CN110791508A

CN110791508A - 密码子优化的片球菌素基因、表达载体及重组工程菌株

Info

Publication number: CN110791508A
Application number: CN201911125081.7A
Authority: CN
Inventors: 王建荣; 王鹏; 王玲玲
Original assignee: SHENZHEN SUNSMILE BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: SHENZHEN SUNSMILE BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2019-11-18
Filing date: 2019-11-18
Publication date: 2020-02-14
Anticipated expiration: 2039-11-18
Also published as: CN110791508B

Abstract

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种密码子优化的片球菌素基因、表达载体及重组工程菌株。所述片球菌素密码子优化基因peda‑op的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述的信号肽S1的序列如SEQ ID NO.2所示。本发明首先根据毕赤酵母密码子偏好性优化了片球菌素基因获得peda‑op，其次将peda‑op连入不同信号肽表达载体进行表达，通过筛选获得最适信号肽S1，S1重组工程菌在5L发酵罐的表达量达到1.83g/L，为片球菌素的产业化奠定基础。

Description

密码子优化的片球菌素基因、表达载体及重组工程菌株

技术领域

本发明属于分子生物学领域，特别涉及一种密码子优化的片球菌素基因peda-op、其重组表达信号肽S1以及包含peda-op及信号肽S1的重组工程菌。

背景技术

李斯特菌是食品中一种常见的致病菌，研究发现常规食品(蛋类、肉类、乳制品以及蔬菜等)均能成为李斯特菌的感染源。误食被李斯特菌感染的食品容易引起身体发生病变，因此需要对食品进行良好的包装和储存以防李斯特菌的感染。和许多细菌不同，李斯特菌能够在低温条件下生长和繁殖，加大了李斯特菌的控制难度。通过科学家的研究发现片球菌素PedA对李斯特菌具有强烈的抑制作用，低剂量条件下便能很好的抑制李斯特菌的生长和繁殖。片球菌素PedA虽具有很好的抑制作用，但是天然菌PedA表达量低，导致PedA生产成本高，限制了PedA的产业化应用。因此提高PedA表达量，降低其生产成本具有重要的意义。

异源重组表达能够有效提升PedA的表达量，目前PedA的异源表达主要集中在大肠杆菌。相比大肠杆菌表达系统，毕赤酵母表达系统则具有很多优点如：重组蛋白胞外分泌，内源蛋白少等优点。本专利以毕赤酵母为表达宿主，通过密码子优化、信号肽筛选最终获得一株高效表达PedA的重组毕赤酵母工程菌，为PedA的产业化应用奠定基础。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种密码子优化的片球菌素基因peda-op、peda-op在毕赤酵母重组表达最适信号肽S1以及包含peda-op和信号肽S1的重组毕赤酵母工程菌，从而实现PedA的高效表达。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种密码子优化的片球菌素基因，所述片球菌素基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

进一步的改进，所述片球菌素基因对应的信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

进一步的改进，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

进一步的改进，所述片球菌素基因的扩增引物如SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示。

一种片球菌素基因的表达载体，所述表达载体中包含有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

进一步的改进，所述表达载体中包含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的信号肽序列，所述信号肽序列的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列、SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列、SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列、SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列或SEQ IDNO.8所示的核苷酸序列。

进一步的改进，所述信号肽序列的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

一种重组毕赤酵母工程菌，所述重组毕赤酵母工程菌有片球菌素基因的表达载体，所述所述表达载体中包含有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

进一步的改进，所述信号肽序列的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列、SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列、SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列、SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列或SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：本发明根据毕赤酵母密码子偏好性，首次通过密码子优化获得基因peda-op，将peda-op连接至表达载体pPICZαA获得表达载体pPICZαA-peda-op。其次首次优化了peda-op在毕赤酵母重组表达所用的信号肽，以pPICZαA-peda-op为模板，构建了其它5种不同信号肽表达载体，通过筛选获得最适信号肽S1，S1重组菌在5升发酵罐最高表达量达到1.83g/L。相对于天然戊糖片球菌，本发明有效的提升了抗菌肽PedA的表达量，为其产业化应用奠定基础。

附图说明

图1密码子优化基因peda-op与原始基因peda序列比对图。

图2不同信号肽摇瓶培养发酵上清抑菌效果图。

图3 S1信号肽重组工程菌不同发酵时间PedA蛋白胶电泳图。

图4 S1信号肽重组工程菌5L发酵罐发酵曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。本发明中涉及到的实验材料和试剂：

1、菌株与载体

大肠杆菌菌株Top10、毕赤酵母X33、表达载体pPICZαA均从商业途径购买获得。

2、酶与试剂盒

Q5高保真Taq酶MIX购自NEB公司；质粒提取，胶纯化试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；限制性内切酶购自宝日医生物技术(北京)有限公司；Zeocin购自Invitrogen公司，蛋白测定试剂盒购自上海生工股份有限公司。

3、培养基

大肠杆菌培养基为LB(1％(w/v)蛋白胨，0.5％(w/v)酵母提取物，1％(w/v)NaCl，pH7.0)。LBZ为LB培养基加25μg/mL Zeocin(博莱霉素)。

酵母培养基为YPD(1％(w/v)酵母提取物，2％(w/v)蛋白胨，2％(w/v)葡萄糖)。酵母筛选培养基为YPDZ(YPD+100mg/L zeocin)。

酵母诱导培养基BMGY(1％(w/v)酵母提取物、2％(w/v)蛋白胨、1.34％(w/v)YNB、0.00004％(w/v)Biotin、1％甘油(V/V))和BMMY培养基(除以0.5％(v/v)甲醇代替甘油，其余成份相与BMGY相同)。

注：YNB为酵母氮源基础(Yeast Nitrogen Base)；Biotin为生物素。

实施例1、peda-op表达载体构建

分析NCBI网站报道的peda基因(KT345707.1)发现peda基因全长为189bp，编码62个氨基酸，其中蛋白N端前18个氨基酸为信号肽。根据毕赤酵母密码子偏好性，通过全基因合成技术合成密码子优化基因peda-op。peda-op和peda序列比对如图1所示。根据peda-op的序列设计一对引物,(如SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示，引物序列分别为fw：5'-agtcgaattcAAATACTACGGTAATGGGGTT-3'和rev：5'-ttctctagaCTAGCATTTATGATTACCTTG-3')用于扩增不含信号肽的成熟肽基因peda-op，将扩增得到的片段克隆到表达载体pPICZαA，得到重组载体pPICZαA-peda-op。

实施例2、peda-op不同信号肽表达载体构建

除α-MF信号肽外，本发明还选取了5种不同信号肽进行重组表达实验，这5种信号肽的序列如表1所示，不同信号肽表达载体的构建过程大致如下(以信号肽S1表达载体为例，其他以此类推)：(1)以构建好的pPICZαA-peda-op为模板，通过引物PIC-fw和PIC-rev进行PCR扩增，琼脂糖电泳检测PCR扩增结果，纯化回收PCR产物，作为主框架(去掉了pPICZαA-peda-op的α-MF信号肽)；(2)通过引物合成法将引物S1-fw和S1-rev进行融合获得信号肽S1；将S1和主框架融合后，转入大肠杆菌Top10，通过菌液PCR验证重组转化子，将验证正确的转化子进行质粒提取并进行测序，从而确定获得表达载体pPICZαA-peda-op-S1。其它4种不同信号肽表达载体参照上述方法一一进行构建。

表1不同信号肽序列(分别如SEQ ID NO.3和5-8所示)

表2不同信号肽所用引物(分别如SEQ ID NO.9-20所示)

引物	序列(5’-3’)
		PIC-Fw	GAATTCAAATACTACGGTAAT
PIC-Rev	CGTTTCGAATAATTAGTTGTT
		S1-Fw	AATTATTCGAAACGATGCTTTTGCAAGCTTTCCTTTTCCTTTTGGCTGG
S1-Rev	GTATTTGAATTCTGCAGATATTTTGGCTGCAAAACCAGCCAAAAGGA
		S2-Fw	TAATTATTCGAAACGATGTCTTTTAGATCCTTGTTGGCTTTGTCTGGTTT
S2-Rev	AGTATTTGAATTCAGCCAAACCAGAACAAACCAAACCAGACAAAGCCA
		S3-Fw	AATTATTCGAAACGATGAAGTTAGCATACTCCTTGTTGCTTCCAT
S3-Rev	GTATTTGAATTCAGCACTGACTCCTGCCAATGGAAGCAACAAGGA
		S4-Fw	TAATTATTCGAAACGATGAAGTGGGTTACCTTTATCTCTTTGTTGTTTCT
S4-Rev	GTATTTGAATTCAGAGTAAGCAGAAGAGAAAAGAAACAACAAAGAGAT
		S5-Fw	CTAATTATTCGAAACGATGCTATCAACTATCTTAAATATCTTTATCCTGTTGCTCT
S5-Rev	TATTTGAATTCCTGTAGGGATGCCTGTATGAAGAGCAACAGGATAAAGATA

实施例3、不同信号肽重组毕赤酵母构建及筛选

将pPICZαA-peda-op及其它5种不同信号肽表达载体用SacI线性化后转入毕赤酵母X33，将重组转化子涂布于不同浓度的Zeocin抗性平板上(100ug/ml-500ug/ml)。将平板长出的酵母重组转化子用牙签逐个挑至每孔含有2mL BMGY培养基的24孔板中，30℃，220rpm培养36h左右，再分别加入1％(v/v)的甲醇进行诱导培养。30℃，220rpm培养48小时后，离心取上清进行抑菌实验测定。抑菌实验测定具体步骤如下：(1)将李斯特菌(ATCC10417)培养至对数生长期(OD600大约为1)，将培养好的菌液按照1μl/ml加入到无菌培养基中制作平板。(2)用半径为3mm的打孔器在固体平板上打孔，将不同的上清培养液加入孔中(加入体积为75μL)，低温(4℃-8℃)放置2小时；(3)从冰箱取出平板，在37℃静置培养24小时后测定抑菌圈，根据抑菌圈的大小，初步判断每个菌的表达量，每种信号肽均挑选一个抑菌效果最好的重组菌进行摇瓶比较。

实施例4、摇瓶培养比较

分别将不同信号肽抑菌效果最好的重组菌进行摇瓶培养比较，这6个菌分别命名为X33-α(α-MF信号肽)、X33-S1(S1信号肽)、X33-S2(S2信号肽)、X33-S3(S3信号肽)、X33-S4(S4信号肽)和X33-S5(S5信号肽)。摇瓶诱导培养96小时后进行抑菌实验，抑菌半径值的结果如图2所示。由图2可知，X33-S1的抑菌半径最大为8mm。由于X33-S1抑菌效果最好，因此选择其进行下一步高密度发酵实验。

实施例5、重组酵母工程菌高密度发酵

高密度发酵条件具体如下：挑取单菌落接种于100mL BMGY培养基中，30℃、240rpm培养20h。以1：50的比例接种到300mL BMGY培养基中，30℃、240rpm培养至OD_600nm＝5，用以接种发酵罐。5L发酵罐加入2L发酵基础培养基，121℃灭菌20min，调节温度至30℃，用氨水调节pH至5.0，加入PTMl(4.35mL/L)，接入种子菌(1：10)。发酵过程中，温度控制在30℃，转速控制在400-600rpm之间以维持溶氧20％以上。

发酵分为三个阶段：生长期，从加入种子菌，培养约16-24h，直到将发酵罐中甘油耗尽，表现为溶氧突然上升；之后进入甘油促生长期，补加50％甘油(含有PTMl)，持续4-6h；最后进入诱导期，用氨水或磷酸调节pH至所需值，流加100％甲醇(含有PTMl)进行诱导培养。

重组工程菌X33-S1的表达量测定方法如下：(1)首先测定发酵液上清中总蛋白的含量：使用改良型的Bradford试剂盒测定发酵上清液中的总蛋白含量。取100μL样品稀释液(对照组加入100μL蒸馏水)，加入1mL Bradford试剂，迅速混匀，室温静置15分钟，在595nm下测定吸光值；(2)将发酵液上清进行SDS-PAGE蛋白胶电泳；(3)通过软件Quantity One分析重组PedA在上清蛋白所占的比例，根据比例乘以总蛋白含量便得到重组PedA的表达量。

由图3可知，发酵上清液中主要以重组PedA为主。重组工程菌X33-S1在5L发酵罐的表达量如图4所示，由图4可知，随着发酵时间的增加，重组PedA的表达量也逐渐增加，当诱导培养时间为144小时，重组PedA的表达量达到1.83g/L。目前大肠杆菌重组表达高密度发酵融合型PedA(将PedA和标签蛋白进行融合)的最高表达量约为0.35g/L，天然菌摇瓶培养PedA的表达量约为1.5mg/L，因此本发明重毕赤酵母工程菌PedA的表达量具有明显的优势，为PedA的产业化奠定基础。

序列表

<110> 深圳市圣西马生物技术有限公司

<120> 密码子优化的片球菌素基因、表达载体及重组工程菌株

<130> 1

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 135

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 1

aagtactacg gtaacggtgt gacctgtggt aagcactctt gttctgttga ctggggtaaa 60

gccaccacct gtatcattaa caacggtgct atggcttggg ctactggtgg tcatcaaggt 120

aaccacaagt gttaa 135

<210> 2

<211> 62

<212> PRT

<213> 人工合成()

<400> 2

Met Lys Lys Ile Glu Lys Leu Thr Glu Lys Glu Met Ala Asn Ile Ile

1 5 10 15

Gly Gly Lys Tyr Tyr Gly Asn Gly Val Thr Cys Gly Lys His Ser Cys

20 25 30

Ser Val Asp Trp Gly Lys Ala Thr Thr Cys Ile Ile Asn Asn Gly Ala

35 40 45

Met Ala Trp Ala Thr Gly Gly His Gln Gly Asn His Lys Cys

50 55 60

<210> 3

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 3

atgcttttgc aagctttcct tttccttttg gctggttttg cagccaaaat atctgca 57

<210> 4

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工合成()

<400> 4

Met Leu Leu Gln Ala Phe Leu Phe Leu Leu Ala Gly Phe Ala Ala Lys

1 5 10 15

Ile Ser Ala

<210> 5

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 5

atgtctttta gatccttgtt ggctttgtct ggtttggttt gttctggttt ggct 54

<210> 6

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 6

atgaagttag catactcctt gttgcttcca ttggcaggag tcagtgct 48

<210> 7

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 7

atgaagtggg ttacctttat ctctttgttg tttcttttct cttctgctta ctct 54

<210> 8

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 8

atgctatcaa ctatcttaaa tatctttatc ctgttgctct tcatacaggc atccctacag 60

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 9

gaattcaaat actacggtaa t 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 10

cgtttcgaat aattagttgt t 21

<210> 11

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 11

aattattcga aacgatgctt ttgcaagctt tccttttcct tttggctgg 49

<210> 12

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 12

gtatttgaat tctgcagata ttttggctgc aaaaccagcc aaaagga 47

<210> 13

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 13

taattattcg aaacgatgtc ttttagatcc ttgttggctt tgtctggttt 50

<210> 14

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 14

agtatttgaa ttcagccaaa ccagaacaaa ccaaaccaga caaagcca 48

<210> 15

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 15

aattattcga aacgatgaag ttagcatact ccttgttgct tccat 45

<210> 16

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 16

gtatttgaat tcagcactga ctcctgccaa tggaagcaac aagga 45

<210> 17

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 17

taattattcg aaacgatgaa gtgggttacc tttatctctt tgttgtttct 50

<210> 18

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 18

gtatttgaat tcagagtaag cagaagagaa aagaaacaac aaagagat 48

<210> 19

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 19

ctaattattc gaaacgatgc tatcaactat cttaaatatc tttatcctgt tgctct 56

<210> 20

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 20

tatttgaatt cctgtaggga tgcctgtatg aagagcaaca ggataaagat a 51

<210> 21

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 21

agtcgaattc aaatactacg gtaatggggt t 31

<210> 22

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 22

ttctctagac tagcatttat gattaccttg 30

Claims

1.一种密码子优化的片球菌素基因，其特征在于，所述片球菌素基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的密码子优化的片球菌素基因，其特征在于，所述片球菌素基因对应的信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.如权利要求1所述的密码子优化的片球菌素基因，其特征在于，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

4.如权利要求1所述的密码子优化的片球菌素基因，其特征在于，所述片球菌素基因的扩增引物如SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示。

5.一种片球菌素基因的表达载体，其特征在于，所述表达载体中包含有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

6.如权利要求5所述的片球菌素基因的表达载体，其特征在于，所述表达载体中包含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的信号肽序列，所述信号肽序列的核苷酸序列为SEQ IDNO.3所示的核苷酸序列、SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列、SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列、SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列或SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。

7.如权利要求6所示的片球菌素基因的表达载体，其特征在于，所述信号肽序列的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

8.一种重组毕赤酵母工程菌，其特征在于，所述重组毕赤酵母工程菌有片球菌素基因的表达载体，所述所述表达载体中包含有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

9.如权利要去8所述的重组毕赤酵母工程菌，其特征在于，所述信号肽序列的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列、SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列、SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列、SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列或SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。

10.如权利要去9所述的重组毕赤酵母工程菌，其特征在于，所述信号肽序列的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。