JPH022362A - 新規なグルタチオン・パーオキシダーゼ遺伝子およびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は、新規なグルタチオン・バーオキンダーゼ遺伝
情報を有するＤＮＡ、該ＤＮＡを保持してなる形質転換
体、該形質転換体により該ＤＮＡの遺伝情報を発現せし
めて得られるポリペプチドおよびその製造法に関する。

〈従来の技術〉 グルタチオン・パーオキシダーゼは、グルタチオンを基
質として、２分子のグルタチオンと１分子の過酸化水素
から２分子のグルクチオン酸化物と２分子の水分子を生
成する反応を触媒する酵素であって、哺乳動物の肝臓、
腎臓、心臓、肺、赤血球や血漿など生体内の組織、臓器
に存在していることが知られ（ＦＩｏｈｅ、Ｌ、　ｅｔ
　ａｌ、ＦＥＢｓ　Ｌｅｔｔ、、３２゜１３２−１３４
（１９７３））、グルタチオンによる過酸化脂質酸化物
の２電子還元を触媒して生体内の過酸化物処理に重要な
役割を果している。このようなグルタチオン・パーオキ
シダーゼは、セレンを含む蛋白質で、セレンはその活性
部位にセレノシスティン（Ｓｅｃ）の形で存在する。ク
ローニングされたマウス由来のグルタチオン・パーオキ
シダーゼ遺伝子から、通常は停止コドンとして読み取ら
れるデオキンリボヌクレオチド配列（ＤＮＡ）のオパー
ルコドンＴＧＡが、本酵素ではセレノシスティン（Ｓｅ
ｃ）をコードしている（ＵＭＢＯＪｏｕｒｎａｌＶｏ＋
、　５．Ｎｏ、６．ｐｐ１２２１−１２２７（１９８６
））。

またヒトグルタチオン・パーオキシダーゼ（以下、ｈ　
−Ｇ　Ｓ　ＨＰ　ｘと略すこともある）は、赤血球およ
び血漿から分離され、赤血球型のサブユニットの分子量
は分子９２０６００であるに対し、血漿型のサブユニッ
トの分子量は２１５００からなるホモテトラマーとして
存在することが知られている（Ａｒｃｈｉｖｓ　ｏｆ　
［ｌｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓ
ｉｃｓ、Ｖｏｌ、２５６．Ｎｏ、２．ｐｐ６７７−６８
６（１９８７）　、Ｔｈｅ　ＪｏｕｒｎａＩ　ｏｆ　Ｂ
ｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｖｏｌ、２
６２．Ｎｏ、３６．ａｐ１７３９８−１７４０３（１９
８７））。

さらに赤血球由来のｈ　−Ｇ　Ｓ　ＨＰ　ｘと肝や腎臓
由来のｈ−ＧＳＨＰｘとは免疫的に交叉することやサブ
ユニットの分子量が分子量２０６００であることから同
一物質と推定され、またすでに報告されているマウス由
来のＧＳＨＰｘと極めて相同性の高い遺伝子であるが、
これらと血漿由来のｈＧＳＨＰＸとは明らかに異なって
おり、現在のところ２種類のｈ−ＧＳＨＰｘの存在が認
められている。

これらのｈ−ＧＳＨＰｘに関して、肝および腎細胞のｍ
−ＲＮＡから作ったｃ−ＤＮＡライブラリーからｈ−Ｇ
ＳＨＰｘがクローニングされ、遺伝子構造が明らかにさ
れている（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃ
ｈ、Ｖｏｌ、１５．Ｎｏ、１３．ｐｐ５４８４（１９８
７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ八ｃｉｄｓ　へＲｅ５ｅａｒｃｈ
、Ｖｏｌ、１５．Ｎｏ、１７．ｐｐ７１７８（１９８７
））　　が、しかし血漿由来のｈ　−Ｇ　Ｓ　ＨＰ　ｘ
については蛋白質は単離されたが、その遺伝子はクロー
ニングされていない状況である。

〈発明が解決しようとする問題点〉 以上の通り、ｈ　−Ｇ　Ｓ　ＨＰ　ｘ遺伝子としては、
肝および腎細胞からクローニングされ、構造が明らかに
されているに止まり、今回本発明者らは、ヒト肝細胞由
来のｃ−ＤＮＡライブラリーから、上記既知のｈ−ＧＳ
ＨＰｘｉｌｔ伝子とは異なるｈＧ　Ｓ　ｔ（Ｐ　ｘ遺伝
子をクローニングし、その構造を確認し、新規なｈ−Ｇ
ＳＨＰｘ遺伝子を得ることに成功した。

く問題点を解決するための手段〉 本発明者らは、ヒト肝細胞由来のｃ−ＤＮＡライブラリ
ーから第３図に示されるポリＡテールから伸びた全長９
５１塩基対の遺伝子をクローニングし、このクローンが
開始コドンから停止コドンを含むオープンリーディング
フレームを有し、少なくともＮ端側より下記式（１） ％式％ （ただし式中、＊＊＊はセレノシスティンを示す）で表
わされるｈ−ＧＳＨＰｘを構成する１８９個のアミノ酸
からなるポリペプチドをコードするもので、この構造遺
伝子において、既知（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ、１５．Ｎｏ、１７．ｐｐ７１
７８（１９８７））のヒト肝臓由来ｈ−ＧＳＨＰｘとは
ヌクレオチドで６１．０％、アミノ酸で６６．１％の相
同性を示すもので、新規な遺伝子であることを知った。

さらに前述の既知の２種のｈ−ＧＳＨＰｘ遺伝子と比較
検討するために遺伝子の発現をノーサンプロティング法
で確認した結果、本発明のｈ−ｃｓＨＰ　ｘ遺伝子はメ
ジャーに発現される細胞内で主要なｈ−ＧＳＨＰｘをコ
ードする遺伝子であり、また既知ｈ−ＧＳＨＰｘ遺伝子
はマイナーに発現されるもので本発明のｈ−ＧＳＨＰｘ
のアイソマ−であることを知った。かつ、上記の式（＋
）で表わされるｈ−ＧＳＨＰｘを構成するポリペプチド
を得、またその塩基配列が、５″末端側より第２図にお
ける塩基１から５６７位で表わされ、セレノシスティン
をコードするオパールコドン（ＴＧＡ）を有する新規な
遺伝子であることを知った。

さらに本件ｈ−ＧＳＨＰｘを構成するポリペプチドのア
ミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡを遺伝子
操作の手段により、宿主に導入せしめて形質転換体を得
、これを培養して新規なｈＣ３ＨＰｘを構成するポリペ
プチドを大量生産する方法を確立した。

本発明は、上記の知見に基づいて完成されたもので、少
なくともＮ端側より下記式（１）％式％ （ただし式中、＊＊＊はセレノシスティンを示す）で表
わされるｈ−ＧＳＨＰｘを構成するポリペプチドのアミ
ノ酸配列をコードするＤＮＡ、宿主にとって外来性であ
る上記のアミノ酸配列で表わされるｈ　−Ｇ　Ｓ　ＨＰ
　ｘを構成するポリペプチドのアミノ酸配列をコードす
る塩基配列を含むＤＮＡを保持することを特徴とする形
質転換体、上記のアミノ酸配列で表わされるｈ　−Ｇ　
Ｓ　ＨＰ　ｘを構成するポリペプチド、および宿主にと
って外来性である上記のアミノ酸配列で表わされるｈ　
−Ｇ　Ｓ　ＨＰｘを構成するポリペプチドのアミノ酸配
列をコードする塩基配列を含むＤＮＡを保持した形質転
換体をセレン含有培地にて培養して該Ｄ　Ｎ　Ａの遺伝
情報を発現せしめ、該培養物からｈ−Ｃ３ＨＰＸを構成
するポリペプチドを採取することを特徴とするｈ−ＧＳ
ＨＩ’ｘの製造法に関する。

まず本発明におけるｈ−ＧＳＨＰｘ遺伝子としては、市
販のヒト肝臓Ｃ−ＤＮＡライブラリーを用いるか、肝臓
組織から調製したｍ−ＲＮＡを用いてファージベクター
に組み込んで得られるライブラリーを用いて調製すれば
よく、例えばヒト肝臓組繊を粉末化したのちグアニジウ
ム液を加えホモジェナイズし、この懸ン蜀ン夜を１８１
／２ゲージの注射針に数回通して高分子ＤＮＡを分断し
、これを５．７Ｍ塩化セシウム液上に重層し、３６００
０ｒｐｍ、２５°Ｃで一夜遠心後、沈澱を少量のエタノ
ールで洗浄し、水に溶解し、酢酸ナトリウムを０．３Ｍ
になるように加え、２．５容積のエタノールを加え、再
沈澱させ、さらに遠心して全ＲＮＡを回収し、これを０
．５Ｍ食塩水に溶解し、６５゛Ｃで５分加熱２冷し、オ
リゴｄＴセルロースカラムにチャージしてポリメラーゼ
をもっＲＮＡのみを溶出し、このポリ（Ａ）”ＲＮＡを
オリゴｄ　（Ｔ）とアニーリングさせ、逆転写酵素を用
いて第−鎖を合成し、次いでＲＮａｓｅＨおよびＤＮＡ
ポリメラーゼＩで第二鎖を合成し、さらにＥｃｏＲＩメ
チラーゼで遺伝子に内在しているＥｃｏＲ１サイトをメ
チル化し、Ｔ、ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端となし、
さらにこの両末端にＥｃｏＲＩリンカ−を付着させた後
、制限酵素Ｅｃ。

ｒｌｌで消化し、これを電気泳動によってサイズを分画
するとともに過剰に加えたリンカ−を除去後、さらにフ
ァージベクターλｇ　ｔ　１．　ｌに連結することによ
って肝臓組繊から調製したｍ−１’？　Ｎ　Ａを用いて
なるλｇａｌｌベクターに組み込んだＣＤＮＡライブラ
リーが調製できる。さらにこのようなライブラリーを用
いて、例えばヒト肝臓組繊から調製したｍ−ＲＮＡを用
いてλｇｔｌｌベクターに組み込んで得たライブラリー
を、公知のＧＳＨＰｘ遺伝子を参考としてセレノシステ
ィンをコードするＴＧＡを含んだ数十ないし数百の塩基
を合成してプローブとして用いればよく、筒便には既知
のマウスＧＳＨＰｘ遺伝子を参考としてセレノシスティ
ンをコードするＴＧＡを含んだ塩基、例えばそのＮ、を
端Ｃｙｓから数えて３１番目のアミノ酸（Ｓｅｔ）から
５７番目のアミノ酸（Ａｓｎ）までをコードする８１ｍ
ｅｒの合成オリゴヌクレオチドをプローブとして用いて
スクリーニングする。

ヌクリーニングにあたり、例えばλｇｔｌｌヘクターに
組み込んで得たライブラリーを、宿主菌（エシェリヒア
・コリーＬＥ３９２）に感染させ寒天培地上で増殖、溶
菌せしめ、溶菌した培地表面にナイロンメンブランフィ
ルタ−を載せてファージを吸着せしめ、さらにフィルタ
ーをアルカリ処理してＤＮＡを変性し、中和した後８０
°Ｃで６０分間焼付けてＤＮＡを固定し、このフィルタ
ーをプレハイブリダイゼイション液（例えば５ＸＤｅｎ
ｈａｒｔ　　？夜、　５　　Ｘ　　Ｓ　　Ｓ　　Ｃ（Ｓ
ｏｄｉｕｍ　　Ｃｈｌｏｒｉｄｅ　　十Ｓｏｄｉｕｍ　
Ｃ１ｔｒａｔｅ）　、５０　ｍＭリン酸ナトリウム、Ｐ
Ｈ６，５，０，１％ＳＤＳ　（ラウリル硫酸ナトリウム
）、２５０μｇ／ｍｌ非相同性ＤＮＡ、５０％ホルムア
ミド）中で４２°Ｃ１６０分間保温し、この液に２２Ｐ
でラヘルした上述の如くのＤＮＡプローブを加え、４２
℃、−夜ハイブリダイズさせ、その移譲フィルターを室
温で２ＸＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ中で３回および５０°
Ｃで０．ｔｘｓｓｃ、０．１％ＳＤＳ中で洗浄し、通風
乾燥して、オートラジオグラムをとり、シグナルの出た
位置にあるプラークを回収し、再度プレートにまき、プ
ラークを純化して、目的とするｈ−ＧＳＨＰｘ遺伝子を
含むファージクローンをスクリーニングする。さらにこ
のようにしてスクリーニングされた純化ファージは、次
いで宿主に感染させ、液体培地中で一夜培養し、培養後
遠心して上清を回収し、これに等量の２．５ＭのＮａＣ
ｌ含有２０％ポリエチレングリコールを加え、水冷し、
１５０００ｒｐｍ、２０分間遠心し、沈澱物をＳＭ　（
０゜１ＭＮａｃｌ／８ｍＭＭｇ５Ｏ，１５０ｍＭ　　ト
　リスｐ　１４７　、　５　／　０　、　０２％ゼラチ
ン水溶液）に）容解し、フェノール抽出してＤＮＡを抽
出し、この抽出したファージＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉで消化し、精製してｈ−ＧＳＨＰｘ遺伝子を含む挿入
断片となし、この断片を、プラスミドｐＵｃｌ１８のＥ
ｃｏＲ［サイトにライゲイジョンしてサブクローニング
すればよく、このようにしてプラスミドｐＵｃ１１８の
ＥｃｏＲＩサイｌ−ｈ　−Ｇ　ＳＨＰ　ｘ遺伝子を含む
挿入したプラスミドｐＵｃ１１１３−ＧＰＡを得る。な
おこのようなサブクローニングにおいて、上記のプラス
ミドｐＵｃ１１Ｂの代わりに適宜な制限酵素サイトを有
するプラスミ　ドＰＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣ
ＹＣ１８４、ｐＵｃ１２、ｐＵｃ１８、ｐＵｃ１９等の
エシェリヒア属に属する微生物を宿主とするプラスミド
を選択してもよく、その他バチルス・ズブチリスを宿主
とするプラスミドＰＵＢＩＩＯ，ＰＣ１９４等を用いて
もよい。

さらにこのｈ−ＧＳＨＰｘ遺伝子を含む挿入したプラス
ミドル　ＵＣ１１Ｂ−ＧＰＡが、目的とするｈ−ＧＳＨ
Ｐｘの活性を発現することの確認のために、適宜有効な
発現ベクターを構築すればよい。このような発現ベクタ
ーを構築するにあたり、宿主微生物としてエシェリヒア
属に属するエシェリヒア・コリー（大腸菌）、例えばエ
シェリヒア・コリーＤＨＩ、同ＨＢ　Ｉ　Ｏｈ同ＭＶ１
３０４、同Ｗ３１１０、同Ｃ６００株等に適する発現プ
ラスミド、例えばプラスミドｐｌＮ［、ｐｌＮ■等を使
用してもよく、またバチルス・ズブチルスを宿主微生物
とする場合には、例えばプラスミドｐＴＵ８２１　Ｂ、
ｐＴＵ８２８５等の発現用プラスミドが使用でき、また
サツカロマイセス・セレビシア等の酵母を宿主とする例
えばプラスミドｐＡＭ８２等の発現用ベクターを使用し
てもよく、さらにＳＶ４０ウイルスの後期ブロモターで
外来遺伝子を発現させるウィルスベクター例えばプラス
ミドｐＳＶＬ　（ファルマシア社製）やプラスミドｐＳ
Ｖ２−ｄｈｆ　ｒ　（ＢＲＬ社）を使用してなる動物細
胞、例えばサル腎（ＣＯ３）細胞やチャイニーズハムス
ターオバリー（ＣＨＯ）ｔａ胞、さらにまたＣＨＯ−ｄ
ｈｆｒ（葉酸還元酵素欠損）株細胞等を宿主として構築
すればよい。またこのような発現ベクターを用いる場合
、前記と同様にベクターを制限酵素で切断消化し、挿入
すべきｈ−Ｃ３ＨＰｘ遺伝子を含むＤＮＡ断片のサイト
とライゲイジョンできるように、適宜いずれかのサイト
を付加または削除するかし“ζ常法により調製し、組換
えに使用すればよい。

例えばこのような発現ベクターを構築するにあたり、目
的とするｈ−ＧＳＨＰｘの活性を発現することの確認の
ためにＣＨＯ細胞による発現を行うに、まずｈ−ＧＳＨ
Ｐｘ遺伝子を含む挿入したプラスミドｐＵｃ１１Ｂ−Ｇ
ＰＡを制限酵素で消化、切断してｈ−ＧＳＨＰｘ遺伝子
を含むＤＮＡ断片を得、次いでプラスミドｐｓＶ２−ｄ
ｈｆｒ中のｄｈｆｒ遺伝子部分の代わりに挿入する。こ
の様にしてＳＶ４０の初期遺伝子のブロモターの下流に
連結して作成したｈ−ＧＳＨＰｘ遺伝子発現用ＤＮＡ断
片を、再びプラスミドｐＳＶ２−ｄｈｒｒのＥｃｏＲＩ
サイトに挿入して、発現用ベクターであるプラスミドｐ
　５Ｖ−ＧＰＡ−（ｌ　ｈ　ｆｒを得る。

次いでこのようにして調製した発現ベクターを宿主生物
に移入する方法としては、例えばリン酸カルシウム法に
よってＣＯ３細胞やＣＨＯ細胞等に直接上記の如くして
得られた発現用プラスミドヘククーの移入を行うか、そ
の他公知の宿主生物に移入する方法であるコンピテント
セル法、ポリエチレングリコール法を用いて形質転換体
を得ればよい。

このようにしてＣＨＯ細胞等に直接プラスミドｐＳＶ　
−ＧＰＡ−ｄ　ｈ　ｒ　ｒを保持せしめた形質転換体は
、常法によるＣＨＯ細胞等動物細胞の組織培養の手段を
使用してセレンを含有する培地を用いて培養すればよ（
、例えばＣＨＯ細胞の組織培養の培地、例えば、ダルベ
ンコ変法イーグルＭＥＭ培地＋１０％牛脂児血清＋０．
０１〜０．０５μＭ亜セレン酸を存する培養器、簡便に
はシャーレに、形質転換体を１０’個／Ｃｍ２程度１１
ｉ種して、２〜６日間、３０〜３７℃にて培養した後、
培養細胞を回収゛して細胞を破砕し、その上清を回収し
て目的とするｈ−ＧＳＨＰｘの活性を確認し、ｈ−ＧＳ
ＨＰｘが発現されたことを確認し、さらに適宜公知酵素
の回収、精製手段を利用して、目的とするｈ−ＧＳＨＰ
ｘを回収すればよい。このようにして得られたｈ−ＧＳ
ＨＰｘ含有溶液は、例えば減圧濃縮、膜濃縮、硫安や硫
酸ナトリウム等での塩析処理、メタノールやエタノール
、アセトン等の親水性有機溶媒での分別沈澱等の手段を
適宜選択し、組み合わせて行い沈澱せしめ、さらにこの
ｈ　−Ｇ　Ｓ　ＨＰ　ｘを含有する沈澱物を、必要に応
じて精製すればよく、例えばこの沈澱物を水または緩衝
液に溶解し、透析膜にて透析して、より低分子量の不純
物を除去してもよく、また吸着剤やゲル濾過剤等による
イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィ
ー、やゲル濾過によりｔ＃製してもよく、精製ｈ−ＧＳ
ＨＰχは凍結乾燥して保存すればよい。

さらにこのｈ−ＧＳＨＰｘを生産する遺伝子を有するプ
ラスミドｐＵｃ１］８−ＧＰＡは、これをエシェリヒア
・コリー　ＤＨＩに保持せしめてエシェリヒア・コリー
　ＤＨｌｐＵＣｌ　１８−ＧＰＡ株と命名し、これを工
業技術院微生物工業技術研究所にブタベスト条約に基づ
く国際寄託にて［微工研条寄第１９０３号（ＦＥＲＭ　
　ＢＰ−１９０３）Ｊとして寄託した。

またこのプラスミドを用いることにより、第３図に示さ
れるｈ−ＧＳＨＰｘ遺伝子を含むポリＡテールから伸び
た全長９５１塩基対の遺伝子を得ることができるもので
、この第３図に示されるｈＧＳＨＰＸ遺伝子を含むポリ
Ａテールから伸びた全長９５１塩基対の遺伝子は、開始
コドン（５２〜５４位のＡＴＣ；）から停止コドン（６
２２〜６２４位のＴＡＧ）を含むオープンリーディング
フレームを有するものであることが明らかである、なお
この遺伝子は、シークエンサーキットを用いて塩基配列
を決定されたものである。

さらに目的とするｈ−ＧＳＨＰｘは、第１図に示される
少なくとも１８９個のアミノ酸からなるポリペプチドを
コードするもので、この第１図中、Ｘ＋は水素原子、ア
セチル茫、メチオニンまたはメチオニンを含むシグナル
ペプチドを示してもよく、またこの構造遺伝子において
、既知（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃ
ｈ、Ｖｏｌ、１５．Ｎｏ、１７．ＰＰ７１７８（１９８
７）〕のヒト肝臓由来ｈ−ＧＳＨＰｘとはヌクレオチド
で６１．０％、アミノ酸で６６．１％の相同性を示す新
規な遺伝子であることが明らかで、また第１図に示され
るｈ−ＧＳＨＰｘを構成するポリペプチドの塩基配列は
、５゛末端側より第２図における塩基ｌから５６７位で
表わされ、セレノシスティンをコードするオパールコド
ン（ＴＧＡ）を有する新規な遺伝子であることが明らか
で、この第２図の５“末端側たるＧＣＴの上流コドンが
アミノ酸をコードするコドンであればいずれでもよく、
さらにその５゛末端側にアミノ酸をコードするコドンを
１個以上有してもよいが、好ましくはＡＴＧまたはシグ
ナルペプチドに対応するポリデオキンリボ核酸を挙げる
ことができ、また３゛末端側たるＡＴＡの下流コドンは
翻訳停止コドンまたはアミノ酸、ペプチドをコードする
コドンであればいずれでもよ（、さらにその３°末端側
にアミノ酸、ペプチドをコードするコドンを１個以上有
する場合にはこのコドンの３°末端側にさらに翻訳停止
コドンを有することが好ましい。

この新規なｈ−ＧＳＨＰｘを構成するポリペプチドのア
ミノ酸配列をコードしたＤＮＡを発現させることにより
、生産された目的とするｈ−ｃｓＨＰｘのポリペプチド
のアミノ酸配列は、そのＤＮＡの塩基配列から決定でき
、また液相プロティン・ンークエンサー（ヘノクマン社
製）にテｈＧ　Ｓ　ｔ（Ｐ　ｘのポリペプチドのＮ末端
を構成するアミノ酸配列を決定し、ＤＮＡ塩基配列から
決定したアミノ酸配列とＮ末端部分にて一敗することを
確認したもので、その結果、目的とするｈ−ＧＳＨＰ　
ｘを構成するポリペプチドが少なくとも前記した式（１
）で表わされるアミノ酸配列である。

また上記のＣＨＯ細胞を用いる代わりに宿主として微生
物を用いて適宜な発現用ベクターを用いて形質転換体を
得てもよく、このような微生物形質転換体を用いてｈ−
ＧＳＨＰｘを得るに、例えばエシェリヒア属に属する微
生物に形質転換せしめればよく、このようにして得られ
た形質転換体である微生物は、目的とするｈ−ＧＳＨＰ
ｘを発現せしめるために培養するが、培養の形態は液体
培養で行えばよく、工業的には深部通気撹拌培養を行う
のが有利である。培地の栄養源としては、微生物の培養
に通常使用されるものが広く使用でき、微生物の同化可
能な炭素源、例えばグルコース、シュクロース、糖蜜、
グリセリン、スターチ加水分解物等が使用され、窒素源
としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えばコ
ーン・スチーブ・リカー、大豆粉、カゼイン加水分解物
、ペプトン、種々の肉エキス、酵母エキス、硫安、塩化
アンモニウム等が使用され、その他、ナ１リウム、カリ
ウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、マンガン、亜鉛
、銅等とのリン酸塩、塩化塩、硫酸塩、炭酸塩、硝酸塩
等との水溶性塩を添加してもよく、さらに亜セレン酸を
培地中に０．０５〜１０ｔＩＭ程度添加する。培養温度
は、微生物が生育し、ｈ−ＧＳＨＰｘを生産する範囲で
適宜変更できるが、エシェリヒア属に属する微生物の場
合、好ましくは２０〜４２°Ｃ程度である。培養時間は
、条件によって多少異なるが、ｈ＝ＧＳＨＰＸが最高収
量に達する時間を見計らって適当な時期に培養を収量す
ればよく、通常は１２〜７２時間程度である。次いで培
養後、ｈ−ＧＳＨＰｘは、菌体を含む培養液そのままを
採取して分離、精製すればよい、ｈ−ＧＳＨＰｘが菌体
内に存在する場合には、得られた培養物を濾過または遠
心分離等の手段にて菌体を回収し、次いでこの菌体をボ
ールミルや超音波による機械的破砕方法やリソチーム等
の酵素的破砕方法で破砕し、必要に応してキレート剤や
界面活性剤を添加してｈ　−Ｇ　Ｓ　ＨＰｘを可溶化し
て分離採取し、前述の分離、精製手段を適宜選択組み合
わせて分離、精製すればよい。　このようにして得られ
たｈ−ＧＳＨＰｘの活性は、その１０μ！溶液を、Ｏ，
ＩＭ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）、０．２ｍＭ還元
型ＮＡＤＰ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭのグルタチ
オン、１単位のグルタチオン・リダクターゼを含有する
反応液０．９８ｍ１に混合し、１０μｌ（最終濃度７０
μＭ）の過酸化ブタノール（Ｂｕｏ　０　Ｈ）を添加し
、３７゛Ｃで還元型ＮＡＤＰの酸化による減少量を３４
０ｎｍの波長にて吸光度測定した結果、目的とするｈ−
ＧＳＨＰｘ活性を発現したもので、ＧＳＨＰｘが産生さ
れたことを確認した。

なお本明細書におけるアミノ酸、ペプチド、塩基、その
他に関する略号は、それらの当該分野における慣用略号
に基づ（もので、また全てのアミノ酸はＬ体を示す。

以下に本発明の参考例および実施例を挙げて具体的に説
明するが、本発明は何らこれにより限定されるものでは
ない。

〈実施例１〉 ヒト肝Ｋ１ｌ１１０ｇを液体チン素中で粉末にし、４０
ｍ１の６門グアニジンイソチオシアネート中でホモジナ
イズしたのち、１８．５ゲージの太さの注射針を通して
高分子ＤＮＡを切断し粘度を下げた。ホモジナイズを３
分の１容の５．７Ｍ塩化セシウム、０．１ＭＥＤＴＡ　
（ｐＨ７，５）の溶液上に重層し、３５．００Ｏｒｐｍ
　・２５°Ｃで１８時間遠心した。遠心後、沈澱を少量
のエタノールで洗浄し、過剰の塩化セシウムを除いた後
、水１　ｍｌに溶解し、１０分の１容の３Ｍ酢酸ナトリ
ウムおよび２．５倍容のエタノールを加えて遠心し、沈
澱を集め、減圧乾燥した。この様にして粗ＲＮ　Ａ５　
ｍｇを得た。

この沈澱を１．５−の水に溶解後、６５°Ｃで５分間保
温し、急冷して１．５ｍＭの４０ｍＭ　）リス−塩酸（
ｐ　Ｈ７，６）　、１．ＯＭＮ　ａ　ＣＬ　２ｍＭＥＤ
ＴＡ、　０．２χＳＤＳを加えた。この溶液全量を２０
ｎＭ　）リス−塩酸（ｐＨ７，６）　、０．５ＭＮａ　
Ｃ＋、　１．ｍＭ　ＥＤＴＡおよび０．１χＳＤＳで平
衡化した７５＋ｍｇのオリゴ（ｄＴ）−セルロース（フ
ァルマシア社製）カラムに吸着させた。１０ｍ１の同じ
溶液で洗浄した後、５ｄの２０ｍＭ　）リス−塩酸（ｐ
　Ｈ７，６）　、０．ＩＭＮ　ａ　Ｃ！、１ｍＭＥＤＴ
Ａおよび０．ｌＸ５ＤＳｔ容液でポリ　（Ａ）゛ＲＮＡ
以外のＲＮ　Ａを溶出させた。次に１０ｍＭトリス−塩
酸（ｐ　Ｈ７，５）　、１ｍＭ　Ｅ　ＤＴＡ、　０．０
５！　ＳＤＳの？容？ｆｆＬでポリ　（Ａ）’ＲＮＡを
？８出させ、始めに溶出してくる１　ｒｎｌを分画した
。これに１０分の１容の３Ｍ酢酸ナトリウムおよび２．
５倍容のエタノールを加え、−２０°Ｃで一晩放置し、
１５．ＯＯＯｒｐｍ　・３０分の遠心で沈澱を集め、減
圧乾燥した。

この様にしてポリ（Ａ）’ＲＮＡ５０μｇを得た。

〈実施例２〉 実施例１で得たポリ（Ａ）”ＲＮＡを１μｇ／μｌにな
るように水にン容解し、その５μｉをマイクロチューブ
に移し、６５°Ｃで５分間加熱し、急冷した後に、これ
に５０ｍＭ　）リス−塩酸（ｐＨ８，３）　、１０＋ｗ
ＭＭｇＣＩｚ　、１４０＋Ｍ　ＫＣＬ　１０ｍＭジチオ
スレイトールおよび２ｍＭのｄＮＴＰｓ　（ｄＡＴＰ、
ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰの等量混合物）、５μｇ
のオリゴｄＴ（ファルマシア社製）と１５ｍ位の逆転写
酵素（全酒造社製）を加え、全量を２０μ２とし、４２
”Ｃで１時間反応させた。その反応液に８０１トリス−
塩酸（ｐ　Ｈ７，５）　、２００ｍＭ　ＫＣＩ、１０ｍ
ＭＭｇ　Ｃｌｘ　、２５＃ｇ　／ｍ１ＢｓＡにＲＮａｓ
ｅＨ（全酒造社製）６０単位およびＤＮＡポリメラーゼ
ｌ　（ヘーリンガーマンハイム社製）５１ｔ１位を加え
て総量を１５０μｌにし、１２゛Ｃで１時間反応させた
のち、２２°Ｃで１時間反応させた。２０　ｕ　ｆ（７
）０．２５Ｍ　ＥＤＴＡと１０μ、ｆｆ（７）１０２　
ＳＤＳを加えて反応を停止した後、等量のフェノール−
クロロホルムを加え、１０．００Ｏｒｐｍ　　・５分間
遠心し、水層を分取した。それに等量の４門酢酸アンモ
ニウムと２倍のエタノールを加え、１５，０００ｒｐｍ
・１５分間遠心し、沈澱を集め減圧乾燥した。沈澱に１
００ｍＭ　　ｌ−リス−塩酸（ｐ　Ｈ８，０）　、１０
ｍＭＥ　ＤＴＡ、８０μ？ＩＳ−アデノシルメチオニン
、１００　μｇ／ｍｊ！ＢＳＡおよび２単位のＥｃｏＲ
１メチレース（プロメガバイオチック社製）を加え、１
０μｌとし、３７°Ｃで１時間反応させた。反応後、反
応液に４０μ２の水を加え、等量のフェノール−クロロ
ホルムで処理し、遠心により分取した水層に、等量の４
Ｍ酢酸アンモニウムと２倍のエタノールを加え、−７０
’Ｃで１５分間放置した。１５，０００ｒｐｍ　　−１
５分間遠心後の沈澱物に６７ｍＭ　）リス−塩酸（ｐＨ
８，８）　、６．７ｍＭ　Ｍ　ｇ　ＣＩ□、１６．６ｍ
Ｍ硫酸アンモニウム、ｌ０ｍＭ　２−メルカプトエタノ
ール、６．７　μ門ＥＤＴＡ、０．１６７χＢＳＡ、各
７５０　μ門ｄＡＴＰ、ｄＣ，ＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴ
ＰおよびＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）４単位
加え、全量を１２μρとし、３７°Ｃで１時間反応させ
た。等量のフェノール−クロロホルム液で処理し、エタ
ノール沈澱し、遠心によって沈澱物を回収し、減圧乾燥
した。１μｇのＥｃｏＲＩリンカ−に５０ｍＭ　トリス
−塩酸（ｐＨ７，６）　、１０ｍＭＭｇＣｌｚ　、１０
ｍＭジチオスレイトール、０．１ｍＭスペルミジン、０
．１１ＥＤＴＡ、１ｍＭＡＴＰおよび３単位のＴ４ポリ
ヌクレオチドカイネース（宝酒造社製）を加え、全量を
１０μｌとし、３７°Ｃで３０分間反応させた。

これをＴ４ＤＮＡポリメラーゼ処理後のサンプルに全量
加え、６０単位のＴ４リガーゼ（ファルマシア社製）を
加え、１４°Ｃで一晩反応させた。この反応液に１００
ｍＭ　Ｎ　ａ　Ｃｌ　、５０ｍＭ　トリス−塩酸（ｐＨ
７，５）　、１０ｍＭＭｇ　ＣＩｇ　、７ｍＭ　２−メ
ルカプトエタノール、１００　μｇ／成りＳＡおよび２
５０単位のＥｃｏＲＩを加え、全量４０ｕｌにて、３７
°Ｃで２時間反応させた。この反応液を１ｚ低融点アガ
ロースゲルにて分画し、６００−２０００ヘースのＤＮ
Ａを含むゲルを回収した。６５°Ｃで１０分間保温し、
ゲルを融解した後、等量のフェノールを加え、１０分間
水冷後、＋５，０００ｒｐ＋ｍ　　・４°Ｃで１０分間
遠心した。水層に等量のフェノールを加え操作を繰り返
し、再々度フェノールで処理した後、水層をクロロホル
ムで処理し、１０分の１容の３Ｍ酢酸す１−リウムおよ
び２．５倍容のエタノールを加え、７０゛Ｃに放置した
。１５，０００ｒｐｍ−１５分間遠心した後、沈澱を７
５χエタノールで２回洗浄し、減圧乾燥した。それにラ
ムダファージベクターλｇｔ！ｌアーム（ストラドジー
ン社製）を１μｇ加え、ライゲーシゴンキット（宝酒造
社製）を用いて、２６°Ｃで１０分間反応させた。反応
後のサンプルはインビトロバノケージングキノト（スト
ラドジーン社製）を用いて反応させた。得られたλファ
ージを大腸菌ＬＥ３９２に怒染させ、総数を調べたとこ
ろ、８．Ｏｘｔｏ’　ｐ　ｒ　ｕ　（ｐｌａｑｕｅ　ｆ
ｏｒｍｉｎｇＵ旧（）よりなっていた。

〈実施例３〉 作製したヒト肝臓、ｃＤＮＡライブラリー８．０ＸＩＯ
’　ｐ　ｒ　ｕを大腸菌ＬＥ３９２　　（ストラジーン
社から購入）を指示菌として、１．５χＬＢ寒天培地（
１１につき、バクトドリブトンＬｏｇ　、バクトイ−ス
トエキストラクト５ｇ、　Ｎａ　Ｃ１１０ｇ　）上にひ
らき、プラークハイブリダイゼーション法を用いて、Ｇ
ＳＨＰχ遺伝子のクローンの選択を行った。

Ｌ　Ｂプレート上に溶菌したプラークをナイロン膜上に
移してから、膜を０．５ＭＮ　ａ　ＯＨ，１，５ＭＮ　
ａ　Ｃ１で５分、３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，５）で
５分処理した後、８０゛Ｃ減圧下で２時間乾燥した。次
にこの膜をビニール袋にいれ、１０成の５倍濃度ＳＳＣ
（１倍：　１５０ｍＭ　Ｎ　ａ　Ｃ１、１５ｍＭクエン
酸ナトリウム）、５倍デンハルト液（０，０２Ｘフイコ
ール、０．０２χポリビニルピロリドン、０．０２χＢ
ＳＡ）、５０ｍＭ’Ｊ　７酸す）ｌＪ’７ム（ｐＨ６，
５）、０．１ＸＳＤＳ、２５０９８７ｍｌサケ精子ＤＮ
Ａ、５０χホルムアミド中で、４２°Ｃ・６０分間保温
した。液を除いてから、５　端をｙｔｐでラベルした合
成オリゴヌクレオチド（１０’　ｃｐｍ／μｇ　）　、
５°ＧＴＴＣＡＴＣＴＣＧＧＴＧＴＡＧＴＣＣＣＣ，Ｇ
ＡＴＣＧＴＧＧＴＧＣＣＴＣＡＧＡＧＡＧＡＣＧＣＧＡ
ＣＡＴＴＣＴＣＡＡＴＧＡＧＣＡＧＣＡＣＣＴＴＧＣＣ
ＣＣＧＣＡＧＧＧＡ３′　（この合成オリゴヌクレオチ
ドはマウスＧＳＨＰχのセレノシスティンをコードして
いる領域を含むアミノ酸部分（Ｓｅｒ、　Ｌｅｕ、　Ａ
ｒｇ＋　ｃｔｙ、　Ｌｙｓ、　Ｖａｔ、　Ｌｅｕ、　Ｌ
ｅｕ、　［ｌｅ、　Ｇｌｕ、　Ａｓｎ＋Ｖａｌ、八ｌａ
、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ｓｅｃ、Ｇｌｙ＋Ｔｈｒ、Ｔｈｒ＋
　Ｉｌｅ、Ａｒｇ、ＡｓｐＴｙｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ｍ
ｅｔ、Ａｓｎ　）をコードする塩基配列である。）を２
０ｎｇ上液に加え、４２°Ｃで一晩ハイフリダイズさせ
た。その後フィルターを２倍５ＳＣ５０，ｌχＳＤＳで
室温で３回、５０°Ｃで１０分洗浄後、さらに０．　１
倍５ＳＣ１０，１χＳＤＳで５０°Ｃで１０分洗浄し、
通風乾燥し、オートラジオグラムを行った。゛シグナル
の出た位置の培地をくり抜き、ＳＭ　（０，ＩＭＮａ　
Ｃｌ、８ｍＭ　Ｍｇ　Ｓｏ、　、５０ｍＭトリス−塩酸
（Ｐ　Ｈ７，５，０，０１χゼラチン）で希釈し、ＬＢ
プレートにひらき直し、同しプローブでスクリーニング
を繰り返し、プラークを純化した結果、１０株のクロー
ンを得た。

〈実施例４〉 実施例３で得た組換え体ラムダファージを宿主菌ＬＥ３
９２に感染させ、ＬＢＢ地１０ｍ１中で一晩浸とう培養
した。８．　ＯＯＯｒｐｍ・１０分遠心後の上清に、６
０単位のＤＮａｓｅｌ（宝酒造社製）および、＋００　
ｕｇのＲＮａ　ｓ　ｅＡ　（シグマ社製）を加え、３７
°Ｃで３０分間保温した。これに等量の２０χポリエチ
レングリコール、２．５ＭＮ　ａ　Ｃｌを加え、１時間
水冷した後、１５．ｏｏＯｒｐｍ　　・２０分遠心し、
沈澱を得た。この沈殿を０．５ｍｌのＳＭに混濁し、等
量のフェノールを加えて処理し、遠心後の水層をクロロ
ホルム−フェノールを加えて処理し、１０分の１容の酢
酸ナトリウムおよび２倍容のエタノールを加え一７０°
Ｃに１５分放置した。　１５，０００ｒｐ１１　　・１
５分の遠心にて回収した沈澱を７５２エタノールで２回
洗浄し、減圧乾燥した。５μｇ／ｍ１ＲＮａ　ＳｅＡを
含む水５０μβに沈澱を溶かし、１０μｉをＥｃｏ、Ｒ
［で完全消化して挿入断片を調べると、約１ｋｂの最長
の断片を有する、ヒ）Ｏ３ＨＰ、クローンが得られた。

ＥｃｏＲＩ消化後に得られた約１ｋｂの挿入断片を低融
点アガロースゲルから回収した。ベクターｐＵｃ１１８
をＥｃｏＲＩで完全消化した後、５０ｄ）リス−塩酸（
ｐＨ８，０）中にバクテリアアルカリホスファターゼ（
東洋紡績社製）を０．５単位加え、６５゛Ｃで１時間反
応させた。クロロホルム−フェノール液で２回処理した
後、水層に１０分の１容３Ｍ酢酸ナトリウムおよび２倍
容のエタノールを加え、遠心してベクターを回収した。

ゲルから回収した挿入断片とＥｃｏＲ１消化したベクタ
ーｐＵｃ１１Ｂを、ライゲーションキット（宝酒造社製
）を用いて連結させた。　１００　ｄのψ培地（１ｆｆ
ｉにつきバタトトリプトン２０ｇ、バクトイ−ストエキ
ストラクト５ｇ、　Ｍ　ｇ　５０．１４ｇ　、　ｐ　Ｈ
７，６）で培養した対数増殖期の大腸菌ＭＶ１３０４（
宝酒造社から購入）を集菌し、４０ｍ１の水冷した３０
ｍＭ酢酸カリウム、１００ｎ＋Ｍ　ＲｂＣｌ、１０ｍＭ
Ｃａ　Ｃ１，，５０ｍＭＭｎＣ１２および１５χグリセ
リン（ｐｌ＋５．　８）で？−，？Ｑした後、０°Ｃで
５分間放置後遠心集菌し、さらに４　ｍｌの１０ｍＭＭ
　ＯＰ　３１１衝′ａ（ドータイ社製）　、７５ｍＭＣ
ａＣ＋２．１０ｍＭＲｂＣｌおよび１５χグリセリン（
ｐＨ６，５）に懸濁し０°Ｃで１５分間放置してコンピ
テント細胞とした。この大腸菌ＭＦＡ液２００ｕｆにラ
イゲーションしたＤ　Ｎ　Ａ　？８？Ｆ１２０μｆを加
え、０°Ｃで３０分間放置した。４２°Ｃ９０秒間熱処
理し、ＬＢ壇境地８００ｕｌ加え、３７°Ｃ６０分間保
温した。この３００　μ！をアンピシリン５０μｇ／成
、０．０２Ｘ　Ｘ−ｇａｌ　（５−ブロモ−４−クロロ
−３−インドリル−β−ガラクシド）および５０μＭＩ
ＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオーガラクトビラノ
ンド）を含んだＬＢＢ天プレートにまき、−晩培養して
形質転換体を得た。形質転換した単一の白コロニーを２
　ｍｌのＬＢ培地で一晩培養し、遠心により集菌した。

これに１ｍｇ／ｍ１リゾチーム（シグマ社製）を含む５
０ｆｆｉＭトリスー塩酸（ｐ　Ｈ８，０）　、５０ｍＭ
ＥＤＴＡ　（ｐ　Ｈ８，０）　、１５χシａｔ唐を０．
６　ｍＱｊＪ口え、３７°Ｃで１５分反応させた後、ｌ
ＯχＳＤＳを１２μｉを加え混ぜ合わせた後、５Ｍ酢酸
カリウムを６０μ２加え、０°Ｃで３０分間放置した。

１０，０００ｒｐｍ　・１５分間遠心し、上清に等量の
クロロホルム−フェノールを加えて処理し、水層をエー
テルで２回処理してから、２倍容のエタノールを加え、
７０゛Ｃで１５分間放放置た。１５，０ＯＯｒｐｎ　　
・１５分間遠心して沈澱を回収し、７５Ｘエタノールで
２回洗浄後、減圧乾燥した。沈澱を５μｇ／ｄＲＮａｓ
ｅを含む水に溶き、ＥｃｏＲＩで消化して、挿入断片を
含むクローンを選別した。

〈実施例５〉 このクローンを含む単一コロニーを６　ｍｌのＬＢ液に
て３７°Ｃで一晩培養後、その５雁を５００雁のＬ　Ｂ
液に植菌し、３７°Ｃで培養した。対数増殖期の菌液に
２０μｌ７ｍ１のクロラムフェニコールを加え、さらに
−晩培養した。６．０００ｒｐｍ・１０分の遠心により
集菌し、１５ｍの８χシヨ糖、１０χ　トリトンＸ、２
５ｍＭ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ、５０ｍＭ　トリス−塩酸（Ｐ
Ｈ８，０）および０．２５と　トリス−塩酸（ｐ　Ｈ８
，０）に溶解した１０ｍｇ／　ｄのリゾチーム１．５ｍ
ｌを加え、加熱により溶菌させた。１４，０ＯＯｒρｍ
　・３０分の遠心後の上清に、等量のクロロポルム−フ
ェノールを加えて処理し、水層に１０分の１容の卦酢酸
ナトリウムと２倍容のエタノールを加えて、−７０°Ｃ
で１５分放置した。３．　ＯＯＯｒｐｍ・１５分の遠心
にて回収した沈澱に、２１ｍ１のトリス−塩酸（ｐＨ７
，４）を加えて溶解し、２０ｇの塩化セシウムおよびＬ
ｏｎｇ／　ｍｌのエチジウムブロマイドｌＩｎ１を加え
、５０．００Ｏｒｐｍ　　・４“Ｃにて一晩遠心した。

遠心後間環状プラスミドＤ　Ｎ　Ａを分取し、エチジウ
ムブロマイドを除くために等量のブタノールで３回処理
した。さらに、０．２門ＮａＣ１を含んだトリス−塩酸
（ｐＨ７，４）を洗浄したＣＬ４Ｂセファロースゲル（
ファルマシア社製）にて、サンプルをゲル濾過し不純物
を除いた後、２倍容のエタノールを加えて、−７０’Ｃ
で１５分間放面した。３，０００ｒｐｎ＋　・３０分間
遠心し、沈澱を７５χエタノールで２回洗浄後、乾燥し
、濃度を１Ｍｇ／μ℃になるように調整した。得られた
プラスミドから、全領域にわたり、正負両頂の一本ｔ３
￥ＤＮＡを調整し、Ｍ１３ファージを用いたジデオキシ
法（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２１４　１２０５−１２１０　（
１９８１）　）を用いて決定した（第３図）。

更に、このプラスミド０．５μｇを前述のエシェリヒア
・コリＭＶ１３０４コンピテント細胞と同様に処理した
エシェリヒア・コリＤＨＩ（国立遺伝学研究所より分与
を受ける）コンピテント細胞に形質転換し、アンピシリ
ン５０μｇ／ｍρを含んだＬＢ寒天培地に接種し、−晩
培養して形質転換体を得た。このヒトＧＳＨＰｘを含む
プラスミドを大腸菌（エシェリヒア・コリー）　　ＤＨ
１ｐＵＣ１１８−ＧＰＡとした。

〈実施例６〉 このｈ−ｃＳＨＰｘ遺伝子を挿入したプラスミドｐＵｃ
ｌ　１８−ＧＰＡが目的とするｈ−ＧＳＨＰ、の活性を
発現することの確認のために、動物細胞で発現させるベ
クターを構築した。ｐＵｃｌｌ　Ｂ−ＧＰＡＤＮＡ１０
μｓをＨ緩衝ｌ夜（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏ１ｅｃｕ
ｌａｒ　Ｃｌｏｒｎｉｎｇ　＋ＩＯ虹、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐ
ｒｉｎｇ　１ｉａｒｂａｒ　　（１９８２）　）を用い
て１５単位のＥｃｏＲＩを加え全量を２０μ２として、
３７°Ｃ・２時間切断し、１χ低融点アガロース電気泳
動により、約９９０塩基対のＤＮＡ断片を抽出精製乾燥
した。これとは別にブルースクリプトＫＳ（ストラドジ
ーン社製）ＤＮＡＩμｇを１１緩衝液（前出）を用いて
、２単位のＥｃｏＲＩを加え全量を２０μＰとして、３
７°Ｃ・２時間切断した。１Ｍ　トリス−塩酸（ｐＨ８
，０）５μｅを蒸留水７５μｌを加えた後、１単位のバ
クテリアアルアルカリフォスファターゼで６５°Ｃ・１
時間処理した（以下ＢＡＰ処理と略す）。Ｗ”ｌのクロ
ロホルム−フェノールで２回処理した後、エタノール沈
澱でＤＮＡを回収し、減圧乾燥した。９９０塩基対のＤ
ＮＡ断片とＢＡＰ処理したベクターとを１７μｌの水に
溶解し、１０倍濃度のライゲーション緩衝液（前出、Ｐ
２４６）２μｌとＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製、３
５０１／μＱ）１　μｉを力ｎえ、１４゛Ｃで一晩放置
した。コンピテント化した大腸菌Ｄ　Ｈ−１２００μｌ
に、上で反応したＤＮＡ液を加え０°Ｃ・３０分間放置
後、４２°で９０秒置き、Ｌ培地８００μｌを加え、３
７’Ｃ・６０分間保温した。この１００μｌをアンピノ
リン５０μｇ／ｍを含んだし寒天培地にまき、３７°Ｃ
で一晩培養して形質転換体を得た。この様にして得られ
たクローンをブルースクリプトＫＳ−ＧＰＡとした。次
に、ブルースクリプトＫＳ−ＧＰＡＤＮＡＩＯμｇをＨ
緩衝液を用いて、１５単位のｔ（ｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩと
１５単位のＢａｍＨＩを加え全量を２０μ２として、３
７°Ｃ・２時間切断し、１χ低融点アガロース電気泳動
により、約１，０００塩基対のＤＮＡ断片を抽出精製乾
燥した。これとは別にｐＳＶ２−ｄｈｆ　ｒ　（ＢＲＬ
社製）ＤＮＡ１μｓをｌ］緩衝液を用いて２単位のＨｉ
ｎｄｌｌｌと２単位のＢｇｌ■を加え全量を２０μ２と
して、３７°Ｃ・２時間切断した。前述した如＜　ＢＡ
Ｐ処理を行ってベクターを得た。このベクターと約１，
０００塩基対のＤＮＡ断片を前述の如くライゲーション
反応と形質転換を行い、形質転換体ｐＳＶ２−ＧＰＡと
した。最後に、ｐ　Ｓ　Ｖ　２−Ｃ，ＰＡＤＮＡＩＯμ
ｇを８３３）重液を用いて、１５単位のＥｃｏＲｌを加
え全量を２０ｕｌとして、３７°Ｃ・２時間切断し、１
χ低融点アガロース電気泳動により、約２．９７０塩基
対のＤＮＡ断片を抽出精製乾燥した。これとは別に、ｐ
ｓＶ２−ｄｈｆ　ｒＤＮＡｌｕｇをＨ緩衝液を用いて２
単位のＥｃｏＲ［を加え全量を２０μｌとして、３７°
Ｃ・２時間切断し、前述した如＜　ＢＡＰ処理を行って
ベクターを得た。このベクターと約２，９７０塩基対の
ＤＮＡ断片を前述の如くライゲーション反応と形質転換
を行い、形質転換体ｐＳＶ２−ＧＰＡ−ｄ　ｈ　ｒ　ｒ
とした（第４図）。

〈実施例７〉 ｈ　　Ｇ　Ｓ　ＨＰ　ｘを継続発現させるために、前述
した方法で構築した発現ベクターｐＳ■２−ＧＰＡ−ｄ
ｈｒｒを、ＣＨＯｄ　ｈ　ｆ　ｒ−細胞へ遺伝子移入し
て形質転換細胞を育株した。２ＸＨＢＳ　（ＨＥＰＥＳ
１０ｇ／ｌ　Ｎａ　Ｃｌ　６ｇ／ｌ　ｐ　Ｈ７，１０）
２．５ｍｆｆ１と１ｏＯＸＰＯ４（７０ｍＭＮａＨｚ　
　ＰＯ＋　　＋７０ｍＭＮ　ａ　ｚ　ＨＰ　Ｏａ　）　
０．０５ｍｆｆ１とからなるＡ？ｆｆｌに対シテ、ｐＳ
Ｖ２−ＧＰＡ−ｄ　ｈ　ｆ　ｒＤＮＡｌｏｏ　ｕｇを含
む水溶液２．２ｍｌと２Ｍ　Ｃａ　Ｃ１２０，３ｍｌと
からなるＢ液を除々に空気注入しながら滴下し、ＤＮＡ
−リン酸カルシウム沈澱を生成させる。牛胎児血清１０
χを含むＨａ　ｍ　Ｆ　−１２培ｉｔ！！　（フロー社
製）ＩＭの中で増殖させたＣＨＯ−ｄｈｒｒ−細胞に上
述したＤＮＡ−リン酸カルシウム沈澱液ｌＩｄを添加し
、炭酸ガス濃度５χ・３７°Ｃで一晩放置する。同し培
地１０ｄで培地交換し、さらに２４時間培養する。最後
に選択培地として用いる透析した牛胎児血清ｌＯχを含
むＤ−ＭＥＭ培地（ギブコ社製）に交換し、４日に一度
づつ培地交換を行い約１ケ月間培養を続け、この選択培
地中で増殖する形質転換細胞ＣＨＯ−ＧＰＡ株を得た。

次にｈＧ　Ｓ　ＨＰ　ｘの細胞当りの発現量を増加させ
るために、メトトレキセート（シグマ社製）による遺伝
子増幅を行った。さきに得られた形質転換細胞ＣＨＯ−
ＧＰＡ株をメトトレキセート１彌ｉ、ｌｏｍＭ、１００
ｍＭを含有する１０χ生胎児血清入りＤ−ＭＥＭ培地で
各々培養した。４日に一度づつ培地交換を行い、約１ケ
月間培養を続け、メトトレキセート１００ｍＭで増殖し
てきた形質転換細胞ＣＨＯ−ＯＰＡ１００を得た。

〈実施例８〉 このＣＨＯ−ＣＰＡ　Ｉ　００株を直径１０ｃｍのプラ
スチックシャーレ５０枚を用いて、ＩＯ！牛脂児血清お
よび１００ｍＭのメトトレキセートを含むＤ−ＭＥＭ培
地で３日間培養した。培養した細胞約１０”を１００　
ｄの０．７１の２−メルカプトエタノールを含む１０ｎ
＋Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に懸濁し、川音破砕す
る。破砕液を１０．ＯＯＯｒｐｍ−１５分間遠心し、上
清を酵素精製原ｒ４とした。この溶液に硫安を加えて、
２５２から５０χの間で沈澱する部分を１５．ＯＱＱｒ
ｐｍ　・３０分間遠心して硫安沈澱を得た。この沈澱を
１０ｍ１の０．７ｍＭメルカプトエタノールを含む１０
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）再溶解し、５０倍量の
同じ緩衝液に対して３回透析した。透析内液をＤＥＡＥ
−セルロースＤＥ５２　（ワットマン社２．５　Ｘ２Ｏ
ｒ、ｍカラム）に吸着させ、同じ緩衝液に０〜１００ｍ
ＭのＮａＣ１濃度で作成したリニアーグラジェントで溶
出させる。ＮａＣＮ４度４５〜７５ｍＭの間で溶出した
酵素活性画分をａ縮した後、セファデックスＧ−２００
（ファルマシア社製、２×９０ｃｍ　）で分子ふるいを
行い酵素活性画分を得た。

この両分をＤＥＡＥ−セファデックス（ファルマンア社
製、　１．５　ＸＩＯｃｍ）に吸着させ、０．７＋ｎＭ
２−メルカプトエタノールを含む５ｍＭ　リン酸緩衝液
（ｐＨ７，０）に０−１００ｍＭのＮａ　Ｃｌａ度で作
成したりニアーグラジヱントでｔ６出させた。ＮａＣ１
′ａ度１０〜２０ｍＭの間で溶出された酵素活性画分を
同じ１１衝１夜の５０倍量に対して３回透析し、内）夜
を４１宿してｈ−ｃｓＨＰｘ標品とした。この標品の総
量をローリ−法（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、１９３．２
６３−２７５　、　　（１９５１））でタンパク質の定
量をしたところ、１１０　μｇのＧＳＨＰＸが得られた
。次に、この標品１μｇ、あるいは標準タンパク質とし
て、牛血清アルブミン（６８キロダルトン）、卵アルブ
ミン（４５キロダルトン）、キモトリプシノーゲン（２
４キロダルトン）、リヅチーム（１，１，４キロダルト
ン）、ＲＮＡ分Ａ？　ｔ’４素Ａ　（１３，７キロダル
トン）の各々５μｇを含む・？容、（！を０．１χＳＤ
Ｓと０．５？Ｉ２−メルカフ゛トエタノール存在下で９
５°Ｃ・２分間処理した。これらをラメリーの方法（Ｎ
ａｔｕｒｅ、２２７，６８０−６８５　、　（１９７０
））に従って５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動した
結果、分子量約２１キロダルトンのほぼ単一なバンドを
示した（第５図）。また、この０．１μεを０．１１ト
リス−塩酸緩衝液（ｐ　Ｈ８，０）　、０゜２ｍＭ還元
型ＮＡＤＰ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭのグルタチ
オン、１単位のグルタチオン・リダクターゼ（シグマ社
製）を含存する反応液０．９８ｍｆｆ１に混合し、１０
μｌ（最終濃度７０μｈ）の過酸化ブタノールを添加し
、３７°Ｃで還元型ＮＡＤＰの酸化による減少量を３４
０ｎｍの波長にて吸光度測定した。その結果、３７°Ｃ
−１分間に１μモルのグルタチオンを酸化型に変換する
活性を１ユニツトとした時に、０．１ユニツトの活性が
あった。最後に、この標品１０μｇを０．ＯＩ門５ＤＳ
ｉ容ン夜として、８９０ＭＥ型シーケンサー（ベンクマ
ン社製）によって、Ｎ末端側からのアミノ酸配列を決め
た。その配列、ＡｌａＰｈｅ−１１ｅ−Ａｌａ−Ｌｙｓ
−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−八５ｐ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−
Ａｌａｌｉｅ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−＾５ｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌ
ｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌが決定され、この配列はこの標品を
得るための遺伝子操作に用いたプラスミドｐＵｃ１１８
−ＧＰＡによってコードされるアミノ酸配列に一致した
。

〈発明の効果〉 本発明のＤＮＡおよび形質転換体を用いることによって
、効率よくグルタチオンパーオキシダーゼを製造するこ
とが可能となった。また本発明によって新規なヒト由来
のグルタチオンパーオキシダーゼのアミノ酸配列を明ら
かとすると共に、単諦した。更にそのグルタチオンパー
オキシダーゼ遺伝子が明らかとなった。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のグルタチオンパーオキシダーゼのアミ
ノ酸配列を示す図面であり、第２図は本発明のグルタチ
オンパーオキシダーゼ遺伝子の塩法配列を示す図面であ
り、第３図はグルタチオンパーオキシダーゼ遺伝子を含
むポリデオキシリボ核酸およびアミノ酸コード領域を示
す図面である。 第４１１ＦはプラスミドｐｓＶ２−ＣＰＡ−ｄｈｆｒの
構成を示す模式図であり、第５図は本発明のゲルタデオ
ン・パーオキシダーゼの発現を示す電気泳動図の模式図
である。

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１）少なくともＮ端側より下記式〔 I 〕 【遺伝子配列があります】 〔 I 〕 （ただし式中、＊＊＊はセレノシステインを示す）で表
   わされるグルタチオン・パーオキシダーゼを構成するポ
   リペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
2. （２）アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列が、５′末
   端側より第２図における少なくとも塩基１から５６７位
   で表わされる特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ。
3. （３）宿主にとって外来性である特許請求の範囲第１項
   記載のグルタチオン・パーオキシダーゼを構成するポリ
   ペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤ
   ＮＡを保持することを特徴とする形質転換体。
4. （４）アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列が、５′末
   端側より第２図における少なくとも塩基１から５６７位
   で表わされる特許請求の範囲第３項記載の形質転換体。
5. （５）形質転換体が、動物細胞または微生物細胞である
   特許請求の範囲第３項記載の形質転換体。
6. （６）特許請求の範囲第１項記載のグルタチオン・パー
   オキシダーゼを構成するポリペプチド。
7. （７）宿主にとって外来性である特許請求の範囲第１項
   記載のグルタチオン・パーオキシダーゼを構成するポリ
   ペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤ
   ＮＡを保持した形質転換体をセレン含有培地にて培養し
   て該ＤＮＡの遺伝情報を発現せしめ、該培養物からグル
   タチオン・パーオキシダーゼを構成するポリペプチドを
   採取することを特徴とするグルタチオン・パーオキシダ
   ーゼの製造法。
8. （８）宿主が、動物細胞または微生物細胞である特許請
   求の範囲第７項記載の製造法。