CN111443119B - 氧化还原状态检测探针及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了氧化还原状态检测探针及其应用，所述探针包括茶碱乙醛。本发明设计的探针参与氧还能力评价反应，该反应以茶碱乙醛作为底物、可经醛歧化酶及氧还电子传递对作用，同时生成氧化与还原型稳定终代谢物茶碱乙酸和羟乙基茶碱。由于两个终产物之间、终产物与底物之间均不产生可逆反应变换，因此，利用不同底物浓度、与不同反应时间的组合可最终测定出反应样本中存在多少氧还的总量及氧还对的比值，计算氧还状态。与现有技术相比，具有以下优点：(1)本发明所述氧化还原状态检测探针克服了测定处理条件、氧化或酶解等对检测结果的影响，能够稳定、高效的发挥测定作用；(2)本发明所述探针，方式简便、快速高效的完成氧化还原状态的检测。

Description

氧化还原状态检测探针及其应用
技术领域
本发明属于生物化学技术领域，涉及一种应用于体内或体外检测机体的氧化还原状态的探针，具体为氧化还原状态检测探针及其应用。
背景技术
氧化还原是生命代谢的基本过程，电子转移、传递及其反应过程驱动着所有的细胞能量及物质代谢。在能量代谢中，ATP合成依赖于底物电子转移及传递的级联反应；在物质代谢中(如碳水化合物，氨基酸，脂肪酸和核酸合成过程中)，电子转移与传递是生物物质合成代谢途径的基本组成部分。在上述代谢中，活性氧、活性氮和活性硫及其系列衍生物等氧还物质均参与其中，发挥着至关重要的生理作用，如翻译后蛋白质修饰，细胞信号传导途径和免疫应答等。但这些氧还物质一旦过剩将导致异常，过量的氧还物损害细胞、直接破坏细胞的主要成分如脂质、蛋白质和核酸等，导致对细胞和组织的伤害，引发疾病的病理过程。这些氧还对既可以定义为具体的电子传递分子，也可以定义为整体的氧还状态环境。因此，维系氧还对稳态及其环境的平衡对所有细胞发挥正常的代谢功能、保持健康均至关重要。
传统上，氧还对值与氧还对总量两个概念来定量定义氧化还原状态。根据上述概念，相应地测定方法有直接对氧还对成分的测定法、氧还电位和还原能力测定法。氧还对直接测定法包括两种方法：基于酶偶联和质谱(MS)的替代底物含量及比值的测定法。
1、基于偶联的酶促底物和产物的比率来估计氧化还原比率是常用方法。例如，乳酸脱氢酶(LDH)催化丙酮酸可逆还原为乳酸，同时伴随[NADH]与[NAD+]之间的相互转换。丙酮酸和乳酸均较[NAD+]/[NADH]对更易于生化测定，因此，丙酮酸/乳酸比率可作为NAD+/NADH比率的替代指标。但在这个反应中，丙酮酸与乳酸之间是可以相互转换的，不是稳定的终产物，因此，反应易于受到测定处理条件的干扰。
2、质谱(MS)法来直接测量这些氧化还原对成分，对于互换型与非互换型电子传递对都是适合的。由于氧化还原对的不稳定性，在整个测试及其前处理中，必须格外小心注意防止这氧化还原对的氧化或酶降解作用，因此，误差很大。
3、氧化还原状态及环境的测试也可以根据能斯特方程(the Nernst equation)、用半电池还原电位和氧化还原对的还原容量测定，是一种相对比较方法，例如，线粒体基质的GSSG/GSH的稳态氧化还原电势约为-280mV，细胞质的氧还势(-200mV)，稍高，内质网的氧还势为-190mV相对最高。该方法的主要缺陷是对样本有结构完整的要求，因此，样本处置中要极为小心，不可破坏其结构完整性。
发明内容
解决的技术问题：为了克服现有技术的不足，依据总当量、氧还对比值及定量计算氧还势的原理，设计并筛选出以茶碱乙醛为底物探针的醛歧化反应，获得相关，同时克服测定处理条件、氧化或酶解、及反应中对检测结果的多种干扰与影响，鉴于此，本发明公开了氧化还原状态检测探针及其应用。
技术方案：氧化还原状态检测探针，所述探针包括茶碱乙醛。茶碱乙醛的结构式如下：
Figure GDA0002532586990000021
优选的，所述探针包括茶碱乙醛水合物和/或多索茶碱。茶碱乙醛水合物和多索茶碱的结构式为：
Figure GDA0002532586990000022
采用多索茶碱作为探针基本成分之一的原理在于：多索茶碱是茶碱乙醛的前体化合物，其经P4501A催化形成茶碱乙醛、是茶碱乙醛的释放前体。茶碱乙醛已被证明是可经醛氧化还原酶所催化的，这些酶包括醛氧化酶、醛脱氢酶、醇脱氢酶、醛酮还原酶等。该催化反应的电子传递辅因子氧还对可以是相互转换的，如NADP+/NADPH、NAD+/NADPH，也可以是非相互转换的，在酶的作用下能够通过与NA(D)P+反应生成茶碱乙酸，通过与NA(D)PH反应生成茶碱乙醇。通过检测茶碱乙酸和茶碱乙醇的含量，可以评估NA(D)P+和NA(D)PH的量，利用该方法可以评估氧化还原辅因子的含量，并评价氧化还原平衡状态；可以评估氧化还原酶的活性，判别是哪些代谢酶存在、活性是多少。
本发明所述探针参与的反应如下：以探针为反应底物，利用醛歧化酶催化的、依赖电子传递氧还对作为辅因子的氧还歧化反应，测定产生的所有氧还对总当量与氧还对当量比值，定量计算被测样品的氧化还原状态。所述探针反应的化学方程式为：
Figure GDA0002532586990000031
以上反应的产物为茶碱乙酸与羟乙基茶碱，结构式如下：
Figure GDA0002532586990000032
在总氧还反应中，单位时间内、单位体积或蛋白质样本量中，氧化或者还原产物总量为氧还总能力，氧化型产物与还原型产物的比值为氧还方向，氧还对总当量的计算方式为：
总当量＝茶碱乙酸+羟乙基茶碱摩尔数/时间/蛋白质含量，
氧还对比值＝茶碱乙酸/羟乙基茶碱(摩尔数比值)，
氧还势(定量)＝总当量*(1-氧还对比值)。
优选的，所述探针包括醛氧化酶、醛脱氢酶、醇脱氢酶、醛酮还原酶中的至少一种。该催化反应的电子传递辅因子氧还对可以是相互转换的，如NADP+/NADPH、NAD+/NADPH，也可以是非相互转换的，如GSSG/GSH等。
以上任一所述探针在制备氧化还原状态检测试剂盒或药物中的应用。
优选的，所述药物的剂型为口服、注射或雾化吸入。
优选的，药物口服或注射时的施药浓度，药物/体重为每次100-800mg/60kg。
优选的，所述试剂盒针对的体外检测样本为细胞、亚细胞器、血液、唾液、肺灌洗液、胃肠道灌洗液、胃液、腹水、胸腔积液或组织样本。
优选的，所述试剂盒检测体外样本时，首先将探针与体外样本进行共孵育，然后通过LC-MS、LC-荧光、LC紫外检测、质谱中的至少一种方法测定孵育后产物。
以上任一所述探针在制备疾病诊疗试剂盒或药物中的应用。
优选的，所述疾病为肿瘤疾患、心血管病疾患、呼吸道疾患、消化道疾患、生殖泌尿道疾患、内分泌疾患、神经精神疾患、脏器功能损伤、衰老或食药品致脏器毒性。
本发明所述探针的应用原理在于：本发明设计的探针参与氧还能力评价反应，该反应以茶碱乙醛作为底物、可经醛歧化酶及氧还电子传递对作用，同时生成氧化与还原型稳定终代谢物茶碱乙酸和羟乙基茶碱。由于两个终产物之间、终产物与底物之间均不产生可逆反应变换，因此，利用不同底物浓度、与不同反应时间的组合可最终测定出反应样本中存在多少氧还的总量及氧还对的比值。
有益效果：(1)本发明所述氧化还原状态检测探针克服了测定处理条件、氧化或酶解等对检测结果的影响，能够稳定、高效的发挥测定作用；(2)本发明所述探针应用方式简便，可以快速高效的完成氧化还原状态的检测。
附图说明
图1是茶碱乙醛配成水溶液后质谱分析图；
图2是茶碱乙醛用氘代DMSO配成溶液后进行核磁分析的氢谱图；其中，1HNMR(400MHz,DMSO)δ9.67(s,1H),8.00(s,1H),5.29(s,2H),3.44(s,3H),3.19(s,3H)；
图3是茶碱乙醛用氘代DMSO配成溶液后进行核磁分析的碳谱图；其中，13CNMR(101MHz,DMSO)δ196.76,154.91,151.47,148.48,143.62,106.76,55.57,29.95,27.92；
图4是茶碱乙酸配成水溶液后质谱分析图；
图5是茶碱乙酸用氘代DMSO配成溶液后进行核磁分析的氢谱图；其中，1HNMR(400MHz,DMSO)δ8.04(s,1H),5.07(s,2H),3.44(s,3H),3.20(s,3H)；
图6是茶碱乙酸用氘代DMSO配成溶液后进行核磁分析的碳谱图；其中，13CNMR(101MHz,DMSO)δ169.48,154.89,151.47,148.36,143.63,106.83,47.64,29.92,27.91；
图7是羟乙基茶碱配成水溶液后质谱分析图；
图8是羟乙基茶碱用氘代DMSO配成溶液后进行核磁分析的氢谱图；其中，1HNMR(400MHz,DMSO)δ8.00(s,1H),4.93(t,J＝5.4Hz,1H),4.28(t,J＝5.3Hz,2H),3.71(m,2H)；
图9是羟乙基茶碱用氘代DMSO配成溶液后进行核磁分析的碳谱图；其中，13CNMR(101MHz,DMSO)δ154.91,151.46,148.88,143.59,106.32,60.11,49.37,29.88,28.01。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
将300mg多索茶碱用0.9％生理盐水配成40mL溶液后，分别向4名健康受试者进行静脉推注，5min推注75mg，推注结束后在第2min、4min、6min和8min共4个时间点采集血液，随后将采集的抗凝全血置于肝素化试管中，3000rpm离心10min，分离血浆，置于-20℃保存备用；
向20μL血浆中分别加入80μL内标溶液(2ng/mL苯海拉明乙腈溶液)和60μL水，涡旋混合后在-4℃条件下20000×g离心20min，取3μL上清液进行LC-MS/MS分析。
按照表1进行LC-MS/MS检测，得到血浆样本中不同采血点的血浆中多索茶碱(DOXO)及其代谢终产物茶碱乙酸(TAA)和羟乙基茶碱(ETO)的浓度；
表1LC-MS/MS法的条件参数
Figure GDA0002532586990000051

Claims (8)

1.氧化还原状态检测探针，其特征在于，所述探针包括茶碱乙醛；所述探针需要以下代谢酶介导的歧化反应的催化，包括醛氧化酶、醛脱氢酶、醇脱氢酶、醛酮还原酶中的至少一种；所述探针检测的氧还当量与氧还对比值源于以下氧还对，包括NAD+／NADH、NADP+／NADPH、GSSG/GSH。
2.根据权利要求1所述的氧化还原状态检测探针，其特征在于，所述探针包括茶碱乙醛水合物和/或其前体化合物多索茶碱。
3.权利要求1-2任一所述探针在制备氧化还原状态检测试剂盒或药物研发中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为口服、注射或雾化吸入。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，药物口服或注射时的施药浓度，药物/体重为每次100-800mg/60kg。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒针对的体外检测样本为细胞、亚细胞器、血液、唾液、肺灌洗液、胃肠道灌洗液、胃液、腹水、胸腔积液或组织样本。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述试剂盒检测体外样本时，首先将探针与体外样本进行共孵育，然后通过LC-MS、LC-荧光、LC紫外检测、质谱中的至少一种方法测定孵育后产物。
8.权利要求1-2任一所述探针在制备疾病诊疗试剂盒或药物中的应用，其特征在于，所述疾病为肿瘤疾患、心血管病疾患、呼吸道疾患、消化道疾患、生殖泌尿道疾患、内分泌疾患、神经精神疾患、脏器功能损伤、衰老或食药品致脏器毒性。
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