CN102344494B - 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸基因编码荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸基因编码荧光探针及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸基因编码荧光探针及其制备方法和应用。一方面，本发明涉及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的检测探针，具体涉及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的重组荧光融合蛋白检测探针。在一个具体方面，本发明涉及还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的重组荧光融合蛋白检测探针；在另一个具体方面，本发明涉及氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的重组荧光融合蛋白检测探针；在又一方面，本发明涉及还原型和氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸比率的重组荧光融合蛋白检测探针。本发明也涉及上述检测探针的制备方法及其分别在检测NADH、NAD+和NADH/NAD+比率中的应用。

Description

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸基因编码荧光探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的检测探针，具体涉及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的重组荧光融合蛋白检测探针。在一个具体方面，本发明涉及还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的重组荧光融合蛋白检测探针；在另一个具体方面，本发明涉及氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的重组荧光融合蛋白检测探针；在又一方面，本发明涉及还原型和氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸比率的重组荧光融合蛋白检测探针。本发明也涉及上述检测探针的制备方法及其分别在检测NADH、NAD+和NADH/NAD+比率中的应用。
背景技术
NAD+及NADH作为辅酶，是呼吸链的重要组成部分，它参与了呼吸链中的电子传递过程(Rich，P.R.等，Biochem Soc Trans.2003，V.31(6)，pp.1095-1105)。在呼吸链的氧化还原反应中，NAD+作为质子的载体，当其接受了其他分子传递过来的一个电子后，由最初的氧化态转变为还原态，该反应的最终产物为NADH，而NADH可以作为还原剂向其他分子提供电子(Belenky，P.等，Trends in Biochemical Sciences.2007，V.32(1)，pp.12-19)。近来的研究表明，NAD(H)不仅参与能量代谢、物质合成以及抗氧化作用，还涉及到体内的钙稳态、基因表达、免疫作用以及细胞衰老与死亡等等，而NAD(H)在其中均有着至关重要的作用，因此NAD(H)本身及其代谢所涉及的众多酶类也成为了药物设计的靶标(Sauve，A.A.等，J Pharmacol ExpTher.2008，V.324(3)，pp.883-893)。
但是，大多数活细胞内的NAD(H)的总量大约为10-6M～10-3M，而且NAD+/NADH的比例也随着细胞内状态不同而不尽相同(Lin，S.J.等，Current Opinion in Cell Biology.2003，V.15(2)，pp.241-246)，因此这给NAD(H)的测定带来了极大的不便。较早的检测方法主要是利用NADH在340nm紫外光区有特征吸收，由此建立了紫外分光光度法，该方法存在两个主要的缺陷：1、有效灵敏度受仪器精密度所限，约为10-7M；2、在复杂体系中，不能有效地区分NADH与NADPH。随后，根据NAD+作为辅酶，在电子传递过程中接受电子转变为NADH的特性，发展出了一系列酶学检测方法。其他如HPLC分析、电化学法、毛细管电泳、荧光成像等方法也常见诸于各种文献报道中。然而，大部分的方法或者对单个细胞中靶标分子的灵敏度不足，或者不能进行亚细胞器定位。特别需要指出的是，这些现有方法均存在一个主要的缺陷，即需要对样品进行裂解、分离、纯化等操作，而NADH本身又极易氧化，在一系列繁琐的操作中极易将误差引入，导致最终显示的结果与实际存在出入。另外，这些现有方法不能应用于活体动物或细胞，不能进行实时地检测，这限制了这些方法在临床疾病诊断及药物前体研究等邻域的应用。目前在活体或细胞上只能采用NADH自发荧光来检测(Zhang，Q.H.等，Science.2002，V.295(5561)，pp.1895-1897)，而这种传统方法存在以下严重缺陷：首先，已知细胞对NAD+/NADH和NADP+/NADPH的调控是相对独立的，正常状态下NAD+/NADH的比例大约在700∶1，而NADP+/NADPH的比例在1∶200；其次，它们的氧化还原势存在着巨大的区别，这反映出NADH与NADPH分别在能量代谢与合成代谢中扮演截然不同的角色；第三，NADH与NADPH自发荧光完全不可区分，利用自发荧光进行成像测量获得的结果是NADH与NADPH之和，鉴于NADH含量很低且大部分以蛋白质结合形式存在，所以NADH自发荧光数据实质反映的是蛋白质结合的NADPH的浓度(Zhang，Q.H.等，Science.2002，V.295(5561)，pp.1895-1897)；第四，由于NADH激发波长位于紫外区(340nm)且自发荧光较弱，需要复杂昂贵的仪器如用于临床监测的仪器CritiView，再加上紫外光对组织的穿透力很弱并会造成细胞损伤，这些光学特性严重制约了自发荧光监测的应用。
因此，本领域亟需发展一种特异性NADH检测技术，特别是一种适合生理水平和亚细胞水平的特异性NADH检测技术。
而相对于传统的小分子染料检测技术以及迅速发展的量子点检测技术，荧光蛋白检测技术在大多数的活体细胞成像方面具有独一无二的压倒性优势，它能够通过遗传导入至细胞、组织乃至整个器官中，因此荧光蛋白能够作为一个全细胞标记物或基因启动激活的指示器。
绿色荧光蛋白最初是从维多利亚多管发光水母(Aequorea victoria)中提取，野生型的AvGFP由238个氨基酸构成，分子量约为26kD。当前的研究确认，天然GFP蛋白中第65～67位的三个氨基酸Ser-Tyr-Gly能够自发形成一个荧光生色基团：对-羟基苯亚甲基咪唑啉酮(p-hydroxybenzylideneimidazolinone)，是其主要的发光位置。野生型AvGFP的光谱特征十分复杂，其荧光激发的主峰在395nm处，而在475nm处另有一个附峰，后者振幅强度约为前者的1/3。在标准的溶液条件下，395nm处的激发可产生508nm处的发射，而475nm处的激发产生的最大发射波长位于503nm(Heim，R.等，Proc Natl Acad Sci U S A.1994，V.91(26)，pp.12501-12504)。
随着对GFP蛋白突变的研究日渐深入，利用分子生物学技术，目前已经发展出多种表现突出的GFP衍生物，通过在野生型GFP基础上进行不同的单点突变或者组合，可获得诸如增强型GFP(S65T，F64L)、YFP(T203Y)、CFP(Y66W)等。而借助对GFP蛋白序列的重新排列，将原第145-238位氨基酸部分作为新蛋白的N端，原第1-144位氨基酸作为新蛋白的C端，两片段间通过一小段具有柔性的短肽链连接，形成一个对空间变化敏感的环状排列荧光蛋白(circular permutation fluorescent protein)，在此基础上对原蛋白T203Y进行的点突变就形成了环状排列的黄色荧光蛋白cpYFP(Nagai，T.等，Proc NatlAcad Sci U S A.2001，V.98(6)，pp.3197-3202)。
由于对荧光蛋白研究日益深入，相关的一些基于荧光的分析检测技术也获得了进一步的发展。例如当前常用的荧光共振能量转移(FRET)技术，该技术主要原理是当两个荧光发色基团在足够靠近时，当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态，在该电子回到基态前，通过偶极子相互作用，实现了能量向邻近的受体分子转移(即发生能量共振转移)。FRET是一种非辐射能量跃迁，通过分子间的电偶极相互作用，将供体激发态能量转移到受体激发态的过程，使供体荧光强度降低，而受体可以发射更强于本身的特征荧光(敏化荧光)，也可以不发荧光(荧光猝灭)。当前对绿色荧光蛋白的进一步研究发现，衍生自绿色荧光蛋白突变体的青色荧光蛋白(CFP)和黄色荧光蛋白(YFP)是一对表现出色的供体/受体对。CFP的发射光谱与YFP的吸收光谱有相当的重叠，当它们足够接近时，用CFP的吸收波长激发，CFP的发色基团将会把能量高效率地共振转移至YFP的发色基团上，所以CFP的发射荧光将减弱或消失，主要发射将是YFP的荧光。两个发色基团之间的能量转换效率与它们之间的空间距离的6次方成反比，对空间位置的改变非常灵敏。因此现有研究报道利用基因工程重组手段将期望研究的蛋白基因两端分别与CFP与YFP融合表达出一个全新的融合蛋白，该蛋白与其专一性的靶标分子的结合所产生的空间变化即通过荧光的变化所直观地显现。
因此，本文所用的荧光蛋白序列可以来自于维多利亚多管发光水母(Aequorea victoria)的荧光蛋白及其衍生物，包括但不局限于这些突变体：黄色荧光蛋白(YFP)、绿色荧光蛋白(GFP)、青色荧光蛋白(CFP)等的序列，其中优选黄色荧光蛋白YFP的序列，更优选环状排列的黄色荧光蛋白cpYFP的序列。
本技术中所涉及的另一蛋白，YdiH蛋白(又称为Rex蛋白)是一种本领域已知的细菌转录抑制蛋白，分子量为23kDa，它能调控发酵和厌氧呼吸。常见的YdiH蛋白来自嗜热水生菌(Thermus aquaticus)(SEQ ID NO：1 NCBIGenBank：AF061257.1)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)(SEQ ID NO：2NCBI GenBank：AL939116.1)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(SEQ ID NO：3NCBI GenBank：AL009126.3)，YdiH蛋白首次获得鉴定是Brekasis和Paget等人于2003年在天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)中发现的，这是一种广泛存在于革兰氏阳性菌中的一种对氧化还原敏感的调控蛋白。对于天蓝色链霉菌(S.coelicolor)YdiH(Rex)蛋白的研究显示，这是一种典型的含有Rossmann结构域的NAD(H)结合蛋白。其中关键的Rossmann结构域是一种主要存在于核苷酸结合蛋白中的蛋白质超二级结构，是典型的辅因子NAD(H)结合结构域，以各类辅因子NAD结合蛋白为代表。该结构主要由6个β折叠通过2对α螺旋以有序的β-α-β-α-β形式组成。因为每个Rossmann结构域只能结合一个核苷酸分子，因此类似NAD这类的二核苷酸结合蛋白的结构域中存在两个成对的Rossmann部分。当前研究显示天蓝色链霉菌YdiH(Rex)蛋白能够直接感应胞质NADH/NAD+比率的变化，而在有氧环境下，当细胞内NADH/NAD+比率处于低水平时，YdiH(Rex)蛋白可抑制其靶基因(cydABC、nuoA-D和rexhemACD)的转录，而NADH/NAD+比率的升高能够使Rex从其操纵子位点解离，在这一动态过程中YdiH(Rex)蛋白的空间构象会随着环境的变化而发生改变(Brekasis，D.等，EMBO J.2003，V.22(18)，pp.4856-4865)。因此Rex蛋白是一个很好的细胞内NADH检测探针的候选者。同时，最近Wang等人对枯草芽孢杆菌YdiH(Rex)蛋白进行结晶并对其作用机理和功能进行了部分研究，结果显示源自枯草芽孢杆菌的YdiH(Rex)蛋白是一个同源二聚体蛋白，由两个功能结构域构成，其中N端结构域(1-85位残基)是一个DNA结合域，而C端结构域(86-215位残基)是一个典型的Rossmann折叠，它能够结合NADH(Wang，E.等，MolMicrobiol.2008，V.69(2)，pp.466-478)。
虽然YdiH(Rex)蛋白本身对环境内的氧化还原状态敏感，但是其自身发生的变化并不能直观的显示出并被外界所捕获，而借助于荧光蛋白这一工具，我们可以很好地通过将两者进行融合表达，获得一个全新的基因编码的荧光探针，利用YdiH(Rex)蛋白感受环境内氧化还原状态的变化并将这一变化传递至荧光蛋白，通过荧光蛋白产生荧光与否以及荧光的强弱，对环境中氧化还原状态改变进行实时且直观地描述。
综上所述，我们认为，利用包含YdiH蛋白的重组荧光融合蛋白能够满足在生理水平和亚细胞水平上检测NADH的迫切需要。
不应认为对本文所述参考文献的引用或讨论意味着承认这些参考文献是本发明的现有技术。
发明内容
一方面，本发明提供一种遗传编码的NADH荧光探针，其内含有对环境内NADH敏感的多肽，和通过光谱性质的改变对环境内NADH进行表现的部分。在一个实施方式中，所述通过光谱性质的改变对环境内NADH进行表现的部分是荧光蛋白序列或其衍生物。在另一个实施方式中，所述对NADH敏感的多肽是具有如下特征的多肽，或其功能片段或NADH结合结构域：
(1)具有NADH结合特性的Rossman结构域；和/或
(2)来源于对NADH敏感的转录调控因子Rex家族蛋白。
在一个优选实施方式中，所述对NADH敏感的多肽可具有以下特征：
(1)含有来自于细菌的转录调控因子Rex蛋白基因ydiH的多肽，该多肽的编码序列可以是SEQ ID No：1、2或3；
(2)在至少85个氨基酸残基内任何与(1)所述序列具有95％相同性的同源或非同源序列；
(3)在至少85个氨基酸残基内任何与(1)所述序列具有90％相同性的同源或非同源序列；
(4)在至少85个氨基酸残基内任何与(1)所述序列具有70％相同性的同源或非同源序列；
(5)在至少85个氨基酸残基内任何与(1)所述序列具有50％相同性的同源或非同源序列；
(6)在至少85个氨基酸残基内任何与(1)所述序列具有40％相似性的同源或非同源序列；或
(7)在至少85个氨基酸残基内任何与(1)所述序列具有35％相似性的同源或非同源序列。
在另一实施方式中，本发明荧光探针可以包含具有NADH结合特性的Rossman结构域B和荧光蛋白序列A、A1和/或A2，其组合形式可以是：
(1)B-A-B；
(2)B-A-B-B；
(3)A1-B-A2，其中A1和A2可以相同或不同；A1可以是来自于维多利亚多管发光水母的荧光蛋白或其衍生物的氨基酸序列，A2可以是来自于维多利亚多管发光水母的另一荧光蛋白或其衍生物的氨基酸序列；
(4)B的第一部分-A-B的第二部分；其中A插入在B的柔性区域内，因而将B分割成B的第一部分和B的第二部分，B的第一部分和B的第二部分构成完整的B结构域；或
(5)B的第一部分-A-B的第二部分-B；其中A插入在B的柔性区域内，因而将B分割成B的第一部分和B的第二部分，B的第一部分和B的第二部分构成完整的B结构域。
在又一实施方式中，本发明荧光探针也可以具有以下结构：
A1-B1-接头1-FM-接头2-B2，
其中，A1是YdiH蛋白的第一结构域，优选包含枯草芽孢杆菌属YdiH蛋白的氨基酸序列的氨基酸1-84(SEQ ID NO：14)或嗜热水生菌属YdiH蛋白的氨基酸序列的氨基酸1-79(SEQ ID NO：15)或其变异体；B1是YdiH蛋白的第二结构域，优选包含枯草芽孢杆菌属YdiH蛋白的氨基酸序列的氨基酸85-194(SEQ ID NO：16)或嗜热水生菌属YdiH蛋白的氨基酸序列的氨基酸80-189(SEQ ID NO：17)或其变异体；B2是YdiH蛋白的第三结构域，优选包含枯草芽孢杆菌属YdiH蛋白的氨基酸序列的氨基酸120-215(SEQ ID NO：18)或嗜热水生菌属YdiH蛋白的氨基酸序列的氨基酸114-211(SEQ ID NO：19)或其变异体；
FM是荧光团，可以是YFP、GFP、CFP等以及以这些蛋白为基础的变异体，优选YFP，更优选cpYFP；
接头1可以存在或不存在；存在时，接头1可以是任何氨基酸序列，优选长度不超过4个氨基酸，例如包含氨基酸T、S、A、G或由这四个氨基酸中任意1至4个构成的任意组合，例如氨基酸序列SAG或TS等，但不限于此种组合；
接头2可以存在或不存在；存在时，接头2可以是任何氨基酸序列，优选长度不超过3个氨基酸，例如包含氨基酸G、T、G或由这四个氨基酸中任意1至4个构成的任意组合，例如包含氨基酸序列GTG，但不限于此种组合。
在一个实施方式中，本发明还提供一种荧光探针，其包含荧光团以及YdiH蛋白或YdiH蛋白的任何片段、衍生物或类似物。在另一实施方式中，本发明还提供一种荧光探针，其包含荧光团以及YdiH蛋白的变异体。本发明还提供一种荧光探针，其包含荧光团以及YdiH蛋白的可溶性片段。
在一个实施方式中，本发明提供一种荧光探针，其包含氨基酸序列SEQID NO：4、5、6、7或8。在优选实施方式中，本发明提供一种荧光探针，在至少85个氨基酸残基内任何与氨基酸序列SEQ ID NO：4、5、6、7或8具有99％、95％、90％、80％、70％或50％相同性的同源或非同源序列。在优选实施方式中，本发明提供一种荧光探针，包含在至少85个氨基酸残基内任何与氨基酸序列SEQ ID NO：4、5、6、7或8实质上相似或相同的同源或非同源序列。在优选实施方式中，本发明提供一种荧光探针，包含氨基酸序列SEQ ID NO：4、5、6、7或8的变异体或衍生物。
在另一实施方式中，本发明还提供了一种遗传编码的NAD+荧光探针，其内含有对环境内NAD+敏感的多肽，和通过光谱性质的改变对环境内NAD+进行表现的部分。在一个具体实施方式中，所述NAD+荧光探针包含SEQ IDNO：129。
在又一实施方式中，本发明还提供了一种遗传编码的NADH/NAD+比率荧光探针，其内含有对环境内NADH/NAD+比率敏感的多肽，和通过光谱性质的改变对环境内NADH/NAD+比率进行表现的部分。在一个具体实施方式中，所述NADH/NAD+比率荧光探针包含SEQ ID NO：148。
另一方面，本发明提供一种融合蛋白，其包含本发明荧光探针。在一个实施方式中，所述融合蛋白包含本发明荧光探针和各种特异性亚细胞定位信号，所述定位信号可将目标蛋白定位于指定的亚细胞器内。
另一方面，本发明提供一种核酸序列，其包含编码本发明荧光探针或融合蛋白的核苷酸序列。在一个具体实施方式中，本发明提供一种核酸序列，其包含编码荧光蛋白的核苷酸序列和编码对NADH敏感的蛋白质的核苷酸序列。
在一个优选实施方式中，所述编码对NADH敏感的蛋白质的核苷酸序列是编码具有如下特征的多肽或其功能片段或NADH结合结构域的核苷酸序列：
(1)具有NADH结合特性的Rossman结构域；和/或
(2)来源于对NADH敏感的转录调控因子Rex家族蛋白。
在另一个优选实施方式中，本发明核酸序列可以包含具有NADH结合特性的Rossman结构域的编码序列b和荧光蛋白的编码序列a、a1和/或a2，其组合形式可以是：
(1)b-a-b；
(2)b-a-b-b；
(3)a1-b-a2，其中a1和a2可以相同或不同；a1可以是来自于维多利亚多管发光水母的荧光蛋白或其衍生物的编码序列，a2可以是来自于维多利亚多管发光水母的另一荧光蛋白或其衍生物的编码序列；
(4)b的第一部分-a-b的第二部分；其中a插入在b的柔性区域内，因而将b分割成b的第1部分和b的第二部分，b的第一部分和b的第二部分构成完整的b结构域；
(5)b的第一部分-a-b的第二部分-b；其中a插入在b的柔性区域内，因而将b分割成b的第1部分和b的第二部分，b的第一部分和b的第二部分构成完整的b结构域。
在另一个优选实施方式中，本发明提供一种核酸序列，包含核苷酸序列SEQ ID NO：9、10、11、12或13。在优选实施方式中，本发明提供一种核酸序列，包含在至少85个碱基长度内任何与核苷酸序列SEQ ID NO：9、10、11、12或13具有99％、95％、90％、80％、70％或50％相同性的同源或非同源序列。在另一优选实施方式中，本发明提供一种核酸序列，包含在至少85个碱基与核苷酸序列SEQ ID NO：9、10、11、12或13实质上相似或相同的核苷酸序列；在优选实施方式中，本发明提供一种核酸序列，包含核苷酸序列SEQ ID NO：9、10、11、12或13的变异体或衍生物。
本发明还涉及上述核酸序列的互补序列和变异体，其可包含编码本发明荧光探针或融合蛋白的片段、类似物、衍生物、可溶性片段和变异体的核酸序列或其互补序列。
在又一方面，本发明还提供一种表达载体，其包含与表达控制序列操作性连接的本发明核酸序列。所述表达控制序列可以是复制起点、启动子、增强子、操纵子、终止子、核糖体结合位点等。
在又一方面，本发明还提供一种宿主细胞，其包含本发明表达载体。
在又一方面，本发明还提供一种制备本发明荧光探针或融合蛋白的方法，包括以下步骤：
a.将本发明表达载体转移到宿主细胞中，
b.在适合所述宿主细胞表达的条件下培养所述宿主细胞，和
c.由所述宿主细胞分离所述荧光探针或融合蛋白。
本发明还提供本发明荧光探针或融合蛋白在检测NADH中的应用。在一个实施方式中，本发明提供本发明荧光探针或融合蛋白在体外或体内检测NADH中的应用。在一个实施方式中，本发明提供本发明荧光探针或融合蛋白在亚细胞水平检测NADH中的应用。在一个实施方式中，本发明提供本发明荧光探针或融合蛋白在原位检测NADH中的应用。在另一个实施方式中，本发明提供本发明荧光探针或融合蛋白在筛选药物中的应用，所述药物可用于调节对象的NADH水平。在另一个实施方式中，本发明提供本发明荧光探针或融合蛋白在诊断疾病中的应用，所述疾病与NADH水平有关。
本发明还提供了一种检测NADH的试剂盒，其中包含本发明荧光探针或融合蛋白。所述检测可以在体内、体外、亚细胞或原位水平进行。本发明还提供一种筛选药物的试剂盒，所述药物可用于调节对象的NADH水平，所述试剂盒包含有效量的本发明荧光探针或融合蛋白。本发明还提供了一种用于检测与NADH水平有关的疾病的试剂盒，所述试剂盒包含有效量的本发明融合蛋白。在使用时，本领域技术人员能够根据所述融合蛋白的活性方便地确定所述的有效量。
本发明中的蛋白质和核酸序列优选以分离形式提供，更优选地被纯化至均质。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1SDS-PAGE鉴定从大肠杆菌(E.coli)中分离纯化的F-rex1。
图2SDS-PAGE鉴定从大肠杆菌(E.coli)中分离纯化的F-rex2。
图3为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸荧光探针F-rex1的基本光谱特性。
图4为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸荧光探针F-rex2的基本光谱特性。
图5为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸荧光探针F-rex1在体外模拟的生理条件下对吡啶核苷酸类似物的响应。
图6为衍生的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸荧光探针在体外模拟的生理条件下对吡啶核苷酸类似物的响应。
图7为经药物3-NP、AOA处理后，HEK293FT细胞内的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸变化。
图8-1为还原性与氧化性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸比率探针实时测定外源NADH加入对细胞内NADH水平变化的监测。
图8-2为还原性与氧化性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸比率探针实时测定葡萄糖、丙酮酸、乳酸变化对细胞内NADH水平变化的监测。
图8-3为还原性与氧化性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸比率探针实时监测线粒体内NADH水平变化。
图9-1为NAD+探针对胞浆中的NAD+变化的监测。
图9-2为NAD+探针在体外对NAD+的响应变化。
图9-3为NAD+探针在体外模拟生理条件下对吡啶核苷酸类似物的响应。
图10-1为还原性与氧化性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸比率探针对NADH、NAD+结合的响应特性。
图10-2为还原性与氧化性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸比率探针对不同NADH与NAD+比率的测定结果。
图10-3为NADH/NAD+比率探针在体外模拟生理条件下各吡啶核苷酸类似物对此探针的影响检测。
具体实施方式
I.定义：
在给出数值或范围时，本文所用术语“约”指该数值或范围在给定数值或范围的20％以内、10％以内和5％以内。
本文所用术语“包含”、“包括”和其等同形式包括“含有”以及“由......组成”的含义，例如“包含”X的组合物可仅由X组成或可含有其它物质，例如X+Y。
在本发明中，术语“YdiH蛋白”指YdiH蛋白(又称为Rex蛋白)是一种本领域已知的细菌转录抑制蛋白，分子量为23kDa，它能调控发酵和厌氧呼吸。这是一种广泛存在于革兰氏阳性菌中的一种对氧化还原敏感的调控蛋白，并且是一种典型的含有Rossmann结构域的NAD(H)结合蛋白。其中关键的Rossmann结构域是一种主要存在于核苷酸结合蛋白中的蛋白质超二级结构，是典型的结合辅因子NAD(H)的活性区域，以各类辅因子NAD结合蛋白为代表。该结构主要由6个β折叠通过2对α螺旋以有序的β-α-β-α-β形式组成。因为每个Rossmann结构域只能结合一个核苷酸分子，因此类似NAD这类的二核苷酸结合蛋白的结构域中存在两个成对的Rossmann部分。YdiH(Rex)蛋白能够直接感应胞质NADH/NAD+比率的变化，而在有氧环境下，当细胞内NADH/NAD+比率处于低水平时，YdiH(Rex)蛋白可抑制其靶基因(cydABC、nuoA-D和rexhemACD)的转录，而NADH/NAD+比率的升高能够使Rex从其操纵子位点解离，在这一动态过程中YdiH(Rex)蛋白的空间构象会随着环境的变化而发生改变。本发明中所涉及的“YdiH蛋白”可以包含核苷酸序列SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3编码的氨基酸序列。本发明中所涉及的“柔性区域”是指蛋白质高级结构中存在的一些特定的如Loop结构域等结构，这些结构域相比于其他的蛋白质高级结构具有更高的移动性和柔性，并且能够导致结构域发生动态变化，而蛋白质在这些区域也存在着极大地发生空间构象改变的趋势。本发明所涉及的柔性区域主要指T-rex(即嗜热水生菌(Thermus aquaticus)来源的蛋白质Rex)中的V113-G119区域，以及D188-G192这段区域。
本文所用术语“荧光探针”是指与荧光蛋白融合的对环境内NADH敏感的多肽，所述对环境内NADH敏感的多肽具体可以是YdiH蛋白，其利用YdiH中专一性的NADH结合结构Rossman结构域与NADH结合后产生的构象变化引起的荧光蛋白的构象变化，进而导致产生或消失的荧光或产生的荧光发生改变，并借助不同NADH浓度下测定的荧光蛋白的荧光绘制标准曲线，进而检测并分析NADH的存在和/或水平。
本文所用术语“融合蛋白”与“荧光融合蛋白”和“重组荧光融合蛋白”同义，指包含第一种多肽或蛋白质或者其片段、类似物或衍生物的氨基酸序列，以及异源多肽或蛋白质(即，不同于第一种多肽或蛋白质或者其片段、类似物或衍生物的第二种多肽或蛋白质或者其片段、类似物或衍生物)的氨基酸序列的多肽或蛋白质。在一个实施方式中，融合蛋白包含与异源蛋白质、多肽或肽融合的荧光蛋白。按照这个实施方式，异源蛋白质、多肽或肽可能是或不是不同类型荧光蛋白。在一个实施方式中，与融合于异源蛋白质、多肽或肽之前的原始多肽或蛋白质的活性相比，融合蛋白保持或提高了活性。在一个具体实施方式中，融合蛋白包含与异源蛋白质、多肽或肽融合的荧光探针，所述异源蛋白质、多肽或肽可以是特异性亚细胞定位信号。
本文所用术语“荧光团”与“荧光蛋白”同义，指自身发出荧光或在照射下发出荧光的蛋白质。荧光蛋白常常用作检测手段，例如生物技术领域常用的绿色荧光蛋白GFP及由该蛋白突变衍生出的BFP、CFP、YFP、cpYFP等。
本文所用术语“GFP”指绿色荧光蛋白，最初是从维多利亚多管发光水母(Aequorea victoria)中提取，野生型的AvGFP由238个氨基酸构成，分子量约为26kD，其氨基酸序列为SEQ ID No：20。当前的研究确认，天然GFP蛋白中第65～67位的三个氨基酸Ser-Tyr-Gly能够自发形成一个荧光生色基团：对-羟基苯亚甲基咪唑啉酮(p-hydroxybenzylideneimidazolinone)，是其主要的发光位置。野生型AvGFP的光谱特征十分复杂，其荧光激发的主峰在395nm处，而在475nm处另有一个附峰，后者振幅强度约为前者的1/3。在标准的溶液条件下，395nm处的激发可产生508nm处的发射，而475nm处的激发产生的最大发射波长位于503nm。
本文所用术语“YFP”指黄色荧光蛋白，该蛋白衍生自绿色荧光蛋白GFP，其氨基酸序列与GFP同源性高达90％以上，YFP相比于GFP关键改变在于第203位氨基酸由苏氨酸突变为酪氨酸(T203Y)。相比于原始的AvGFP，YFP的主激发峰的波长红移至514nm而发射波长则改变为527nm。在此基础上对YFP第65位氨基酸进行定点突变(S65T)可获得荧光增强型黄色荧光蛋白EYFP，典型的EYFP氨基酸序列为SEQ ID No：21。而对EYFP蛋白序列的重新排列，将原第145-238位氨基酸部分作为新蛋白的N端，原第1-144位氨基酸作为新蛋白的C端，两片段间通过一小段具有柔性的短肽链VDGGSGGTG连接，形成一个对空间变化敏感的环状排列黄色荧光蛋白cpYFP(circular permutationyellow fluorescent protein)，典型的cpYFP氨基酸序列为SEQ ID No：22。
在本发明中，与荧光团融合的YdiH蛋白可以是分离自枯草芽孢杆菌或嗜热水生菌或天蓝色链霉菌的天然YdiH蛋白的全长或其片段，优选是天然枯草芽胞杆菌属YdiH蛋白的氨基酸1-215或嗜热水生菌属YdiH蛋白的氨基酸1-211或天蓝色链霉菌属YdiH蛋白的氨基酸1-259，更优选枯草芽胞杆菌属YdiH蛋白的氨基酸1-215或嗜热水生菌属YdiH蛋白的氨基酸1-211。
“接头”指在本发明多肽、蛋白质或核酸中连接两个部分的氨基酸或核酸序列。在本发明多肽或蛋白质中进行连接时，接头的长度不大于6个氨基酸，优选不大于4个氨基酸，更优选是3个氨基酸。在本发明核酸中进行连接时，接头的长度不大于18个核苷酸，优选不大于12个核苷酸，更优选是9个核苷酸。
提到某多肽或蛋白时，本发明所用术语“变异体”包括具有所述多肽或蛋白相同功能、但序列不同的变异体。这些变异体包括(但并不限于)：在所述多肽或蛋白的序列中缺失、插入和/或取代一个或多个(通常为1-30个，较佳地1-20个，更佳地1-10个，最佳地1-5个)氨基酸，以及在其C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸获得的序列。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变多肽或蛋白的功能。在本领域中，性能相似的氨基酸往往指具有相似侧链的氨基酸家族，在本领域已有明确定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变多肽或蛋白的功能。本领域技术人员公知，在基因克隆操作中，常常需要设计合适的酶切位点，这势必在所表达的多肽或蛋白末端引入了一个或多个不相干的残基，而这并不影响目的多肽或蛋白的活性。又如为了构建融合蛋白、促进重组蛋白的表达、获得自动分泌到宿主细胞外的重组蛋白、或利于重组蛋白的纯化，常常需要将一些氨基酸添加至重组蛋白的N-末端、C-末端或该蛋白内的其它合适区域内，例如，包括但不限于，适合的接头肽、信号肽、前导肽、末端延伸、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白、蛋白A、如6His或Flag的标签，或Xa因子或凝血酶或肠激酶的蛋白水解酶位点。多肽或蛋白的变异体可包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与所述多肽或蛋白的DNA杂交的DNA所编码的多肽或蛋白、以及利用抗所述多肽或蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。这些变异体还可包含与所述多肽或蛋白的序列相同性为至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％的多肽或蛋白。
在两种或多种多肽或核酸分子序列中，术语“相同性”或“相同性百分数”指在比较窗口或指定区域上，采用本领域已知方法如序列比较算法，通过手工比对和目测检查来比较和比对最大对应性时，两个或多个序列或子序列相同或其中在指定区域有一定百分数的氨基酸残基或核苷酸相同(例如，60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同)。例如，适合测定序列相同性百分数和序列相似性百分数的优选算法是BLAST和BLAST 2.0算法，分别可参见Altschul等(1977)Nucleic Acids Res.25：3389和Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403。
本文所用术语“可溶性片段”通常指具有所述蛋白全长序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸的片段。
本文所用术语“功能片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持与本发明天然YdiH相同的生物学功能或活性的蛋白。本发明的YdiH的功能片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白，或(iii)成熟蛋白与另一个化合物(比如延长蛋白半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的蛋白，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白(如前导序列或分泌序列或用来纯化此蛋白的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些功能片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
所述类似物与天然YdiH蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术得到。
所述类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的YdiH蛋白并不限于上述列举的代表性蛋白、片段、衍生物和类似物。修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的蛋白的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的蛋白。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的蛋白。
本发明所用术语“核酸”可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟蛋白的编码区序列可以与SEQID NO：9、10、11、12或13所示的编码区序列相同或者是其简并变体。如本文所用，“简并变体”在本发明中是指编码本发明荧光融合蛋白，但与SEQID NO：9、10、11、12或13所示的编码区序列有差别的核酸序列。
提到核酸时，本文所用术语“变异体”可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括简并变异体、取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个核酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的蛋白的功能。本发明核酸可包含与所述核酸序列的序列相同性为至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％的核苷酸序列。
如此处所用，术语“在严谨条件下杂交”是用来描述典型的相互间至少60％同源的核苷酸序列仍可相互杂交的杂交和清洗条件。优选的，严谨条件为这样的条件，在此条件下相互间有至少65％、更优的至少70％、且甚至更优选的至少80％或更高同源性的序列一般仍可相互杂交。此严谨条件为本领域普通技术人员所公知。严谨条件的一个优选，非限制性实例为：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，0℃；或(2)杂交时加有变性剂，50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的核酸编码的蛋白与SEQ ID NO：4、5、6、7或8所示的成熟蛋白有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)。
本发明荧光探针或融合蛋白的全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离和纯化得到有关多肽或蛋白。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段、衍生物、类似物或变异体)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(如载体)和细胞中。可通过突变PCR或化学合成等方法将突变引入本发明蛋白序列中。
本文所用的术语“表达载体”和“重组载体”可互换使用，指本领域熟知的原核或真核载体，例如细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体，这些载体能够在宿主体内复制和稳定，这些重组载体的一个重要特征是通常含有表达控制序列。本文所用术语“表达控制序列”指调控目的基因的转录、翻译和表达的可以与目的基因操作性连接的元件，可以是复制起点、启动子、标记基因或翻译控制元件，包括增强子、操纵子、终止子、核糖体结合位点等，表达控制序列的选择取决于所用的宿主细胞。在本发明中适用的重组载体包括但不限于细菌质粒。在重组表达载体中，“操作性连接”是指目的的核苷酸序列与调节序列以允许核苷酸序列表达的方式连接。本领域的技术人员熟知能用于构建含本发明融合蛋白编码序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体的方法。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTR和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
本领域普通技术人员将理解重组表达载体的设计可取决于如欲转化的宿主细胞的选择、所需的蛋白质表达水平等因素。此外，重组表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如用于真核细胞的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
在一种实施方式中，将本发明荧光探针或融合蛋白的编码序列经BamHI和HindIII双酶切后与BamHI和HindIII双酶切的pRSETb载体连接，得到大肠杆菌重组表达载体。可以将本发明的表达载体转移到宿主细胞中，以产生包括融合蛋白的蛋白或肽。此种转移过程可用转化或转染等本领域技术人员熟知的常规技术进行。
本文在所用术语“宿主细胞”又称为受体细胞，是指能够接收和容纳重组DNA分子的细胞，是重组基因扩增的场所，理想的受体细胞应该满足易于获取和增殖两个条件。本发明的“宿主细胞”可包括原核细胞和真核细胞，具体包括细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。
本发明的表达载体可用于在原核或真核细胞中表达本发明荧光探针或融合蛋白。从而，本发明涉及已导入本发明表达载体的宿主细胞、优选大肠杆菌。宿主细胞可为任何原核或真核细胞，代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属，鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞，真菌细胞如酵母，植物细胞，果蝇S2或Sf9的昆虫细胞，CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等，其中包括但不限于上述的那些宿主细胞。所述宿主细胞优选各种利于基因产物表达或发酵生产的细胞，此类细胞已为本领域熟知并常用，例如各种大肠杆菌细胞和酵母细胞。在本发明的一个实施方式中，选用大肠杆菌BL21构建表达本发明融合蛋白的宿主细胞。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
本文所用术语“转化”和“转染”、“接合”和“转导”意指本领域内公知的各种将外源核酸(例如，线性DNA或RNA(例如，线性化载体或无载体的单独的基因构建体))或载体形式的核酸(例如，质粒、粘粒、噬菌体、噬粒、噬菌粒、转座子或其它DNA)导入宿主细胞的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-甘露聚糖-介导的转染、脂转染、天然感受态、化学介导的转移或电穿孔。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主细胞是真核细胞时，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
可以用适合所述宿主细胞表达的常规方法培养获得的转化细胞，表达本发明融合蛋白。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可以是各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组蛋白可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离或纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
在一个实施方式中，通过包含本发明融合蛋白编码序列的大肠杆菌发酵生产本发明荧光探针或融合蛋白，并通过硫酸铵沉降，离子交换层析和凝胶层析纯化得到了纯形式的本发明荧光探针或融合蛋白。
本发明荧光探针或融合蛋白的用途包括但不限于：检测NADH、在生理状态下检测NADH、在亚细胞水平检测NADH、原位检测NADH、筛选药物、诊断与与NADH水平有关的疾病等。
在本文中，浓度、含量、百分数和其它数值均可用范围的形式表示。也应理解，使用这种范围形式只是为了方便和简洁，应该被弹性地借读为包括范围上下限所明确提及的数值，还应包括该范围内包括的所有单个数值或子范围，就好像明确提及各个数值和子范围那样。
实施例
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等，《分子克隆：实验室指南》(美国纽约州：冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，1989)；或按照制造厂商所建议的条件进行。在本文中，除非另外说明，百分比和份数均按重量计算。
I.实验材料和试剂
试剂：除特别标注，其他均来自上海国药集团化学试剂有限公司(中国上海)。
PCR扩增所使用的Taq酶、缓冲液、dNTP；分子生物实验中所使用的蛋白酶、缓冲液、T4DNA连接酶、T4DNA连接酶缓冲液、T4多聚核苷酸激酶(PNK)、T4 PNK缓冲液，均来自立陶宛维尔纽斯的富酶泰斯公司(Fermentas)。
实施例1pRSETb-ydiH-YFP-ydiH(D2)的构建和表达
1.扩增cpYFP的核酸序列：
以pMD19-cpYFP(Nagai，T.等，Proc Natl Acad Sci U S A.2001，V.98(6)，pp.3197-3202)(获自华东理工大学蛋白质化学实验室(中国上海))为模板，利用引物cpYFP F和cpYFP R扩增黄色荧光蛋白(cpYFP)的编码序列，引物序列(引物由中国上海的上海生工生物工程有限公司合成)如下：
P1：SpeI GAAATCGAAACTAGTTACAACAGCCACAACGTCTATATC(SEQ ID NO：23)
P2：KpnI CCAAGCTTCGGGGTACCGTTGTACTCCAGCTTGTG(SEQID NO：24)
PCR反应体系为
PCR反应条件为：
将PCR扩增产物在1％的琼脂糖凝胶中电泳30分钟，得到约750bp的cpYFP片段。利用上海生工DNA片段回收纯化试剂盒(上海生物工程有限公司，中国上海)按照厂商说明书从凝胶中回收和纯化cpYFP片段。
2.从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168细胞中提取目的基因序列：
a.样品处理
(i)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168获自中国普通微生物菌种保藏管理中心(目录编号为1.1656)。
(ii)根据上述条件，取100μl培养的枯草芽孢杆菌168，测定培养液在600nm处的光密度，OD600＝0.1时细胞密度为1×107～5×107个/毫升，据此计算实际细胞数量，进而对每1×107个枯草芽孢杆菌细胞加入1ml TRIzol试剂(来自英杰公司(Invitrogen，美国加州)进行处理。
(iii)取一定量的菌液，4℃、5000rpm离心10分钟，弃上清液。
(iv)菌体沉淀用100μl 1×TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTApH8.0，试剂来自艾玛思科公司(Amresco，美国俄亥俄州)清洗，5000rpm离心10分钟，弃上清液。
(v)用100μl 1×TE缓冲液(含2mg/ml溶菌酶(来自美季生物，中国上海))重悬菌体沉淀，37℃孵育30分钟。
b.相分离
(i)加入1ml TRIzol试剂(英杰公司)，用移液器吹打混匀，室温静置5分钟。
(ii)加入200μl氯仿，持续15秒震荡混匀，室温静置2～3分钟，4℃、12,000g离心15分钟。
(iii)离心后溶液分层，上层水相约占40％，含有RNA，下层有机相约占60％，含有DNA和蛋白质，小心地吸取并除去上层水相。
c.除杂质
有机相中加入50μl 10％SDS和250μl饱和食盐水，震荡混匀，4℃、12,000g离心5分钟，弃去上层水相。
d.DNA乙醇沉淀
有机相加入750μl预冷的95％乙醇，翻转混匀，-80℃静置15分钟以沉淀DNA。
e.DNA清洗
(i)倾去上层有机相。
(ii)沉淀用1ml 0.1M柠檬酸钠/10％乙醇溶液清洗多次，每次均4℃、12,000g离心5分钟。
(iii)最后用75％乙醇清洗一次，4℃、12,000g离心5分钟。
(iv)室温自然风干乙醇。
f.溶解DNA
用50μl 8mM NaOH溶液沉淀的DNA，4℃或-20℃保存。
以如上所述抽提出的基因组为模板，利用引物ydiH 1F和ydiH 1R、ydiH(D2)2F和ydiH 2R分别扩增枯草芽孢杆菌168的YdiH蛋白基因(ydiH)全长和部分(氨基酸85-215)，其中引物ydiH 1F和ydiH 1R扩增获得N端含有BamHI酶切位点C端含有SpeI酶切位点的YdiH蛋白基因(ydiH)全长片段yidH 1，引物ydiH(D2)2F和ydiH 2R扩增获得N端含有KpnI酶切位点C端含有HindIII酶切位点的YdiH蛋白基因(ydiH)部分(氨基酸85-215)片段ydiH(D2)2)，引物ydiH 1F、ydiH 1R、ydiH(D2)2F和ydiH 2R序列如下：
ydiH 1F：BamHI CCGGATCCATGAATAAGGATCAATCAAAAATTC(SEQ ID NO：25)
ydiH 1R：SpeI GCTGTTGTAACTAGTTTCGATTTCCTCTAAAACT(SEQ ID NO：26)
ydiH(D2)2F：KpnI CGGGGTACCATGACAGACGTCATCTTGATTGGTG(SEQ ID NO：27)
ydiH 2R：HindIII CCCAAGCTTCTATTCGATTTCCTCTAAAAC(SEQID NO：28)
PCR反应体系为：
PCR反应条件为：
将PCR扩增产物在1％的琼脂糖凝胶中电泳30分钟，得到大小约为700bp的ydiH 1片段和大小约为450bp的ydiH(D2)2片段，利用上海生工DNA片段回收纯化试剂盒(上海生物工程有限公司，中国上海)按照厂商说明书回收和纯化ydiH 1和ydiH(D2)2片段。
3.目的基因片段与载体的连接
利用重叠延伸PCR技术以ydiH 1和cpYFP为模板以ydiH 1F和cpYFP 1R为引物进行PCR，PCR体系为：
PCR条件为：
(1)模板片段需经过纯化。
(2)初始反应体系中不含正、反向引物，反应进行了10个循环后再将引物加入反应体系中。
将PCR扩增产物在1％的琼脂糖凝胶中电泳40分钟，得到大小约为1400bp的ydiH-cpYFP片段。将回收纯化的PCR片段ydiH-YFP以及载体质粒pRSETb分别进行双酶切，体系如下：
反应条件：37℃，5小时。
反应结束后，50μl反应体系中加入10μl 6×上样缓冲液终止反应。然后通过琼脂糖凝胶电泳分离目的片段，利用上海生工DNA片段回收纯化试剂盒(上海生物工程有限公司，中国上海)按照厂商说明书回收并纯化片段。
将回收到的ydiH-cpYFP双酶切产物及载体质粒pRSETb双酶切产物连接，体系如下：
反应条件：16℃，过夜。从而形成连接产物pRSETb-ydiH-YFP。
最后，利用以下条件对上述ydiH(D2)2和经过验证的pRSETb-ydiH-YFP双酶切：
反应条件：37℃，5小时。
反应结束后，50μl反应体系中加入10μl 6×上样缓冲液终止反应。然后通过琼脂糖凝胶电泳分离目的片段，利用上海生工DNA片段回收纯化试剂盒(上海生物工程有限公司，中国上海)按照厂商说明书回收并纯化片段。
如上所述，将回收到的ydiH(D2)2和pRSETb-ydiH-YFP的双酶切产物连接，从而形成最终连接产物pRSETb-ydiH-YFP-ydiH(D2)。
取菌落PCR鉴定为阳性的克隆，采用通用引物测序，由北京六合华大基因科技股份有限公司上海分公司进行测序。测定的序列用Vector NTI 8.0进行数据比对分析。结果表明该质粒中确实插入了ydiH-cpYFP-ydiH(D2)的核苷酸序列(如序列表中SEQ ID NO：9所示)，该序列编码序列表中SEQID NO：4所示的蛋白。
4.转化
将重组质粒pRSETb-ydiH-cpYFP-ydiH(D2)转化入感受态的大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)pLysS(购自中国北京的天根生化)中，获得重组菌BL-Frex，具体方法如下：
(i)在洁净条件下，取1μl质粒或10μl连接产物加入100μl感受态中，冰浴45分钟；
(ii)冰浴后，迅速于42℃水浴中热激90～120秒；
(iii)再冰浴5分钟；
(iv)加入800ul LB液体培养基，37℃、150rpm摇床复苏1小时；
(v)4000rpm、常温离心5分钟后，弃去上清；
(vi)用少量的新鲜LB重悬沉淀，随后将全部菌液均匀涂布于所需的LB平板上，37℃倒置培养过夜。
采用常规的菌落PCR方法筛选阳性克隆，并转入5ml含有相应抗性的LB液体培养基中，37℃、220rpm过夜培养。重组菌BL-Perex在LB培养基中37℃培养至菌体浓度OD为0.8，加入0.1mM IPTG，18℃诱导表达20小时，用Ni2+亲和层析柱(通用电气公司，瑞典乌普萨拉)从菌体裂解液中分离纯化F-rex1蛋白，经SDS-PAGE鉴定，只在约66.5kD处有一条蛋白条带，为F-rex1蛋白(图1)，图1中1为Ni2+亲和层析柱分离纯化的F-rex蛋白，2为标记物。
实施例2pRSETb-ydiH(189)-YFP-ydiH(190)的构建和表达
1.扩增cpYFP的核酸序列：
以pMD19-cpYFP为模板，利用引物cpYFP F和cpYFP R扩增黄色荧光蛋白(cpYFP)的编码序列，引物序列(引物由上海生工生物工程有限公司(中国上海)合成)如下：
P1：PstI GAATCTGCAGGCTACAACAGCCACAACGTCTATATC(SEQID NO：29)
P2：KpnI CCAAGCTTCGGGGTACCGTTGTACTCCAGCTTGTG(SEQID NO：30)
PCR反应体系为
PCR反应条件为：
将PCR扩增产物在1％的琼脂糖凝胶中电泳20分钟，得到约750bp的cpYFP片段。利用上海生工DNA片段回收纯化试剂盒(上海生物工程有限公司，中国上海)按照厂商说明书从凝胶中回收和纯化cpYFP片段。
2.扩增嗜热水生菌(Thermus aquaticus)属YdiH蛋白目的基因序列：
嗜热水生菌属YdiH蛋白基因T-ydiH委托上海捷瑞生物工程有限公司(中国上海)合成(按照NCBI Genbank数据中记录的基因全序列进行合成，NCBIGenbank AF061257.1)。
以上述基因为模板，利用引物ydiH 1F和ydiH 2R扩增嗜热水生菌的YdiH蛋白基因(T-ydiH)全长，其中引物ydiH 1F和ydiH 2R扩增获得N端含有BamHI酶切位点C端含有HindIII酶切位点的T-YdiH蛋白基因(T-ydiH)全长片段T-yidH，引物ydiH 1F和ydiH 2R序列如下：
P3：BamHI CCGGATCCGATGAATAAGGATCAATCAAAAATTC(SEQID NO：31)
P4：HindIII CCCAAGCTTCTATTCGATTTCCTCTAAAAC(SEQ ID NO：32)
PCR反应体系为
PCR反应条件为：
将PCR扩增产物在1％的琼脂糖凝胶中电泳30分钟，得到大小约为700bp的ydiH1片段，利用上海生工DNA片段回收纯化试剂盒(上海生物工程有限公司，中国上海)按照厂商说明书回收和纯化T-ydiH片段。
3.目的基因与载体的连接
将回收纯化的PCR片段T-ydiH以及载体质粒pRSETb分别进行双酶切，体系如下：
反应条件：37℃，5小时。
反应结束后，50μl反应体系中加入10μl 6×上样缓冲液终止反应。然后通过琼脂糖凝胶电泳分离目的片段，利用上海生工DNA片段回收纯化试剂盒(上海生物工程有限公司，中国上海)按照厂商说明书回收并纯化片段。
将回收到的T-ydiH双酶切产物及载体质粒pRSETb双酶切产物连接，体系如下
反应条件：16℃，过夜。从而形成连接产物pRSETb-ydiH。
以上述经过验证的pRSETb-ydiH为模板，利用引物T-ydiH(L190)F和T-ydiH(F189)R扩增pRSETb-ydiH序列全长，其中引物T-ydiH(L190)F和T-ydiH(F189)R扩增获得N端含有PstI酶切位点C端含有KpnI酶切位点的pRSETb-ydiH序列全长片段yidH-pRSETb，引物T-ydiH(L190)F和T-ydiH(F189)R序列如下：
P5：KpnI ATAGGTACCGGCCTGGCCGGCCTGACCCGGCTG(SEQID NO：33)
P6：PstI ATACTGCAGAGAAGTCCACGTTCTCCACGGCCACCTC(SEQ ID NO：34)
最后，利用以下条件对上述yidH-pRSETb片段和经过验证的cpYFP片段双酶切：
反应条件：37℃，5小时。
反应结束后，50μl反应体系中加入10μl 6×上样缓冲液终止反应。然后通过琼脂糖凝胶电泳分离目的片段，利用上海生工DNA片段回收纯化试剂盒(上海生物工程有限公司，中国上海)按照厂商说明书回收并纯化片段。
如上所述，将回收到的yidH-pRSETb和cpYFP的双酶切产物连接，从而形成最终连接产物pRSETb-ydiH(189)-YFP-ydiH(190)。
取菌落PCR鉴定为阳性的克隆，采用通用引物测序，由北京六合华大基因科技股份有限公司上海分公司进行测序。测定的序列用Vector NTI 8.0进行数据比对分析。结果表明该质粒中确实插入了ydiH(189)-YFP-ydiH(190)的核苷酸序列(如序列表中SEQ ID NO：13所示)，该序列编码序列表中SEQID NO：8所示的蛋白。
4.转化
将重组质粒pRSETb-ydiH(189)-YFP-ydiH(190)转化入感受态的大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)pLysS(购自天根生化，中国北京)中，获得重组菌BL-Frex，具体方法如下：
(i)在洁净条件下，取1μl质粒或10μl连接产物加入100μl感受态中，冰浴45分钟；
(ii)冰浴后，迅速于42℃水浴中热激90～120秒；
(iii)再冰浴5分钟；
(iv)加入800ul LB液体培养基，37℃、220rpm摇床复苏1小时；
(v)4000rpm、常温离心5分钟后，弃去上清；
(vi)用少量的新鲜LB重悬沉淀，随后将全部菌液均匀涂布于所需的LB平板上，37℃倒置培养过夜。
采用常规的菌落PCR方法筛选阳性克隆，并转入5ml含有相应抗性的LB液体培养基中，37℃、220rpm过夜培养。重组菌BL-Perex在LB培养基中37℃培养至菌体浓度OD为0.8，加入0.1mM IPTG，18℃诱导表达20小时，用Ni2+亲和层析柱(通用电气，瑞典乌普萨拉)从菌体裂解液中分离纯化F-rex2蛋白，经SDS-PAGE鉴定，只在约50kD处有一条蛋白条带，为F-rex2蛋白(图2)，图2中1为Ni2+亲和层析柱分离纯化的F-rex2蛋白，2为标记物。
实施例3.ydiH-YFP-ydiH(D2)衍生系列探针
探针构建原理
利用构建pRSETb-ydiH-YFP-ydiH等探针的中间过渡质粒为模板，根据定点突变的原理，进行衍生系列探针的构建。
截短突变序列示意如下：
  原始序列   206KHYSVLEEIE 215-TS-YFP-GT-ydiH   SEQ ID NO
  Del T(2)   206KHYSVLEEIE 215-TS-YFP-G-ydiH   104
  Del G   206KHYSVLEEIE 215-TS-YFP-T-ydiH   103
  Del GT   206KHYSVLEEIE 215-TS-YFP-ydiH   102
  Del S   206KHYSVLEEIE 215-T-YFP-GT-ydiH   126
  Del T(1)   206KHYSVLEEIE 215-S-YFP-GT-ydiH   101
  Del TS   206KHYSVLEEIE 215-YFP-GT-ydiH   159
  C9   206KHYSVLEEI 214-YFP-GT-ydiH   100
  C8   206KHYSVLEE 213-YFP-GT-ydiH   99
  C2   206KH 207-YFP-GT-ydiH   93
  C1   206K-YFP-GT-ydiH   92
突变文库的建立
1.引物设计(上海生工)
2.PCR扩增
利用定点突变PCR进行截短突变及定点突变。
突变PCR扩增体系(引物、酶、dNTP等来自富酶泰斯公司)：
3.DNA片段分离、纯化
DpnI消化
首先利用DpnI酶(来自富酶泰斯公司)在37℃处理上述PCR扩增片段3小时，以便去除潜在的模板质粒污染。然后，使反应体系在80℃变性失活20分钟。经变性失活的反应混合物可以直接用于后续的分子生物学实验。
DNA片段磷酸化
在ATP存在下，利用T4多聚核苷酸激酶(T4polynucleotide kinase，T4PNK)(来自富酶泰斯公司)在37℃处理1小时，以使DNA核糖环的5’-OH磷酸化，以便于片段环化自连。然后，使反应体系在75℃变性失活10分钟。变性失活的反应混合物可以直接用于后续的分子生物学实验。
连接
用T4 DNA连接酶(来自富酶泰斯公司)将经过磷酸化处理的DNA片段(突变的DNA片段pRSETb-ydiH-YFP或pRSETb-YFP-ydiH)进行环化自连(16℃，过夜)。
突变系列质粒双酶切
将抽提的pRSETb-ydiH-YFP系列及pRSETb-YFP-ydiH突变体质粒分别进行双酶切，体系如下：
反应条件：37℃，5小时。
反应结束后，50μl反应体系中加入10μl 6×上样缓冲液终止反应。然后通过琼脂糖凝胶电泳分离目的片段，利用柱吸附法回收并纯化片段，详细步骤见“上海生工DNA片段回收纯化试剂盒”。
对于截短突变，根据需要选择突变质粒pRSETb-ydiH-YFP系列的酶切片段pRSETb-ydiH-YFP与未发生突变的正常序列片段YFP-ydiH片段连接。对于定点突变，根据根据需要选择突变质粒pRSETb-ydiH-YFP系列的酶切片段pRSETb-ydiH-YFP与同样发生定点突变的pRSETb-YFP-ydiH系列的酶切片段YFP-ydiH连接。
连接
将回收的纯化片段pRSETb-ydiH-YFP与YFP-ydiH段连接，体系如下：
反应条件：16℃，过夜。
连接产物标记为pRSETb-ydiH-YFP-ydiH Truc v2.xx或pRSETb-ydiH-YFP-ydiH。
突变体质粒鉴定
取菌落PCR筛选为阳性的克隆，采用通用引物测序，由北京六合华大基因科技股份有限公司上海分公司完成。测定的序列用Vector NTI 8.0进行数据比对分析。
构建探针系列
根据上述方法可进一步获得下述探针系列。
实施例4.ydiH(189)-YFP-ydiH(190)衍生系列探针
探针构建原理
利用构建pRSETb-ydiH(189)-YFP-ydiH(190)等探针的中间过渡质粒为模板，根据定点突变的原理，进行衍生系列探针的构建。
截短突变序列示意如下：
突变文库的建立
1.引物设计(上海生工)
2.PCR扩增
利用定点突变PCR进行截短突变及定点突变。
突变PCR扩增体系(引物、酶、dNTP等来自富酶泰斯公司)：
3.DNA片段分离、纯化
DpnI消化
首先利用DpnI酶(来自富酶泰斯公司)在37℃处理上述PCR扩增片段3小时，以便去除潜在的模板质粒污染。然后，使反应体系在80℃变性失活20分钟。经变性失活的反应混合物可以直接用于后续的分子生物学实验。
DNA片段磷酸化
在ATP存在下，利用T4多聚核苷酸激酶(T4 polynucleotide kinase，T4PNK)(来自富酶泰斯公司)在37℃处理1小时，以使DNA核糖环的5’-OH磷酸化，以便于片段环化自连。然后，使反应体系在75℃变性失活10分钟。变性失活的反应混合物可以直接用于后续的分子生物学实验。
连接
用T4 DNA连接酶(来自富酶泰斯公司)将经过磷酸化处理的DNA片段(突变的DNA片段pRSETb-ydiH-YFP或pRSETb-YFP-ydiH)进行环化自连(16℃，过夜)。
突变体质粒鉴定
取菌落PCR筛选为阳性的克隆，采用通用引物测序，由北京六合华大基因科技股份有限公司上海分公司完成。测定的序列用Vector NTI 8.0进行数据比对分析。
构建探针系列
根据上述方法可进一步获得下述探针系列，并予以分别编号。
实施例5.还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸荧光探针的光谱特性
将如上所述制备的荧光探针溶解于测定缓冲液(100mM KPi(磷酸钾)，pH7.4)中配制成终浓度为10μM的荧光探针溶液。利用多功能荧光酶标仪(协作2型(Synergy 2))(伯腾公司(BioTek，美国佛蒙特州)测定吸收光谱(图3A)。
用荧光分光光度计(CE荧光分光光度计(Cary Eclipse Fluorescencespectrophotometer)，(瓦里安公司(Varian))测定激发和发射光谱(图3B)。
光谱特性测定的实验结果表明，F-rex1蛋白具有两个激发峰分别为400nm和490nm，其中后者的振幅强度是前者的五倍，而F-rex1蛋白仅有一个发射峰为521nm。F-rex2蛋白具有两个激发峰分别为410nm和500nm，其中后者的振幅强度约是前者的二分之一，而F-rex2蛋白仅有一个发射峰为518nm(图4)。
实施例6.还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸荧光探针对生理条件下吡啶核苷酸类似物响应特性
将如上所述制备的荧光探针溶解于测定缓冲液(100mM KPi，pH 7.4)中配制成终浓度为1μM的蛋白溶液。用测定缓冲液(100mM KPi，pH 7.4)将吡啶核苷酸类似物NAD+、NADH、ATP、ADP、NADP+及NADPH(默克公司(Merck，德国达姆施塔特)分别配制成终浓度为8mM的储液，在测定前稀释至80μM待用。
取200μl 1μM的荧光探针溶液，首先用4μl 80μM NAD+或NADH或ATP或ADP或NADP+或NADPH连续滴定5次，然后用4μl 8mM NAD+或NADH或ATP或ADP或NADP+或NADPH再连续滴定5次，每次滴定结束后振荡5s待充分反应后，测定蛋白的485nm荧光激发后528nm发射的荧光强度。对样品的荧光激发、发射测定利用多功能荧光酶标仪(协作2型，伯腾公司)完成。
测定结果显示，生理浓度(＜100μM NADH)下还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸荧光探针仅对还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)有明显响应，而对于其他吡啶类核苷酸并无明显响应(如图5和6)。
实施例7.还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸荧光探针在不同亚细胞器内定位表达
以pRSETb-ydiH-cpYFP-ydiH(D2)为模板，利用BamHI和HindIII双酶切获得还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸荧光探针基因(Frex)，酶切产物片段回收后分别连接到pcDNA3.1-Hygro-Cyto、pcDNA3.1-Hygro-Mito、pcDNA3.1-Hygro-Nuc、pcDNA3.1-Hygro-Mem、pcDNA3.1-Hygro-Golgi、pcDNA3.1-Hygro-ER、pcDNA3.1-Hygro-Peroxi载体上(中国上海的华东理工大学蛋白质化学实验室改造)。
制备方法：未经特别声明，本方法内所有引物均由上海生工合成(上海生工，中国上海)。首先构建pcDNA3.1-Hygro-Cyto载体，以pcDNA3.1-Hygro(+)(英杰公司(Invitrogen)，美国加州)为基础，设计两条引物Cyto引物F和Cyto引物R，
Cyto引物F：CTAGCATGGCGGATCCACTAGTAAGCTTAAGC(SEQ ID No 80)
Cyto引物R：TCGAGCTTAAGCTTACTAGTGGATCCGCCATG(SEQ ID No 81)
这组引物中含有酶切位点及起始密码子ATG，结构为“NheI-ATG-GC-BamHI-HindIII-XhoI”，将获得的引物按如下步骤操作进行双引物退火：
1.将引物干粉用专用缓冲液(10mMTris，pH7.5-8.0；50mMNaCl，1mMEDTA)稀释至100μM
2.将要退火的引物对，等摩尔混合，总体积不超500μl
3.加热到95度，然后缓慢冷却至室温(低于30℃)，产物至于-20℃待用
对于定位信号Mito(SEQ ID No 82)及Golgi(SEQ ID No 83)，采用人工合成序列的方法，在定位信号N端设置NheI酶切位点在C端设置BamHI酶切位点后，通过双酶切的方发将定位信号介入pcDNA3.1-Hygro(+)载体中。
对于定位信号Nuc、Mem、ER、Peroxi同样在定位信号两端分别设置一组酶切位点后，通过合成引物利用双引物退火成双链DNA的方法直接获得含有黏性末端的DNA双链片段，然后接入已双酶切的pcDNA3.1-Hygro(+)载体中。
Nuc引物F：
AGCTTGATCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAGATCCAAAAAAGAAGAGA
AAGGTAGATCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAGC(SEQ ID No 84)
Nuc引物R：
TCGAGCTACCTTTCTCTTCTTTTTTGGATCTACCTTTCTCTTCTTTTTTGGATC
TACCTTTCTCTTCTTTTTTGGATCA(SEQ ID No 85)
Mem引物F：
CTAGCATGGCGCTGTGCTGTATGAGAAGAACCAAACAGGTTGAAAAGA
ATGATGAGGACCAAAAGATCGCG(SEQ ID No 86)
Mem引物R：
GATCCGCGATCTTTTGGTCCTCATCATTCTTTTCAACCTGTTTGGTTCTTCT
CATACAGCACAGCGCCATG(SEQ ID No 87)
ER引物F：
CTAGCATGGCGCTGCTATCCGTGCCGTTGCTGCTCGGCCTCCTCGGCCT
GGCCGTCGCCGCG(SEQ ID No 88)
ER引物R：
GATCCGCGGCGACGGCCAGGCCGAGGAGGCCGAGCAGCAACGGCACGG
ATAGCAGCGCCATG(SEQ ID No 89)
Peroxi引物F：AGCTTTCCAAGCTGTAAC(SEQ ID No 90)
Peroxi引物R：TCGAGTTACAGCTTGGAA(SEQ ID No 91)
构建重组质粒pcDNA3.1-Hygro-Cyto-Frex、pcDNA3.1-Hygro-mito-Frex、pcDNA3.1-Hygro-Frex-Nuc、pcDNA3.1-Hygro-mem-Frex、pcDNA3.1-Hygro-golgi-Frex、pcDNA3.1-Hygro-Frex-ER、pcDNA3.1-Hygro-Frex-peroxi。进行测序，测序结果表明Frex片段的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：9所示。利用所得的重组质粒分别转染、HEK293细胞、HEK293FT细胞和Cos7细胞，用激光共聚焦显微镜(来自尼康公司(Nikon，日本)观察转染后的细胞，两组激发光波长分别为405nm和488nm，发射光波长为500-550nm。
实验结果表明，Frex-Cyto在HEK293FT细胞中高效、准确定位于细胞浆中(图7A)；Frex-Mito在HEK293FT细胞中高效、准确定位于线粒体中(图7B)；Frex-Nuc在HEK293FT细胞中高效、准确定位于细胞核中(图7C)；Frex-Mem在HEK293FT细胞中高效、准确定位于细胞膜中(图7D)；Frex-Golgi在HEK293FT细胞中高效、准确定位于高尔基体中(图7E)；Frex-ER在HEK293FT细胞中高效、准确定位于内质网中(图7F)；Frex-Pero在HEK293FT细胞中高效、准确定位于过氧化物酶体中(图7G)。
实施例8用该系列探针指示细胞内还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的变化
(1)还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸荧光探针实时测定NADH跨膜进入细胞导致不同亚细胞区室内NADH水平增加。
按照实施例7将还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸荧光探针于293FT细胞不同亚细胞器内标表达，结果显示该系列探针能够实时地检测细胞培养基中外加NADH对细胞内NADH水平的影响(图8-1A)，当在细胞培养基中外加NADH时，用激光共聚焦显微镜(来自尼康公司(Nikon，日本)观察转染后的细胞，结果显示在485nm荧光激发下探针528nm下的发射荧光比对照组增强2.5倍，证明NADH可以跨膜进入细胞导致细胞内NADH水平立即增加；图8-1D和图8-1E显示还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸荧光探针不受NADH类似物NAD+、NADPH等影响。比照的对照实验组，单独存在的cpYFP蛋白亦不受外加NADH影响。由此可排除pH和cpYFP自身受环境变化对探针产生的影响。我们进一步利用该系列探针检测外加NADH对其他细胞器内NADH水平的影响，结果显示外加NADH亦也可导致细胞核和线粒体内NADH水平的增加，图8-1B显示细胞核内结果，图8-1C显示线粒体内结果所示。综上结果表明烟酰胺腺嘌呤二核苷酸荧光探针可以很好指示出NADH跨膜进入哺乳动物细胞内导致细胞内NADH水平的增加。
(2)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸荧光探针实时测定葡萄糖、丙酮酸、乳酸对不同亚细胞区室内NADH水平的调节。
糖酵解作为细胞内产生NADH小分子的重要途径，其对细胞内NADH水平起着至关重要的调控作用，我们利用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸荧光探针对该途径中重要代谢物葡萄糖、丙酮酸、乳酸对不同亚细胞区室内NADH水平的影响进行了测试。图8-2A显示细胞浆内结果，图8-2D显示线粒体内结果。上述结果表明，葡萄糖作为细胞能量来源之一，可导致细胞浆和线粒体内NADH水平的增加。丙酮酸和乳酸作为糖酵解途径的产物，二者在细胞浆中存在动态的平衡，当细胞内丙酮酸水平增加，乳酸脱氢酶催化消耗NADH，生成乳酸和NAD+，进而导致细胞浆内NADH水平减少；当细胞内乳酸水平增加时，乳酸脱氢酶催化消耗NAD+，生成丙酮酸和NADH，进而导致细胞浆内NADH水平增加。图8-2B显示出丙酮酸可导致细胞浆内NADH水平迅速减少，但随着时间的增加又回复正常水平过程，而图8-2C显示乳酸促使细胞浆内NADH水平迅速增加，但随着时间的增加也能够回复正常水平，这些结果表明烟酰胺腺嘌呤二核苷酸荧光探针可以实时地显示细胞浆内NADH水平这一动态平衡调节过程。
(3)还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸荧光探针实时测定氧化磷酸化途径对线粒体内NADH水平的调控。
经由糖酵解途径和三羧酸循环途径产生的NADH经由线粒体呼吸链氧化磷酸化途径氧化，生成ATP为细胞各种生命活动提供能量。我们利用测试烟酰胺腺嘌呤二核苷酸荧光探针对呼吸链上不同位点复合物被抑制后对线粒体内NADH水平的影响进行了测定，图8-3A显示3-NP处理的表达于线粒体内NADH探针蛋白的6min动态图，图8-3B显示3-NP处理的表达于线粒体内对照蛋白cpYFP的6min动态图。上述每幅图时间间隔为1min。用激光共聚焦显微镜(来自尼康公司(Nikon，日本)观察处理前后的细胞，结果表明复合体II抑制剂3-NP由于抑制了三羧酸途径导致线粒体内NADH水平极大地降低，对照组中cpYFP无显示变化。图8-3C显示利用测试烟酰胺腺嘌呤二核苷酸荧光探针其他复合体抑制剂对线粒体内NADH水平影响的测定，结果显示复合体I抑制剂鱼藤酮、复合体III抑制剂抗霉素A、复合体IV抑制剂NaCN处理细胞30min后，探针485nm激发528nm发射荧光增加，表明复合体I抑制剂鱼藤酮、复合体III抑制剂抗霉素A、复合体IV抑制剂NaCN由于抑制氧化磷酸化途径阻止了NADH的氧化，从而导致线粒体内NADH水平的增加(图8-3C)。
实施例9氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸荧光探针测定细胞内NAD+水平的变化
氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸荧光探针的结构是，在Trex的F189和L190这两处氨基酸中间插入cpYFP，此探针的序列是SEQ ID NO：129，制备方法同实施例4。通过将氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸荧光探针在293FT细胞细胞浆中表达，发现该系列探针可以很好地实时检测细胞培养基中外加NAD+对细胞内NAD+水平的影响(图9-1)，如图9-1所示，当细胞培养基中外加NAD+时，485nm光激发探针528nm荧光立即大大增加至2.8倍左右，这说明氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸荧光探针可以很好指示NAD+跨膜进入哺乳动物细胞内导致细胞内NAD+水平增加。在蛋白检测时，单通道485nm激发，528nm发射时，Frex-2探针对NAD+的响应约有1000％倍(如图9-2)。在单通道485nm激发，528nm发射时，Frex-2探针对NADP、NADPH、ADP和ATP无响应(如图9-3)。
实施例10还原型和氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸比率荧光探针测定NADH/NAD+比率的变化
还原型和氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸比率荧光探针的结构是，在Trex的F189和L190这两处氨基酸中间插入cpYFP，此探针的序列是SEQID NO：148，制备方法同实施例4。该探针仅对NADH和NAD+有响应，对NADH类似物没有任何响应，当采用485nm激发可发现NAD和NADH结合均能导致探针528nm发射荧光均有增强，但是采用420nm激发，仅NADH的结合能够致使探针发生响应。由于探针420nm激发与485nm激发，均能于528nm处产生发射荧光，因此利用不同波长的荧光激发，测定其这两者在528nm出发射荧光的强度比值(420nm/485nm)可发现仅NADH的结合导致探针荧光比值的响应为上升，而NAD+的结合导致其响应为下降(图10-1)。当NADH和NAD保持总浓度不变，调整二者的相互比例时，该趋势变化更为明显，且不随总浓度的变化而变化(图10-2)。
当含有20uM的NADP，NADPH，ADP和ATP时，[NADH]/[NAD]按照一定比例去滴定，我们发现变化的响应倍数和变化趋势均没有受其影响，说明NADP，NADPH，ADP和ATP四种类似物对探针没有影响(如图10-3)。
因此该探针既可以做还原型和氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸比率探针，还可以单独做还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸探针。
其它实施方式
本说明书描述了许多实施方式。然而应理解，本领域技术人员通过阅读本说明书获知不背离本发明的构思和范围的各种改进。因此，这些其他实施方式也应包括在所附权利要求书的范围内。

Claims (8)

1.一种遗传编码的NADH荧光探针，所述荧光探针的氨基酸序列在至少85个氨基酸残基内与SEQ ID NO：4所示序列具有95％相同性，具体地，所述荧光探针的氨基酸序列选自SEQ ID NO：4、106、107、108、109、110、114、117、118、119、120、123、124或125。
2.一种核酸序列，其核苷酸序列编码权利要求1所述的荧光探针。
3.如权利要求2所述的核酸序列的互补核酸序列。
4.一种表达载体，其包含与表达控制序列操作性连接的如权利要求2所述的核酸序列。
5.一种宿主细胞，其包含权利要求4所述的表达载体。
6.一种制备权利要求1所述荧光探针的方法，包括以下步骤：
(1)将权利要求4所述的表达载体转移到宿主细胞中，
(2)在适合所述宿主细胞表达的条件下培养所述宿主细胞，和
(3)由所述宿主细胞分离所述荧光探针或融合蛋白。
7.权利要求1所述的荧光探针在制备NADH检测制品中的应用。
8.一种用于检测NADH的试剂盒，其包含权利要求1所述的荧光探针。
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