CN111157667B

CN111157667B - 一种同时检测丙二醛、尿酸和核苷酸及其衍生物的方法

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Publication number: CN111157667B
Application number: CN201911358626.9A
Authority: CN
Inventors: 李同据; 陈彦杰; 马光银; 冀鹏; 李彩霞; 汤青
Original assignee: Ennova Health Technology Co ltd
Current assignee: Ennova Health Technology Co ltd
Priority date: 2019-12-25
Filing date: 2019-12-25
Publication date: 2022-09-20
Anticipated expiration: 2039-12-25
Also published as: CN111157667A

Abstract

本发明提供了一种同时检测丙二醛、尿酸和核苷酸及其衍生物的方法，包括：取适量供试样品，经初步处理后对其进行酸化处理，使其pH值为3‑4；再经过离心过程去除供试样品中的不溶物，得到可以用于高压液相色谱（HPLC)分析的供试样品溶液；分别取适量各种待检测化合物的标准品，配制成不同浓度的标准品溶液，经酸化处理后，获得标准样品溶液；分别将供试样品溶液和标准品溶液进行HPLC测定，并根据各待检测化合物的标准曲线，确定供试样品中各种待检测化合物的含量。本发明通过对供试样品进行酸化处理，利用反相柱进行色谱分离，利用单一或多波长紫外光吸收进行样品检测，同时将样品中的多种待检测化合物分离并测定出各成分的含量。

Description

一种同时检测丙二醛、尿酸和核苷酸及其衍生物的方法

技术领域

本发明涉及检测分析技术领域，具体而言，涉及一种同时检测丙二醛、尿酸和核苷酸及其衍生物的方法。

背景技术

尿酸和丙二醛是体内物质代谢最常见的终产物。尿酸是食物中的含嘌呤分子代谢后的产物之一，反应了身体的肌肉活动状况，在体内的积累常导致痛风和结石等临床疾病。对尿酸的检测和控制是预防疾病的重要部分。丙二醛是体内分子被强氧化性物质氧化后的产物，反应了体内的氧化应激水平，研究表明尿液或血液中的丙二醛含量对心血管疾病具有诊断价值。

常规的尿酸检测分析方法有荧光法(Galba´n et al., 2001)、高效液相色谱法(George et al., 2006; 郁颖佳 et al., 2006)、酶方法(Gabison et al., 2006)和电化学方法(万莉, 2009)。这些检测方法各有利弊，色谱法是最基本的检测方法，分离效果好，流动相简单，操作简便、快速，但需要多步的样品处理过程；光谱法易受样品中存在的其它发色团的干扰；酶方法虽然选择性好，但价格昂贵，限制了它的使用范围。

丙二醛通常采用TBA比色法。检测中，通常使用2-硫代巴比妥酸与丙二醛在高温、强酸性介质中进行反应生成的红色络合物，然后利用液相色谱、气相色谱或光吸收检测等方法对其进行定量分析。但由于衍生化过程需要较高温度或者较长时间，而且选择性差，特异性低，测定效果并不理想。高效液相色谱法(Moselhy et al., 2013)，近红外光谱技术检测法(孔汶汶 et al., 2011)，以及高效液相色谱－质谱联用，气相色谱－质谱联用，高效液相色谱串联质谱检测法，气相色谱串联质谱检测法等，这些方法能够定性、定量、确证，特异性高，灵敏度高，是现在主要的检测手段。但仪器设备昂贵，限制了这些方法在检测中的应用。

ATP是重要的细胞和生物体内可以直接利用的能量物质，是最重要的能源物质，是一种含碱基的化合物。含碱基化合物包括含有腺嘌呤的ATP、ADP、AMP、NADH、NADPH等，以及含有鸟嘌呤的GTP、GDP和GMP等；这些化合物在紫外光区域，尤其是254nm附近，有最大光吸收，很难直接通过紫外光吸收来进行样品中这些分子的定量分析。ATP的检测通常采用酶学方法，在荧光酶和过氧化氢的作用下，通过测定释放的化学发光来进行ATP的定量分析。但该方法测定步骤复杂，准确度差。利用HPLC进行ATP等的定量分析，虽然仪器昂贵，由于其准确性高，使用范围在逐渐扩大。

对血液和尿液中尿酸和丙二醛以及ATP等的检测不仅对临床的疾病诊断具有参考价值，在生物医学研究中也经常必不可少。但常规方法比较耗时，灵敏度和准确度不够高。分别测定各个分子的含量不仅需要更多的样品，更长的时间，而且也不利于各个指标间的比较和相关分析。

发明内容

鉴于此，本发明提出了一种同时检测丙二醛、尿酸和核苷酸及其衍生物的方法，旨在解决现有现有技术存在的以上问题。

本发明提供的同时检测丙二醛、尿酸、ATP等含碱基化合物的方法，包括以下步骤：供试品溶液的制备：取适量供试样品，经初步处理后对其进行酸化处理，使其pH值为3-4；再经过离心过程去除所述供试样品中的不溶物，得到可以用于高压液相色谱（HPLC)分析的供试样品溶液；标准样品溶液的制备：分别取适量各种待检测化合物的标准品，配制成不同浓度的标准品溶液，经与上述步骤相同的酸化处理后，获得可以用于HPLC分析的标准样品溶液；HPLC测定：分别将所述供试样品溶液和所述标准品溶液进行HPLC测定，并制备各种所述待检测化合物的标准曲线，然后根据各待检测化合物的标准曲线，确定供试样品中各种待检测化合物的含量。

进一步地，上述同时检测丙二醛、尿酸、ATP等含碱基化合物的方法中，所述待检测化合物包含丙二醛、尿酸和核苷酸及其衍生物中的至少两种化合物，其中至少一种为丙二醛或尿酸。

进一步地，上述同时检测丙二醛、尿酸、ATP等含碱基化合物的方法中，所述核苷酸及其衍生物为ATP、ADP、AMP、GTP、GDP、GMP 、NADH、NAD⁺、NADPH和NADP⁺中的至少一种。

进一步地，上述同时检测丙二醛、尿酸、ATP等含碱基化合物的方法中，所述供试样品为血浆、血清、尿液、汗液、血细胞或培养细胞。

进一步地，上述同时检测丙二醛、尿酸、ATP等含碱基化合物的方法中，所述供试品溶液的制备步骤中，采用高氯酸对所述供试样品进行酸化。

进一步地，上述同时检测丙二醛、尿酸、ATP等含碱基化合物的方法中，所述HPLC测定步骤中，色谱分析的条件如下：采用C18色谱柱，流动相A为甲醇或乙腈，流动相B为磷酸二氢钾溶液、其pH值为6-7，流速为0 .6mL/min，所述流动相A和所述流动相的B体积比为5-8：95-92。

进一步地，上述同时检测丙二醛、尿酸、ATP等含碱基化合物的方法中，所述HPLC测定步骤中，以紫外光吸收来定量测定供试样品中各种待检测化合物的浓度。

进一步地，上述同时检测丙二醛、尿酸、ATP等含碱基化合物的方法中，所述HPLC测定步骤中，以紫外光吸收来定量测定供试样品中各种待检测化合物的浓度时，检测波长为240nm-330nm。

进一步地，上述同时检测丙二醛、尿酸、ATP等含碱基化合物的方法中，所述HPLC测定步骤中，采用单波长或多个波长进行检测。

进一步地，上述同时检测丙二醛、尿酸、ATP等含碱基化合物的方法中，采用多波长检测时，所用的检测器为二极管阵列检测器。

本发明提供的同时检测丙二醛、尿酸、ATP等含碱基化合物的方法，通过对供试样品进行酸化处理以使得样品中各种待检测化合物处于较为稳定的状态，利用反相柱进行色谱分离，利用单一或多波长进行样品检测，同时将样品中的多种待检测化合物分离并测定出各成分的含量；操作简单，节约了样品用量，提高了检测效率。

附图说明

图1为本发明实施例中同时检测丙二醛、尿酸和核苷酸及其衍生物的方法流程图；

图2为本发明实施例中检测波长为260nm的标准品混合液的色谱图；其中丙二醛、尿酸和ATP的浓度分别为2.98、9.98和8.82 µmol/L；

图3为丙二醛、尿酸和ATP标准品在各自的最大吸收波长下的响应色谱图；其中丙二醛、尿酸和ATP的浓度分别为2.98、9.98和8.82 µmol/L；其中测定丙二醛、尿酸和ATP的波长分别为258.8nm、268.4nm和293.6nm；

图4为采用尿液样品制备供试品测定丙二醛、尿酸和ATP的色谱图；

图5为采用培养细胞悬液制备供试品测定丙二醛、尿酸和ATP的色谱图；

图6为采用血浆样品制备供试品测定丙二醛、尿酸和ATP的色谱图。

具体实施方式

以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和修饰，这些改进和修饰也视为本发明的保护范围。

本发明提供的同时检测丙二醛、尿酸、核苷酸及其衍生物的方法，包括以下步骤：

供试品溶液的制备步骤S1：取适量供试样品，经初步处理后对其进行酸化处理，使其pH值为3-4；再经过离心过程去除所述供试样品中的不溶物，得到可以用于高压液相色谱分析的供试样品溶液。

具体而言，待检测化合物可以包括丙二醛、尿酸和核苷酸及其衍生物中的至少两种化合物，其中至少一种为丙二醛或尿酸。所述核苷酸及其衍生物为ATP、ADP、AMP、GTP、GDP、GMP、NADH、NAD⁺、NADPH和NADP⁺中的至少一种。例如，本实施例中可以同时对丙二醛、尿酸和ATP进行检测；也可以对尿酸、ATP、ADP和AMP同时检测。需要说明的是，选用的供试样品中可以含有待检测化合物，也可能不含待检测化合物，本实施例中，供试样品可以为血浆、血清、尿液、汗液、血细胞或培养细胞等。根据不同的样品采用不同的手段进行初步处理。

该步骤中，经初步处理获得供试样品溶液或匀浆液，加入适量酸液使样品的pH保持在3-4，经离心去除变性的蛋白质等不溶物得到稳定的酸性供试品溶液，该样品在进样前进被一定量碱性溶液中和。

对供试样品进行酸化处理时可以选用质量浓度2-10%的高氯酸溶液，优选为质量浓度6%的高氯酸溶液。酸液的种类、浓度及用量选择需要满足样品的pH维持在3-4即可。

在本实施例的一种具体实施方式中，选用血浆或尿液制备供试品溶液。以血浆、尿液为样品制备供试品溶液的过程为：

例如选用尿液样品时，准确吸取100 μL的尿液样品，置于1.5 mL离心管中，加入40μL水振荡混匀，再加入6%高氯酸溶液360 μL，振荡混匀后，冰浴10min，取出后在4℃，10000g下离心5 min，取上清液300 μL于1.5 mL离心管中，加入40 μL的2 mol﹒L^-1碳酸钾，中和后过滤进样。

选用血浆样品时，准确吸取200 μL的血浆样品，置于1.5 mL离心管中，加入50 μL水振荡混匀后，再加入10%高氯酸溶液250μL，振荡混匀后，冰浴10min，取出后在4℃，10000g下离心5 min，取上清液300 μL于1.5 mL离心管中，加入40 μL的2 mol﹒L^-1碳酸钾，中和后过滤进样。

在本实施例的另一种具体实施方式中，选用培养细胞原液制备供试品溶液，制备过程如下：准确吸取适量细胞原液，离心、重悬。加入水振荡混匀后使细胞膜低渗破裂，再加入适量酸液振荡混匀后，冰浴一段时间，在预设温度、预设速度下离心一段时间，取一定量上清中加入适量碳酸钾溶液，中和后过滤进样。

具体实施时，准确吸取适量培养细胞原液，在4℃，1000g下离心5min，弃去上清液，加入100μL PBS溶液重悬，加入40μL水振荡混匀使细胞膜低渗破裂，再加入6%高氯酸溶液360μL，振荡混匀后，冰浴10min，取出后在4℃，10000g下离心5min，取上清液300μL于1.5 mL离心管中，加入40 μL 2 mol﹒L^-1的碳酸钾，中和后过滤进样。

标准样品溶液的制备步骤S2：分别取适量各种待检测化合物的标准品，配制成不同浓度的标准品溶液，经与上述步骤相同的酸化处理后，获得可以用于HPLC分析的标准样品溶液。

具体而言，以待检测化合物为丙二醛、尿酸和ATP为例配制标准样品溶液，具体过程如下：

尿酸标准品溶液的制备过程可以为：精密称取2.00 mg尿酸标准品，置于10 mL容量瓶中，加水溶解后定容，摇匀即得。

丙二醛对照品溶液的制备过程可以为：取10μL 1,1,3,3-四甲氧基丙烷溶于10mL0.1moL/L盐酸中，在沸水浴中加热5 min冷却后用水稀释至100mL，摇匀即得。

ATP标准品溶液的制备过程可以为：精密称取3.00mg腺苷三磷酸标准品，置于10mL容量瓶中，加水溶解后定容，摇匀即得。

以上3种标准品均购自美国Sigma公司，将上述标准品酸性溶液置于4℃冰箱中冷藏保存，保存期不超过15天。

HPLC测定步骤S3：分别将所述供试样品溶液和所述标准品溶液进行HPLC测定，并制备各种待检测化合物的标准曲线，然后根据各待检测化合物的标准曲线，确定所述供试样品溶液中各种待检测化合物的含量。

具体而言，分别将所述供试样品溶液和所述标准品溶液进行HPLC测定，确定各种待检测化合物的保留时间和标准曲线，然后根据各所述待检测化合物的标准曲线，确定所述供试样品中各种待检测化合物的含量。需要说明的是，本实施例中的待检测化合物包括丙二醛、尿酸和核苷酸及其衍生物中的至少两种化合物，其中至少一种为丙二醛或尿酸。

本实施例进行高效液相色谱测定所用的仪器可以为Thermo Fisher U3000 HPLC。将所述供试品溶液置于-20℃下保存，在进行HPLC测定前，利用0.1-0.5 mol/L的碳酸钾中和所述供试品溶液。

色谱条件为：C18色谱柱，流动相A为甲醇或乙腈，流动相B为磷酸二氢钾溶液、其pH值为6-7，流速为0 .6mL/min，所述流动相A和所述流动相的B体积比为5-8：95-92。

更具体的，本实施例采用Venusil MP C18反相柱（4.6mm× 250mm，5μm），流动相组成为甲醇和磷酸二氢钾（pH = 6.25），进样体积为10μL，柱温为25℃。

本发明实施例中，以紫外光吸收来定量测定供试样品中各种待检测化合物的浓度，采用单波长或多个波长进行检测，检测波长为240-330nm。在采用单波长检测时，检测波长优选为260 nm。采用多波长检测时，采用每个待检测化合物的最大吸收波长，所用的检测器为二极管阵列检测器。

本发明中，步骤S1和S2的顺序不分先后，可以根据实际情况选择。

参阅图2，以同时检测丙二醛、尿酸和ATP为例，在检测波长为260nm时，将本发明实施例中各种待检测化合物的标准品溶液进行混合并进行高效液相色谱测定，可以得到丙二醛、尿酸和ATP不同的出峰时间，它们在此条件下能够被有效分离，分离度均在1.0以上。参阅图3，其示出了丙二醛（最大吸收波长为258.8nm）、尿酸（最大吸收波长为268.4nm）、ATP（最大吸收波长为293.6nm）每个标样的最大响应色谱图。

参阅图4，其示出了采用尿液样品制备供试品溶液时，在260nm检测波长下的色谱结果，可以根据各待检测化合物的标准品对应的标准曲线，使用外标法，将供试品中丙二醛、尿酸和ATP的峰面积代入相应的标准曲线中，计算出各成分的浓度，经过计算，原尿液中丙二醛、尿酸和ATP的浓度分别为0.36µmol/L、30.27µmol/L和20.26 µmol/L。

参阅图5和图6，分别示出了采用培养细胞和血浆样品制备供试品溶液时，在260nm检测波长下的色谱结果，按上述方法计算出丙二醛、尿酸、ATP在供试品溶液中的浓度。其中，原细胞悬液中丙二醛、尿酸和ATP的浓度分别为1.29µmol/L、4.62µmol/L和37.06 µmol/L；原血浆中丙二醛、尿酸和ATP的浓度分别为0.42µmol/L、412.47µmol/L和17.41 µmol/L。

综上，本发明通过对供试样品进行酸化处理以使得样品中各种待检测化合物处于较为稳定的状态，利用反相柱进行色谱分离，利用单一或多波长进行样品检测，同时将样品中的丙二醛、尿酸和核苷酸及其衍生物分离并测定出各成分的含量；操作简单，节约了样品用量，提高了检测效率。由于样品酸化处理后可以在-20°C 下保存，便于样品的集中处理和实验安排。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种同时检测丙二醛、尿酸和核苷酸及其衍生物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

供试品溶液的制备：取适量供试样品，经初步处理后，采用质量浓度2-10%的高氯酸对所述供试样品进行酸化处理，使其pH值为3-4；再经过离心过程去除所述供试样品中的不溶物，得到用于HPLC分析的供试样品溶液；所述供试样品为血浆、血清、尿液、汗液、血细胞或培养细胞；选用尿液样品时，准确吸取100 μL的尿液样品，置于1 .5 mL离心管中，加入40 μL水振荡混匀，再加入6%高氯酸溶液360μL，振荡混匀后，冰浴10min，取出后在4℃，10000 g下离心5 min，取上清液300μL于1.5 mL离心管中，加入40 μL的2 mol﹒L-1碳酸钾，中和后过滤进样；

选用血浆样品时，准确吸取200 μL的血浆样品，置于1 .5 mL离心管中，加入50 μL水振荡混匀后，再加入10%高氯酸溶液250μL，振荡混匀后，冰浴10min，取出后在4℃，10000g下离心5 min，取上清液300 μL于1.5 mL离心管中，加入40 μL的2 mol﹒L-1碳酸钾，中和后过滤进样；

标准样品溶液的制备：分别取适量各种待检测化合物的标准品，配制成不同浓度的标准品溶液，经与上述步骤相同的酸化处理后，获得用于HPLC分析的标准样品溶液；所述待检测化合物中的核苷酸及其衍生物为ATP；

HPLC测定：分别将所述供试样品溶液和所述标准品溶液进行HPLC测定，并制备各种所述待检测化合物的标准曲线，然后根据各待检测化合物的标准曲线，确定供试样品中各种待检测化合物的含量；所述HPLC测定步骤中，色谱分析的条件如下：采用C18色谱柱，流动相A为甲醇或乙腈，流动相B为磷酸二氢钾溶液、其pH值为6-7，流速为0 .6mL/min，所述流动相A和所述流动相B的体积比为5-8：95-92；所述HPLC测定步骤中，以紫外光吸收来定量测定供试样品中各种待检测化合物的浓度时，检测波长为240nm-330nm。

2.根据权利要求1所述的同时检测丙二醛、尿酸和核苷酸及其衍生物的方法，其特征在于，所述待检测化合物包含丙二醛、尿酸和核苷酸及其衍生物中的至少两种化合物，其中至少一种为丙二醛或尿酸。

3.根据权利要求1所述的同时检测丙二醛、尿酸和核苷酸及其衍生物的方法，其特征在于，所述HPLC测定步骤中，以紫外光吸收来定量测定供试样品中各种待检测化合物的浓度。

4.根据权利要求3所述的同时检测丙二醛、尿酸和核苷酸及其衍生物的方法，其特征在于，所述HPLC测定步骤中，采用单波长或多个波长进行检测。

5.根据权利要求4所述的时检测丙二醛、尿酸和核苷酸及其衍生物的方法，其特征在于，采用多波长检测时，所用的检测器为二极管阵列检测器。