CN111826384B

CN111826384B - 一种适冷核糖核酸酶r及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN111826384B
Application number: CN201910323090.0A
Authority: CN
Inventors: 侯艳华; 王亚彤; 王全富; 王一帆
Original assignee: Harbin Institute of Technology Weihai
Current assignee: Harbin Institute of Technology Weihai
Priority date: 2019-04-22
Filing date: 2019-04-22
Publication date: 2022-08-02
Anticipated expiration: 2039-04-22
Also published as: CN111826384A

Abstract

本发明公开了一种适冷核糖核酸酶R及其编码基因与应用，本发明首先从南极海冰微生物嗜冷杆菌（Psychrobactersp.）中克隆了一段新型适冷核糖核酸酶R编码基因，氨基酸残基序列如SEQ ID No.2所示。序列分析表明：该基因所编码的蛋白序列共含有770个氨基酸残基，属于RNR超家族，与目前数据库中已发表的蛋白序列的最高同源性为90.07%。其表达方式是利用质粒pET‑28(+)构建含有核糖核酸酶R基因的重组表达载体，并将构建的重组表达载体转入大肠杆菌宿主细胞（Escherichia coli），经诱导使核糖核酸酶R基因表达。本发明的表达产物核糖核酸酶R最适催化温度为30℃左右，在15~40℃之间保持最高酶活的50%以上；在0~3 M NaCl存在时保持最高酶活的85%以上，具有广阔的应用前景。本发明的表达产物具有突出的适冷性，稳定性较好，有一定的耐盐性，开辟了其在食品，医药，分子生物学相关领域中的潜在应用。

Description

一种适冷核糖核酸酶R及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于酶工程及食品、医药等相关领域，尤其涉及一种适冷核糖核酸酶R及其编码基因与应用。

背景技术

核糖核酸酶（Ribonuclease，RNase）是生物体内重要的核酸水解酶，其作用是水解核酸残基之间的磷酸二酯键，生成单核苷酸或寡聚核苷酸，在RNA代谢过程中起着重要作用。RNase家族因其具有特殊的生物学活性和药理学功能，在食品、医药及分子生物学科研等领域具有较高的应用价值。核糖核酸酶R是核糖核酸酶家族的一员，主要作用于核酸中3’-5’磷酸二酯键。核糖核酸酶R可参与控制细胞内RNA的种类与数量分布，还能修饰mRNA和降解不同类型的RNA（包括tRNA和rRNA）。此外，核糖核酸酶R参与tmRNA-SmpB 介导的反式翻译过程，16S和5S rRNA的加工过程，以及与核糖体30S小亚基和核糖体S13蛋白的稳定性有关。

从动植物中提取的核糖核酸酶R易受时节、气候和地域的限制，且稳定性较差，难以直接应用于工业生产等相关领域。利用重组基因工程菌诱导表达是降低成本和获得具有天然活性的核糖核酸酶R的有效途径。南极由于其富有的地理及气候特征，形成了一个干燥、酷寒、强辐射的自然环境，孕育了丰富的极端微生物资源和新型低温酶资源。鉴于上述论述，从南极微生物Psychrobacter sp.体内克隆得到适冷核糖核酸酶R，且该基因在大肠杆菌中实现了表达，并具有特殊活性，可应用于食品，医药，分子生物学相关领域。

发明内容

本发明的目的在于提供一种适冷核糖核酸酶R及其编码基因和应用，所述核糖核酸酶R具有适冷性和耐盐性，具有良好的工业前景。

本发明实现目的的技术方案是：

一种新型适冷核糖核酸酶R编码基因，所述基因序列见SEQ ID NO.1。

一种新型适冷核糖核酸酶R，由上述基因编码，其氨基酸序列见SEQ ID NO.2，蛋白序列共含有770个氨基酸残基，属于RNR超家族，与目前数据库中已发表的蛋白序列的最高同源性为90.07%，并在大肠杆菌中实现了功能表达，获得一株高产适冷核糖核酸酶R的基因工程菌。

一种新型适冷核糖核酸酶R的基因工程菌，包括上述的基因。

所述工程菌的宿主菌为E.coliBL21。

所述工程菌的载体为pET-28a (+)。

上述基因工程菌发酵获得的适冷核糖核酸酶R。

而且，所述酶最适催化温度为30 ℃，在15 ~ 40 ℃之间保持最高酶活的50%以上；在0 ~ 3 M NaCl存在时保持最高酶活的85%以上。

附图说明

图1为适冷核糖核酸酶R表达纯化后的SDS-PAGE检测图；

图2为适冷核糖核酸酶R最适温度检测图；

图3为不同浓度的NaCl对适冷核糖核酸酶R酶活影响图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

实施例1：

核糖核酸酶R基因的克隆及测序分析。

南极微生物Psychrobactersp. ANT206于2216E液体培养基中活化，培养至对数生长期的中后期（约4d），结合CTAB法和苯酚-氯仿抽提法提取菌株的总基因DNA。以提取的总DNA为模板，利用简并引物进行PCR。

上游引物：5’- ATGANGGAATGATCRACGCCT -3’

下游引物：5’- ANGTTTGGATCATTNACTCAT -3’

扩增条件为：94 ℃变性1 min，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，循环30次。然后通过琼脂糖凝胶电泳检测从中寻找含有目的基因适冷核糖核酸酶R的条带并进行测序。分析测序结果，得到一个全长为2 313 bp完整阅读框序列的基因，核苷酸序列见SEQ IDNO.1，编码一个由770个氨基酸组成的蛋白质，氨基酸序列件SEQ ID NO.2。

实施例2：

核糖核酸酶R基因的表达与纯化

根据测定的适冷核糖核酸酶R的全长序列重新设计含有酶切位点的引物。

上游引物：5’- ACTGGATCCATGTCAAACCAAGATC -3’

下游引物：5’- TACCTCGAGCGCTCTTTTTACTACT -3’

划线处分别为BamHI，XhoI酶切位点。

将适冷核糖核酸酶R基因与pET-28a（+）双酶切后胶回收产物按比例利用T4连接酶连接，构建重组表达载体。将重组表达载体转化至感受态细胞E. coli BL21中，进行阳性克隆筛选及酶切验证。

将筛选得到的重组菌株，利用IPTG诱导表达。将重组菌接种至LB培养基中，32 ~40 ℃下培养至OD₆₀₀为0.6 ~ 0.8，培养基中加入IPTG至终浓度为0.5 ~ 1.5 mM，18 ~ 22℃下诱导发酵12 ~ 18 h。离心，收集菌体沉淀，冰浴中研磨和超声波破碎，提取粗蛋白。用Ni柱亲和层析对适冷核糖核酸酶R重组蛋白进行纯化，进行SDS-PAGE电泳分析，最终得到单一目的条带，其分子量约为87.4 kDa。结果如图1所示，1，标准分子量蛋白marker；2，空白质粒对照；3，重组菌；3，纯化的核糖核酸酶R。Ni柱亲和层析具体实施方案如下：提取粗蛋白上Ni柱后，使用5 ~ 20 mM咪唑洗脱8 ~ 10个柱体积，40 ~ 60 mM咪唑洗脱8 ~ 10个柱体积，最后用100 ~ 500 mM咪唑洗脱8 ~ 10个柱体积，收集峰值处洗脱液，得到纯化后的适冷核糖核酸酶R。

实施例3：

重组适冷核糖核酸酶R酶学性质的研究

（1）最适反应温度的测定：在不同温度(0 ~ 50 ℃)和pH 6.0的条件下，测定适冷核糖核酸酶R的酶活，将最高酶活定为100％，其他温度下的酶活与最高酶活的比值即为待测酶液在该温度下的相对酶活。结果如图2所示，结果表明：该酶的最适作用温度在28 ~ 32℃之间，在20 ~ 35 ℃时酶活扔保持在最高酶活的85%以上，当温度超过35 ℃时，随着温度的升高，酶活力逐渐下降，当温度达到50 ℃以上，酶活基本丧失。

（2）不同浓度的NaCl对酶活的影响：将酶置于不同浓度NaCl （0 ~ 4.0 M）保温30min，在30 ℃、pH 6.0的条件下测定测残余酶活，未用NaCl处理的酶活作为100%。结果如图3所示，结果表明适冷核糖核酸酶R在NaCl浓度为1.5 M时，酶活最高，在0 ~ 3 M NaCl处理下，残余酶活仍能达到85%以上，说明其有一定的耐盐性。

综上所述，本发明中的核糖核酸酶R的最适温度为30 ℃，在1.5 M NaCl存在时酶活最高，具有适冷性和耐盐性，为工业应用奠定了基础。

序列表

<110> 哈尔滨工业大学（威海）

<120> 一种适冷核糖核酸酶R及其编码基因与应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2313

<212> DNA

<213> 嗜冷杆菌ANT206(Psychrobacter sp. ANT206)

<400> 1

atgagttgga atgatccaaa cgcctcaagt gaggcacaaa aatatgataa cccgattcct 60

agtcgcgagc ttatattaag cacgattaat gaacacggtg aaatcaccca tcagcaattg 120

gcaaaagcct ttaatattgc tgatcccgat cagtttgacg ctttaggcaa ccgcctaaaa 180

gcgatgacac gcgatggaca agtcaatcgt gacggtcgcc cttatcgcta tcgtacggtc 240

actcagcacg acatcgtcac cggtacagta acagcccatc caaagggctt tggctttgta 300

ttattaagtg atatgcctga cctattcttg catgaaaaac aaatgcgttg ggtctttaat 360

ggcgatacag tagaagccgt tggcacgtca acagacaacc gcggtcgtac tgaaggtcgt 420

atcgttgatg tcgttgagcg tcgtcaaaat cattttatcg gtacgctggc tcatgatgaa 480

gacggttact gcgttgagct tggtagccca aataaccatc agccgattac cgttacagaa 540

gacaatgtac aggctttcaa tgctaagcaa ggctcgccgg taaaagttga tattattgat 600

tggccaaatc agcatgaatt tgccacgggc aaaatcgttg aagtcatgga tgatgacaat 660

gatcgcgaag taatcattga gactacgtta tataattatg atattccaca tgagttcggt 720

gccgcgactc tcgagcaagc agcttcgtat aaagagccga ctgaaaaaga tttcaaaaat 780

cgtactgact tacgtcaatt gccattagtg acgatcgatg gtgaagattc ccgtgacttt 840

gatgatgctg tgtatgcaga aaagcgtaca ggtggtaatt atcgcgtcgt ggtagcgatt 900

agtgatgtca gtcattatgt gacaccgcag tcgccacttg atcacgaagc ctacgagcgt 960

ggtacgtcag tatatttccc gcatcatgtg gtgcctatgt tgcctgaagt actgtctaat 1020

ggtctctgtt cgctgaagcc tggcgtcgat cgcctctgta tggttgctga tattaaggta 1080

tcacgtacag gtaaaatcac cagttatgag ttttatccta gtgtcatgca ctcgcaagcg 1140

cgcttgactt acaatcaagt gaacgattat tttgtagatc caactgacga gagcgttcca 1200

gacgaattga caagaaataa agacgtcaaa aaatctatag ataccatgtt ccaactgtat 1260

gaggtactcg ataaaaagcg tgaacaacgt aacgcgatgg agtttgagac cccagaaact 1320

tatattaagt tcgatgaaga aggtgatatc gatgatatcg taaagcgtac gcgcggtgat 1380

tcacataagc ttatcgaaga gatgatgttg cttgccaata cctgtgcagc aaacttttca 1440

ctaaaacacg agctgcctgt gttatatcgt aatcatgata agcctgatga tgaaaagtcg 1500

agaattttac atgaatatgt caaaaacttt ggtctaccct tcccacagga aagtcctact 1560

cacgaggatt ataaacgtat cattgaagca actaaagagc gaccggatgc ggttagcatt 1620

catagcatgc tgcttcgttc gatgatgcaa gcgaactatt cacctgacaa tatcggtcac 1680

tttggtttgg cttacgatga gtatagtcat tttacctcgc cgattcgtcg ttatcctgac 1740

ttaatgttgc atcgtgcgat caaggcgaaa gtgacaaatg ccaaacagcc tgtgatggat 1800

ttttcattag aaggtgctgg catgcaaacc tcagatactg agcgccgtgc tgaaaaggct 1860

tcacgctacg tagaatcatg gctcaaatgt cattatatga aagatcatgt cggcgaagag 1920

ttcgatggtg tcgtaactac cgtcacaaac tttggtttat ttattactct gacggatttg 1980

tatatcgatg gtttggtgca tatctcaaac gttggtgacg atttctttgt ttatgatgag 2040

cagcagcaac agcttatcgg taaagataga ggcacagtgt ttgggctggg cgatttggtt 2100

aaagttaaag tagctggcgt taatatggat ctgctacaaa ttgactttgg tttacaagca 2160

aagctgcaat ctagtaaaat gaatcaaact aagaaagatc attcaaactc tagtcagcca 2220

aaccgcagct ccacaagcaa agatcagcca aagaaatcac ctgcgaagag aagcggcagt 2280

cgtggtggta gaggcagtag taaaaagagc taa 2313

<210> 2

<211> 770

<212> PRT

<213> 嗜冷杆菌ANT206(Psychrobacter sp. ANT206)

<400> 2

Met Ser Trp Asn Asp Pro Asn Ala Ser Ser Glu Ala Gln Lys Tyr Asp

1 5 10 15

Asn Pro Ile Pro Ser Arg Glu Leu Ile Leu Ser Thr Ile Asn Glu His

20 25 30

Gly Glu Ile Thr His Gln Gln Leu Ala Lys Ala Phe Asn Ile Ala Asp

35 40 45

Pro Asp Gln Phe Asp Ala Leu Gly Asn Arg Leu Lys Ala Met Thr Arg

50 55 60

Asp Gly Gln Val Asn Arg Asp Gly Arg Pro Tyr Arg Tyr Arg Thr Val

65 70 75 80

Thr Gln His Asp Ile Val Thr Gly Thr Val Thr Ala His Pro Lys Gly

85 90 95

Phe Gly Phe Val Leu Leu Ser Asp Met Pro Asp Leu Phe Leu His Glu

100 105 110

Lys Gln Met Arg Trp Val Phe Asn Gly Asp Thr Val Glu Ala Val Gly

115 120 125

Thr Ser Thr Asp Asn Arg Gly Arg Thr Glu Gly Arg Ile Val Asp Val

130 135 140

Val Glu Arg Arg Gln Asn His Phe Ile Gly Thr Leu Ala His Asp Glu

145 150 155 160

Asp Gly Tyr Cys Val Glu Leu Gly Ser Pro Asn Asn His Gln Pro Ile

165 170 175

Thr Val Thr Glu Asp Asn Val Gln Ala Phe Asn Ala Lys Gln Gly Ser

180 185 190

Pro Val Lys Val Asp Ile Ile Asp Trp Pro Asn Gln His Glu Phe Ala

195 200 205

Thr Gly Lys Ile Val Glu Val Met Asp Asp Asp Asn Asp Arg Glu Val

210 215 220

Ile Ile Glu Thr Thr Leu Tyr Asn Tyr Asp Ile Pro His Glu Phe Gly

225 230 235 240

Ala Ala Thr Leu Glu Gln Ala Ala Ser Tyr Lys Glu Pro Thr Glu Lys

245 250 255

Asp Phe Lys Asn Arg Thr Asp Leu Arg Gln Leu Pro Leu Val Thr Ile

260 265 270

Asp Gly Glu Asp Ser Arg Asp Phe Asp Asp Ala Val Tyr Ala Glu Lys

275 280 285

Arg Thr Gly Gly Asn Tyr Arg Val Val Val Ala Ile Ser Asp Val Ser

290 295 300

His Tyr Val Thr Pro Gln Ser Pro Leu Asp His Glu Ala Tyr Glu Arg

305 310 315 320

Gly Thr Ser Val Tyr Phe Pro His His Val Val Pro Met Leu Pro Glu

325 330 335

Val Leu Ser Asn Gly Leu Cys Ser Leu Lys Pro Gly Val Asp Arg Leu

340 345 350

Cys Met Val Ala Asp Ile Lys Val Ser Arg Thr Gly Lys Ile Thr Ser

355 360 365

Tyr Glu Phe Tyr Pro Ser Val Met His Ser Gln Ala Arg Leu Thr Tyr

370 375 380

Asn Gln Val Asn Asp Tyr Phe Val Asp Pro Thr Asp Glu Ser Val Pro

385 390 395 400

Asp Glu Leu Thr Arg Asn Lys Asp Val Lys Lys Ser Ile Asp Thr Met

405 410 415

Phe Gln Leu Tyr Glu Val Leu Asp Lys Lys Arg Glu Gln Arg Asn Ala

420 425 430

Met Glu Phe Glu Thr Pro Glu Thr Tyr Ile Lys Phe Asp Glu Glu Gly

435 440 445

Asp Ile Asp Asp Ile Val Lys Arg Thr Arg Gly Asp Ser His Lys Leu

450 455 460

Ile Glu Glu Met Met Leu Leu Ala Asn Thr Cys Ala Ala Asn Phe Ser

465 470 475 480

Leu Lys His Glu Leu Pro Val Leu Tyr Arg Asn His Asp Lys Pro Asp

485 490 495

Asp Glu Lys Ser Arg Ile Leu His Glu Tyr Val Lys Asn Phe Gly Leu

500 505 510

Pro Phe Pro Gln Glu Ser Pro Thr His Glu Asp Tyr Lys Arg Ile Ile

515 520 525

Glu Ala Thr Lys Glu Arg Pro Asp Ala Val Ser Ile His Ser Met Leu

530 535 540

Leu Arg Ser Met Met Gln Ala Asn Tyr Ser Pro Asp Asn Ile Gly His

545 550 555 560

Phe Gly Leu Ala Tyr Asp Glu Tyr Ser His Phe Thr Ser Pro Ile Arg

565 570 575

Arg Tyr Pro Asp Leu Met Leu His Arg Ala Ile Lys Ala Lys Val Thr

580 585 590

Asn Ala Lys Gln Pro Val Met Asp Phe Ser Leu Glu Gly Ala Gly Met

595 600 605

Gln Thr Ser Asp Thr Glu Arg Arg Ala Glu Lys Ala Ser Arg Tyr Val

610 615 620

Glu Ser Trp Leu Lys Cys His Tyr Met Lys Asp His Val Gly Glu Glu

625 630 635 640

Phe Asp Gly Val Val Thr Thr Val Thr Asn Phe Gly Leu Phe Ile Thr

645 650 655

Leu Thr Asp Leu Tyr Ile Asp Gly Leu Val His Ile Ser Asn Val Gly

660 665 670

Asp Asp Phe Phe Val Tyr Asp Glu Gln Gln Gln Gln Leu Ile Gly Lys

675 680 685

Asp Arg Gly Thr Val Phe Gly Leu Gly Asp Leu Val Lys Val Lys Val

690 695 700

Ala Gly Val Asn Met Asp Leu Leu Gln Ile Asp Phe Gly Leu Gln Ala

705 710 715 720

Lys Leu Gln Ser Ser Lys Met Asn Gln Thr Lys Lys Asp His Ser Asn

725 730 735

Ser Ser Gln Pro Asn Arg Ser Ser Thr Ser Lys Asp Gln Pro Lys Lys

740 745 750

Ser Pro Ala Lys Arg Ser Gly Ser Arg Gly Gly Arg Gly Ser Ser Lys

755 760 765

Lys Ser

770

Claims

1.一种适冷核糖核酸酶R编码基因，其特征在于，其基因序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种适冷核糖核酸酶R，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种含有权利要求1所述的适冷核糖核酸酶R编码基因的重组表达载体。

4.一种含有权利要求3所述的重组表达载体的基因工程菌。

5.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述的工程菌为大肠杆菌E.coliBL21(DE3)。

6.一种诱导表达权利要求2所述的适冷核糖核酸酶R的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将转有编码所述适冷核糖核酸酶R的基因的重组菌，在32～40℃下培养至OD 600为0.6～0.8，培养基中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-d-thiogalactoside，IPTG)至终浓度为0.5～1.5mM，18～22℃下诱导发酵12～18h，即可诱导表达所述适冷核糖核酸酶R。