of YNB medium and then applied to a YNB selective agar plate (0.67% yeast nitrogen base Without Amino Acid (manufactured by Difco), 1.5% agarose, 2% glucose), 30 A strain that grows in a static culture at 3 ° C. for 3 days was selected, and a wild-type protease precursor-expressing yeast was obtained.
  • YNB selective agar plate 0.67% yeast nitrogen base Without Amino Acid (manufactured by Difco), 1.5% agarose, 2% glucose
  • Comparative Example 3 Culture of transformed yeast The wild-type protease precursor-expressing yeast obtained in Comparative Example 2 was treated with 2 ml of BMGY medium (1% yeast extract bacto (Difco), 2% polypeptone (Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.), 0.34% yeast nitrogen base Without Amino Acid and Ammonium Sulfate (manufactured by Difco), 1% Ammonium Sulfate, 0.4 mg / l Biotin, 100 mM potassium phosphate (pH 6.0), 1% glycerol, 1% glycerol After inoculation and shaking culture at 30 ° C. for 48 hours, the culture supernatant was collected by centrifugation (12000 rpm, 5 minutes, 4 ° C.).
  • BMGY medium 1% yeast extract bacto (Difco), 2% polypeptone (Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.), 0.34% yeast nitrogen base Without Amino Acid and Ammonium Sulfate (manufactured by
  • Comparative Example 4 SDS-PAGE of culture supernatant SDS-PAGE analysis of the culture supernatant obtained in Comparative Example 3 was performed. Mix 12 ⁇ l of culture supernatant and 3 ⁇ l of 5 ⁇ sample buffer (0.25 M Tris-HCl (pH 6.8), 50% Glycerol, 6.7% SDS, 0.01% BPB) and treat at 95 ° C. for 8 min. Did. This sample was subjected to SDS-PAGE electrophoresis using an e-PAGE gel (ER15L, manufactured by ATTO) together with a molecular weight marker (Precision Plus Protein ' TM Dual Color Standards, manufactured by Bio-Rad).
  • sample buffer (0.25 M Tris-HCl (pH 6.8), 50% Glycerol, 6.7% SDS, 0.01% BPB) and treat at 95 ° C. for 8 min. Did.
  • This sample was subjected to SDS-PAGE electrophoresis using an e-PAGE gel (ER15L, manufactured by
  • Comparative Example 5 Conversion of protease precursor by self-digestion
  • the protease precursor present in the culture supernatant was converted to the active form by self-digestion as follows. 500 ⁇ l of the culture supernatant was replaced with an activity measurement buffer (10 mM TrisHCl (pH 8.0), 10 mM MgCl 2) using Amicon Ultracel-3K (manufactured by Merck Millipore). Thereafter, using the same buffer, the liquid volume was adjusted to 500 ⁇ l and incubated at 15 ° C. for 24-48 hours.
  • an activity measurement buffer 10 mM TrisHCl (pH 8.0), 10 mM MgCl 2
  • Amicon Ultracel-3K manufactured by Merck Millipore
  • the amount of enzyme that generates 1 ⁇ mol of p-nitroaniline in 1 min was defined as 1 unit.
  • Protease activity in the culture supernatant obtained in Comparative Example 3 and the solution after self-digestion obtained in Comparative Example 5 was measured by the above method, but no activity was detected (Table 1).
  • Comparative Example 7 Construction of protease expression vector A protease gene was prepared by PCR using a synthetic gene of a wild-type protease precursor gene to which an MF sequence was added as a template. PCR was performed using Primer 7 and Primer 9 (SEQ ID NO: 15), Primer 10 (SEQ ID NO: 16) and Primer 8, and after amplification of each PCR was mixed, PCR was performed with Primer 7 and Primer 8. A protease gene with an MF sequence was prepared.
  • protease gene prepared above was treated with BglII and inserted into the BglII site of pUC-PaoxTaoxHIS4 prepared in Comparative Example 1 to construct a protease gene expression vector to which an MF sequence was added.
  • Comparative Example 8 Protease Production of Protease Using the vector constructed in Comparative Example 7, the treatments of Comparative Examples 2 to 6 were performed to evaluate the secretory production of protease in Pichia yeast. As a result, although a small amount of protease activity was observed in the culture supernatant, no protease band was observed on PAGE (FIG. 1, lane 2, Table 1). This result indicates that it is difficult to secrete the prosthesis with Pichia yeast.
  • Comparative Example 9 Construction of Mutant Protease Precursor Expression Vector A mutant protease precursor gene having a porcine trypsin-derived prosequence was prepared by PCR using a synthetic gene of a wild-type protease precursor gene to which an MF sequence was added as a template. PCR was performed using Primer 7 and Primer 11 (SEQ ID NO: 17), Primer 12 (SEQ ID NO: 18) and Primer 8, and after amplification fragments of each PCR were mixed, PCR was performed with Primer 7 and Primer 8. A mutant protease precursor gene to which an MF sequence was added was prepared.
  • protease gene prepared above was treated with BglII and inserted into the BglII site of pUC-PaoxTaoxHIS4 prepared in Comparative Example 1 to construct a mutant protease precursor gene expression vector to which an MF sequence was added.
  • Comparative Example 10 Secretory Production of Mutant Protease Precursor Using the vector constructed in Comparative Example 9, the treatments of Comparative Examples 2 to 6 were performed to evaluate the secretory production of the mutant protease precursor in Pichia yeast. As a result, no protease activity was observed in the culture supernatant (Table 1), and a band different from the size estimated from the amino acid sequence was observed on PAGE. This result shows that even if the prosequence of porcine trypsin, which has been reported to be converted from a precursor to an active form by autolysis, does not function well with this protease.
  • Example 1 Construction of mutant protease precursor expression vector 1
  • An N7NR mutant precursor gene was prepared by PCR using a synthetic gene of a wild-type protease precursor gene to which an MF sequence was added as a template. PCR was performed using primer 7 and primer 13 (SEQ ID NO: 19), primer 14 (SEQ ID NO: 20) and primer 8, and after mixing the amplified fragments of each PCR, PCR was performed using primer 7 and primer 8. A N7NR mutant precursor gene having an MF sequence was prepared.
  • mutant protease precursor gene prepared above was treated with BglII and inserted into the BglII site of pUC-PaoxTaoxHIS4 prepared in Comparative Example 1 to construct various mutant protease precursor gene expression vectors with MF sequences.
  • This mutant precursor has a mutation in which an R residue is inserted between residues corresponding to N7 and I8 of the wild type precursor.
  • Example 2 Construction 2 of a mutant protease precursor expression vector An N7NK mutant precursor gene was prepared by PCR using a synthetic gene of a wild-type protease precursor gene to which an MF sequence was added as a template. PCR was performed using primer 7 and primer 15 (SEQ ID NO: 21), primer 16 (SEQ ID NO: 22), and primer 8, and after amplification fragments of each PCR were mixed, PCR was performed with primer 7 and primer 8. The N24NK mutation precursor gene to which the MF sequence was assigned was prepared.
  • the mutant protease precursor gene prepared above was treated with BglII and inserted into the BglII site of pUC-PaoxTaoxHIS4 prepared in Comparative Example 1 to construct various mutant protease precursor gene expression vectors to which MF sequences were added. .
  • This mutant precursor has a mutation in which a K residue is inserted between residues corresponding to N7 and I8 of the wild type precursor.
  • Example 3 Construction of a mutant protease precursor expression vector 3 Using the expression vector of the N7NR mutation precursor gene constructed in Example 1 as a template, PCR was performed using the combinations of primers (1stPCR-1, 1stPCR-2) shown in Table 2 below. PCR was carried out with primers 7 and 8 using a mixture of fragments as a template to prepare various mutant protease precursor genes with MF sequences.
  • the mutant protease precursor gene prepared above was treated with BglII and inserted into the BglII site of pUC-PaoxTaoxHIS4 prepared in Comparative Example 1 to construct various mutant protease precursor gene expression vectors to which MF sequences were added. .
  • These mutant precursors have mutations in which an R residue is inserted between residues corresponding to wild-type precursors N7 and I8, and a residue corresponding to N7 is substituted with another amino acid residue.
  • Example 4 Construction of mutant protease precursor expression vector 4 Using the expression vector of the N7NK mutant precursor gene constructed in Example 2 as a template, PCR was performed using the combinations of primers (1stPCR-1, 1stPCR-2) shown in Table 3 below. PCR was carried out with primers 7 and 8 using a mixture of fragments as a template to prepare various mutant protease precursor genes with MF sequences. The mutant protease precursor gene prepared above was treated with BglII and inserted into the BglII site of pUC-PaoxTaoxHIS4 prepared in Comparative Example 1 to construct various mutant protease precursor gene expression vectors with MF sequences. .
  • mutation precursors are mutations in which a K residue is inserted between residues corresponding to wild-type precursors N7 and I8, and a residue corresponding to N7 is replaced with another amino acid residue.
  • Example 5 Secretory production of mutant protease precursor 1 Using the various mutant protease precursor gene expression vectors obtained in Examples 1 and 3, the treatments described in Comparative Examples 2 to 6 were performed, and secretion production of mutant protease precursors in Pichia yeast was evaluated. As a result, protease activity was observed in the culture supernatant (Table 4), and a precursor band was also detected on PAGE. Furthermore, protease activity was greatly improved by performing autolysis (Table 4). These results indicate that the protease can be efficiently secreted and produced by using a mutant protease precursor having a modified prosequence.
  • Example 6 Secretion production of mutant protease precursor 2 Using the various mutant protease precursor gene expression vectors obtained in Examples 2 and 4, the treatments described in Comparative Examples 2 to 6 were performed to evaluate the secretory production of the mutant protease precursor in Pichia yeast. As a result, protease activity was observed in the culture supernatant (Table 5), and a precursor band was also detected on PAGE. Furthermore, protease activity was greatly improved by performing autolysis treatment (Table 5). As a result of the SDS-PAGE analysis of the sample before and after the self-digestion treatment, the protease precursor band disappeared by the treatment and was converted to the protease band (FIG. 2). These results indicate that the protease can be efficiently secreted and produced by using a mutant protease precursor having a modified prosequence.
  • Example 7 Construction of mutant protease precursor expression vector 5 Using the expression vector of the N7NK mutation precursor gene constructed in Example 2 as a template, PCR was performed using the combinations of primers (1stPCR-1, 1stPCR-2) shown in Table 6 below. PCR was carried out with primers 7 and 8 using a mixture of fragments as a template to prepare various mutant protease precursor genes with MF sequences.
  • mutant protease precursor gene prepared above was treated with BglII and inserted into the BglII site of pUC-PaoxTaoxHIS4 prepared in Comparative Example 1 to construct various mutant protease precursor gene expression vectors with MF sequences. .
  • a K residue is inserted between residues corresponding to the wild-type precursor N7 and I8, and each amino acid residue from G1 to I5 is replaced with another amino acid residue.
  • Example 8 Secretory production of mutant protease precursor 3 Using the various mutant protease precursor gene expression vectors obtained in Example 7, the treatments described in Comparative Examples 2 to 6 were performed to evaluate the secretory production of the mutant protease precursor in Pichia yeast. As a result, protease activity was observed in the culture supernatant (Table 7), and a precursor band was also detected on PAGE. Furthermore, protease activity was greatly improved by performing autolysis treatment (Table 7).
  • Example 9 Construction of mutant protease precursor expression vector 6 Using the expression vector of the N7EK mutation precursor gene constructed in Example 4 as a template, PCR was performed using the combinations of primers (1stPCR-1, 1stPCR-2) shown in Table 8 below. PCR was carried out with primers 7 and 8 using a mixture of fragments as a template to prepare various mutant protease precursor genes with MF sequences.
  • the mutant protease precursor gene prepared above was treated with BglII and inserted into the BglII site of pUC-PaoxTaoxHIS4 prepared in Comparative Example 1 to construct various mutant protease precursor gene expression vectors with MF sequences. .
  • mutation precursors have mutations in which a K residue is inserted between residues corresponding to wild-type precursors N7 and I8, and a residue corresponding to N7 is substituted with an E residue. Furthermore, it has a mutation in which R111, which is one of the sites capable of causing autolysis within the active form, is substituted with another amino acid residue.
  • Example 10 Secretory production of mutant protease precursor 4 Using the various mutant protease precursor gene expression vectors obtained in Example 9, the treatments described in Comparative Examples 2 to 6 were performed to evaluate the secretory production of the mutant protease precursor in Pichia yeast. As a result, protease activity was observed in the culture supernatant (Table 9), and a precursor band was also detected on PAGE. Furthermore, protease activity was greatly improved by performing autolysis treatment (Table 9).
  • Example 11 Construction of a mutant protease precursor expression vector under the GAP promoter
  • the N7EK-R111A mutant precursor gene expression vector constructed in Example 9 was subjected to BamHI treatment, subjected to agarose gel electrophoresis, and the above vector excluding the AOX1 promoter The region was purified.
  • a nucleic acid fragment added with a BamHI recognition sequence on both sides of the GAP promoter (SEQ ID NO: 82) was prepared by PCR using primers 75 (SEQ ID NO: 83) and 76 (SEQ ID NO: 84).
  • An expression vector was constructed that was inserted into the BamHI site of the vector region to express the N7EK-R111A mutant precursor gene under the GAP promoter.
  • Example 12 Secretory production of mutant protease precursor 4 Using the expression vector that expresses the N7EK-R111A mutant precursor gene under the GAP promoter obtained in Example 11, the treatment described in Comparative Examples 2 to 6 was performed, and the mutant protease precursor in Pichia yeast was treated. Secretory production was evaluated. As a result, protease activity was observed in the culture supernatant (Table 10), and a precursor band was also detected on PAGE. Furthermore, protease activity was greatly improved by carrying out autolysis treatment (Table 10).

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Abstract

本発明の課題は、酵母を宿主として用いてカビ由来トリプシン様プロテアーゼを製造する方法において、カビ由来トリプシン様プロテアーゼを高い生産性で製造できる方法を提供することである。本発明によれば、酵母内で機能する分泌シグナル配列と、フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼのプロ配列に変異が導入され、Ｃ末端にアルギニン又はリジン残基を有するプロ配列と、フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼのアミノ酸配列とをＮ末端側からＣ末端側にこの順に有する融合タンパク質をコードする遺伝子を酵母で発現させることを含む、酵母におけるプロテアーゼの製造方法が提供される。

Description

酵母におけるプロテアーゼの製造方法
　本発明は、酵母におけるカビ由来トリプシン様プロテアーゼの製造方法、並びにカビ由来トリプシン様プロテアーゼ前駆体などに関する。
　遺伝子組換え技術を用いてタンパク質を生産するためには、そのタンパク質の発現に適切な宿主が使用される。宿主としては、例えば、ＣＨＯ（Chinese Hamster Ovary）細胞等の動物細胞、カイコ等の昆虫及び昆虫細胞、ニワトリや牛などの動物、並びに大腸菌又は酵母などの微生物などが用いられる。上記の中でも酵母は、安価な培地で大規模な高密度培養が可能であり、タンパク質を低コストで生産することができる。また、分泌シグナルペプチド等を利用すれば培養液中への分泌生産も可能なため、タンパク質の精製も容易となる。
　トリプシンは哺乳動物の膵臓で生産されるセリンプロテアーゼであり、アルギニン残基またはリジン残基のＣ末端側を切断するプロテアーゼ活性を有しており、インスリン等のタンパク質性医薬品の製造又は細胞分散などに用いられている。哺乳動物由来（ウシ、ブタ、ヒト）のトリプシン以外にも、カビや魚由来のトリプシン様プロテアーゼも知られている。
　例えば、特許文献１には、フザリウム属カビ（Fusarium oxysporum）からのトリプシン様プロテアーゼの精製及び当該トリプシン様プロテアーゼ遺伝子のクローニングが記載されている。非特許文献１には、フザリウム属カビ（Fusarium oxysporum）におけるトリプシン様プロテアーゼの生産が記載されている。
　また、非特許文献２には、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces　griseus）由来トリプシンを酵母（Pichia pastosis）により発現させることが記載されている。さらに、非特許文献３には、ブタトリプシンを酵母（Pichia pastosis）において発現させることが記載されている。
国際公開ＷＯ１９９４／０２５５８３号公報 Natalie E.Farnworth et al., Enzyme and Microbial Technology 33 (2003) 85-91 Zhenmin Ling et al., J Ind Microbiol Biotechnol (2012) 39:1651-1662 Min Shu et al., Protein Expression and Purification 114 (2015) 149-155
　本発明は、酵母を宿主として用いてカビ由来トリプシン様プロテアーゼを製造する方法において、カビ由来トリプシン様プロテアーゼを高い生産性で製造できる方法を提供することを解決すべき課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、酵母内で機能する分泌シグナル配列と、フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼが有するプロ配列に変異を導入したプロ配列と、フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼのアミノ酸配列とをＮ末端側からＣ末端側にこの順に有する融合タンパク質をコードする遺伝子を酵母で発現させることによって、フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼを高い生産性で製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すわなち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）　酵母内で機能する分泌シグナル配列と、フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼのプロ配列に変異が導入され、Ｃ末端にアルギニン又はリジン残基を有するプロ配列と、フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼのアミノ酸配列とをＮ末端側からＣ末端側にこの順に有する融合タンパク質をコードする遺伝子を酵母で発現させることを含む、酵母におけるプロテアーゼの製造方法。
（２）　酵母の培養上清中に、前記プロテアーゼと、前記プロ配列と前記プロテアーゼのアミノ酸配列とからなるプロテアーゼ前駆体とが１：１以上の活性比で分泌される、（１）に記載の方法。
（３）　培養上清中に発現したプロテアーゼにより、培養上清中に発現したプロテアーゼ前駆体がプロテアーゼに変換される、（１）叉は（２）に記載の方法。
（４）　フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼが、下記（ａ）～（ｃ）の何れかである、（１）から（３）の何れか一に記載の方法。
（ａ）配列番号６７のアミノ酸配列からなるプロテアーゼ；
（ｂ）配列番号６７のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号６７のアミノ酸配列からなるプロテアーゼと同等のトリプシン様プロテアーゼ活性を有するプロテアーゼ；又は
（ｃ）配列番号６７のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号６７のアミノ酸配列からなるプロテアーゼと同等のトリプシン様プロテアーゼ活性を有するプロテアーゼ。
（５）　酵母内で機能する分泌シグナル配列が、酵母ＭＦ配列である、（１）から（４）の何れか一に記載の方法。
（６）　プロ配列が、Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Asnで示されるアミノ酸配列に対して１～数個のアミノ酸が付加、欠失又は置換したアミノ酸配列であり、Ｃ末端にアルギニン又はリジン残基を有し、酵母においてそのＣ末端で切断されてプロテアーゼ前駆体からプロテアーゼが生成するアミノ酸配列である、（１）から（５）の何れか一に記載の方法。
（７）　プロ配列が、
Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb、
Xcc-Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa- Xbb、
Xdd-Xcc-Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa- Xbb、
Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb、
Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb、
Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb、
Ile-Pro-Xaa-Xbb、
Pro-Xaa-Xbb、又は
Xaa-Xbb
（式中、Xaaは任意のアミノ酸残基を示し、XbbはArg又はLys残基を示し、Xccは任意のアミノ酸残基を示し、Xddは任意のアミノ酸残基を示す）
の何れかで示されるアミノ酸配列である、（１）から（６）の何れか一に記載の方法。
（８）　フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼのアミノ酸配列のＮ末端側に、Ｃ末端にアルギニン又はリジン残基を有するプロ配列が融合しているプロテアーゼ前駆体であって、
（ｉ）前記プロテアーゼ前駆体を酵母の培養上清中に発現させた場合、前記プロテアーゼと、前記プロ配列と前記プロテアーゼのアミノ酸配列とからなるプロテアーゼ前駆体とが１：１以上の活性比で分泌され、かつ
（ｉｉ）前記発現したプロテアーゼにより、前記発現したプロテアーゼ前駆体をプロテアーゼに変換することが可能である、
プロテアーゼ前駆体。
（９）　フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼが、下記（ａ）～（ｃ）の何れかである、（８）に記載のプロテアーゼ前駆体：
（ａ）配列番号６７のアミノ酸配列からなるプロテアーゼ；
（ｂ）配列番号６７のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号６７のアミノ酸配列からなるプロテアーゼと同等のトリプシン様プロテアーゼ活性を有するプロテアーゼ；又は
（ｃ）配列番号６７のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号６７のアミノ酸配列からなるプロテアーゼと同等のトリプシン様プロテアーゼ活性を有するプロテアーゼ。
（１０）　プロ配列が、Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Asnで示されるアミノ酸配列に対して１～数個のアミノ酸が付加、欠失又は置換したアミノ酸配列であり、Ｃ末端にアルギニン又はリジン残基を有し、酵母においてそのＣ末端で切断されてプロテアーゼ前駆体からプロテアーゼが生成するアミノ酸配列である、（８）又は（９）に記載のプロテアーゼ前駆体。
（１１）　プロ配列が、
Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb、
Xcc-Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa- Xbb、
Xdd-Xcc-Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa- Xbb、
Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb、
Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb、
Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb、
Ile-Pro-Xaa-Xbb、
Pro-Xaa-Xbb、又は
Xaa-Xbb
（式中、Xaaは任意のアミノ酸残基を示し、XbbはArg又はLys残基を示し、Xccは任意のアミノ酸残基を示し、Xddは任意のアミノ酸残基を示す）
の何れかで示されるアミノ酸配列である、（８）から（１０）の何れか一に記載のプロテアーゼ前駆体。
（１２）　酵母内で機能する分泌シグナル配列と、フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼのプロ配列に変異が導入され、Ｃ末端にアルギニン又はリジン残基を有するプロ配列と、フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼのアミノ酸配列とをＮ末端側からＣ末端側にこの順に有する融合タンパク質をコードするＤＮＡを有する組み換え発現ベクター。
（１３）　フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼが、下記（ａ）～（ｃ）の何れかである、（１２）に記載の組み換え発現ベクター：
（ａ）配列番号６７のアミノ酸配列からなるプロテアーゼ；
（ｂ）配列番号６７のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号６７のアミノ酸配列からなるプロテアーゼと同等のトリプシン様プロテアーゼ活性を有するプロテアーゼ；又は
（ｃ）配列番号６７のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号６７のアミノ酸配列からなるプロテアーゼと同等のトリプシン様プロテアーゼ活性を有するプロテアーゼ。
（１４）　酵母内で機能する分泌シグナル配列が、酵母ＭＦ配列である、（１２）又は（１３）に記載の組み換え発現ベクター。
（１５）　プロ配列が、Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Asnで示されるアミノ酸配列に対して１～数個のアミノ酸が付加、欠失又は置換したアミノ酸配列であって、酵母においてそのＣ末端で切断されてプロテアーゼ前駆体からプロテアーゼが生成するアミノ酸配列である、（１２）から（１４）の何れか一に記載の組み換え発現ベクター。
（１６）　プロ配列が、
Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb、
Xcc-Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa- Xbb、
Xdd-Xcc-Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa- Xbb、
Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb、
Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb、
Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb、
Ile-Pro-Xaa-Xbb、
Pro-Xaa-Xbb、又は
Xaa-Xbb
（式中、Xaaは任意のアミノ酸残基を示し、XbbはArg又はLys残基を示し、Xccは任意のアミノ酸残基を示し、Xddは任意のアミノ酸残基を示す）
の何れかで示されるアミノ酸配列である、（１２）から（１５）の何れか一に記載の組み換え発現ベクター。
（１７）　（１２）から（１６）の何れか一に記載の組み換え発現ベクターを有する形質転換酵母。
　さらに本発明によれば、以下の発明が提供される。
（Ａ）　酵母で発現したフザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼを含む、酵母培養物由来プロテアーゼ組成物。
（Ｂ）　フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼが、下記（ａ）～（ｃ）の何れかである、（Ａ）に記載の酵母培養物由来プロテアーゼ組成物；
（ａ）配列番号６７のアミノ酸配列からなるプロテアーゼ；
（ｂ）配列番号６７のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号６７のアミノ酸配列からなるプロテアーゼと同等のトリプシン様プロテアーゼ活性を有するプロテアーゼ；又は
（ｃ）配列番号６７のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号６７のアミノ酸配列からなるプロテアーゼと同等のトリプシン様プロテアーゼ活性を有するプロテアーゼ。
　本発明によれば、酵母においてカビ由来トリプシン様プロテアーゼを高い生産性で製造することができる。本発明によるカビ由来トリプシン様プロテアーゼの製造方法においては、高密度培養が可能な酵母を宿主として用いることが可能であることからカビ由来トリプシン様プロテアーゼの製造コストを削減できる。
図１は、比較例３で得られた培養上清のＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析の結果を示す。レーン１は MF-プロ配列-プロテアーゼ、レーン２は MF-プロテアーゼを示す。 図２は、実施例６で得られた培養上清について自己消化処理の前後のサンプルのＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析の結果を示す。Ｍはマーカー、レーン１は変換反応前の培養上清(MF-APQEIPNK-トリプシン)、レーン２は 自己消化反応後の結果を示す。
　以下、本発明の実施の形態についてさらに詳細に説明する。
［酵母におけるプロテアーゼの製造］
　本発明においては、酵母内で機能する分泌シグナル配列と、プロ配列（より詳細には、フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼのプロ配列に変異を導入し、Ｃ末端にアルギニン又はリジン残基を有するプロ配列）と、フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼのアミノ酸配列とを、Ｎ末端側からＣ末端側にこの順に有する融合タンパク質をコードする遺伝子を酵母で発現させることによって、酵母においてプロテアーゼを製造する。
　本発明においては、酵母内で機能する分泌シグナル配列と、上記プロ配列と、フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼのアミノ酸配列とをコードするＤＮＡを有する組み換え発現ベクターを使用して酵母において上記の融合タンパク質を発現させることにより、酵母の培養上清中に、プロ配列とプロテアーゼのアミノ酸配列とからなるプロテアーゼ前駆体と、プロテアーゼとが先ず発現する。さらに、培養上清中に発現したプロテアーゼにより、培養上清中に発現したプロテアーゼ前駆体がプロテアーゼに変換されることを見出した。上記メカニズムにより、本発明においては、所望のプロテアーゼ活性を有するフザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼを酵母において効率よく生産（製造）することが可能になった。
　酵母の培養上清中におけるプロテアーゼとプロテアーゼ前駆体との発現比率（自己消化反応前の発現比率）は特に限定されないが、好ましくは、１：１以上の活性比で分泌され、より好ましくは１：１０以上の活性比で分泌され、さらに好ましくは１：１００以上の活性比で分泌される。
　ここでいう活性比とは、培養上清中のプロテアーゼ活性量（培養後に自己消化によるプロテアーゼ前駆体からプロテアーゼへの変換を行う前の培養上清中のプロテアーゼ活性量）をプロテアーゼの発現量とし、自己消化後のプロテアーゼ活性量から培養上清中のプロテアーゼ活性量を引いた活性量をプロテアーゼ前駆体の発現量とした場合の発現量比のことを示す。
［フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼ］
　本発明で言うフザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼとは、フザリウム・オキシスポラムが発現するトリプシン様プロテアーゼ又はその改変体を意味する。ザリウム・オキシスポラムが発現するトリプシン様プロテアーゼは、配列番号６７のアミノ酸配列からなるプロテアーゼである。
　本発明では、フザリウム・オキシスポラムが発現するトリプシン様プロテアーゼの改変体として、
（ｂ）配列番号６７のアミノ酸配列と９０％以上（好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号６７のアミノ酸配列からなるプロテアーゼと同等のトリプシン様プロテアーゼ活性を有するプロテアーゼ；又は
（ｃ）配列番号６７のアミノ酸配列において１又は数個（好ましくは１～１０個、より好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～３個）のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号６７のアミノ酸配列からなるプロテアーゼと同等のトリプシン様プロテアーゼ活性を有するプロテアーゼ。
を発現させてもよい。例としては、実施例９および１０に記載した配列番号６７のＲ１０４残基（１０４番目のアミノ酸残基であるArg残基）を他のアミノ酸に置換した変異体が挙げられる。
　アミノ酸配列の配列同一性は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Ｐｒｏ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９０，  ５８７３（１９９３）］やＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  １８３，  ６３  （１９９０）］を用いて決定することができる。
　また、アミノ酸の置換の場合には、置換するアミノ酸は、置換前のアミノ酸と類似の性質を有するアミノ酸（同族アミノ酸）であることが好ましい。ここでは、以下に挙げる各群の同一群内のアミノ酸を同族アミノ酸とする：
 （第１群：中性非極性アミノ酸）Ｇｌｙ，Ａｌａ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｍｅｔ，Ｃｙｓ，Ｐｒｏ，Ｐｈｅ；
 （第２群：中性極性アミノ酸）Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｇｌｎ，Ａｓｎ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ；
 （第３群：酸性アミノ酸）Ｇｌｕ，Ａｓｐ；
 （第４群：塩基性アミノ酸）Ｈｉｓ，Ｌｙｓ，Ａｒｇ：
　上記したトリプシン様プロテアーゼの改変体をコードするＤＮＡは、部位特異的突然変異誘発法などの当業者に公知の常法により取得することができ、例えば、市販の変異導入用キット（例えば、Ｍｕｔａｎｔ－Ｋ、Ｍｕｔａｎｔ－Ｇ、ＬＡ　ＰＣＲ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　シリーズキット（ＴＡＫＡＲＡ社製））を用いて取得することもできる。
［酵母内で機能する分泌シグナル配列］
　本発明で使用する酵母内で機能する分泌シグナル配列は、細胞質内で生合成されたタンパク質の小胞体への輸送及び局在化を指示する配列であり、タンパク質のＮ末端に存在することにより、発現したタンパク質を宿主細胞である酵母外に分泌させる機能を有するペプチドである。分泌シグナル配列は、通常、分泌性タンパク質が細胞内から細胞膜を通過して細胞外へ分泌される際にシグナルペプチダーゼにより分解されることにより除去される。
　本発明で使用する酵母内で機能する分泌シグナル配列としては、酵母内で機能する配列であればよく、酵母由来の分泌シグナル配列、又は酵母以外の生物に由来する分泌シグナル配列のいずれでもよいが、好ましくは酵母由来の分泌シグナル配列である。
　酵母内で機能する分泌シグナル配列としては、酵母（サッカロマイセス・セレビシエ等）のＭａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ α（ＭＦα）プレプロシグナル配列（ＭＦ配列）の他、オガタエア・ポリモルファやコマガタエラ・パストリスの酸ホスファターゼ（ＰＨＯ１）、サッカロマイセス・セレビシアエのインベルターゼ（ＳＵＣ２）又はサッカロマイセス・セレビシアエのＰＬＢ１のシグナル配列等を挙げることができるが、特に限定されない。
［プロ配列］
　本発明で使用するプロ配列は、フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼのプロ配列に変異を導入することにより得られるものであり、かつそのＣ末端にアルギニン又はリジン残基を有していることが好ましい。
　フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼのプロ配列のアミノ酸配列としては、Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Asnを挙げることができる。従って、本発明で使用するプロ配列としては、Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Asnで示されるアミノ酸配列に対して１～数個（好ましくは１～７個、より好ましくは１～６個、例えば、１個、２個、３個、４個、５個又は６個）のアミノ酸が付加、欠失又は置換したアミノ酸配列であり、Ｃ末端にアルギニン又はリジン残基を有している配列を挙げることができる。
　本発明で使用するプロ配列は、酵母においてそのＣ末端で切断されてプロテアーゼ前駆体からプロテアーゼが生成するアミノ酸配列である。アミノ酸の置換の場合には、置換するアミノ酸は、置換前のアミノ酸と類似の性質を有するアミノ酸（同族アミノ酸）であることが好ましい。同族アミノ酸については、本明細書中上記した通りである。
　プロ配列の具体例としては、
Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb、
Xcc-Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa- Xbb、
Xdd-Xcc-Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa- Xbb、
Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb、
Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb、
Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb、
Ile-Pro-Xaa-Xbb、
Pro-Xaa-Xbb、又は
Xaa-Xbb
（式中、Xaaは任意のアミノ酸残基を示し、XbbはArg又はLys残基を示し、Xccは任意のアミノ酸残基を示し、Xddは任意のアミノ酸残基を示す）
の何れかで示されるアミノ酸配列を挙げることができる。
　プロ配列の別の具体例としては、Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Asn-Argで示されるアミノ酸配列に対して１～数個（好ましくは１～７個、より好ましくは１～６個、例えば、１個、２個、３個、４個、５個又は６個）のアミノ酸が置換したアミノ酸配列、又はAla- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Asn-Lysで示されるアミノ酸配列に対して１～数個（好ましくは１～７個、より好ましくは１～６個、例えば、１個、２個、３個、４個、５個又は６個）のアミノ酸が置換したアミノ酸配列を挙げることができる。
　Xaa、Xbb及びXccはそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基を示し、具体的には、Asp、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Cys、Met、Ser、Thr、Tyr、Phe、Trp、Pro、Glu、Asn、Gln、Lys、Arg、又はHisの何れかを表す。なお、Asp、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Cys、Met、Ser、Thr、Tyr、Phe、Trp、Pro、Glu、Asn、Gln、Lys、Arg、およびHisはそれぞれ、アスパラギン酸残基、グリシン残基、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロシシン残基、システイン残基、メチオニン残基、セリン残基、スレオニン残基、チロシン残基、フェニルアラニン残基、トリプトファン残基、プロリン残基、グルタミン酸残基、アスパラギン残基、グルタミン残基、リジン残基、アルギニン残基、およびヒスチジン残基を指す。
　Xaaは、好ましくは、Asn、Gly、Asp、Ser、Arg、Thr 、Glu、Val、His、Ala、Tyr、Ile、Gln、又はMetである。
　Xcc及びXddは、好ましくは中性アミノ酸残基（Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Cys、Met、Ser、Thr、Tyr、Phe、Trp、Pro、Asn、Gln）であり、より好ましくは脂肪族アミノ酸残基（Gly、Ala、Val、Leu、Ile）であり、さらに好ましくはAlaである。
［組み換え発現ベクター］
　本発明では、酵母内で機能する分泌シグナル配列と、フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼのプロ配列に変異が導入され、Ｃ末端にアルギニン又はリジン残基を有するプロ配列と、フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼのアミノ酸配列とをＮ末端側からＣ末端側にこの順に有する融合タンパク質をコードするＤＮＡを有する組み換え発現ベクターを用いて、酵母においてフザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼを発現及び分泌させる。
　本発明における組換え発現ベクターとは、形質転換後の宿主細胞において、組換え発現ベクターに組み込まれた発現カセット中の遺伝子が発現する機能を有する核酸分子のことを意味する。組み換え発現ベクターは、発現カセットに加えて、組み込み相同領域、栄養要求性相補遺伝子または薬剤耐性遺伝子などの選択マーカー遺伝子、自律複製配列などを有していてもよい。
　本発明において宿主に形質転換された後のベクターは、形質転換体の染色体に組み込まれている状態でも良く、自律複製型として存在している状態でも良い。
　発現ベクターは、プラスミドベクターでも人工染色体であってもよい。ベクターの調製が容易であり、また酵母細胞の形質転換が容易である点で、プラスミドベクターが好ましい。プラスミドとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３などのＹＥｐ系、ＹＣｐ５０などのＹＣｐ系等）などが挙げられるが、特に限定されない。
　本発明における「発現カセット」とは、プロモーターおよび発現する目的タンパク質遺伝子より構成され、ターミネーターを含んでも良く、例えば、ｐＵＣ等のプラスミド上に構築することもできるし、ＰＣＲ法によっても作製することもできる。
　プロモーターとしては、ＡＯＸ１プロモーター、ＡＯＸ２プロモーター、ＣＡＴプロモーター、ＤＨＡＳプロモーター、ＦＤＨプロモーター、ＦＭＤプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＭＯＸプロモーター、ＴＥＦプロモーター、ＬＥＵ２プロモーター、ＵＲＡ３プロモーター、ＡＤＥプロモーター、ＡＤＨ１プロモーター、ＰＧＫ１プロモーター等を使用することができるが、特に限定されない。
　ターミネーターとしては、ＡＯＸ１ターミネーター、ＧＡＰターミネーター、ＡＤＨ１ターミネーター等を使用することができるが、特に限定されない。
　本発明における組み込み相同領域とは、本発明の組換えベクターが形質転換後の宿主細胞の染色体上に相同組換えで組み込まれるための領域を指す。本領域は、宿主細胞の染色体の一部を任意で利用できるが、栄養要求性相補遺伝子や、発現カセット内のプロモーターやターミネーターなどを利用することもできる。
　本発明における栄養要求性相補遺伝子は、宿主細胞のアミノ酸や核酸などの栄養要求性を相補する遺伝子であれば特に限定されない。具体的な例としては、ＵＲＡ３遺伝子、ＬＥＵ２遺伝子、ＡＤＥ１遺伝子、ＨＩＳ４遺伝子などが挙げられ、それぞれウラシル、ロイシン、アデニン、ヒスチジンの栄養要求性株において原栄養株表現型の回復により選択することができる。
　本発明における薬剤耐性遺伝子などの選択マーマー遺伝子は、宿主細胞が保有していない薬剤耐性を付与する遺伝子であれば特に限定されない。具体的な例としては、G418耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子などが挙げられ、それぞれＧ４１８、ゼオシン、ハイグロマイシンを含む培地上における耐性により選択することができる。なお、酵母宿主を作成するときに用いた栄養要求性選択マーカーは、該選択マーカーが破壊されていない場合は、用いることができない。この場合、該選択マーカーを回復させればよく、方法は当業者において公知の方法を用いることができる。
　本発明における自律複製配列とは、宿主細胞において、本発明の組換えベクターの複製起点として作用し、自律的な複製を可能とする配列のことを指す。
［形質転換酵母］
　本発明によれば、上記した本発明の組み換え発現ベクターを有する形質転換酵母が提供される。
　酵母の種類は、特に限定されないが、メタノール資化性酵母がより好ましく、オガタエア属（Ｏｇａｔａｅａ）やコマガタエラ属(Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ)に属するメタノール資化性酵母がさらに好ましい。オガタエア属に属するメタノール資化性酵母の中でも、オガタエア・ポリモルファ（Ｏｇａｔａｅａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、オガタエア・ミニュータ（Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ）が好ましく、コマガタエラ属に属するメタノール資化性酵母では、コマガタエア・パストリス（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）が好ましい。
　本発明の組み換え発現ベクターを酵母に導入する方法は、酵母にＤＮＡを導入することができる方法であれば特に限定されず、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、酢酸リチウム法、スフェロプラスト法、プロトプラスト法などのトランスフェクション法やマイクロインジェクション法のような公知の方法を制限なく使用できる。また、ＹＩｐ系などのベクター又は染色体中の任意の領域と相同なＤＮＡ配列を用いた染色体への置換又は挿入型の酵母の形質転換法を使用することもできる。
　本発明におけ形質転換酵母とは、本発明の組換えベクターが導入された酵母を意味する。本発明の形質転換酵母は、組換えベクターに含まれる栄養要求性相補遺伝子や薬剤耐性遺伝子により得られる表現型を指標にして、選択的に得ることができる。
　本発明の組み換え発現ベクターが酵母に組み込まれたか否かの確認は、ＰＣＲ、サザンハイブリダイゼーション又はノーザンハイブリダイゼーション等により行うことができる。例えば、形質転換酵母からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行い、増幅産物について電気泳動（アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲル又はキャピラリー）を行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ液等により染色して増幅産物を検出することにより、形質転換を確認することができる。あるいは、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。
　形質転換酵母を培養するための培地は、酵母が資化する栄養源を含む培地であれば何でも使用でき、上記栄養源としては、グルコース、シュークロース、マルトース等の糖類、乳酸、酢酸、クエン酸、プロピオン酸等の有機酸類、メタノール、エタノール、グリセロール等のアルコール類、パラフィン等の炭化水素類、大豆油、菜種油等の油脂類、またはこれらの混合物等の炭素源、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、尿素、酵母エキス、肉エキス、ペプトン、コーンスチープリカー等の窒素源、更に、その他の無機塩、ビタミン類等の栄養源を適宜混合・配合した通常の培地を用いることができるが、特にグリセロールやメタノールを炭素源として用いることが好ましい。また、培養方法としてバッチ培養、連続培養またはドーム型培養のいずれでも培養可能である。
　培養は通常一般の条件により行なうことができ、例えば、ｐＨ２．５～１０．０、好ましくはｐＨ４．０～８．０、温度１０℃～４８℃、好ましくは２０℃～４２℃、より好ましくは２５℃～３７℃で、好気的に１０時間～１０日間培養することにより行うことができる。
［プロテアーゼ前駆体］
　本発明によれば、フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼのアミノ酸配列のＮ末端側に、Ｃ末端にアルギニン又はリジン残基を有するプロ配列が融合しているプロテアーゼ前駆体が提供される。
　本発明のプロテアーゼ前駆体は、
（ｉ）前記プロテアーゼ前駆体を酵母の培養上清中に発現させた場合、前記プロテアーゼと、前記プロテアーゼ前駆体とが１：１以上の比率で分泌し、かつ
（ｉｉ）前記発現したプロテアーゼにより、前記発現したプロテアーゼ前駆体をプロテアーゼに変換することが可能である、
という特徴を有している。
　フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼ、並びにプロ配列の詳細については本明細書中において上記した通りである。
　本発明のプロテアーゼ前駆体は、上記した形質転換酵母を培養することにより、形質転換酵母に生産させることができる。従って、本発明のプロテアーゼ前駆体は、本発明の形質転換酵母を培養し、その培養上清中に本発明のプロテアーゼ前駆体を蓄積させる分泌生産により得ることができる。
　本発明における分泌生産とは、形質転換酵母を液体培養して、菌体内部でなく培養上清にプロテアーゼ前駆体及びプロテアーゼを蓄積させることを指す。
［フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼを含む酵母培養物由来プロテアーゼ組成物］
　本発明によれば、酵母で発現したフザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼを含む、酵母培養物由来プロテアーゼ組成物が提供される。本発明の組成物は、酵母培養物由来プロテアーゼ組成物であり、酵母培養物由来成分を含む場合がある。また、本発明におけるフザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼは、酵母で発現したものであり、酵母における翻訳語修飾を受けているものである場合がある。
　フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼとしては、本明細書中上記した通り、下記（ａ）～（ｃ）の何れかであることが好ましい。
（ａ）配列番号６７のアミノ酸配列からなるプロテアーゼ；
（ｂ）配列番号６７のアミノ酸配列と９０％以上（好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号６７のアミノ酸配列からなるプロテアーゼと同等のトリプシン様プロテアーゼ活性を有するプロテアーゼ；又は
（ｃ）配列番号６７のアミノ酸配列において１又は数個（好ましくは１～１０個、より好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～３個）のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号６７のアミノ酸配列からなるプロテアーゼと同等のトリプシン様プロテアーゼ活性を有するプロテアーゼ。
　本発明の形質転換酵母を培養した後の培養上清又は培養物には、フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼ、及びその前駆体（プロテアーゼ前駆体）が含まれている。本発明においては、上記の培養上清又は培養物において、自己消化を行うことにより、プロテアーゼ前駆体から、フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼへの変換を行うことが好ましい。自己消化は、培養上清又は培養物を自己消化反応に適した条件下の反応液に調整し、得られた反応液をインキュベートすることにより行うことができる。自己消化反応は、好ましくはｐＨ６～１０、より好ましくはｐＨ７～９、Ｍｇ2+イオンの存在下、かつ温度０℃～４０℃、より好ましくは温度４℃～２０℃の条件下において行うことができる。
　フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼの単離精製は、公知のタンパク質精製法を適当に組み合わせて用いることにより実施できる。例えば、形質転換酵母を適当な培地で培養した後、培養液の遠心分離、あるいは、濾過処理により培養上清から菌体を除く。次いで、得られた培養上清を用いて、所望により、自己消化を行うことができる。自己消化後の反応液を用いて、塩析（硫酸アンモニウム沈殿、リン酸ナトリウム沈殿など）、溶媒沈殿（アセトンまたはエタノールなどによる蛋白質分画沈殿法）、透析、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、限外濾過等の手法で、フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼを回収することができる。
　上記の通り回収したフザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼは、そのまま使用することもできるが、各種の製剤化処理を施してから使用してもよい。
　本発明のプロテアーゼ組成物は、タンパク質分解酵素として使用できる。酵素反応のｐＨ及び温度は、本発明のプロテアーゼ組成物中のトリプシン様プロテアーゼがトリプシン活性を発揮し得る範囲内であればよい。例えば、ｐＨ６～１２、より好ましくはｐＨ７～１０、温度４℃～４０℃、より好ましくは温度２０℃～３７℃の条件下において行うことができる。
　本発明の酵母培養物由来プロテアーゼ組成物の用途は特に限定されないが、例えば、組織や細胞からＤＮＡ等の核酸を調製する際に、試料を前処理するための試薬（研究試薬など）として利用することができる。さらに、本発明の酵母培養物由来プロテアーゼ組成物は、例えば、洗剤（医療器具用洗剤、食器洗浄機用洗剤、洗濯用洗剤等）、飼料加工、食品加工（魚油加工、食肉加工等）、繊維加工、羊毛加工、皮革加工、コンタクトレンズ洗浄、配管洗浄、医薬等に利用することができ、入浴剤や脱毛剤に配合してもよい。
　以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。なお、以下の実施例において用いた組換えDNA技術に関する詳細な操作方法などは、次の成書に記載されている：Molecular Cloning 2nd Edition（Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）、Current Protocolsin Molecular Biology（Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience）。
　また、以下の実施例において、酵母の形質転換に用いるプラスミドは、構築したベクターを大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５αコンピテントセル（タカラバイオ社製）に導入し、得られた形質転換体を培養して増幅することによって調製した。プラスミド保持株からのプラスミドの調製は、ＱＩＡｐｒｅｐ　ｓｐｉｎ　ｍｉｎｉｐｒｅｐ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて行った。
　ベクターの構築において利用した、ＡＯＸ１プロモーター（配列番号２）、ＡＯＸ１ターミネーター（配列番号３）、ＨＩＳ４遺伝子（配列番号４）はコマガタエラ・パストリスＡＴＣＣ７６２７３株の染色体ＤＮＡ（塩基配列はＥＭＢＬ　（Ｔｈｅ　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）　ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ　Ｎｏ．　ＦＲ８３９６２８～ＦＲ８３９６３１に記載）混合物をテンプレートにしてＰＣＲで調製した。
　ベクターの構築において利用した、Ｍａｔｉｎｇ　Ｆａｃｔｏｒαプレプロシグナル配列（ＭＦ配列）が付与された野生型プロテアーゼ前駆体遺伝子（配列番号５）は公開配列情報に基づいて合成ＤＮＡを調製した。
　ＰＣＲにはＰｒｉｍｅ　ＳＴＡＲ　ＨＳ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）等を用い、反応条件は添付のマニュアルに記載の方法で行った。染色体ＤＮＡの調製は、コマガタエラ・パストリスＡＴＣＣ７６２７３株からＧｅｎとるくんTM（タカラバイオ社製）等を用いて、これに記載の条件で実施した。
比較例１:野生型プロテアーゼ前駆体の分泌発現ベクターの構築
　ＨｉｎｄＩＩＩ－ＢａｍＨＩ－ＢｇｌＩＩ－ＸｂａＩ－ＥｃｏＲＩのマルチクローニングサイトをもつ遺伝子断片（配列番号６）を全合成し、これをｐＵＣ１９（タカラバイオ社製、Ｃｏｄｅ　Ｎｏ．　３２１９）のＨｉｎｄＩＩＩ－ＥｃｏＲＩサイト間に挿入して、ｐＵＣ－１を構築した。
　また、ＡＯＸ１プロモーターの両側にＢａｍＨＩ認識配列を付加した核酸断片を、プライマー１（配列番号７）及び２（配列番号８）を用いたＰＣＲにより調製し、ＢａｍＨＩ処理後にｐＵＣ－１のＢａｍＨＩサイトに挿入して、ｐＵＣ－Ｐａｏｘを構築した。
　次に、ＡＯＸ１ターミネーターの両側にＸｂａＩ認識配列を付加した核酸断片を、プライマー３（配列番号９）及び４（配列番号１０）を用いたＰＣＲにより調製し、ＸｂａＩ処理後にｐＵＣ－ＰａｏｘのＸｂａＩサイトに挿入して、ｐＵＣ－ＰａｏｘＴａｏｘを構築した。
　次に、ＨＩＳ４遺伝子の両側にＥｃｏＲＩ認識配列を付加した核酸断片を、プライマー５（配列番号１１）及び６（配列番号１２）を用いたＰＣＲにより調製し、ＥｃｏＲＩ処理後にｐＵＣ－ＰａｏｘＴａｏｘのＥｃｏＲＩサイトに挿入して、ｐＵＣ－ＰａｏｘＴａｏｘＨＩＳ４を構築した。
　次に、ＭＦ配列が付与されたプロテアーゼ前駆体遺伝子の両側にＢｇｌＩＩ認識配列を付加した核酸断片を、プライマー７（配列番号１３）及び８（配列番号１４）を用いたＰＣＲにより調製し、ＢｇｌＩＩ処理後にｐＵＣ－ＰａｏｘＴａｏｘＨＩＳ４のＢｇｌＩＩサイトに挿入して、ｐＵＣ－ＰａｏｘＴＰＴａｏｘＨＩＳ４を構築した。このｐＵＣ－ＰａｏｘＴＰＴａｏｘＨＩＳ４は、野生型プロテアーゼ前駆体遺伝子がＡＯＸ１プロモーター制御下で分泌発現するように設計されている。
比較例２: 形質転換酵母の取得
　比較例１で構築した野生型プロテアーゼ前駆体発現ベクターを用いて、以下のようにコマガタエラ・パストリスを形質転換した。
　コマガタエラ・パストリスＡＴＣＣ７６２７３株由来ヒスチジン要求性株を３ｍｌのＹＰＤ培地（１％　ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｂａｃｔｏ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％　ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ（日本製薬社製）、２％　ｇｌｕｃｏｓｅ）に接種し、３０℃で一晩振盪培養して、前培養液を得た。得られた前培養液５００μｌを５０ｍｌのＹＰＤ培地に接種し、ＯＤ６００が１～１．５になるまで振盪培養後、集菌（３０００×ｇ、１０分、２０℃）し、２５０μｌの１Ｍ　ＤＴＴ（終濃度２５ｍＭ）を含む１０ｍｌの５０ｍＭリン酸カリウムバッファー，ｐＨ７．５に再懸濁した。
　この懸濁液を３０℃で１５分インキュベート後、集菌（３０００×ｇ、１０分、２０℃）し、予め氷冷した５０ｍｌのＳＴＭバッファー（２７０ｍＭスクロース、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭ塩化マグネシウム、ｐＨ７．５）で洗浄した。洗浄液を集菌（３０００×ｇ、１０分、４℃）し、２５　ｍｌのＳＴＭバッファーで再度洗浄したのち、集菌（３０００×ｇ、１０分、４℃）した。最終的に、２５０μｌの氷冷ＳＴＭバッファーに懸濁し、これをコンピテントセル溶液とした。
　比較例１で構築した野生型プロテアーゼ前駆体発現ベクターｐＵＣ－ＰａｏｘＴＰＴａｏｘＨＩＳ４を用いて大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体を２ｍｌのアンピシリン含有２ＹＴ培地（１．６％　ｔｒｙｐｔｏｎｅ　ｂａｃｔｏ（Ｄｉｆｃｏ社製）、１％　ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｂａｃｔｏ（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．５％　塩化ナトリウム、０．０１％アンピシリンナトリウム（和光純薬工業社製））で培養し、得られた菌体からＱＩＡｐｒｅｐ　ｓｐｉｎ　ｍｉｎｉｐｒｅｐ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、ｐＵＣ－ＰａｏｘＴＰＴａｏｘＨＩＳ４を取得した。本プラスミドをＳａｌＩ処理し、ＨＩＳ４遺伝子内のＳａｌＩ認識配列で切断された直鎖状ベクターを調製した。
　上述のコンピテントセル溶液６０μｌと直鎖状のｐＵＣ－ＰａｏｘＴＰＴａｏｘＨＩＳ４溶液１μｌを混合し、エレクトロポレーション用キュベット（ディスポキュベット電極、電極間隔２ｍｍ（ビーエム機器社製））に移し入れ、７．５ｋＶ／ｃｍ、２５μＦ、２００Ωに供した後、菌体を１ｍｌのＹＰＤ培地で懸濁し、３０℃で１時間静置した。１時間静置後、集菌（３０００×ｇ、５分、２０℃）し、１ｍｌのＹＮＢ培地（０．６７％　ｙｅａｓｔ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｂａｓｅ　Ｗｉｔｈｏｕｔ　Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄ（Ｄｉｆｃｏ社製））に懸濁後、再度集菌（３０００×ｇ、５分、２０℃）した。菌体を適当量のＹＮＢ培地で再懸濁後、ＹＮＢ選択寒天プレート（０．６７％　ｙｅａｓｔ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｂａｓｅ　Ｗｉｔｈｏｕｔ　Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄ（Ｄｉｆｃｏ社製）、１．５％アガロース、２％　ｇｌｕｃｏｓｅ）に塗布し、３０℃、３日間の静置培養で生育する株を選択し、野生型プロテアーゼ前駆体発現酵母を取得した。
比較例３：　形質転換酵母の培養
　比較例２で得られた野生型プロテアーゼ前駆体発現酵母を２ｍｌのＢＭＧＹ培地（１％　ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｂａｃｔｏ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％　ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ（日本製薬社製）、０．３４％　ｙｅａｓｔ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｂａｓｅ　Ｗｉｔｈｏｕｔ　Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄ　ａｎｄ　Ａｍｍｏｎｉｕｍ　Ｓｕｌｆａｔｅ（Ｄｉｆｃｏ社製）、１％　Ａｍｍｏｎｉｕｍ　Ｓｕｌｆａｔｅ、０．４ｍｇ／ｌ　Ｂｉｏｔｉｎ、１００ｍＭ　リン酸カリウム（ｐＨ６．０）、１％　ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１％　Ｍｅｔｈａｎｏｌ）に接種し、これを３０℃、４８時間振盪培養後、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、５分、４℃）により培養上清を回収した。
比較例４：培養上清のＳＤＳ－ＰＡＧＥ
　比較例３で得られた培養上清のＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析を実施した。
　１２μｌの培養上清と３μｌの５×サンプルバッファー（０．２５Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、５０％　Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、６．７％　ＳＤＳ、０．０１％　ＢＰＢ）を混合し、９５℃－８ｍｉｎ処理をした。本サンプルを分子量マーカー（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　Ｐｌｕｓ　Ｐｒｏｔｅｉｎ’TM　Ｄｕａｌ　Ｃｏｌｏｒ　Ｓｔａｎｄａｒｄｓ、バイオラッド社製）と共に、　ｅ－ＰＡＧＥＬゲル（Ｅ－Ｒ１５Ｌ、ＡＴＴＯ社製）を用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動に供した。泳動後、ゲルを１５分間水洗し、染色液（Ｂｉｏ－Ｓａｆｅ　ＣＢＢ　Ｇ－２５０ステイン；Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）により３０分染色したのち、水で脱色した。その結果、プロテアーゼ前駆体のアミノ酸配列から推定される分子量に相当する領域にバンドは認められた（図１、ｌａｎｅ１）。
比較例５：自己消化によるプロテアーゼ前駆体の変換
　培養上清中に存在するプロテアーゼ前駆体を自己消化により活性体への変換は以下のように実施した。
　培養上清　５００μｌを、Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａｃｅｌ－３Ｋ（メルクミリポア製）を用いて、活性測定用ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣｌ　（ｐＨ８．０），　１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２）に置換した。その後、同ｂｕｆｆｅｒを用いて、液量を５００μｌに調整して、１５℃で２４～４８時間インキュベートした。
比較例６：プロテアーゼ活性の測定
　各サンプル中に含まれるプロテアーゼ活性は以下の方法で測定した。
　活性測定用ｂｕｆｆｅｒ　　９９０μｌに、２．５ｍＭ　Ｎ－Ｂｅｎｚｏｙｌ－ＤＬ－ａｒｇｉｎｉｎｅ－ｐ－ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅＨＣｌ　（ｎａｃａｌａｉ社製）　のＤＭＳＯ溶液　１０μｌを加えた後に、サンプル　１～１０μｌを添加後、初発の４１０ｎｍの吸光度を測定する。そして３７℃で１時間インキュベートし、反応後の４１０ｎｍの吸光度を測定した。反応前後の４１０ｎｍの吸光度変化から、遊離したｐ－ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｎｅ量を算出して、プロテアーゼ活性を計算した。なお、１ｍｉｎ間に１μｍｏｌのｐ－ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｎｅを生成する酵素量を１ユニットと定義した。
　上記方法で比較例３で得られた培養上清および比較例５で得られた自己消化後の溶液中のプロテアーゼ活性を測定したが、活性は検出できなかった（表１）。
比較例７：プロテアーゼ発現ベクターの構築
　ＭＦ配列が付与された野生型プロテアーゼ前駆体遺伝子の合成遺伝子をテンプレートにプロテアーゼ遺伝子をＰＣＲで調製した。プライマー７及びプライマー９（配列番号１５）、プライマー１０（配列番号１６）及びプライマー８を用いたＰＣＲを実施し、それぞれのＰＣＲの増幅断片を混合した後に、プライマー７及びプライマー８でＰＣＲを実施し、ＭＦ配列が付与されたプロテアーゼ遺伝子を調製した。
　上記で調製したプロテアーゼ遺伝子をＢｇｌＩＩ処理し、比較例１で調製したｐＵＣ－ＰａｏｘＴａｏｘＨＩＳ４のＢｇｌＩＩサイトに挿入して、ＭＦ配列が付与されたプロテアーゼ遺伝子発現ベクターを構築した。
比較例８：プロテアーゼの分泌生産
　比較例７で構築したベクターを用いて、比較例２～６の処理を行い、ピキア酵母でのプロテアーゼの分泌生産を評価した。その結果、培養上清中に少量のプロテアーゼ活性を認めたものの、ＰＡＧＥ上でのプロテアーゼのバンドは認められなかった（図１　ｌａｎｅ　２，　表１）。本結果は、プロテーゼをピキア酵母で高分泌させるのは困難であることを示している。
比較例９：変異プロテアーゼ前駆体発現ベクターの構築
　ＭＦ配列が付与された野生型プロテアーゼ前駆体遺伝子の合成遺伝子をテンプレートにブタトリプシン由来プロ配列をもつ変異プロテアーゼ前駆体遺伝子をＰＣＲで調製した。プライマー７及びプライマー１１（配列番号１７）、プライマー１２（配列番号１８）及びプライマー８を用いたＰＣＲを実施し、それぞれのＰＣＲの増幅断片を混合した後に、プライマー７及びプライマー８でＰＣＲを実施し、ＭＦ配列が付与された変異プロテアーゼ前駆体遺伝子を調製した。
　上記で調製したプロテアーゼ遺伝子をＢｇｌＩＩ処理し、比較例１で調製したｐＵＣ－ＰａｏｘＴａｏｘＨＩＳ４のＢｇｌＩＩサイトに挿入して、ＭＦ配列が付与された変異プロテアーゼ前駆体遺伝子発現ベクターを構築した。
比較例１０：変異プロテアーゼ前駆体の分泌生産
　比較例９で構築したベクターを用いて、比較例２～６の処理を行い、ピキア酵母での変異プロテアーゼ前駆体の分泌生産を評価した。その結果、培養上清中にプロテアーゼ活性は認められず（表１）、ＰＡＧＥ上ではアミノ酸配列から推測されるサイズとは異なるバンドが認められた。本結果は、自己消化による前駆体から活性型への変換例が報告されているブタ由来トリプシンのプロ配列を用いても、本プロテアーゼではうまく機能しないことを示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
実施例１：変異プロテアーゼ前駆体発現ベクターの構築１
　ＭＦ配列が付与された野生型プロテアーゼ前駆体遺伝子の合成遺伝子をテンプレートにＮ７ＮＲ変異前駆体遺伝子をＰＣＲで調製した。プライマー７及びプライマー１３（配列番号１９）、プライマー１４（配列番号２０）及びプライマー８を用いたＰＣＲを実施し、それぞれのＰＣＲの増幅断片を混合した後に、プライマー７及びプライマー８でＰＣＲを実施し、ＭＦ配列が付与されたＮ７ＮＲ変異前駆体遺伝子を調製した。
　上記で調製した変異型プロテアーゼ前駆体遺伝子をＢｇｌＩＩ処理し、比較例１で調製したｐＵＣ－ＰａｏｘＴａｏｘＨＩＳ４のＢｇｌＩＩサイトに挿入して、ＭＦ配列が付与された各種変異プロテアーゼ前駆体遺伝子発現ベクターを構築した。
　この変異前駆体は、野生型前駆体のＮ７とＩ８に相当する残基間にＲ残基が挿入された変異を有する。
実施例２：　変異プロテアーゼ前駆体発現ベクターの構築２
　ＭＦ配列が付与された野生型プロテアーゼ前駆体遺伝子の合成遺伝子をテンプレートにＮ７ＮＫ変異前駆体遺伝子をＰＣＲで調製した。プライマー７及びプライマー１５（配列番号２１）、プライマー１６（配列番号２２）及びプライマー８を用いたＰＣＲを実施し、それぞれのＰＣＲの増幅断片を混合した後に、プライマー７及びプライマー８でＰＣＲを実施し、ＭＦ配列が付与されたＮ２４ＮＫ変異前駆体遺伝子を調製した。
　上記で調製した変異型プロテアーゼ前駆体遺伝子をＢｇｌＩＩ処理し、比較例１で調製したｐＵＣ－ＰａｏｘＴａｏｘＨＩＳ４のＢｇｌＩＩサイトに挿入して、ＭＦ配列が付与された各種変異型プロテアーゼ前駆体遺伝子発現ベクターを構築した。
　この変異前駆体は、野生型前駆体のＮ７とＩ８に相当する残基間にＫ残基が挿入された変異を有する。
実施例３：　変異プロテアーゼ前駆体発現ベクターの構築３
　実施例１で構築したＮ７ＮＲ変異前駆体遺伝子の発現ベクターをテンプレートに、以下の表２に示した、各プライマーの組合せ（１ｓｔＰＣＲ－１、１ｓｔＰＣＲ－２）を用いてＰＣＲを行い、得られた各断片を混合したものをテンプレートに、プライマー７およびプライマー８でＰＣＲを行い、ＭＦ配列が付与された各種変異型プロテアーゼ前駆体遺伝子を調製した。
　上記で調製した変異型プロテアーゼ前駆体遺伝子をＢｇｌＩＩ処理し、比較例１で調製したｐＵＣ－ＰａｏｘＴａｏｘＨＩＳ４のＢｇｌＩＩサイトに挿入して、ＭＦ配列が付与された各種変異型プロテアーゼ前駆体遺伝子発現ベクターを構築した。
　これらの変異前駆体は、野生型前駆体のＮ７とＩ８に相当する残基間にＲ残基が挿入され、かつＮ７に相当する残基が別のアミノ酸残基に置換された変異を有する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
実施例４: 変異プロテアーゼ前駆体発現ベクターの構築４
　実施例２で構築したＮ７ＮＫ変異前駆体遺伝子の発現ベクターをテンプレートに、以下の表３に示した、各プライマーの組合せ（1ｓｔＰＣＲ－１、１ｓｔＰＣＲ－２）を用いてＰＣＲを行い、得られた各断片を混合したものをテンプレートに、プライマー７およびプライマー８でＰＣＲを行い、ＭＦ配列が付与された各種変異型プロテアーゼ前駆体遺伝子を調製した。
　上記で調製した変異型プロテアーゼ前駆体遺伝子をＢｇｌＩＩ処理し、比較例1で調製したｐＵＣ－ＰａｏｘＴａｏｘＨＩＳ４のＢｇｌＩＩサイトに挿入して、ＭＦ配列が付与された各種変異型プロテアーゼ前駆体遺伝子発現ベクターを構築した。
　これらの変異前駆体の一部は、野生型前駆体のＮ７とＩ８に相当する残基間にＫ残基が挿入され、かつＮ７に相当する残基が別のアミノ酸残基に置換された変異を有する。また、別のこれらの変異前駆体の一部は、野生型前駆体のＮ７とＩ８に相当する残基間にＫ残基が挿入され、プロ配列の長さが異なる変異を有する
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
実施例５: 変異型プロテアーゼ前駆体の分泌生産１
　実施例１および３で得られた各種変異型プロテアーゼ前駆体遺伝子発現ベクターを用いて、比較例２～６に記載の処理を行い、ピキア酵母での変異型プロテアーゼ前駆体の分泌生産を評価した。その結果、培養上清中にプロテアーゼ活性が認められ（表４）、PAGE上において前駆体バンドも検出された。さらに、自己消化処理を行うことにより、プロテアーゼ活性が大きく向上した（表４）。
　これらの結果は、改変したプロ配列を有する変異型プロテアーゼ前駆体を用いることにより、効率的にプロテアーゼを分泌生産できることを示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
実施例６: 変異型プロテアーゼ前駆体の分泌生産２
　実施例２および４で得られた各種変異型プロテアーゼ前駆体遺伝子発現ベクターを用いて、比較例２～６に記載の処理を行い、ピキア酵母での変異型プロテアーゼ前駆体の分泌生産を評価した。その結果、培養上清中にプロテアーゼ活性が認められ（表５）、PAGE上において前駆体バンドも検出された。さらに、自己消化処理を行うことにより、プロテアーゼ活性が大きく向上した（表５）。自己消化処理の前後のサンプルのSDS-PAGE解析の結果、処理によりプロテアーゼ前駆体のバンドが消失し、プロテアーゼのバンドに変換されていた（図２）。
　これらの結果は、改変したプロ配列を有する変異型プロテアーゼ前駆体を用いることにより、効率的にプロテアーゼを分泌生産できることを示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
実施例７: 変異プロテアーゼ前駆体発現ベクターの構築５
　実施例２で構築したＮ７ＮＫ変異前駆体遺伝子の発現ベクターをテンプレートに、以下の表６に示した、各プライマーの組合せ（1ｓｔＰＣＲ－１、１ｓｔＰＣＲ－２）を用いてＰＣＲを行い、得られた各断片を混合したものをテンプレートに、プライマー７およびプライマー８でＰＣＲを行い、ＭＦ配列が付与された各種変異型プロテアーゼ前駆体遺伝子を調製した。
　上記で調製した変異型プロテアーゼ前駆体遺伝子をＢｇｌＩＩ処理し、比較例1で調製したｐＵＣ－ＰａｏｘＴａｏｘＨＩＳ４のＢｇｌＩＩサイトに挿入して、ＭＦ配列が付与された各種変異型プロテアーゼ前駆体遺伝子発現ベクターを構築した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　これらの変異前駆体の一部は、野生型前駆体のＮ７とＩ８に相当する残基間にＫ残基が挿入され、かつＧ１からＩ５の各アミノ酸残基が別のアミノ酸残基に置換された変異を有する。
実施例８: 変異型プロテアーゼ前駆体の分泌生産３
　実施例７で得られた各種変異型プロテアーゼ前駆体遺伝子発現ベクターを用いて、比較例２～６に記載の処理を行い、ピキア酵母での変異型プロテアーゼ前駆体の分泌生産を評価した。その結果、培養上清中にプロテアーゼ活性が認められ（表７）、PAGE上において前駆体バンドも検出された。さらに、自己消化処理を行うことにより、プロテアーゼ活性が大きく向上した（表７）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　これらの結果は、改変したプロ配列を有する変異型プロテアーゼ前駆体を用いることにより、効率的にプロテアーゼを分泌生産できることを示している。
実施例９: 変異プロテアーゼ前駆体発現ベクターの構築６
　実施例４で構築したＮ７ＥＫ変異前駆体遺伝子の発現ベクターをテンプレートに、以下の表８に示した、各プライマーの組合せ（1ｓｔＰＣＲ－１、１ｓｔＰＣＲ－２）を用いてＰＣＲを行い、得られた各断片を混合したものをテンプレートに、プライマー７およびプライマー８でＰＣＲを行い、ＭＦ配列が付与された各種変異型プロテアーゼ前駆体遺伝子を調製した。
　上記で調製した変異型プロテアーゼ前駆体遺伝子をＢｇｌＩＩ処理し、比較例1で調製したｐＵＣ－ＰａｏｘＴａｏｘＨＩＳ４のＢｇｌＩＩサイトに挿入して、ＭＦ配列が付与された各種変異型プロテアーゼ前駆体遺伝子発現ベクターを構築した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　これらの変異前駆体は、野生型前駆体のＮ７とＩ８に相当する残基間にＫ残基が挿入され、かつＮ７に相当する残基がＥ残基に置換された変異を有する。さらに、活性体の内部で自己分解を起こし得るサイトの一つであるＲ１１１が別のアミノ酸残基に置換された変異を有する。
実施例１０: 変異型プロテアーゼ前駆体の分泌生産４
　実施例９で得られた各種変異型プロテアーゼ前駆体遺伝子発現ベクターを用いて、比較例２～６に記載の処理を行い、ピキア酵母での変異型プロテアーゼ前駆体の分泌生産を評価した。その結果、培養上清中にプロテアーゼ活性が認められ（表９）、PAGE上において前駆体バンドも検出された。さらに、自己消化処理を行うことにより、プロテアーゼ活性が大きく向上した（表９）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　これらの結果は、Ｒ１１１残基を改変することにより、前駆体／活性体の比率を向上させ、より効率的にプロテアーゼを分泌生産できることを示している。
実施例１１: ＧＡＰプロモーター下での変異プロテアーゼ前駆体発現ベクターの構築
　実施例９で構築したＮ７ＥＫ-Ｒ１１１Ａ変異前駆体遺伝子の発現ベクターをＢａｍＨＩ処理後に、アガロースゲル電気泳動し、ＡＯＸ１プロモーターを除く上記ベクター領域を精製した。次に、ＧＡＰプロモーター（配列番号８２）の両側にＢａｍＨＩ認識配列を付加した核酸断片を、プライマー７５（配列番号８３）及び７６（配列番号８４）を用いたＰＣＲにより調製し、ＢａｍＨＩ処理後に上記のベクター領域のＢａｍＨＩサイトに挿入して、ＧＡＰプロモーター下でのＮ７ＥＫ-Ｒ１１１Ａ変異前駆体遺伝子が発現する発現ベクターを構築した。
実施例１２: 変異型プロテアーゼ前駆体の分泌生産４
　実施例１１で得られたＧＡＰプロモーター下でのＮ７ＥＫ-Ｒ１１１Ａ変異前駆体遺伝子が発現する発現ベクターを用いて、比較例２～６に記載の処理を行い、ピキア酵母での変異型プロテアーゼ前駆体の分泌生産を評価した。その結果、培養上清中にプロテアーゼ活性が認められ（表１０）、PAGE上において前駆体バンドも検出された。さらに、自己消化処理を行うことにより、プロテアーゼ活性が大きく向上した（表１０）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　この結果は、プロモーターを変更することにより、前駆体／活性体の比率を向上させ、より効率的にプロテアーゼを分泌生産できることを示している。

Claims (17)

  1. 酵母内で機能する分泌シグナル配列と、フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼのプロ配列に変異が導入され、Ｃ末端にアルギニン又はリジン残基を有するプロ配列と、フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼのアミノ酸配列とをＮ末端側からＣ末端側にこの順に有する融合タンパク質をコードする遺伝子を酵母で発現させることを含む、酵母におけるプロテアーゼの製造方法。
  2. 酵母の培養上清中に、前記プロテアーゼと、前記プロ配列と前記プロテアーゼのアミノ酸配列とからなるプロテアーゼ前駆体とが１：１以上の活性比で分泌される、請求項１に記載の方法。
  3. 培養上清中に発現したプロテアーゼにより、培養上清中に発現したプロテアーゼ前駆体がプロテアーゼに変換される、請求項１叉は２に記載の方法。
  4. フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼが、下記（ａ）～（ｃ）の何れかである、請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
    （ａ）配列番号６７のアミノ酸配列からなるプロテアーゼ；
    （ｂ）配列番号６７のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号６７のアミノ酸配列からなるプロテアーゼと同等のトリプシン様プロテアーゼ活性を有するプロテアーゼ；又は
    （ｃ）配列番号６７のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号６７のアミノ酸配列からなるプロテアーゼと同等のトリプシン様プロテアーゼ活性を有するプロテアーゼ。
  5. 酵母内で機能する分泌シグナル配列が、酵母ＭＦ配列である、請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
  6. プロ配列が、Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Asnで示されるアミノ酸配列に対して１～数個のアミノ酸が付加、欠失又は置換したアミノ酸配列であり、Ｃ末端にアルギニン又はリジン残基を有し、酵母においてそのＣ末端で切断されてプロテアーゼ前駆体からプロテアーゼが生成するアミノ酸配列である、請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
  7. プロ配列が、
    Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb、
    Xcc-Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa- Xbb、
    Xdd-Xcc-Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa- Xbb、
    Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb、
    Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb、
    Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb、
    Ile-Pro-Xaa-Xbb、
    Pro-Xaa-Xbb、又は
    Xaa-Xbb
    （式中、Xaaは任意のアミノ酸残基を示し、XbbはArg又はLys残基を示し、Xccは任意のアミノ酸残基を示し、Xddは任意のアミノ酸残基を示す）
    の何れかで示されるアミノ酸配列である、請求項１から６の何れか一項に記載の方法。
  8. フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼのアミノ酸配列のＮ末端側に、Ｃ末端にアルギニン又はリジン残基を有するプロ配列が融合しているプロテアーゼ前駆体であって、
    （ｉ）前記プロテアーゼ前駆体を酵母の培養上清中に発現させた場合、前記プロテアーゼと、前記プロ配列と前記プロテアーゼのアミノ酸配列とからなるプロテアーゼ前駆体とが１：１以上の活性比で分泌され、かつ
    （ｉｉ）前記発現したプロテアーゼにより、前記発現したプロテアーゼ前駆体をプロテアーゼに変換することが可能である、
    プロテアーゼ前駆体。
  9. フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼが、下記（ａ）～（ｃ）の何れかである、請求項８に記載のプロテアーゼ前駆体：
    （ａ）配列番号６７のアミノ酸配列からなるプロテアーゼ；
    （ｂ）配列番号６７のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号６７のアミノ酸配列からなるプロテアーゼと同等のトリプシン様プロテアーゼ活性を有するプロテアーゼ；又は
    （ｃ）配列番号６７のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号６７のアミノ酸配列からなるプロテアーゼと同等のトリプシン様プロテアーゼ活性を有するプロテアーゼ。
  10. プロ配列が、Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Asnで示されるアミノ酸配列に対して１～数個のアミノ酸が付加、欠失又は置換したアミノ酸配列であり、Ｃ末端にアルギニン又はリジン残基を有し、酵母においてそのＣ末端で切断されてプロテアーゼ前駆体からプロテアーゼが生成するアミノ酸配列である、請求項８又は９に記載のプロテアーゼ前駆体。
  11. プロ配列が、
    Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb、
    Xcc-Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa- Xbb、
    Xdd-Xcc-Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa- Xbb、
    Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb、
    Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb、
    Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb、
    Ile-Pro-Xaa-Xbb、
    Pro-Xaa-Xbb、又は
    Xaa-Xbb
    （式中、Xaaは任意のアミノ酸残基を示し、XbbはArg又はLys残基を示し、Xccは任意のアミノ酸残基を示し、Xddは任意のアミノ酸残基を示す）
    の何れかで示されるアミノ酸配列である、請求項８から１０の何れか一項に記載のプロテアーゼ前駆体。
  12. 酵母内で機能する分泌シグナル配列と、フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼのプロ配列に変異が導入され、Ｃ末端にアルギニン又はリジン残基を有するプロ配列と、フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼのアミノ酸配列とをＮ末端側からＣ末端側にこの順に有する融合タンパク質をコードするＤＮＡを有する組み換え発現ベクター。
  13. フザリウム・オキシスポラム由来トリプシン様プロテアーゼが、下記（ａ）～（ｃ）の何れかである、請求項１２に記載の組み換え発現ベクター：
    （ａ）配列番号６７のアミノ酸配列からなるプロテアーゼ；
    （ｂ）配列番号６７のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号６７のアミノ酸配列からなるプロテアーゼと同等のトリプシン様プロテアーゼ活性を有するプロテアーゼ；又は
    （ｃ）配列番号６７のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号６７のアミノ酸配列からなるプロテアーゼと同等のトリプシン様プロテアーゼ活性を有するプロテアーゼ。
  14. 酵母内で機能する分泌シグナル配列が、酵母ＭＦ配列である、請求項１２又は１３に記載の組み換え発現ベクター。
  15. プロ配列が、Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Asnで示されるアミノ酸配列に対して１～数個のアミノ酸が付加、欠失又は置換したアミノ酸配列であって、酵母においてそのＣ末端で切断されてプロテアーゼ前駆体からプロテアーゼが生成するアミノ酸配列である、請求項１２から１４の何れか一項に記載の組み換え発現ベクター。
  16. プロ配列が、
    Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb、
    Xcc-Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa- Xbb、
    Xdd-Xcc-Ala- Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa- Xbb、
    Pro-Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb、
    Gln-Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb、
    Glu-Ile-Pro-Xaa-Xbb、
    Ile-Pro-Xaa-Xbb、
    Pro-Xaa-Xbb、又は
    Xaa-Xbb
    （式中、Xaaは任意のアミノ酸残基を示し、XbbはArg又はLys残基を示し、Xccは任意のアミノ酸残基を示し、Xddは任意のアミノ酸残基を示す）
    の何れかで示されるアミノ酸配列である、請求項１２から１５の何れか一項に記載の組み換え発現ベクター。
  17. 請求項１２から１６の何れか一項に記載の組み換え発現ベクターを有する形質転換酵母。
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