CN110305917B - 芽胞杆菌rex基因在提高聚γ-谷氨酸产量中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程和微生物技术领域，具体芽胞杆菌rex基因在提高聚γ‑谷氨酸产量中的应用。本方法采用分子生物学技术，通过在地衣芽胞杆菌中敲除转录抑制因子基因rex，获得了rex缺失的地衣芽胞杆菌工程菌株WX‑02△rex，显著提高了地衣芽胞杆菌甘油代谢的速率。WX‑02△rex在不同培养基中的甘油消耗速率比原始菌地衣芽胞杆菌WX‑02至少提高了10.55%，最高可达27.94%。利用该菌株在聚γ‑谷氨酸发酵培养基中能够显著提高聚γ‑谷氨酸的产量，至少提高了35.29%，最高可达50%。说明该基因工程改造方法在提高微生物甘油代谢速率具有重要作用，并提高甘油合成生物基化学品的效率。

Description

芽胞杆菌rex基因在提高聚γ-谷氨酸产量中的应用

技术领域

本发明属于基因工程和微生物技术领域，具体涉及芽胞杆菌rex基因在提高聚γ-谷氨酸产量中的应用。

背景技术

聚γ-谷氨酸(γ-PGA)，又称纳豆菌胶、多聚γ-谷氨酸，它是一种通过微生物发酵法制得的生物高分子聚合物，主要由L-谷氨酸和(或)D-谷氨酸单体通过γ-酰胺键聚合而成，分子量通常为10KD-10000KD。γ-PGA具备良好的水溶性、吸附能力、可被生物降解、对人体和环境无毒害等特性，在众多领域中具有广泛的应用价值，在医学领域中，可用作药物缓释剂；在污水处理方面，可作为吸附剂和絮凝剂；在农业领域，可作为保水剂，增肥剂，增效剂。由于γ-PGA具有良好的经济价值和广泛的应用前景，γ-PGA的生产受到愈来愈广泛的重视。

NADH，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，主要产生于糖酵解和柠檬酸循环，用于胞内大多数氧化还原反应，是微生物生命代谢活动中必不可少的辅因子；Rex，NADH相关的转录因子，对细胞内氧化还原电位作出反应，并对参与革兰氏阳性细菌能量代谢和发酵生长的基因的表达进行负性控制；Rex的DNA结合活性受细胞内NADH/NAD+比率的调节，在较低的NADH:NAD+比值下，Rex蛋白与靶位点结合，抑制参与NADH再氧化的基因转录，而NADH浓度的升高导致Rex与DNA的解离和靶基因的转录阻遏解除。目前国内外对Rex的研究主要集中在它的结构，NADH结合Rex的构型变化，Rex的DNA结合位点的保守性的研究。

目前尚无芽胞杆菌中rex与聚γ-谷氨酸相关性的研究。本申请以地衣芽胞杆菌为例，发现通过在地衣芽胞杆菌中通过敲除rex能够显著提高聚γ-谷氨酸的产量，在芽胞杆菌高产聚γ-谷氨酸方面具有重要的科研意义和应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供了芽胞杆菌rex基因在提高聚γ-谷氨酸产量中的应用，通过敲除地衣芽胞杆菌中rex基因，能够显著提高地衣芽胞杆菌的聚γ-谷氨酸的产量。

本发明的另一个目的在于提供了一种适用于芽胞杆菌rex缺失株的培养基，利用该培养基对该菌株进行发酵培养，可显著提高聚γ-谷氨酸的产量。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

芽胞杆菌rex基因在提高聚γ-谷氨酸产量中的应用，包括利用本领域的常规手段敲除地衣芽胞杆菌中rex或使得rex基因沉默或降低rex基因的表达量，通过发酵来提高芽胞杆菌中聚γ-谷氨酸产量。

以上所述的方法中，优选的，所述的芽胞杆菌为地衣芽胞杆菌，优选菌株为地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)WX-02，CCTCC NO:M208065。

以上所述的应用中，当使用敲除的方式时，优选下述步骤：

(1)采用PCR的方法扩增出地衣芽胞杆菌WX-02的rex基因上下游同源臂序列A和B；并通过SOE的方法将A和B连到一起，构成A+B，随后用Xba1和BamHI双酶切A+B片段，并与经相同内切酶酶切后的T2(2)-ori质粒连接，转化DH5α，对阳性转化子克隆抽质粒进行双酶切和测序验证，最终得到rex的敲除载体T2(2)-rex。

(2)将T2(2)-rex电转化至地衣芽胞杆菌WX-02中，对阳性转化子进行菌落PCR验证和抽质粒验证；将阳性转化子转接培养数次后，得到rex基因的上游同源臂或rex基因的下游同源臂与地衣芽胞杆菌WX-02基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；

(3)将步骤(2)菌株接种于培养基中经过数次转接培养，PCR法筛选双交换菌株，对于阳性克隆进行PCR验证并进行测序，得到rex基因敲除的地衣芽胞杆菌WX-02△rex。所述的rex基因上下同源臂序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

所述rex基因编码的蛋白质为SEQ ID NO.3所示。

一种适用于芽胞杆菌rex缺失株的培养基，所述培养基配方，包括：60-100g/L甘油，8-16g/L柠檬酸钠，20-40g/L谷氨酸钠，磷酸氢二钾0.3-0.7g/L，氯化钙0.3-0.7g/L，硫酸镁0.3-0.7g/L，氯化铁0.003-0.005g/L，硫酸锰0.3-0.7g/L。

以上所述的培养基，优选的，所述的培养基配方：

80g/L甘油，12g/L柠檬酸钠，20g/L谷氨酸钠，磷酸氢二钾0.5g/L，氯化钙0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化铁0.004g/L，硫酸锰0.5g/L。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

转录因子Rex是芽胞杆菌中一种重要的维持NADH和NAD⁺平衡的转录因子，本研究通过缺失rex，显著提高了地衣芽胞杆菌的聚γ-谷氨酸产量。该研究结果表明缺失转录因子基因rex是一种十分有效的提高微生物合成聚γ-谷氨酸能力的方法，利用本发明提供的方法获得的地衣芽胞杆菌WX-02△rex菌株，利用该菌株在不同的聚γ-谷氨酸发酵培养基中能够显著提高甘油利用速率和聚γ-谷氨酸的产量，聚γ-谷氨酸至少提高了10.7％，最高可达50％。本研究为微生物利用甘油高产聚γ-谷氨酸提供了一种新策略。

附图说明

图1为Rex敲除载体和Rex敲除菌株构建流程示意图。

图2为实施例1中PCR扩增基因Rex上下游同源臂和上下游同源臂SOE连接片段；

其中泳道M为5K DNA marker，从上到下依次为：5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；泳道1为基因Rex上游同源臂；泳道2为基因Rex下游同源臂；泳道3为基因Rex上下游同源臂SOE连接片段。

图3为实施例1中T2(2)-rex质粒构建PCR验证胶图；

其中泳道1为T2(2)-rex质粒构建大肠杆菌菌落PCR验证；泳道M为5K DNA marker，从上到下依次为：5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。

图4为实施例2中T2(2)-rex质粒电转化至地衣芽胞杆菌PCR验证胶图；

泳道1、2：T2(2)-rex质粒电转化至地衣芽胞杆菌菌落PCR验证；泳道M：5K DNAmarker，从上到下依次为：5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。

图5为实施例2中Rex敲除菌株的PCR验证胶图；

泳道1：Rex敲除菌株的菌落PCR验证胶图；泳道M：5K DNA marker，从上到下依次为：5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。

具体实施方式

结合以下实例，对本发明进行进一步说明，且不应解释为限制本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的的精神和范围之内。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：

地衣芽胞杆菌rex敲除载体的构建

步骤1：根据地衣芽胞杆菌WX-02基因组DNA序列中的rex基因(该基因编码的蛋白为SEQ ID NO.3所示)的上、下游序列，设计rex基因的上游同源臂引物(A-F和A-R)、下游同源臂引物(B-F和B-R)；并以地衣芽胞杆菌WX-02的基因组DNA为模板，分别以rex基因的上游同源臂引物、下游同源臂引物进行PCR扩增得到rex基因的上游同源臂(508bp，SEQ ID NO.1所示)和rex基因的下游同源臂(497bp，SEQ ID NO.2所示)；

其中，A-F、A-R、B-F、B-R的序列为：

A-F：CGGGATCCGAATGAGTTTACACATTTTAATGA、

A-R：ATTTATTTTTCGTTTTCCGTTAAACTAATCCTCCATGTCTA、

B-F：TAGACATGGAGGATTAGTTTAACGGAAAACGAAAAATAAAT、

B-R：GCTCTAGAAAGCCCACAGCTGGTATAG；

步骤2：通过重叠延伸PCR将rex基因的上游同源臂和rex基因的下游同源臂连接到一起(所用引物为A-F和B-R)，构成目的基因片段(1016bp)；

步骤3：采用BamHI和XbaI限制性内切酶对目的基因片段和T2(2)-ori质粒进行双酶切得到酶切基因片段(1005bp),其中，所述的限制性内切酶BamHI和XbaI限制性内切酶均购自北京全式金生物技术有限公司；

将步骤(3)得到的酶切基因片段和线性质粒片段经DNA连接酶进行连接，得到连接产物；通过氯化钙转化法将该连接产物转入大肠杆菌DH5α，在37℃的条件下经含有卡那青霉素抗性的培养基进行筛选，筛选得到转化子，对转化子挑质粒进行菌落PCR验证(所用引物为：T2-F和T2-R)。若转化子的PCR验证结果为：在1323bp处出现电泳条带，说明整合表达载体构建成功，上述转化子为阳性转化子，命名为整合表达载体T2(2)-rex；

T2-F：ATGTGATAACTCGGCGTA

T2-R：GCAAGCAGCAGATTACGC。

实施例2：

rex敲除菌株的构建：

步骤1:将整合表达载体T2(2)-rex转入地衣芽胞杆菌WX-02中，在37℃的条件下、含有卡那青霉素抗性的培养基进行筛选，筛选得到转化子，对转化子挑质粒进行菌落PCR验证(所用引物为：T2-F和T2-R)。若转化子的PCR验证结果为：在1323bp处出现电泳条带，证明：整合表达载体T2(2)-rex成功转入地衣芽胞杆菌WX-02中，此时，该转化子为阳性转化子(即转入了整合表达载体T2(2)-rex的地衣芽胞杆菌WX-02)；

步骤2：将步骤1得到的阳性转化子在45℃条件下、含有卡那青霉素抗性的培养基上转接培养3次，每次培养12h，并以T2-F与rex-YR为引物进行菌落PCR检测单交换菌株；

其中，rex-YF和rex-YR的序列为:

rex-YF:CTGATTTACTTGTAAAATCAT、

rex-YR:ATCTGAGACTCTCGTCATAAA；

步骤3：将步骤2得到的PCR检测出现1323bp条带的即为单交换菌株。挑选其中一个单交换菌株的单菌落接种于液体LB中，在37℃、不含有卡那青霉素的培养基中经过数次转接培养，挑转化子进行菌落PCR验证(引物为rex-YF和rex-YR)。若转化子的PCR验证结果为：在2727bp处出现电泳条带时，说明基因回复突变，该转化子为地衣芽胞杆菌WX-02；在1331bp处出现电泳条带时，说明rex基因成功敲除。随后针对阳性转化子进行DNA测序进一步验证，得到双交换成功的rex敲除菌株，即地衣芽胞杆菌WX-02△rex。

实施例3：

地衣芽胞杆菌WX-02△rex在高产聚γ-谷氨酸中的应用：

1)种子发酵：平板上活化地衣芽胞杆菌WX-02及地衣芽胞杆菌WX-02△rex，挑菌接至分别接种至含有50mL液体LB的250mL三角瓶中，37℃，230rpm培养10h。然后随后以1％(体积比)的接种量接种至发酵培养基中，250mL三角瓶装50ml发酵培养基。

所述的发酵培养基申请人选择了9种培养基配方，编号1-9为聚γ-谷氨酸发酵培养基(表1)，除此之外，每种培养基中均包含磷酸氢二钾0.5g/L，氯化钙0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化铁0.004g/L，硫酸锰0.5g/L。

表1 γ-PGA发酵的培养基配方

聚γ-谷氨酸发酵培养基的培养条件为37℃，230rpm培养48h，发酵结束后测定聚γ-谷氨酸的产量。

所述聚γ-谷氨酸测定方法如下：

发酵液前处理：利用去离子水将发酵液稀释30倍，离心除菌体，再经0.22μm水相滤膜过滤后进行凝胶渗透色谱检测。凝胶渗透色谱检测条件为：采用TSK Gel G6000 PWXL凝胶渗透色谱柱，检测波长220nm，进样量10μL，流动相为25mM的无水硫酸钠和乙腈的混合液，体积比8:1，流速0.5mL/min。根据聚γ-谷氨酸的标准品制作的标准曲线计算出发酵液中聚γ-谷氨酸的含量。

申请人同时测定了在上述培养基编号为1-9中聚γ-谷氨酸的产量。从表2中可知，在相同的种子发酵和生产发酵的条件下，采用本发明的地衣芽胞杆菌WX-02△rex能够显著提高菌株利用甘油合成聚γ-谷氨酸，提高幅度最低达35.29％，最高可达50％。甘油利用最低提高10.55％，最高可达27.94％。本发明的技术方案在芽胞杆菌高产聚γ-谷氨酸具有重要的科研意义和应用价值。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

表2 WX-02△rex和对照菌WX-02的聚γ-谷氨酸产量和甘油消耗量对比

序列表

<110> 湖北大学

<120> 芽胞杆菌rex基因在提高聚γ-谷氨酸产量中的应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 508

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaatgagttt acacatttta atgaacaagg cagagccaag atggttgata taagcgaaaa 60

ggaagcttca gtgcgcacag ctgcggctgt ttcaagcgtg tccatgaatc gagaagtaca 120

tgaaaaaatc aaaaaccgcg aaatcggaaa aggcgatgtt ttggcggtgg cgcaagtggc 180

cggaatcatg gctgcaaaac agacatccgc catcatcccg atgtgtcatc cgatcgctct 240

gaaaggagtc gacatcgcct tttgctggga gaagaaagag cagaagagca tcctgcatat 300

acaatctaac gtcaagacca aagggagcac aggtgtggaa atggaagcgt taacgtcggc 360

ctccgtatgt gcgctgaccg tttatgacat gtgcaaagcg gcggataagg gaatggtgat 420

aggaccgacc tttcttctcg aaaagacagg cgggaaaaac ggtgactata aaagggaaaa 480

agctgatgta gacatggagg attagttt 508

<210> 2

<211> 497

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aacggaaaac gaaaaataaa taaaggaaag ggggcaggct ttatgccaac aatcggtcct 60

ggaagcttta ttttaattgt cgtggtggcg cttttgatat tcggcccgaa aaaacttccc 120

gagctgggaa gagcggcggg aaacacgctg cgggagttta aaaatgcgac aaaaggtttg 180

gctgacgacg attccgataa taaaaagaaa gaagatcagt aggataggat gacatttatg 240

aagggaaaag aaatgtcgct gttagaacat atcacagaac tgcgcagacg gcttgtgatc 300

acttttttct tttttgtttt gtttgttgcg gcaggctttt ttttggcgaa gccgctcata 360

atctacctgc agcagacgga tgaagcgaag ctgctgactc tcaatgcgtt caagctgacc 420

gatcctttat ttgtgtacgt gcagttcgcg ttcatcatcg gcgctgtctt gacttcgccg 480

cttgttctat accagct 497

<210> 3

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Asn Met Asp His Ser Lys Ile Pro Gln Ala Thr Ala Lys Arg Leu

1 5 10 15

Pro Leu Tyr Tyr Arg Phe Leu Lys Asn Leu His Ala Ser Gly Lys Gln

20 25 30

Arg Val Ser Ser Ala Glu Leu Ser Asp Ala Val Lys Val Asp Ser Ala

35 40 45

Thr Ile Arg Arg Asp Phe Ser Tyr Phe Gly Ala Leu Gly Lys Lys Gly

50 55 60

Tyr Gly Tyr Asn Val Asn Tyr Leu Leu Ser Phe Phe Arg Lys Thr Leu

65 70 75 80

Asp Gln Asp Glu Met Thr Asn Val Thr Leu Ile Gly Val Gly Asn Leu

85 90 95

Gly Thr Ala Phe Leu His Tyr Asn Phe Ile Lys Asn Asn Asn Thr Lys

100 105 110

Ile Ala Met Ala Phe Asp Ile Asn Glu Glu Lys Ile Gly Thr Glu Val

115 120 125

Gly Gly Val Pro Val Tyr Asp Leu Asn Arg Leu Glu Glu His Met Thr

130 135 140

Asp Asp Ile Pro Val Ala Ile Leu Thr Val Pro Ala Gln Ala Ala Gln

145 150 155 160

Ser Ile Thr Asp Arg Leu Val Glu Leu Gly Ile Lys Gly Ile Leu Asn

165 170 175

Phe Thr Pro Ala Arg Leu Asn Val Pro Glu His Ile Arg Ile His His

180 185 190

Ile Asp Leu Ala Val Glu Leu Gln Ser Leu Val Tyr Phe Met Lys His

195 200 205

Tyr Ser Met Gln Glu Lys

210

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgggatccga atgagtttac acattttaat ga 32

<210> 5

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atttattttt cgttttccgt taaactaatc ctccatgtct a 41

<210> 6

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tagacatgga ggattagttt aacggaaaac gaaaaataaa t 41

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gctctagaaa gcccacagct ggtatag 27

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgtgataac tcggcgta 18

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gcaagcagca gattacgc 18

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ctgatttact tgtaaaatca t 21

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atctgagact ctcgtcataa a 21

Claims (5)

1.敲除地衣芽胞杆菌WX-02中的rex基因在提高地衣芽孢杆菌中聚γ-谷氨酸产量中的应用，所述的rex基因编码的蛋白为SEQ ID NO.3所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其中所述的敲除地衣芽孢杆菌中rex基因，其步骤包括：

（1）采用PCR的方法扩增出地衣芽胞杆菌WX-02的rex基因上下游同源臂序列A和B；并通过SOE的方法将A和B连到一起，构成A+B，随后用Xba1和BamHI双酶切A+B片段，并与经相同内切酶酶切后的T2(2)-ori质粒连接，转化DH5α，对阳性转化子克隆抽质粒进行双酶切和测序验证，最终得到rex的敲除载体T2(2)-rex；

（2）将T2(2)-rex电转化至地衣芽胞杆菌WX-02中，对阳性转化子进行菌落PCR验证和抽质粒验证；将阳性转化子转接培养数次后，得到rex基因的上游同源臂或rex基因的下游同源臂与地衣芽胞杆菌WX-02基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；

（3）将步骤（2）菌株接种于培养基中经过数次转接培养，PCR法筛选双交换菌株，对于阳性克隆进行PCR验证并进行测序，得到rex基因敲除的地衣芽胞杆菌WX-02△rex。

3.根据权利要求2所述的应用，所述的rex基因上下同源臂序列为SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示。

4.根据权利要求2所述的应用，适用所述应用中地衣芽胞杆菌WX-02△rex的发酵培养基：包括：60-100 g/L甘油，8-16 g/L柠檬酸钠，20-40 g/L谷氨酸钠，磷酸氢二钾0.3-0.7g/L，氯化钙0.3-0.7 g/L，硫酸镁0.3-0.7 g/L，氯化铁0.003-0.005 g/L，硫酸锰0.3-0.7 g/L。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于发酵培养基为：80g/L甘油，12g/L柠檬酸钠，20g/L谷氨酸钠，磷酸氢二钾0.5g/L，氯化钙0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化铁0.004g/L，硫酸锰0.5g/L。

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