KR100850640B1

KR100850640B1 - 아플라톡신을 변화시키는 활성을 가진 효소 및 그 효소를 코딩하는 유전자

Info

Publication number: KR100850640B1
Application number: KR1020077001737A
Authority: KR
Inventors: 요우뚱썽; 류따링; 꽌민; 민; 쎄춘팡
Original assignee: 광저우 코-윈 바이오엔지니어링 컴퍼니 리미티드
Priority date: 2004-08-17
Filing date: 2005-01-13
Publication date: 2008-08-07
Also published as: AU2005274578A1; DE602005024973D1; EP1780270A1; US20080260711A1; EP1780270B1; HK1106272A1; KR20070032796A; RU2007103735A; CN1294255C; CA2576069A1; ATE489458T1; BRPI0513998A; JP4495758B2; CN1712526A; WO2006017960A1; US7695751B2; CA2576069C; IL180694A; RU2359032C2; EP1780270A4

Abstract

본 발명은 아플라톡신을 변형시키는 활성을 가진 효소 및 그 효소를 코딩하는 유전자에 관한 것으로서, 발명자는 먼저 이런 활성을 가진 신규한 단백질을 분리 및 정제시키고 Aflatoxin-detofizyme(ADTZ)로 명명하였으며 정제와 서열결정(sequencing)을 통하여 ADTZ유전자 특이성 물질을 얻었다. Armillariella tabescen의 전체 RNA로부터 출발하여 복제을 통하여 ADTZ를 코딩할수 있는 유전자를 얻었으며 유전공학의 방법에 의한 다양한 발현시스템을 통해서 재조합 단백질이 발현 및 정제되었다. 본 발명이 서술한 해독효소(detofizyme)는 AFB₁를 변형시킬수 있는 생물활성을 가지며, 돌연변이를 일으키는 작용을 저감시킴으로써 향후 사료가공, 식품가공 및 항종양약물의 연구개발에 우수한 기초를 제공한다.

해독효소, 아플라톡신, 형질전환, 재조합발현

Description

아플라톡신을 변화시키는 활성을 가진 효소 및 그 효소를 코딩하는 유전자{A DETOXIFIZYME HAVING ACTIVITY OF TRANSFORMING AFLATOXIN AND THE GENE ENCODES THEREOF}

본 발명은 아플라톡신을 변화시키는 활성을 가진 효소와 그 효소를 코딩하는 유전자에 관한 것이다.

아플라톡신（Aflatoxin, AFT）은 독성이 아주 강한 종류의 진균독소로서 독을 일으키는 작용기가 같고 구조가 같은 아플라톡신B1（Aflatoxin B1,AFB₁）_,아플라톡신M1（Aflatoxin M1,AFM₁）_,아플라톡신G1（Aflatoxin G1,AFG₁）등을 포함한다. 이들은 병균주인 Aspergillus flavus 와 Aspergillus parasiticus 및 일부 기타 곰팡이균으로부터 산생된다. 아플라톡신은 곡물, 사료, 식품 중에 널리 존재하고 있으며 인체에 대한 유해성으로는（1）만약 AFT(아플라톡신)에 오염된 식품을 먹기 전에 AFT를 제거하지 않으면 섭취자를 직접 해치게 된다. 또는 AFT가 오염된 먹이사슬을 통해 가금류나 가축의 체내에 들어가거나 또는 우유제품에 들어갈 경우, 간접적으로 해를 끼치거나 또는 직간접적으로 사람에 암을 유발한다. （2）가금류, 가축이 오염된 사료을 섭취할 경우 가볍게는 중독 되어 직접적인 효과는 동물체중 의 감소 또는 기타 질병을 일으키며 간접적인 효과는 먹이사슬을 통하여 사람에게 만성중독을 일으키고 암을 유발하며 엄중할 경우 사망을 초래한다. （3）AFT에 오염된 양식 곡물은 식용 또는 사료로 할수 없어 폐기처분하여야 한다.

아플라톡신의 유해성으로 인해 AFT의 해독기술은 장기간 중요시되어왔으며 이미 일부 아플라톡신을 무독성으로 변화시키는 방법이 밝혀지게 되었는데, 예를 들면: （1）암모니아화법. 이 방법은 젖은 사료에 대해 응용되었다. 처리후에 식품에 대량의 암모니아가 남아있게 되어 미국 FDA는 이 방법을 식품가공에는 사용할수 없도록 규정하였고 또 사료중에 암모니아가 남아 사용에 영향을 주었다. （2）NaOH법. 식물유의 대충 제조에서 AFT를 제거할때 사용되었다. 설비투자규모가 크고 기름 소모가 크며 비용이 높아 더 이상 사용되지 않는다.

（3）백토흡착법. 인건비가 많이 들고 백토의 먼지와 기름소모 및 환경오염 등 문제점으로 하여 도태되었다. （4）면화씨혼합용매 추출법. 땅콩가루나, 면화씨 등 고체 식품에서 AFT를 제거할 때 사용되었는데, 추출과 용매 회수와 처리에서 비용이 높아 널리 응용가치가 없다. （5）고온법. 이 방법은 처리하고자 하는 샘플을 268℃ 이상으로 가열하여 AFT를 파괴하는 것이다. 일반적인 가열방법으로 이런 온도에 이를 수 없고 높은 온도에서 기타 영양성분이 파괴되므로 실제 사용되는 경우는 드물다. （6）생물학법. 활성균 또는 고정균으로 AFT를 분해하는 것이다. 활성균이 원료의 영양을 분해하고 분해후의 새로운 생성물이 불명확하며 새 생성물의 독성에 대한 이해가 부족하여 이 방법은 극소수의 식품과 땅콩기름의 해독에만 사용된다. 1996년 광동미생물보는 Aspergillus niger의 고정발효로 BDA생물제제를 만 들때 바로 이 방법을 썼다고 보고하였다. （7）자외선조사법. 자외선의 강한 산화작용으로 AFT를 파괴한다. 효과가 안정하지 않을뿐더러 에너지 소모가 크다. （8）한외여과-삼투법. 이 방법은 비균일상에만 사용된다. 균일상 또는 산성화된 우유에는 사용되지 못하며 작업기술요구가 까다롭고 장비가 아주 비싸 실용가치가 없다. （9）생물효소법. 대장균에서 간세포 색소산화효소 P450 (chromo-oxidase) P450를 복제시켜（Brown DW, etc. Proc. Natl. Acad. Sc. USA. 1996）, 아플라톡신의 대사 산화효소를 강화시켜 체내에 진입하여 활성화된 AFT를 형질전환 해독시켜 체내의 AFB₁을 낮추고자 하였다.

상술한 처리방법 중에서 물리화학적인 수단으로 AFT를 형질전환시키는 방법은 일반적으로 아주 강력한바 처리를 거친 곡물, 사료, 식품 등은 그 이용가치가 대대적으로 떨어지고 사용효율도 낮아 비용면에서 볼 때 산업분야 적용에 이상적이지 않다. 그외에 체내에서 P450산화효소를 제고시키는 방법은 AFB₁의 대사를 증가시키기는 하나 AFB₁이 인체에 대한 위험성도 커지게 한다. 생물촉매법은 특이성이 강하고 형질전환효율이 높은 장점을 갖고있어 더욱 많은 직접 AFT를 형질전환시키는 생물효소 연구개발이 진행되고 있다.

본 발명의 목적은 아플라톡신을 무독성으로 변화시키는 활성을 가진 효소 및 그 효소의 유전자 코딩을 제공하는 것이다.

이런 효소를 얻기 위하여 발명자는 효소산생균에 대한 스크린을 통하여 AFB₁을 무독성으로 변화시킬 수 있는 효소를 정제시켰으며 DNA 재조합기술을 적용하여 AFB₁을 무독성으로 변화시키는 단백질을 생산하였다. 이로부터 발명자는 처음으로 이런 활성을 지닌 새로운 단백질을 분리, 정제시켰으며 아플라톡신해독효소, 즉 (Aflatoxin-detofizime, ADTZ)라고 명명하였다 .

본 발명은 정제와 서열결정을 통하여 아플라톡신 해독효소 （aflatoxin-detoxifizyme, ADTZ）의 유전자에 특이적인 프라이머를 얻었으며, Armillariella tabescens의 RNA로부터 출발하여 복제을 거쳐 ADTZ을 코딩할수 있는 유전자를 얻었으며 이 유전자는 지금까지 보고된 적이 없었다. 또 유전공학의 방법으로 비츠 효모발현순서로 ADTZ 단백질을 발현하고 정제시켰다. 사용된 균주는 중국보통미생물균종보관관리센터(China General Microbiological Culture Center, CGMCC)에서 채취한 Armillariella tabescens 이다.

ADTZ의 정제: 먼저 균체 세포를 분쇄시키고 황산암모늄침전법으로 단백질침전을 진행한후 침전된 단백질 샘플을 FPLC로 목적 피크를 얻는다. ADTZ의 N-말단의 아미노산 서열: 목적피크에 대해 MS분석을 하여 짧은 펩타이드 N-말단의 서열을 얻는다.

본 발명에서는 Armillariella tabescens에서 _CRNA를 추출하였다. 얻어낸 펩타이드 N-말단의 아미노산서열에 의해 프라이머를 디자인하고 RT-PCR와 SMART RACE를 진행하여 ADTZ유전자 서열의 길이가 약2.3kb임을 알았고 분석을 통해 서열에 완전한 개방열독프레임이 있고 3’말단과 5’말단의 비전사구역이 있음을 알았다. ADTZ의 성숙한 펩타이드 전체 지름을 코딩하는 cDNA 2088개 리보핵산염기를 얻었고 695개 아미노산을 코딩하였다. 분자량은 약 73~77kDa（SDS-PAGE전기영동）, 등전점은 Pi이 5.3~6.8사이（isoelectric focusing electrophoresis）.아미노산 및 DNA서열은 서열목록과 같으며 (SEQ ID No.1 및 SEQ ID No.2), 부분적 아미노산의 제거반응, 치환반응, 변형과 부가 등에 의한 생성물도 본 발명이 서술한 단백질의 범위에 든다.

본 발명의 다른 목적은 서술된 유전자를 포함한 캐리어를 제공하고 표시된 캐리어가 숙주세포를 형질전환시켜 얻은 형질전환체를 제공하는 것이다. 본 발명은 나아가서 아플라톡신의 해독효소를 얻는 방법을 제공하고 서술된 형질전환체를 배양하고 회수하는 것을 포함한 절차들을 제공한다.

본 발명은 한쌍의 프라이머를 디자인하는 것으로써 ADTZ의 성숙한 펩타이드를 코딩하는 유전자를 Armillariella tabescens의 cDNA에서 증폭시켰고 진핵통합형 분비발현캐리어에 복제시켰다. 예를 들면: pHIL-S1에서, 플라스미드를 표시하는pHIL-S1-ADTZ을 만들고 그것을 재조합 발현 형질전환체로 비츠효모균 GS115를 형질전환시켰다. 이 표시된 캐리어는 AOX를 프로모터로 하여 배양시간과 유도시간을 유추해냈다. ADTZ의 표시량은 전체 배양기 단백질의25%이상이며 용해상태에 처한다.

본 발명이 사용한 진핵발현캐리어는 세포내 캐리어를 선택할수 있다: PAO815、PPIC3K、PPICZ、PHWO10、PGAPZ, 또는 분비형캐리어도 가능하며: PPIC9K、PPICZα、PGAPZα, 시중에서 판매되는 동종의 캐리어도 될수 있다. 사용한 진핵발현균주는 비츠효모균 KM71、MC100-3、SMD1168、SMD1165、SMD1163 등을 숙주세포로 하였다.

본 발명은 원핵으로 된 발현체계에 관한 것이다. 발현캐리어로 pET、pUCH33등을 선택할수 있으며 또는 시판되는 같은 종류의 캐리어도 가능하다. 원핵균주를 사용할 때 대장균 BL21、JM109 등을 숙주세포로 하였다.

발현캐리어의 복제방법으로는 Sambrook등의 방법을 참조하여（Sambrook, et al. 2002, Molecular cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press. USA）, CaCl₂법으로 E.Coli. DH5α 담당세포를 제조 및 형질전환시켰고 암피실린(Ampicillin)（100μg/㎕）을 함유한 LB배양기에서 세균을 배양하고 알카리법으로 플라스미드를 추출하였다.

본 발명에서는 재조합 ADTZ의 정제조건도 탐색하였고, 발효액은 황산암모늄으로 침전시킨후 소수층과 금속친화 크로마토그래피그래피의 두개 부분으로 재조합ADTZ를 정제시켰고, 단백질의 순도가 95%이상에 이르렀다.

본 발명의 다른 목적은 서술된 아플라톡신을 형질전환시키는 활성을 가진 해독효소를 사료와 식품의 아플라톡신을 제거하기 위해 사용하는 것을 제공하는데에 있다. 지금 사용하고 있는 사료와 식품에서 본 발명이 서술한 아플라톡신을 형질전환시키는 활성을 가진 해독효소를 결합하여 탈독첨가제로서 사료에 넣어 독을 제거하거나 고정효소로 하여 땅콩기름에서 독을 제거할 수 있다.

본 발명의 다른 목적은 서술한 아플라톡신을 형질전환시키는 활성을 가진 해독효소를 아플라톡신이 유발한 종양에 대한 약물의 제조와 예방치료에서 사용하는 것을 제공하는데에 있다. 현재 항종양약물의 제조방법에 본 발명이 서술한 아플라톡신 활성형질전환효소를 가하면 아플라톡신이 유발한 종양을 예방 치료하는 약물을 얻을수 있다.

발명자는 최초로 단백질을 코딩하는 유전자를 분리시켰다. 또, 발명자는 서술된 유전자를 발현된 캐리어에 실어 형질전환체를 산생하였으며 이 형질전환체를 이용하여 성공적으로 ADTZ단백질을 생산하였다. 활성 분석실험을 통해 재조합 ADTZ가 천연과 비슷한 AFB₁ 형질전환활성을 가지고 있음을 증명하였다. 재조합 ADTZ가 AFB₁에 대한 해독생물학적활성의 분석실험을 통하여 재조합 ADTZ가 AFB₁의 돌연변이를 일으키는 작용을 감소시킴을 증명하였고 AFB₁가 일으킨 돌연변이의 생물활성에 저항한다는 것을 증명하였다. 본 발명은 향후 사료가공이나 식품가공, 및 항종양약물 개발에 양호한 기초를 마련한다.

도1은 정제된 ADTZ PAGE 전기영동결과를 표시한다. M:표준분자량단백질; 1、2:BSA; 3:황산암모늄법침전의 조제효소 조각; 4:정제된 ADTZ.

도2 는 정제된 ADTZ가 AFB₁에 대한 형질전환작용의 TLC검사결과를 표시한다. 1:AFB₁표준품; 2、3: PBS 버퍼액 대조 조; 4: 활성을 죽인 ADTZ로 AFB₁을 처리한 대조 조; 5: ADTZ로 AFB₁을 처리한 조; 6:AFB₁표준품.

도3은 Armillariella tabescens의 전체 RNA 전기영동결과를 표시한다.

도4는 RT-PCR생성물의 전기영동결과를 표시한다. M:DNA Marker; E1: RT-PCR생성물

도5는 재조합 캐리어인 pTE1의 효소절단감별을 표시한다. M: DNA Marker; 1:Pte1/HindIII+EcoRI; 2:pTE1/EcoRI; 3:pTE1/HindIII.

도6은 3’RACE 생성물의 전기영동측정을 표시한다. M:DNA Marker; E2:3’RANCE 산물

도7은 재조합 캐리어인pTE2의효소절단감별을 표시한다. M:DNA Marker; 1:pTE2/HindIII+EcoRⅠ; 2:pTE2/EcoRⅠ; 3:pTE2/HindIII.

도8은 5’RACE 생성물의 전기영동검측을 표시한다. M:DNA Marker; E3:5’RACE 산물.

도9는 재조합 캐리어 pTE3의 효소절단감별을 표시한다. M:DNA Marker; 1:pTE3/HindIII+EcoRⅠ; 2:pTE3/EcoRⅠ; 3:pTE3/HindIII.

도10은 End to end PCR 생성물의 전기영동검측을 표시한다. M:DNA Marker; ADTZ’: PCR생성물

도11은 재조합캐리어 pSA의 효소절단감별을 표시한다. M:DNA Marker; 1:pSA/BamHI+EcoRI; 2:pSA/ HindIII; 3:pSA/SacI.

도12는 생성물의 SDS-PAGE분석결과를 표시한다. 1: 96시간 유도한 음성대조균; 2:표준분자량단백질; 3: BSA; 4:24시간 유도한 재조합균; 5:48시간 유도한 재조합균; 6:72시간 유도한 재조합균; 7:96시간 유도한 재조합균.

도13 은 재조합 ADTZ가 AFB₁의 활성을 형질전환시키는 TLC 검측을 표시한다. 1:AFB₁표준품대조; 2:재조합 ADTZ로 AFB₁조 샘플을 처리한것; 3:활성을 죽인 재조합 ADTZ로 AFB₁조 대조샘플을 처리한것; 4:버퍼액 대조.

도14 는 ADTZ 재조합의 건립 및 그와 비츠효모균 동질재조합 프로세스를 표시한다.

실시예 1. ADTZ의 획득 및 정제

가、균체의 배양

1. 균종: Armillariella tabescens

2. 상기한 균을 액체배양기에서（감자추출액1리터、포도당20.0g、KH₂PO₄ 3.0g、MgSO₄·7H₂O 1.5g、및 비타민 미량,pH6.6） 25일간 배양한다. 1부터 3군까지는 각각 6, 4, 4일 배양하며 4군은 11일간24-28℃에서 배양하여 균체를 수집한다.

나、ADTZ의 추출

신선한 균체액을 액체질소로 얼린 후 부순다. 1:1（W/V）의 인산염버퍼액에 넣고 얼음배양기(ice bath)에서 균일하게 저으면서 초음파로 세포를 분쇄한다. 11000-12000g 원심분리로 침전물을 제거하고 20-80%포화 황산암모늄으로 여러번 침전시켜 침전을 얻는다. pH 6.0, 0.2 mol/L의 인산버퍼액으로 현탁액을 만들고 Bradford법으로 단백질을 고정하고 AFB₁ ELISA시약으로 단백질효소의 활성을 관찰한다. ADTZ을 함유한 효소액을 얻는다.

다、ADTZ의 정제

（가）효소샘플의 준비

조제한 효소액은 부피가 40인 인산버퍼액으로（pH 6.0,0.02 mol/L）투석하여 염을 없앤후 에틸렌 글라이콜-2000으로 투석 농축하여0.45 ㎛막으로 여과하여 단백질을 고정시킨다（Bradford법）.

（나）액체 크로마토그래피그래피(FPLC)법으로 ADTZ 효소 정제

문헌（Ion Exchange Chromatography principles and methods. Pharmacia Co. Edited, Pharmacia Co.,1984,pp.29~31; 과Chromatofocusing with Polybuffer ^TM and PBE ^TM , 6th. Experimental. Pharmacia Co. Edited, Pharmacia Co., 1984, pp.11~24）공정에 의하여 이온교환크로마토그래피그래피법과 등전점 크로마토그래피그래피 칼럼과 버퍼액으로 FPLC System（Pharmacia Biotech Co. 미국）에서 진행시킨다. 구체적 방법은 하기와 같다.

1. 음이온교환크로마토그래피그래피법

（1） 시약

pH 6.0,0.2 mol/L 인산염버퍼액

A:pH 6.0,0.2 mol/L 인산염버퍼액

B:pH 6.0,0.2 mol/L 인산염버퍼액 + 1 N NaCl.

（2） 칼럼 준비

DEAE-Sephadex 50 ㎕, 2배의 부피의 인산염버퍼액으로 충분히 교반 세척한후 실온에서 20분동안 놓아둔다. 마이크로-펌프로 위의 맑은 부분을 뽑아내고 같은 조작을 반복하여 세척한다. 이렇게 5차 세척한후 0.6 ㎕/min의 유속으로 칼럼에 채운다. 칼럼의 규격은 20 x 30 cm으로 한다.

A완충액으로 이 칼럼을 기준선이 영점부근에서 평형되게 한다. 효소샘플20 ㎕（단백질2 mg/㎕ 포함）을pre-column에 올리고 DEAE-Sephadex의 이온교환칼럼을 통과시킨다. 염화나트륨 용리액으로의 gradient elution진행: A 완충액으로 2시간 씻어준 다음, A액 및 0-80%의 B완충액으로 5시간 씻어준다. 100% B완충액으로 2시간 씻어준다. 유속: 0.6 ㎕/min. fraction collector로 수집한다.UVO.D._280nm로 검측한다. PEG(폴리 에틸렌 글라이콜)-20000으로 투석농축한 뒤 단백질을 고정시킨다(Bradford법). 단백질 조각들이AFB₁을 형질전환시키는 활성을 각각 측정한다. 이상 조작을 반복하며 활성 조각을 수집한다.

2. 등전점크로마토그래피그래피법

（1） 시약

용리액: Polybuffer^TM 74（Pharmacia Co.제품, 250 ㎕포장). 100 ㎕취하여 물로1000 ㎕까지 희석하여 4℃에서 보관한다.

초기 버퍼액: pH 7.4, 0.025 mol/L imidazole-HCl버퍼액

（2） 칼럼

Mono-p^TM PBE 94 ,5 x 20 cm 사전장착칼럼（Pharmacia Co.제품）.

은이온교환크로마토그래피그래피로 정제시킨 효소액6 ㎕（ 단백질 함유3 mg/㎕）, Polybuffer 74로 이 효소액을 평형시킴. (평형후6.5 ㎕.）. 초기 버퍼액으로 Mono-p칼럼을 2시간 평형시킨다. Polybuffer 74로 칼럼의2 ㎕효소액을 씻어낸다. Polybuffer 74용리액으로 10시간동안 씻어낸다.

유속: 0.2 ㎕/min. UVO.D._280nm크로마토그래피그래피를 관찰하고 fraction collector로 수집한다. 2 ㎕/튜브를 설정하여 (즉 10분/튜브) 단백질을 고정한다.（Bradford 법）, 각 단백질 조각이 AFB₁활성을 형질전환시키는 것을 측정한다. 활성조각을 수집한다.

0.1 N/L염산으로 칼럼을 세척하여AU값이 영으로 되게 한다. 다시 1 N/L NaCl로 칼럼을 씻어 AU값이 영이 되게 하고, 초기 버퍼액으로 칼럼을 평형시킨후 밤새 놓아둔다. 같은 조건으로 칼럼을 조작하며 활성조각을 수집한다.

3、ELISA법으로 활성 검측

수집한 단백질 조각으로 각각 AFB₁,을 처리시키고 ELISA법으로 처리한후의 샘플중의AFB₁ 양을 검측한다. 100→로 10분 끓인 같은 조각과 대조한다. AFB₁수치를 낮추는 조각이 활성조각이다. 구체 방법은 아래와 같다:

（1）샘플의 제조

불활성 효소액 혼합조: AFB₁ 200ul（농도2.5ng/㎕메탄올）+ 활성 억제한 효소액200ul（1.2mg/㎕）

활성 효소액 혼합조: AFB₁200ul（농도2.5ng/㎕메탄올）+활성효소액200ul（1.2mg/㎕）

대비 혼합조: AFB₁200ul（농도2.5ng/㎕메탄올）+ 버퍼 200ul（1.2mg/㎕）

불활성 효소액 제조: 조각을 100→로 10분동안 끓인다.

골고루 섞은후 30→에서 30min 반응시키고, 100→에서 15분 끓이고 3000g에서 5분간 원심분리하여 침전을 제거한다. 샘플을 준비한 다음 ELISA시약박스의 안내설명에 따라 조작한다.（AgraQuantTM Total Aflatoxin Assay 4/40,ROMER,미국）, 처리한 후의 산물에 있는AFB₁은 표준곡선으로 계산한다. 검측수집한 조각중에서 샘플중의AFB₁을 줄어들게 하는것이 활성을 가진 것이다. 검측결과: 활성조각에서 활성효소로 처리한 샘플중의 AFB₁은1.230÷0.508ng/㎕, 활성조각중의 활성억제효소액으로 처리한 샘플중의 AFB₁은2.436÷0.326 ng/㎕, 대비조는2.508÷0.203 ng/㎕.

활성의 피크는 비환원성조건에서 전기영동을 실시하면 단일한 밴드로 나타난다. 결과는 도1과 같다.

획득된 단백질의 SDS-PAGE 전기영동 분석에서 분자량은 약73~76kDa; isoelectric focusing electrophoresis: 등전점의 pI 약 5.3~6.8.

실시예 2: 정제된 ADTZ활성 측정

가、AFB₁형질전환할 때 ADTZ의 활성 측정

중국예방의학과학원표준처와（식품위생국가표준회편중국예방의학과학원표준처편,중국표준풀판사,1998년,pp 410~415）자이융신（TLC가 식품분석에서의 응용, 자이융신、루빙쩐,북경대학출판사,1991,pp118~123）이 보고한 방법으로 TLC로 ADTZ가 처리한AFB₁에 대해 관측하여 정제된 ADTZ활성을 측정한다. 구체적 방법은 아래와 같다:

1、실험조:

1.5 ㎕ 원심분리 튜브를 하나 취하여, 1㎕ AFB₁용액을 넣고（AFB₁메탄올용액: 0.5㎍/㎕, 아플라톡신B₁, Alexis Biochemicals Inc., Switzerland）, 질소기체하에서 건조시킨다. 각각 ADTZ효소액을 （단백질함량:0.1mg/㎕）300 ㎕、MgSO₄0.5 ㎕、PEG200 10 ㎕, 충분하게 섞는다. 30℃수욕에서1시간 반응시킨다, 그 뒤로 매시간마다 0.5㎕ AFB₁용액을 넣어 튜브내의 AFB₁이 모두 2 ㎍이 되게 한다. 다 넣은후 2시간 더 반응시킨다.

2、대조조:

1.5 ㎕ 원심분리튜브 하나 취하여 대조조 1로 표기한다. 1㎕ AFB₁용액을 넣고, 질소기체조건에서 건조시킨다. 각각 300 ㎕ 효소액（사전에100℃수욕에서5분간 활성을 죽임）、MgSO₄0.5 ㎕、PEG200 10 ㎕을 넣고 충분히 섞는다. 다른 1.5 ㎕ 원 심분리튜브를 취하여 대조조 2로 표기한다 1㎕ AFB₁용액을 넣고 질소기체로 건조시킨다. 각각PBS버퍼액（0.1M pH 6.6）300 ㎕、MgSO₄0.5 ㎕、PEG200 10 ㎕을 넣고 충분히 섞어준다. 뒤에 다르는 조작은 실험조와 같다.

이상의 실험조와 대조조가 반응한후, 각각 2배의 부피의 클로로포름으로 2번 추출한다. 45℃, 질소기체하에서 추출물을 건조시키고 1 ㎕ 메탄올을 넣어 추출물을 용해시켜 실험조, 대조조1과 대조조2의 셈플을 얻는다

3、TLC로 반응 생성물을 측정

새로 활성화시킨（100℃ 2h）TLC판（10x10 cm ,60Å Whatman,USA）,에 점을 찍는다. 점과 변의 거리는1cm ,점사이 거리는 1cm..왼쪽으로부터 오른쪽으로 찍으면:첫번째 점:10㎕ 25 ㎍/㎕ AFB₁클로로포름용액;2、3번째:각각10㎕ 대조조2;4번째:10㎕ 2번 대조조1;5번째: 10㎕ 실험조;6번째:10㎕ 25 ㎍/㎕ AFB₁클로로포름용액.

전개:전개조에 10㎕ 무수에틸에테르로 전개하고 꺼내여 건조시킨다.

관찰: 365nm 파장의 자외선으로 형광을 관찰하고 사진을 찍는다. 결과는 도2와 같다.

결과표시: AFB₁표준품（1、6）및 효소활성억제대조（4）와 PBS버퍼대조조（2、3）,에테르로 전개할때 미소한 이동이 존재 했고, ADTZ로 처리한 다음의 AFB₁끓생성물의 Rf값은1에 접근하였는데（=0.95） 이는 해독효소로 처리한 다음의 AFB₁는 극성이 뚜렷하게 감소하여 AFB₁과 다름을 나타내며 이는 정제된 ADTZ가 AFB₁의 활성을 형질전환시킴을 의미한다.

나、ADTZ가 AFB₁해독에 대한 생물학활성적인 감정

미생물돌연변이 회복실험（Ames 실험）을 중화인민공화국위생부약정국에서 반포한 방법<중화인민공화국위생부약정국편집, 신약(서약)림상연구지침확편(약학, 약리학, 독리학),1993년7월>을 참조하여 진행한다.구체적 방법은 이하와 같다

1．균주의 시험

히스티딘영양결핍형의Salmonella typhimurium 균주 TA98（위생부약품생무제약검정소） 을 -85 ℃ 저온에서 보관하고 실험전에 균주에 대하여 유전자 감정 및 생물학감정을 하여 합격하였으므로 실험요구에 부합된다

2． 간 S₉의 준비

（1） SD rat 준비:SD rat 를 한주동안 검역하여 병이 없음을 확인하고 PCB로를 옥수수기름에 섞어 복강에 주사한다.（500 mg/kg）, 5일후 죽이며 죽기전 12시간 굶긴다.

（2）S₉조각의 제작:상술한 처리를 거친SD rat를 머리를 자르고 피를 뺀다. 무균상태에서 간을 취하여 무게를 잰다. 찬 0.15 mol/L（이하 같음）KCl으로 씻는다.

1 g 간장에 3 ㎕의 비례로 homogenate 시킨다. 매 몫의 시간은 모두 같도록 한다. 0 ℃, 9000 g 로 20분간 원심분리 하여 상층의 맑은 액체를 취하여 균이 없 음을 확인하고 -85 ℃에서 보존한다.

3．S₉혼합액의 제작

아래의A、B、C액과S₉조각을 혼합하여, 4 ℃이하에서 4시간내에 사용한다.

A:（0.2 mol/L coenzymeII,여과 멸균） 0.2 ㎕.

B:（0.2 mol/L 6- glucose phosphate 여과멸균） 0.25 ㎕.

C: 8.55 ㎕.

C조성（0.4 mol/L MgCl₂ ,20 ㎕ + 1.65 mol/L KCl 20 ㎕,0.2 mol/L + 인산버퍼액（pH7.4）500 ㎕ + 증류수 315 ㎕, 혼합후 여과멸균）.

S₉조각:1.00㎕

4．시험샘플의 제작

30㎕ 반응체계에서ADTZ농도가0.2mg/㎕, AFB₁농도가0.2mg/㎕,pH6.0,28℃에서 120 분 반응시킨다. 체계를 10배 확대한다. 반응후 똑같은 부피의 클로로포름으로 아플라톡신 B₁과 반응하지 않은 잔유물을 세번 추출하고 유기층을 합친다. 40 ℃감압증류하여 클로로포름을 없앤다. 각각3.75 와3 ㎕ DMSO추출물을 세척하고（활성효소반응조） 사전에 클로로포름으로 활성을 죽인 ADTZ로 활성을 가진ADTZ를 대체한다.

같은 조건으로 AFB₁을 처리한다(활성을 죽인 대조조);버퍼액으로활성을 가 진 ADTZ효소액을 대체하고 같은 조건에서AFB₁을 처리한다（버퍼액처리대조조）. 이상의 샘플은 모두 -15 ℃이하에서 보관한다.

5．돌연변이회복실험

시험샘플의 DMSO용액과 밤새 배양한 균액 및 S₉를 함께 아가배양기에 넣고 균일하게 섞는다. 40 ℃이하에서 밑층이 Vogel인 선택배양기에 쏟아낸다. 응고된후 37 ℃ 인큐베이터에서 72시간 놓아둔다. 각 배양기에 나타나는 회복돌연변이균락수를 계산한다.

매조의 실험에서 추출액과 음양성대조균은 모두 3개 디스크를 설치하며 한번 중복한다. 추출액의 결과는 두번의 여섯 조의 평균치를 취한다. 실험결과는 회복균락수、돌연변이수（MR = 샘플회복균락수/음성대조회복균락수）와 억제율（%）[= {1 - （피시험물회복균락수 - 음성대조균회복균락수）/（AFB₁대조회복균락수 -음성대조조회복균락수）} x 100 %]로 표시한다.

6．결과평가표준

용매대조조가 정상적인 범위에 있다면 검사물질은 3개 농도이상이 양성반응을 보이며, 최대 증가치가 용매대조조의 2배이면（즉MR≥2）돌연변이양성을 일으킨 것으로 볼수 있다.

7．결과

활성을 가진ADTZ로 반응조의 세균을 처리할때의 회복 돌연변이균락수와 음성대조균조（DMSO조）와 비슷하였다（MR값이2보다 작음）.버퍼액으로 처리한 조 와 활성을 죽인ADTZ로 처리한 회복돌연변이군락수는 음성대조조보다 뚜렷하게 높았다.（MR값이2보다 큼）. 양성대조조와 비교하면 （AFB₁）뚜렷한 차이가 없었다. 이는 활성을 가진 ADTZ로 시험물을 처리하면 유발성유전자돌연변이가 없음을 의미한다. 이는 ADTZ가AFB₁의 돌연변이를 일으키는 생물활성을 저해함을 보여준다. 결과는 아래 표와 같다.

AFB₁ 의 효소처리를 거친 후 세균 돌연변이 회복 실험

시험샘플	회복돌연변이수/플렛	MR	억제율（%）
PBS-대조조	378±7	13.09	~
불활성 대조조	359±9	12.86	~
효소처리조	31 ±12	1.11	99.16
AFB₁대조조	385±7	13.75	~
DMSO 대조조	28 ±5	~	~

이 표에서 유발실험은 RAT간을 함유한 S-9혼합물의Salmonella typhimuriurmn TA98을 feed 로 진행한 것이다. 실험에 쓰인 AFB₁대조조 농도는0.8㎍/50㎕ DMSO/플렛. 그러나 AFB₁효소처리후의 샘플도 판마다 같은 양에 해당한 AFB₁로 실험을 진행하였고 같은 양의 DMSO를 사용하였다. 플렛에서 28hr 배양한후 수를 세고 결과를 평균치±SD로 표시하였다.

실시예 3. ADTZ 펩타이드 아미노산 서열결정

샘플: 실시예1로부터 수집된 정제된 활성조각의 피크끝이나 또는 활성조각을 PAGE로 전기영동으로 얻은 밴드를 Q-TOF2계기(전자분무-사극칼럼비행시간-직렬애널 라이저;잉글랜드 Micromass사 제조,중국군사의학과학원 계기측정분석중심에서 제공)로 ADTZ N-말단 펩타이드 아미노산 서열 검사를 하여 얻은 아미노산의 서열은 다음과 같다.

M1: EAWEGFTALVDK M2: NKLLQDANGELENLYVR

본 발명의 ADTZ N-말단 펩타이드의 아미노산 서열은 위에 서술한것에만 국한된것이 아니라 기타 아미노산 순서 조각들도 포함하는바 이 조각이 MALDI-MS-TOF또는 기타 화학적방법으로 ADTZ을 검측하여 얻은 것이면 다 포함된다.

실시예4: 효소산생균의 cRNA의 추출

효소산생균 균체를 사전에 냉각시킨 막자사발에 넣고 액체질소를 넣어 샘플이 분말상태가 되게 한다. 100mg정도를 취하여 1.5㎕ 원심분리 튜브에 옮기고 1㎕ Trizol을 넣고 잘 흔들어 실온에서 5분 놓아 둔다. 200㎕클로로포름을 넣고 2분 진탕한 다음 얼음 배양기에 5분 놓아둔다. 2-8℃ 12000 X g,15분 원심분리. 윗층의 맑은 액체를 취하여 다른 1.5㎕ 원심분리튜브에 옮긴다. 500㎕ 냉각한 이소프로파놀을 넣고 빙욕에 20분 놓아둔다. 2-8℃, 12000 X g, 10min동안 원심분리. 윗층의 맑은 액체를 버리고 1㎕냉각시킨 75% 에틸알콜을 넣어 침전과 튜브 벽을 세척한다. 2-8℃, 7500 X g,5분 원심분리. 윗층을 버리고 공기로 5-10분 건조시킨다. 50㎕ DEPC무균수를 넣고 완전히 용해한 다음 자외선분석 및 전기영동검측을 한다.（1.1%Agarose/EB 100V 20min）. 샘플은 -80℃로 보관한다. 결과는 도3에 표시한것과 같이, 전기영동의 결과에서 28s rRNA와18s sRNA두개 특징적인 밴드가 명확하게 보 인다. 밝기비는 2 : 1에 접근한다. 이는 cRNA가 분해되지 않았음을 의미한다.

실시예5: ADTZ 유전자 특이성 프라이머의 고안

실시예3에서 얻은 ADTZ N-말단 펩타이드 아미노산 서열에서 2쌍의 프라이머를 고안할수 있다. （P1、P2와G1、G2）. QIAGEN OneStep RT-PCR Kit（QIAGEN Inc. 미국）프로토클을 참조하여 RT-PCR을 진행하여ADTZ유전자 부분서열의 생성물을 얻어낼수 있다. RT-PCR생성물의 절단을 회수하여 일반적인 방법으로 TA 복제을 진행하면 Hind?와EcoRI 효소절단으로 TA복제의 재조합 플라스미드를 감정할수 있다. 1.5%아가로즈 젤의 전기영동으로 효소절단 결과를 검측할수 있다. 재조합 플라스미드의 서열순서를 측정하여 ADTZ 유전자의 cDNA 조각E1을 얻는다. 구체 방법은 아래와 같다:

프라이머 쌍1 프라이머 쌍2

P1: 5’-TGGGARGGNTTYACNGC-3’ G1: 5’-CARGAYGCNAAYGGNGA-3’

P2: 5’-TCNCCRTTNGCRTCYTG-3’ G2: 5’-GCNGTRAANCCYTCCCA-3’

본 발명에서 ADTZ유전자 특이성 프라이머의 증폭은 이상의 P1,P2 와 G1,G2에만 국한된것이 아니라 기타 프라이머도 포함하는바 그 프라이머가 위의 방법으로 ADTZ N-말단 펩타이드 아미노산 서열을 고안한것이면 다 포함된다.

(가) RT-PCR절차

1、cRNA 탬플렛을 （실시예4에서 얻은것）75℃ 5분 변성시키고 속히 얼음에 넣어 냉각시킨다.

2、Master Mix （80㎕ 전체 부피 기준）준비한다.

42 ㎕ RNase-free Water

16 ㎕ 5 X QIAGEN OneStep RT-PCR Buffer

3.2 ㎕ dNTP Mix （10mM）

3.2 ㎕ QIAGEN OneStep RT-PCR Enzyme Mix

64.4㎕

뽑아낸후 균일하게 혼합하여 짧게 원심분리한다.

3、아래 표의 순서대로 각 조각을 0.5㎕무균 원심분리튜브에 넣는다（단위:㎕）

구분	1（샘플1）	2（-control）	3（샘플2）	4（-control）
RNA	1.3	-	-	-
Primer P1	1.3	1.3	-	-
Primer P2	1.3	1.3	-	-
Primer G1	-	-	1.3	1.3
Primer G2	-	-	1.3	1.3
Water	-	1.3	-	1.3
Master Mix	16.1	16.1	16.1	16.1
총부피	20	20	20	20

4、PCR회로

·역전사: 50℃ 30min

·초기 PCR 활성화 단계: 50℃ 15min

·3-단계 회로

·15 회로: 94℃ 40sec

65℃ 1min （-1℃/cycle）

72℃ 1min

·25 회로: 94℃ 40sec

50℃ 1min

72℃ 1min

·최종 연장: 70℃ 10min

5、회로가 결속된후 5㎕샘플을 취하여 전기영동검측을 진행한다.

(나) RT-PCR생성물의 회수

1. TAE전기영동액을 만들고 0.8%아가로스도 만든다;

2. 50㎕ RT-PCR 생성물을 10Xloading buffer와 비례에 맞게 혼합하고 샘플을 올린다;

3. 100V, 20min 전기영동;

4. 전기영동후 자외선등에서 밴드의 위치를 관찰함. 목적밴드를 잘라내어 새로 멸균한 1.5㎕원심분리튜브에 옮김;

5. 800 ㎕ Buffer NT1를 넣음;

6. 쏘닉. NucleoTrap Suspension,작은 알갱이가 완전히 현탁될 때 10㎕를 취하여 원심분리튜브에 넣음;

7. 원심분리튜브를50℃ 수욕에 6min 방치 2min간격으로 쏘닉;

8. 실온에서 10000Xg 30s 원심분리 윗층을 버림;

9. 500㎕ Buffer NT2 넣음 짧은 쏘닉. 실온에서 10000Xg 30s 원심분리 윗층을 버림. 이 절차를 한번 중복함;

10. 500㎕ Buffer NT3넣음 짧은 쏘닉. 실온에서 10000Xg 30s 원심분리 윗 층을 버림. 이 절차를 한번 중복함;

11. 다시 10000 g X 30s 원심분리 윗층을 버림. 공기중에서 10-15분 건조;

12. 30㎕ TE Buffer（pH8.0）넣고 다시 침전시킴. 회수한 조각을 “E1”로 명명함. RT-PCR생성물을 전기영동 검측.결과는 도4 에 표시. 이는 프라이머 P1과P2의 반응결과에서 얻어낸 밴드임을 보여줌. 이 밴드의 위치는 약800bp좌우,E1조각으로 명명함.

(다) TA복제와 서열결정

1. 접합(litigation)

1.5㎕새로 멸균한 원심분리튜브에 아래 성분들을 넣는다:

1 ㎕ pUCm-T캐리어

3 ㎕ E1조각（RT-PCR회수 생성물）

1 ㎕ 10Xbuffer

1 ㎕ T4 DNA접합효소

4㎕ 무균수를 전체 부피가10㎕ 될때까지 넣는다;

잘 뽑아서 짧게 원심분리, 22℃수욕에서 4h이상 놓아둔다.

2. CaCl₂법으로E.coli DH5α 담당세포의 준비

DH5α monoclone을 골라 2㎕LB액체배양기중에서 37℃로 진탕하면서 밤을 새운다. 활성화된 새DH5α 균액에서50㎕ 취해 5㎕ LB 액체배양기에 접종하고 37℃에서 진탕하면서 1.5-2시간 배양한다. 수욕에 30min, 균액을 무균 원심분리튜브로 옮 겨 5000rpm으로 5분 원심분리하고 윗층을 버리고1.5㎕취하여 빙욕에서 무균 CaCl₂을 원심분리튜브에 넣는다. 균체가 뜰때 빙욕에서 10분 두고 5000rpm로 5분 원심분리하고 윗층을 버리고 200㎕ 빙욕의 무균CaCl₂을 원심분리튜브에 넣는다. 떠오른 균체를 4℃에 보존한다.

3 DH5α 담당세포의 형질전환

DH5α 담당세포 200㎕를 10㎕ 연접물을 함유한 원심분리튜브에 넣고 잘 섞어서 빙욕에 30분 둔다. 42℃수욕에서90s 두고 빙욕에 3-5분 둔다. 800㎕ LB액체배양기를 넣고 37℃에서 40-60min 배양한다. 형질전환된 세포를 Amp 및 IPTG/X-gal를 함유한 LB 고체배양기에 도말하고 매90㎛ 플렛에200㎕ 도말한 다음 37℃에서 12-16h 진탕 배양한다.

4. 알카리법으로 플라스미드DNA를 추출

형질전환된 단균락을 골라서 2㎕의 암피실린을 함유한 LB액체배양기에 접종하고 37℃에서 격렬하게 진탕하면서 밤새 배양한다. 1.5㎕균액을 취하여 미량 원심분리튜브에 넣고 12000rpm 2분 원심분리한다. 윗층을 버리고 400㎕ STE용액으로 균체를 씻어준다. 쏘닉으로 잘 혼합하고 12000rpm 2분 원심분리하고 윗층을 버린다. 100㎕ 사전에 냉각시킨 용액Ⅰ을 침전된 균체에 넣고 세게 진탕한다.200㎕ 새로 만든 용액Ⅱ를 넣고 즉시 뒤집어 잘 섞는다. 빙욕 3min,,150㎕ 미리 냉각시킨 용액Ⅲ을 넣는다.반복적으로 뒤집어 잘 섞는다.빙욕 5 min;12000rpm 5min 원심분리. 윗층을 다른 튜브에 옮기고 같은 부피의 페놀을 넣는다. 뒤집어 잘 섞는다. 12000rpm 5 분간 원심분리. 조심히 윗층을 취하여 다른 튜브에 옮긴다. 2배의 부피의 냉각된 무수알콜을 넣고 뒤집어 잘 섞는다. 실온에서 40-60min 놓아둔다. 12000rpm으로 10분 원심분리한다. 윗층을 버리고 200㎕ 70%알콜을 넣어 침전을 씻은후 12000rpm으로 1분 원심분리한다. 윗층을 버리고 튜브 마개를 열어 공기중에서 5-10min 건조시킨다. 30㎕ DNA효소가 없는 RNA효소의 TE로 침전을 용해한다. 37℃ 한시간 배양한다.-20℃에서 저장한다.

5. 재조합 플라스미드pTE1의 효소절단감별

HindⅢ 와EcoRI 효소절단으로 TA복제의 재조합감별 아래 표와 같음（단위:㎕）

번호	Buffer M	Buffer H	Hind?	EcoRI	pTE1	H₂O
1（20㎕체계）	2	-	1	1	10	6
2（20㎕체계）	-	2	-	1	10	6
3（20㎕체계）	2	-	1	--	10	6

37℃의 환경에서 4시간 이상 효소절단 실시함. 1.5% 아가로스로 효소절단결과를 검측한다. 그 결과는 도5와 같이, 재조합캐리어pTE1의 절단감별. HindIII + EcoRI 더블 절단과 （1번 샘플）HindIII 모노절단（3번샘플）모두 400여 bp의 밴드를 남긴다. 전자의 밝음도가 후자보다 높다. EcoRI 모노절단은 재조합 플라스미드를 선형으로 잘랐다（2번 샘플）. 이는 E1조각중앙위치에 하나의 HindIII 절단점이 있음을 의미한다.

6. 재조합 플라스미드 DNA 서열결정

재조합 플라스미드 PEG정제법으로 （Sambrook,et al. 1989,Molecular cloing. Cold Spring Harbor Labroratory Press. USA）플라스미드DNA를 추출한다. T7과SP6의 서열을 프라이머로 측정하여 ABI377 DNA Sequencer DNA자동서열기로（상해보아회사제공）,정반두개 방향에서 측정하여 E1조각의 핵산 서열을 얻었다. 검사결과는 서열에 P1과 P2 서열이 포함되며 중간위치에 하나의 AAGCTT로 HindIII 절단위치가 있었다.

실시예6: ADTZ 전체에 대한 코딩 cDNA서열의 획득

실시예5에서 이미 얻은 ADTZ유전자 부분서열과 E1조각에 근거하여 프라이머를 디자인한다:

S1: 5’-TAGGCGAAGTGTCGTCGTCAATGGAA-3’、

S3: 5’-GAAGTTATCGGCTTTCCAGTCAGAGGGT-3’

각각 3’RACE와 5’RACE의 프라이머로 한다. SMART^TM RACE cDNA amplification Kit（COLONTECH Laboratories,Inc. Cat. No. K1811-2）프로토콜에 의하여 3’ RACE와5’ RACE를 진행한다. RACE생성물을 회수한후 일반적인 방법으로 TA복제을 진행하여, HindIII 와 EcoRI 효소절단으로 TA복제의 재조합을 감정한다. 1.5%아가로스 전기영동으로 결과를 검측한다. 재조합된 플라스미드를 서열결정회사에 보내여 순서를 측정하여 두개의 조각E2、E3을 얻는다. NCBI의 VecScreen（BLASTN2.2.5）프로그램으로（http:// www.ncbi.nlm.nih.gov / VecScreen.ht㎕）캐리어서열을 식별, 제거하고 DNAMAN프로그램으로（미국Lynnon BioSoft회사의 소프트웨어）E1、E2、E3을 이으면 얻은 서열을 NCBI의 ORFFinder프로그램으로（ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.ht㎕）개방열독식프레임분석을 하면 ADTZ 성숙된 펩타이드를 코딩할수 있는 ADTZ유전자 전체 길이의 cDNA서열을 얻는다. 구체적으로 아래에 표시한 바와 같다:

프라이머S1: 5’-TAGGCGAAGTGTCGTCGTCAATGGAA-3’

프라이머S3: 5’-GAAGTTATCGGCTTTCCAGTCAGAGGGT-3’

가、 3’RACE

（가）3’RACE-Ready cDNA의 제작:

1. cRNA템플렛을 75℃에서 5min 변성시키고 신속하게 얼음에 넣어 냉각시킨다;

2．0.5㎕ 멸균 원심분리튜브에 다음 시약을 넣는다:

1 ㎕ 변성된RNA템플렛

1 ㎕ 3’－CDS Primer A

3㎕의 RNA효소가 없는 무균수를 5㎕까지 보충한다;

3． 잘 섞으면서 짧게 원심분리를 하여 혼합액이 튜브 밑부분에 있게 한다;

4．70℃, 따스한 수욕에2min 방치;

5． 빙욕 2min,약간 원심분리 진행후 이하 시약을 넣음;

2 ㎕ 5 X First-Strand Buffer

1 ㎕ DTT （20mM）

1 ㎕ dNTP Mix （10mM）

1 ㎕ PowerScript 역전사효소

10 ㎕ 전체 부피

6．천천히 흡입하여올려 섞으며 약간 원심분리를 진행;

7．인큐베이터에서 42℃로 1.5h ;

8．100㎕ Tricine-EDTA buffer로 생성물 희석;

9．72℃로 7분동안 배양함;

10． -20℃로 샘플 보존.

(나) 3’RACE PCR의 절차

1．Master Mix를 준비한다（100㎕ 전체 부피 기준）

69 ㎕ PCR-Grade Water

10 ㎕ 10 X Advantage 2 PCR Buffer

2 ㎕ dNTP Mix （10mM）

2 ㎕ 50 X Advantage 2 중합효소 믹스

83 ㎕

잘 흡입하여 섞으며 짧은 원심분리;

2. 아래 표의 순서로 각 조각을 0.5㎕ 무균원심분리튜브에 넣는다（단위:㎕）

조각	1（샘플）	2（-control）	3（-control）
3’-RACE-Ready cDNA	2.5	1.5	1
UPM（10X）	5	3	-
Primer S1（10㎛）	1	-	0.4
H₂O	-	0.6	2
Master mix	41.5	24.9	16.6
전체 부피	50	30	20

3．PCR 회로:

·5 회로: 94℃ 5sec

72℃ 3min

·5 회로:: 94℃ 5sec

70℃ 10sec

72℃ 3min

·35 회로:: 94℃ 5sec

68℃ 10sec

72℃ 3min

4．회로가 결속된후 5㎕샘플을 취해 전기영동검측을 진행.결과는 도6에 표시.3’RACE에서 밴드 하나를 가진 생성물을 얻었음을 나타냄. 생성물 밴드 위치는 분자량이 약 800bp임. E2조각으로 명명함.

(다) 3’RACE생성물의 절단 회수, TA복제, CaCl₂법에 의한 E.coli DH5α담당세포 제작, DH5α담당세포의 형질전환, 알칼리체 플라스미드DNA（실험조작은 앞의 실시 예 5와 같음）.

(라) 재조합 플라스미드의pTE2효소절단감별

HindIII와EcoRI효소절단으로 TA복제의 재조합감별 아래 표와 같음（단위:㎕）

번호	Buffer M	Buffer H	HindIII	EcoRI	pTE2	H₂O
1（20㎕체계）	2	-	1	1	10	6
2（20㎕체계）	-	2	-	1	10	6
3（20㎕체계）	2	-	1	-	10	6

37℃에서 4h이상 반응한다. 1.5%아가로스 전기영동으로 결과를 검측한다. 결과를 도7에 표시하였다. 재조합 캐리어pTE2의 절단을 감별한다. HindIII+EcoRI더블 절단은（1번샘플）두개의 각각 600bp와 300-400bp 좌우에 위치한 밴드를 보이며, HindIII모노절단은（3번샘플）밴드가 약 300-400bp에 위치한다 EcoRI모노절단은 선형으로 나타나며（2번샘플）E2조각중에 HindIII절단 점이 존재함을 나타낸다. 위치는 모두 조각에 가까운 쪽에 있다.

(마) 서열결정:

재조합 플라스미드의 PEG정제법（Sambrook,et al. 1989,Molecular cloing. Cold Spring Harbor Labroratory Press. USA）으로 플라스미드DNA를 추출한다. T7과 SP6를 프라이머로 하여, ABI377 DNA Sequencer DNA자동서열기로（상해보아회사제공） 정반방향에서 측정한다. 두개의 핵산 순서를 얻으며 얻어낸 E2서열은 약간 3’위치에서 약간 떨어진 곳에 AAGCTT의 HindIII 절단위치가 있다.

나、 5’RACE

（가） 5’RACE-Ready cDNA제작

1. cRNA를 75℃에서 5분 변성시키고 신속하게 얼음으로 냉각시킨다;

2．0.5㎕ 멸균 원심분리튜브중 아래 시약들을 넣는다;

1 ㎕ 변성된RNA 템플렛

1 ㎕ 5’－CDS Primer A

1 ㎕ SMART ⅡA Oligonucleotide

2㎕ RNA효소가 없는 무균수를 5㎕까지 보충한다;

2．잘 흡입하여서 섞고 짧게 원심분리를 하여 혼합액이 튜브 아래쪽에 가게 한다;

3．70℃, 온욕에서 2분간 방치;

4．빙욕2min, 약간 원심분리후 아래 시약을 넣는다:

2 ㎕ 5 X First-Strand Buffer

1 ㎕ DTT （20mM）

1 ㎕ dNTP Mix （10mM）

1 ㎕ PowerScript 역전사효소

10 ㎕ 전체부피

5．가볍게 빨아올려 잘 섞고 약간 원심분리조작을 한다;

6．인큐베이터에서 42℃ 온욕으로1.5시간 둠;

7．100㎕ Tricine-EDTA buffer로 생성물 희석;

8．72℃ 로 7분 동안 방치;

9．-20℃에서 보존.

（나） 5’RACE절차

1．Master Mix （110㎕ 총체계）준비

75.9 ㎕ PCR-Grade Water

11 ㎕ 10 X Advantage 2 PCR Buffer

2.2 ㎕ dNTP Mix （10mM）

2.2 ㎕ 50 X Advantage 2 Polymerase Mix

91.3 ㎕

흡입하여 올려 잘 섞고 짧게 원심분리조작;

2. 아래 표에 따라 각 조각을 0.5㎕무균 튜브에 넣는다（단위:㎕）

조각	1（샘플）	2（+control）	3（-control）	4（-control）
5’-RACE-Ready cDNA	2.5	1	1	1
UPM（10 X ）	5	-	2	-
Primer S1（10㎛）	-	0.4	-	-
Primer S3（10㎛）	1	0.4	-	0.4
H₂O	-	1.6	0.4	2
Master mix	41.5	16.6	16.6	16.6
총부피	50	20	20	20

3．PCR회로 프로그램:

· 94℃ 1min

·5 회로: 94℃ 30sec

72℃ 4min

·5 회로: 94℃ 30sec

70℃ 4min

·25 회로: 94℃ 30sec

68℃ 4min

72℃ 10min

4．회로가 끝난후 5㎕샘플을 취하여 전기영동 검측을 진행.5’RACE생성물E3을 얻음. 결과는 도8에 표시. 5’RACE에서 단일밴드 생성물이 얻어짐을 보여줌. 밴드가 약 1400-1800bp에 위치함. E3조각으로 명명함.

(다）5’RACE생성물의 절단 회수. TA복제, CaCl₂법에 의한 E.coli DH5α 담당세포 제작, DH5α 담당세포의 형질전환, 알칼리체플라스미드DNA（실험조작은 앞 의 실시 예 5와 같음）.

（라）재조합플라스미드 pTE3 의 효소절단감별

HindIII와 EcoRI 효소절단으로 TA복제의 재조합감별 아래 표와 같음（단위:㎕）

번호	Buffer M	Buffer H	HindIII	EcoRI	pTE3	H₂O
1（20㎕체계）	2	-	1	1	10	6
2（20㎕체계）	-	2	-	1	10	6
3（20㎕체계）	2	-	1	-	10	6

37℃에서 4h이상 반응한다. 1.5% 아가로스 전기영동으로 결과를 검측한다.결과를 도9에 표시하였다. 재조합 캐리어 pTE2의 절단을 감별함. HindIII+EcoRI더블 절단은（1번샘플）두개의 각각 1400-1000bp와 300-400bp 좌우에 위치한 밴드를 보이며, HindIII 모노절단은（3번샘플）밴드가 약 1400-1000bp에 위치한다. E3조각중에 HindIII 절단 점이 존재함을 나타낸다.

（마） 서열결정:

재조합 플라스미드의 PEG정제법（Sambrook,et al. 1989, Molecular cloing. Cold Spring Harbor Labroratory Press. USA）으로 플라스미드DNA를 추출한다. T7과 SP6를 프라이머로 하여, ABI377 DNA Sequencer DNA자동서열기로（상해보아회사제공） 정반방향에서 측정한다. E3조각의 핵산 서열을 얻으며 이 조각은 5’위치에 치우친 쪽에 HindIII절단 위치가 있으며 3’말단에 HindIII 절단위치가 존재한다.

다、ADTZ cDNA서열의 이음

NCBI의 Vecscreen프로그램으로 캐리어를 식별 및 제거하고 DNAMAN프로그램으로 E1、E2、E3맞춘다. 얻은 서열을 NCBI의 ORF Finder프로그램으로 개방식 프레임 열독분석을 진행하면 길이가 2.3kb 되는 서열을 얻을수 있다. 개방식 열독 프레임을 포함하여 3’말단의 poly（A）꼬리가 있으며 5’말단과 3’말단의 비전사구역을 포함하고있다. 결과는 서열 SEQ ID NO2와 같다. ADTZ 리보핵산의 서열과 추측한 아미노산 서열을 인터넷에서 BLASTA서열의 유사성 검색을 하면 (BLAST와 BLASTX（http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/ BLAST/）결과는 ADTZ가 완전히 새로운 유전자임이 밝혀졌다. ADTZ의 성숙한 펩타이드를 코딩하는 아미노산의 서열은 GENEBANK에서 같은것을 찾을수 없었으며 완전히 새로운 아미노산 서열이다.

ADTZ 옹근 길이를 코딩하는 서열의 획득은 실시 6에서 서술한 방법에 한정되지 않는다. ADTZ 펩타이드 아미노산 서열로 탐침을 디자인하여 Armillariella tabescens의 cDNA 데이터 은행에서 이 서열을 복제하는 것도 포함하고있다.

실시예 7:ADTZ의 성숙한 펩타이드를 코딩하는 cDNA생성물의 획득

실시예6을 분석하여 ADTZ 전체 길이를 코딩하는 두 끝의 서열을 얻어 한쌍의 프라이머를 디자인한다:

P3:5’-GTCGAATTC ATGGCCACCACAACTGTC-3’

P4:3’-GTAACTCTCTGCTAACACTCCTAGGGAC-5’

개시 코돈부터 종결 코돈에 이르는 ADTZ개방열독 프레임 서열을 얻고 프라이머에 각각 절단점을 제한하는 EcoRI（GAATTC）와BamHI（GGATCC）을 붙인다. 일반적인 방법으로 PCR증푹을 진행한다. PCR생성물을 회수한다. 구체적인 방법은 아래와 같다:

1．Master Mix를 준비한다（100㎕전체부피기준）

69 ㎕ PCR-Grade Water

10 ㎕ 10XAdvantage 2 PCR Buffer

2 ㎕ dNTP Mix （10mM）

2 ㎕ 50XAdvantage 2 Polymerase Mix

83 ㎕

흡입하여 올려 골고루 섞고 짧게 원심분리진행

2. 아래 표의 순서대로 각 조각을 0.5㎕ 무균원심분리튜브에 넣는다（단위:㎕）

조각	1（샘플）	2（-control）	3（-control）
5’-RACE-Ready cDNA	2.5	-	1
Primer P3（10㎛）	1	0.6	-
Primer P4（10㎛）	1	0.6	-
H₂O	4	3.9	2.4
Master mix	41.5	24.9	16.6
전체 부피	50	30	20

3．PCR회로 프로그램:

· 94℃ 1min

·5 회로: 94℃ 30sec

72℃ 4min

·5 회로: 94℃ 30sec

70℃ 4min

·35 회로: 94℃ 30sec

68℃ 4min

72℃ 10min

4．회로가 끝난후 5㎕샘플을 취하여 전기영동검측을 진행한다. 결과는 도10에 표시하였다. PCR에서 밴드를 하나 가진 생성물을 얻었다는것을 보여준다. 밴드의 위치는 1800bp좌우에 있으며 ADTZ’조각이라 명명한다.

5．절단후의 PCR생성물 회수

이란적인 PCR생성물 회수방법으로 진행한다. ADTZ를 코딩하는 성숙한 cDNA를 얻음. 이 조각을 “ADTZ’”로 명명함.

실시예 8:재조합 플라스미드 ADTZ 발현 플라스미드의 구성

유전자의 복제은 일반적인 방법（Sambrook,et al. 2001,Molecular Cloning A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. USA）으로 진행한다. 실시예7에서 얻은 ADTZ’을 pHIL-S1가 구성한 플라스미드pHIL-S1-ADTZ 에 복제한다. 크론후의 타겟유전자는 효소절단 및 서열결정을 통해 감별한다.

구체적 방법: 도14의 표시와 같음. 유전자 ADTZ의 재조합 플라스미드 pHIL-S1의 구성과정은 :EcoRI+BamHI 더블 절단과 목표조각을 절단생성물에 대해 0.8%아가로스 전기영동을 진행하고 회수한다. T4 DNA의 접합효소를 이용하여 플라스미드 pHIL-S1와 목표 유전자 ADTZ를 접합시킨다. CaCl₂법으로 E.coli DH5α담당세포를 만들고 DH5α담당세포를 형질전환시킨다. 형질전환체(transformant)을 스크린한. 염기로 플라스미드를 추출한다. EcoRI+BamHI、HindⅢ、SacI효소절단으로 재조합 플라 스미드 pHIL-S1-ADTZ를 감정한다. 플라스미드 PEG정제법（Sambrook,et al. 2001,Molecular Cloning A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Labroratory Press. USA）으로 플라스미드DNA를 추출한다. T7과 SP6를 시퀀싱 프라이머로 하여 ABI377 DNA Sequencer DNA자동서열기로（상해보아회사제공）,정반 방향으로 측정 한다. 효소절단 결과는 도11과 같이, 재조합 캐리어pSA의 효소절단감별에서 BamHI、EcoRI더블 절단은 （샘플1）2000bp좌우의 밴드를 가진 조각으로 HindIII모노절단은 （샘플2）세가닥의 1400bp,600bp와500bp에 ,SacI（샘플3）의 절단은 플라스미드를 선형으로 절단한다. 이는 삽입한 조각에는 SacI의 절단 위치가 없음을 설명한다.

실시예9:재조합ADTZ 유전자의 발현

SacI효소절단 재조합 플라스미드pHIL-S1-ADTZ와 플라스미드pHIL-S1로 효소절단 생성물에 대해 0.8% 아가로스 전기영동을 진행하고 절단후의 선형 플라스미드pHIL-S1-ADTZ와 플라스미드pHIL-S1을 회수한다. Pichia 발현키트（Invitrogen Inc.,미국）프로토클중의 원형질 법으로 비츰효모균GS115을 형질전환시키고 Mut⁺ transformant를 스크린한다. 메탄올을 유일한 탄소원천으로 하여 재조합균에 대해 유도표시를 하는 （Pichia Expression Kit프로토클의 방법）방법에서 배양액이 SDS-PAGE전기영동을 거친후 나타나는것은 형질전환자가 유도표시후 배양액 상층에 뚜렷하게 목표 단백질이 나타난다. 목표단백질을 함유하지 않은 빈 플라스미드의 대조균에 대해 96시간 유도한 결과 윗층의 액체에는 목표단백질이 나타나지 않았다. 결과는 도12에 표시하였다. 형질전환자는 메탄올로 유도시킨후 배양액의 상층에 뚜렷하게 목표단백질을 나타내나 빈 플라스미드 음성대조균을 형질전환시킬 때는 같은 조건에서도 나타나지 않았다.

구체적인 방법은 아래와 같다:

가、 recon과비츠효모균의homologous recombination

（가）플라스미드의 선형화

SacI플라스미드pSA와 플라스미드pHIL-S1의 절단은 플라스미드pHIL-S1선형화오 함께 아래 시험의 대조로 쓴다.

pSA 효소절단（120총체계）:12㎕ Buffer L+ 8㎕ SacI+ 100㎕ pSA

pHIL-S1효소절단 （120총체계）:12㎕ Buffer L+ 8㎕ SacI+ 100㎕ pHIL-S1

0.8%아가로스로 절단 샘플과 재조합 플라스미드pSA와 플라스미드pHIL-S1의 절단 회수물을 전기영동한다

(나）원형질화에 사용할 비츠효모균GS115의 배양

1．플렛에서 GS115 모노복제을 하나 취하여 10㎕ YPD에 접종한다.150㎕ 삼각 플라스크에 넣고 30℃ 250-300rpm으로 진탕하면서 밤새 배양한다;

2．어제 배양한 10㎕YPD균액을 각각 5,10,20㎕ Tlr 취하여 200㎕ YPD에 접종한다. 500㎕ 삼각플라스크에서 250-300rpm으로 진탕하면서 밤새 배양한다;

3．세 배양액중 균의 OD₆₀₀값을 구한다. OD₆₀₀＝0.2-0.3인 균액을 원심분리튜 브에 넣고 실온에서 1500Xg 로 5분 원심분리한다. 윗층을 버리고 수집한 세포를 원형질화에 사용한다.

（다）비츠효모균GS115의 원형질화

1．배양수집한 세포를 200㎕의 무균수중에 띄워놓고,두개의 10㎕ 무균 원심분리튜브에 옮긴다;

2．실온에서 1500Xg 로 5분 원심분리하며 윗층을 버린다;

3. 10㎕ 새로 만든 SED로 침전을 씻는다. 실온에서 1500Xg로 5분 원심분리하여 윗층을 버린다;

4. 10㎕ 1M D-sorbitol로 침전을 씻어준다. 실온에서 1500Xg로 5분 원심분리하고 윗층을 버린다;

5. 10㎕ SCE로 다시 침전을 뛰운다;

6. Zymolyase한 튜브 취하여 녹은후 벽을 튕겨 용액이 잘 섞이게 한다;

7. 7.5㎕ Zymolyase을 취하여 튜브에 넣고 30℃에서 30분 둔다;

8. 실온에서 750Xg으로 10분 분리한다. 균체를 수집하고 윗층을 버린다;

9. 10㎕ 1M D-sorbitol로 원형질체를 씻어준다. 튜브 벽을 두드려 침전이 분산되게 한다 실온에서 750Xg로 10분 원심분리. 균체를 수집하고 윗층의 맑은 액체를 버림;

10. 10㎕ CaS로 균체를 씻어줌. 실온에서 750Xg으로 10분 원심분리, 균체를 수집하고 윗층을 버림;

11 침전을 0.6㎕ CaS에 놓는다. 이원형질은 30분내로 사용해야 한다.

（라）원형질법으로 비츠효모균GS115을 형질전환시키기

1. 100㎕ 비츠효모균원형질을 각각 취하여 A、B、C 3개 15㎕ 무균원심분리튜브에 넣는다;

2. A중에 DNA를 넣지 않고 음성대조를 하며 B에는 30㎕ 선형화된 원형질플라스미드 pHIL-S1,C에는 30㎕ 선형화된 플라스미드 pSA를 넣는다.실온에서 10min 둔다. 그 사이에 3㎕ 새로 만든 PEG/CaT를 준비한다;

3. 각 튜브에 1㎕ 새로 만든 PEG/CaT를 넣고 가볍게 골고루 섞는다. 실온에서 10분 둔다;

4. 실온에서 750Xg로 10분 원심분리한다. 윗층을 버리고 말린다;

5. 침전을 150㎕ SOS에 넣고 실온에서 20분동안 배양한다;

6. 각 튜브에850㎕ 1M D-sorbitol을 넣고 판에 펼 준비를 한다;

7. RD고체배양기에 도말한다. 매 판에 200㎕, 도말하고 28-30℃에서 거꾸로 두어 배양한다 형질전환자는 4-6일후 나타난다.

（마）Mut⁺형질전환자의 스크린

1．멸균한 요지로 His⁺형질전환자를 취하여 각각 MM와 MD판에 대응되게 점을 찍는다. 동시에 GS115/His⁺Mut^sAlbumin과 GS115/His⁺Mut⁺β-gal을 찍어 대조로 한다.

2．28-30℃에서 거꾸로 놓고 2일 배양한다;

3．2일후, MM과 MD판을 대조 관찰한다. 만일 두 판에서 모두 생장이 양호하 면 Mut⁺로 표기하고, 만일 MD에서 잘 자라고 MM판에서 적게 또는 안 자라면 Mut^s로 표기한다.

(바）재조합균의 유도발현

1．His⁺Mut⁺ 형질전환체의 단일복제을 취하여 25㎕ BMG에 접종하고,250㎕ 삼각플라스크에서 28-30℃로 250-300rpm에서 진탕배양하여 OD₆₀₀=2-6되게 한다（약16-18h）;

2．1500-3000Xg 5분 원심분리하여 세포를 수집한다. 윗층의 맑은 액을 버리고 세포를 BMM에 넣어 OD₆₀₀ 을 1.0이 되게 한다.（약100-200㎕ BMM 필요함）.1리터의 삼각플라스크중에서 28-30℃로250-300rpm 계속 진탕배양한다.

3．매 24h마다 100% 메탄올을 넣는다. 나중에 농도가 0.5%되게 하며 유도발현을 유지한다;

4．96h의 시간에 유도표시를 한다. 배양액을 2-3분 원심분리하고 상층의 액체를 취하여 -80℃에서 보존하여 발현생성물의 정제에 쓴다.

96시간 유도한후의 상부의 맑은 액체중의 단백질이 0.23mg/㎖에 달한다. 목표단백질의 분자량과

BioEdit소프트웨어로（http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.ht㎕）예측한 이론값인76.95kDa과 서로 부합된다.

실시예10: 재조합ADTZ의 정제

유도된 발효액은 70% 포화 황산암모늄（NH₄）₂SO₄으로 침전시킨다. 침전을 수집하여 조제효소를 얻는다. 조제 샘플은 똑같은 부피의 PBS로 용해하며 원심분리후 윗층의 액체를 소수성 크로마토그래피 방법으로 Phenyl sepharose칼럼으로 , 연속적 pH계도버퍼액으로 씻어내린후 목적한 피크를 수집한다. 투석으로 염을 제거하고 PBS용액이 평형후 농축시킨다. 농축한 효소액에 금속착화합물친수성크로마토그래피법으로 Chelating Sepharose칼럼으로 pH7.5~6.0에서 연속적 pH계도 버퍼액으로 씻어내리고 목적 피크를 수집한다. 구체적으로 아래와 같다:

1、황산암모늄침전으로 조제효소를 수집

재조합으로 발현된 발효액에 （NH₄）₂SO₄가루를 40% 포화도에 이를때까지 넣는다. 4℃,10000g로 20분 원심분리한다. 윗층에 계속 （NH₄）₂SO₄가루를 넣어 70%포화도에 이르게 한다.4℃,10000g로 20분 원심분리하여 조제효소를 얻는다.

2、소수층 분리: ADTZ조제효소 샘플을 똑같은 부피의 0.02M PBS（pH:6.0）로 용해시키고 4000 g 4℃에서 10분 원심분리시킨다. 윗층의 액체를 취하여 Phenyl sepharose칼럼으로 [Phenyl sepharose 6 Fast flow（high sub）,Pharmacia Biotech,Inc]내린다. 용액을（0.02 M PBS+30％포화황산암모늄,pH:6.0）으로 기준선까지 씻어준다. 다음 연속적 계도버퍼액으로 내린다[A（0.02 M PBS +10％포화홍산암모늄,pH:6.0）+B（0.02M PBS,pH:6.0）],활성피크를 수집하고 투석으로 염을 제거한다. 또 F（0.02 M PBS+0.5M NaCl,pH:7.5）로 평형시키고 단백질 농도가 약 1mg/ ㎖되게 한다.

3、금속착화합물로서의 분리: Chelating Sepharose[Chelating Sepharose Fast Flow,Pharmacia Biotech,Inc] 미리 0.2M CuCl₂용액으로 포화시키고, 순수물로 기준선까지 씻는다. 다시 F액（0.02 M PBS+0.5M NaCl,pH:7.5）으로 기준선이 안정할 때까지 씻어준다. 소수층을 지난 목적피크샘플을 올리고 각각 불연속적인 pH그래디언트 버퍼G[0.02 M PBS+0.5M NaCl,pH7.5~6.0의 불연속적인pH 버퍼（차례로 0.5pH단위가 증가함）]로 내리고 목적피크를 수집한다. 목적피크는 SDS-PAGE전기영동으로 감정한다.

결과 :유도발현후의 1리터 발효액에 상술한 정제를 거친후 58 mg 정제된 재조합 ADTZ 얻는다.순도는95%이상임.

실시예11:재조합ADTZ활성 시험

재조합ADTZ 활성 시험은 실시예2의 (가)의 방법으로 진행한다. 반응체계:（1）활성효소조:1㎕ AFB₁용액（AFB₁메탄올 용액:0.5㎍/㎕,질소기체 건조）+재조합발현ADTZ효소액（단백질함량: 0.1mg/㎕）300 ㎕+ 0.5 ㎕ MgSO₄+ 10 ㎕ PEG200 ;（2）활성을 죽인 조 :1㎕ AFB₁용액（AFB₁메탄올용액: 0.5㎍/㎕,질소기체건조）+활성을 죽인 재조합발현 ADTZ효소액（단백질함량: 0.1mg/㎕,미리100℃수욕에서 5예열）300 ㎕+ 0.5 ㎕ MgSO₄+ 10 ㎕ PEG200 ;（3）버퍼액 대조조:1㎕ AFB₁용 액（AFB₁메탄올용액:0.5㎍/㎕,질소기체건조）+PBS버퍼액（0.1M pH:6.6）300 ㎕+ 0.5 ㎕ MgSO₄ + 10 ㎕ PEG200;반응체계를 충분히 혼합하고 ,30℃수욕에서 1시간 반응시킨다. 그후 매시간마다 0.5㎕ AFB₁용액을 넣어 튜브내의 AFB₁총 양이 2 ㎍되게 한다. 다 넣은후 계속 6시간 반응시킨다. 반응이 끝난후 실시예2의 (가)에 따라 전개검측을 한다.

결과표시::재조합 ADTZ로 처리한 AFB₁생성물의 Rf값은 1（=0.93）에 접근하여 천연적인 ADTZ의 결과와 비슷하였다. 이는 재조합 ADTZ가 AFB₁활성을 형질전환시킨다는것을 의미한다. 결과는 도13에 표시하였다.

실시예12 재조합 ADTZ의 AFB ₁ 해독 생물학적 활성의 시험

재조합ADTZ생물학적 활성의 시험은 실시예2의 (나)에 따라 진행한다. 시험샘플의 제작은 천연 ADTZ을 재조합 ADTZ로 대체하고 나머지는 같게 하여 진행한다. 결과:활성재조합ADTZ로 처리한 반응조의 회복군락수와 음성대조조（DMSO대조조）와 비슷하였다.（MR값이 2보다 작음）.버퍼액으로 처리한 활성을 죽인 재조합 ADTZ처리 대조조의 회복돌연변이군락수는 음성대조조보다 뚜렷하게 높았다（MR값이 2보다 큼）.양성대조（아플라톡신B₁대조）한 세균회복돌연변이군락수는 뚜렷한 차이를 보이지 않았다. 이는 재조합ADTZ가 AFB₁가 일으키는 돌연변이에 저항하는 활성을 가지고있음을 설명한다. 결과는 아래표와 같다.

아플라톡신B₁ 의 재조합효소처리를 거친 후 세균 돌연변이 회복 실험

샘플	회복돌연변이수/플렛	MR	억제율（%）
PBS-대조조	379±7	12.03	~
활성죽인대조조	353±3	11.66	~
재조합효소처리조	30±01	1.01	98.06
AFB₁대조조	383±5	12.35	~
DMSO 대조조	26±8	~	~

서열목록 전자파일 첨부

Claims

등전점이 5.3~6.8이고, 분자량이 73~77Kda이며, 아미노산의 서열이 서열목록의 서열번호 1에 표시한 바와 같으며, 아플라톡신을 무독성으로 변화시키는 활성을 가진 해독효소.
제1항의 아플라톡신을 무독성으로 변화시키는 해독효소를 코딩 하는 핵산 서열을 포함하는 유전자.
제2항에 있어서, 핵산 서열은 서열목록의 서열번호 2에 표기한 바와 같은 것을 특징으로 하는 유전자.
제3항의 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 발현캐리어.
제4항의 재조합 발현캐리어를 이용하여 숙주세포를 형질전환시킴으로써 얻어지는 것을 특징으로 하는 형질전환체.
제1항의 해독효소의 제조방법으로서, 제5항의 형질전환체를 배양하는 절차와,

아플라톡신을 무독성으로 변화시키는 활성을 가진 해독효소를 균체로부터 분리, 크로마토그래피법을 이용하여 정제한 후 회수하는 절차를 포함하는 것을 특징으로 하는 해독효소의 제조방법.
사료와 식품의 아플라톡신 탈독제품을 제조하는 과정에 있어서 제1항의 아플라톡신을 무독성으로 변화시키는 활성을 가진 해독효소를 사용함을 특징으로 하는 사용방법.
아플라톡신으로 유발된 종양을 예방하거나 치료할때 사용하는 약품을 제조하는 과정에서 제1항의 아플라톡신을 무독성으로 변화시키는 활성을 가진 해독효소를 사용함을 특징으로 하는 사용방법.