CN111575340B - 一种利用巯丙基琼脂糖球负载葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶检测葡萄糖的方法 - Google Patents

一种利用巯丙基琼脂糖球负载葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶检测葡萄糖的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用巯丙基琼脂糖球负载葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶检测葡萄糖的方法。该方法以巯丙基琼脂糖球为载体，通过化学反应在巯丙基琼脂糖球的表面和内部负载葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶，形成检测微单元，然后将负载酶的巯丙基琼脂糖球固定在试纸上形成葡萄糖检测试纸条，对葡萄糖进行检测。本发明制备简单，反应条件温和，可以实现随时随地快速高效检测，并且价格低廉，使用安全，对临床葡萄糖监测和疾病诊断有重要指导意义。

Description

一种利用巯丙基琼脂糖球负载葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶检 测葡萄糖的方法
技术领域
本发明涉及医学体外诊断技术领域，具体涉及一种利用巯丙基琼脂糖球负载葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶检测葡萄糖的方法。
背景技术
葡萄糖是自然界中最为重要且分布最广的一种单糖，化学式为C6H12O6，是多羟基醛的一种，是人体内各组织细胞活动所需的物质。血糖是指血液中葡萄糖，尿糖是指尿液中葡萄糖，人体内的血糖必须保持一定的水平才能维持体内各器官和组织的需要。正常人在空腹血糖浓度为3.9-6.0mmol/L，其受饮食、神经系统、激素等影响，当出现不平衡时，会出现血糖升高或降低，空腹血糖浓度超过6.0mmol/L称为高血糖，血糖浓度低于3.9mmol/L称为低血糖。
糖尿病是一种常见的内分泌疾病，是由于人体内胰岛素分泌绝对或相对不足以及机体靶细胞对胰岛素敏感性降低而引起的血中糖、脂肪、蛋白质等一系列代谢紊乱综合征，其主要特点是高血糖。随着我国人口老龄化趋势以及生活习惯、饮食结构的改变，糖尿病的发病率明显升高，长期的糖代谢紊乱会引起多器官、多系统的损害，如心、肾、眼、神经等。葡萄糖是临床生化检验中的重要指标，可以为糖尿病、高血压以及心脑血管系统等疾病的诊断、治疗用药、病情监测以及疾病预防等方面提供客观依据。因此，坚持定期检测血糖和尿糖对糖尿病的治疗有极其重要的意义。
目前，血清中葡萄糖的检测方法主要有：葡萄糖氧化酶法、己糖激酶法、葡萄糖脱氢酶法、电极法、干化学法、气相色谱一同位素稀释质谱法以及无创血糖测量法等。尿糖的检测方式主要包括班氏法检测、费氏法检测、葡萄糖氧化酶试纸法检测、尿液干化学分析仪检测等。己糖激酶方法多见于自动生化分析仪，但从红细胞中释放出的有机磷酸酯和一些酶会消耗NADP，使结果产生偏差，并且价格偏高，临床应用受到限制。葡萄糖脱氢酶法会受到己糖、木糖等其他糖类的干扰而导致测试者血糖值假性偏高。电极法方法简便迅速，标本用量较少，且特异性、灵敏度、精密度、准确性均较高，但需要专业设备，适合在医院等机构使用，不适合居家使用。干化学法快速简便，主要用于急诊。班氏法能够了解患者尿液中糖分类型，但是对病情较低的糖尿病患者无诊断意义，并且需要较长的反应时间，容易受其他因素的干扰，从而出现漏诊或误诊的现象。尿液干化学分析仪检测法是一种现代化的尿糖检测方式，该检查方式具有快捷、准确率高等特点，但是该检测方式会受到温度、尿液中过氧化氢的含量等多方面内的影响，并且该方法的成本较高，无法在基层医院里推广使用。葡萄糖氧化酶法的基本原理是：β-D-葡萄糖在葡萄糖氧化酶的催化下，被氧化生成过氧化氢，在过氧化氢酶的催化下能使发光底物发出光信号，此方法操作简便，性能较好，用量少，成本低，受糖类还原物质的影响小，广泛用于临床，是卫生部推荐的血糖测定的常规方法，但抗干扰能力稍差，反应条件高，无法回收继续利用，因此考虑采用酶固化的方法，将葡萄糖氧化酶固定在基底上进行检测，可以提高酶的稳定性并且降低使用成本。中国专利CN102199592A【一种制备共固定化葡萄糖氧化酶/过氧化氢酶微球的方法】介绍了一种制备共固定化葡萄糖氧化酶/过氧化氢酶微球的方法，以壳聚糖-精氨酸阴离子微球为载体固定葡萄糖氧化酶/过氧化氢酶对β-D-葡萄糖进行检测，是对β-D-葡萄糖检测体系进行的有益尝试和补充，但其制备流程复杂，会受到共存的其他组份的干扰，从而影响测定结果，此外其吸光度变化小，灵敏度较低，需要进一步改进。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种巯丙基琼脂糖球负载葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶检测葡萄糖的方法。目的在于提供一种能够简单快速实时检测葡萄糖的方法，方便检测者在家中自行检测，省去多次跑医院的繁琐流程，同时固定葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的研究相对较少，过氧化氢酶的加入，不仅能够减轻葡萄糖氧化分解过程中产生的H2O2对酶的损伤，而且可以改变酶氧化的微环境，提高葡萄糖氧化酶酶活力。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
首先，本发明提供一种葡萄糖检测试纸及其制备方法。
本发明所提供的葡萄糖检测试纸通过包括如下步骤的方法制备得到：
1)以巯丙基琼脂糖球为载体，通过化学反应在巯丙基琼脂糖球的表面和内部负载葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶，得到负载有葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球，即检测微单元；
2)将所述负载有葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球(检测微单元)固定在试纸上，得到葡萄糖检测试纸。
上述方法步骤1)中，所述负载有葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球通过包括如下步骤的方法制备得到：
(1)用水浸泡巯丙基琼脂糖球使其吸水膨胀，用三(2-羧乙基)膦(TCEP)或者二硫苏糖醇(DTT)与吸水膨胀后的巯丙基琼脂糖球反应，得到TCEP或DTT处理过的激活的巯丙基琼脂糖球；用三(2-羧乙基)膦(TCEP)或者二硫苏糖醇(DTT)与葡萄糖氧化酶溶液反应，得到TCEP或DTT处理过的葡萄糖氧化酶溶液；用三(2-羧乙基)膦(TCEP)或者二硫苏糖醇(DTT)与过氧化氢酶溶液反应，得到TCEP或DTT处理过的过氧化氢酶溶液；
(2)向TCEP或DTT处理过的激活的巯丙基琼脂糖球中加入TCEP或DTT处理过的葡萄糖氧化酶溶液，反应，得到负载有葡萄糖氧化酶的巯丙基琼脂糖球，向得到的负载有葡萄糖氧化酶的巯丙基琼脂糖球中加入TCEP或DTT处理过的过氧化氢酶溶液，反应，得到负载葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球。
其中，步骤(1)中，所述巯丙基琼脂糖球具体可为
Figure BDA0002559548750000031
6B；
所述巯丙基琼脂糖球为干燥的巯丙基琼脂糖球；尺寸范围可为45-165微米，平均尺寸大小可为90微米；
所述水具体可为双蒸水；
所述巯丙基琼脂糖球与水的配比可为：1ml:3ml-1ml:10ml，具体可为1mL:10mL；
所述浸泡可为浸泡过夜；浸泡后巯丙基琼脂糖球的体积大概是干燥状态下体积的3倍；
所述三(2-羧乙基)膦(TCEP)为三(2-羧乙基)膦(TCEP)溶液；
所述三(2-羧乙基)膦(TCEP)溶液中TCEP的浓度可为0.01-10mM，具体可为0.1mM，所用溶剂可为10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液；
所述二硫苏糖醇(DTT)为二硫苏糖醇(DTT)溶液；
所述二硫苏糖醇(DTT)溶液中DTT的浓度可为1-100mM，所用溶剂可为10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液；
所述葡萄糖氧化酶溶液的浓度可为1-1000μg/ml，具体可为50μg/ml，其中葡萄糖氧化酶的酶活为100—250units/mg；所用溶剂可为10mM PBS(pH7.4)，
所述过氧化氢酶溶液的浓度可为1-1000μg/ml，具体可为50μg/ml，其中过氧化氢酶的酶活为≥250units/mg；所用溶剂可为10mM PBS(pH7.4)；
所述反应的温度均为室温，时间均为5min-2h小时，具体可为1小时。
在进行(2)的操作前，还包括将所述TCEP或DTT处理过的激活的巯丙基琼脂糖球用缓冲液洗涤，去除多余的TCEP或DTT；所述缓冲液具体可为10mM PBS(pH7.4)；
步骤(2)中，TCEP或DTT处理过的激活的巯丙基琼脂糖球的巯丙基琼脂糖球与TCEP或DTT处理过的葡萄糖氧化酶溶液中的葡萄糖氧化酶、TCEP或DTT处理过的过氧化氢酶溶液中的过氧化氢酶的配比依次可为：200μL：1-1000μg：1-1000μg；
所述反应可为室温下旋转反应，所述反应的时间可为：0.2-3小时，具体可为1小时；
步骤(2)中，在激活的巯丙基琼脂糖球与TCEP或DTT处理过的葡萄糖氧化酶反应后，还包括将所得体系用缓冲液洗涤，去除多余的葡萄糖氧化酶，得到负载有葡萄糖氧化酶的巯丙基琼脂糖球的操作；所述缓冲液具体可为10mM PBS(pH7.4)；
进一步包括：将负载有葡萄糖氧化酶的巯丙基琼脂糖球与TCEP或DTT处理过的过氧化氢酶反应后的体系缓冲液洗涤，去除多余的过氧化氢酶，得到负载葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球的操作；所述缓冲液具体可为10mM PBS(pH7.4)；
上述方法步骤2)中，所述试纸可为：玻璃纤维，其空隙在50-200微米之间；
上述方法步骤2)的操作为：将负载葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球滴加到检测试纸的检测区域内，或者将检测试纸的检测区域浸泡在含负载葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球的中，使负载葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球负载到检测试纸里并固定好；
所述负载葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球以其溶液的形式滴加；
所述溶液通过向负载葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球中加入PBS制得，其中巯丙基琼脂糖球与PBS以体积比为1:2。
上述葡萄糖检测试纸在体外葡萄糖检测中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明还提供一种体外检测葡萄糖的方法。
所述体外检测葡萄糖的方法，包括如下步骤：将待测葡萄糖样品加入到检测试纸的检测区域，然后加入无色的显色底物溶液，反应，采集检测区域的颜色数据，将之导入颜色数据与葡萄糖浓度之间的关系式或将之与比色卡进行比对，得到待测葡萄糖的浓度值。
上述检测方法中，所述无色的显色底物溶液中的溶质可为3,3-二氨基联苯胺和氯化镍的混合物，溶剂可为10mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)；
其中3,3-二氨基联苯胺的质量浓度可为0.05％，氯化镍的质量浓度可为0.05％；
所述待测葡萄糖样品可为血浆中葡萄糖(血糖)或者尿液中葡萄糖(尿糖)；
加入无色的显色底物溶液后的反应时间可为10分钟；
所述颜色数据(图片三原色R,G,B)与葡萄糖浓度(C)之间的关系式通过如下方法获得：首先用葡萄糖固体粉末配制系列已知浓度的标准葡萄糖溶液，将所述标准葡萄糖溶液依次加入到检测试纸的检测区域，然后加入无色的显色底物溶液，反应后，采集检测区域的颜色数据，通过图片三原色(R,G,B)构建颜色数据(图片三原色R,G,B)与葡萄糖浓度(C)之间的关系式：G/(R+G+B)＝-6*10-5C+0.3394，R2＝0.9901，即可(如图4所示)；其中，配制已知浓度的标准葡萄糖溶液所用的溶剂可为10mM的PBS(pH7.4)；
所述比色卡通过如下方法制备得到：首先用葡萄糖固体粉末配制系列已知浓度的标准葡萄糖溶液，将所述标准葡萄糖溶液依次加入到检测试纸的检测区域，然后加入无色的显色底物溶液，反应后，采集检测区域的颜色数据，得到不同葡萄糖浓度对应的颜色条带，制作成葡萄糖浓度-颜色标准比色卡，即可，其中，配制已知浓度的标准葡萄糖溶液所用的溶剂可为10mM的PBS(pH7.4)。
所述方法具有以下特征：
1、干燥的巯丙基琼脂糖球吸水膨胀，膨胀后的体积大约是干燥状态下的3倍，巯丙基琼脂糖球本身非常稳定，其表面的双硫键也非常稳定，可以较长时间的存放；
2、葡萄糖氧化酶的活性容易受其反应产生的过氧化氢的抑制，从而影响其催化效率，通过双硫键的化学交联同时固定葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶可以保持固定化酶的稳定性和连续操作能力，快速消除葡萄糖氧化酶的产物抑制，保障该酶促反应的顺利进行，有利于充分发挥多酶体系的协同催化作用，实现高效转化；
3、无色的显色底物DAB能与过氧化氢和过氧化氢酶反应生成蓝褐色沉淀，在球内发生反应生成沉淀的颗粒尺寸大于巯丙基琼脂糖球的空隙，刚好能够被“锁住”，沉积在巯丙基琼脂糖球的空隙中，通过反复水洗证实其沉淀不会洗出到溶液中，因此，在检测样本时不需要对反应微球进行清洗，可有效避免外界环境的干扰。反应产物在巯丙基琼脂糖球中的聚集，能够使得反应后的颜色更加集中，更容易观察和判断，方便在家中通过肉眼做初步判断；
4、显色底物的选择非常重要，其直接决定了显色后的颜色变化，进而影响对葡萄糖浓度的判断，与其他生成有色溶液的显色底物相比，DAB显色后生成了沉淀，而沉淀刚好能沉积在巯丙基琼脂糖球中，这是本发明的一大亮点，此外，我们在DAB溶液中添加了氯化镍NiCl2，构建一种增强型的显色溶液，能够使显色后生成的沉淀颜色加深为蓝褐色，更容易识别观察，如果不添加NiCl2，生成的沉淀是淡黄色，颜色较浅，区分度较差；
5、本发明选择适当孔径的玻璃纤维做反应试纸条，它是一层层叠加的丝状结构，层与层之间有空隙，巯丙基琼脂糖球刚好能被其中的空隙“卡住”，被固定在试纸条里，作为检测区域。可以通过均匀滴加的方法使巯丙基琼脂糖球固定在检测试纸里，也可以直接把试纸放在饱和巯丙基琼脂糖球的混合液(巯丙基琼脂糖球和PBS的体积比为1:2)中，巯丙基琼脂糖球自动流动到检测试纸的空隙中并被固定住，形成检测区域。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明制备简单，反应条件温和，所需材料易获取，价格便宜可操作性强；
本发明与现有检测技术相比，不需要大型的仪器设备，不需要复杂的流程，可以很方便地在家里检测葡萄糖含量(包括血糖和尿糖)，动态检测葡萄糖含量变化，不必反复跑医院挂号检查等待结果。
两次巧妙使用“空隙大小”使得颜色变化更加明显。首先利用巯丙基琼脂糖球内部空隙，使得反应后生成的有颜色的沉淀能够聚集在球里，使颜色加深。其次利用检测试纸条(玻璃纤维)的层与层之间的空隙，使巯丙基琼脂糖球能够固定在试纸里，形成检测区域，便于检测操作和观察。
附图说明
图1为本发明制备的葡萄糖检测试纸的示意图；
图2为荧光显微镜下的巯丙基琼脂糖球(标记CY3荧光染料)和检测试纸(玻璃纤维)；
图3为本发明中的葡萄糖检测比色卡示意图，葡萄糖的浓度依次为500、400、250、125、62.5、31.25、0(体系中葡萄糖的终浓度)，单位μM。
图4为颜色数据(R,G,B)与葡萄糖浓度(C)之间的对应关系，G/(R+G+B)＝-6*10-5C+0.3394，R2＝0.9901。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、生物材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明公开了一种利用巯丙基琼脂糖球负载葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶检测葡萄糖的方法。该方法以巯丙基琼脂糖球为载体，通过化学反应在巯丙基琼脂糖球的表面和内部负载葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶，形成检测微单元，然后将负载酶的巯丙基琼脂糖球固定在试纸上形成葡萄糖检测试纸条，对葡萄糖进行检测。检测过程中，葡萄糖被葡萄糖氧化酶快速催化反应生成过氧化氢和葡萄糖酸，过氧化氢在过氧化氢酶的催化下能使无色的显色底物反应生成有色的沉淀并沉积在巯丙基琼脂糖球里，使巯丙基琼脂糖球的颜色从无色依次变成深蓝褐色，颜色的深浅和葡萄糖的浓度成正相关性，通过颜色数据(图片三原色R,G,B)与葡萄糖浓度(C)之间的关系式或者比色卡实现对葡萄糖浓度的检测。
实施例1
检测试纸(如图1)制备流程：
a)首先将2ml双蒸水加入到0.2ml干燥的巯丙基琼脂糖球Thiopropyl
Figure BDA0002559548750000061
6B(平均尺寸90μm)中浸泡过夜，巯丙基琼脂糖球吸水膨胀，其体积大概是干燥状态下体积的3倍。离心弃去上清液，将三(2-羧乙基)膦(TCEP)溶液分别与上述巯丙基琼脂糖球、葡萄糖氧化酶溶液和过氧化氢酶溶液室温下反应1小时，使其双硫键打开。TCEP溶液的浓度为0.5mM，溶剂为10mM Tris-HCl溶液，葡萄糖氧化酶溶液和过氧化氢酶溶液浓度为50μg/ml，溶剂为10mM PBS(pH7.4)；其中葡萄糖氧化酶的酶活为100—250units/mg、过氧化氢酶的酶活为≥250units/mg。
b)将TCEP处理过的激活的巯丙基琼脂糖球用10mM PBS(PH7.4)缓冲液洗涤5遍，去除上清液。接着加入1.5mlTCEP处理过的激活的葡萄糖氧化酶溶液室温旋转反应1小时，使葡萄糖氧化酶负载到巯丙基琼脂糖球上。用10mM PBS(PH7.4)缓冲液洗涤5遍，去除上清液，然后加入1.5mlTCEP处理过的过氧化氢酶溶液室温旋转反应1小时，最后用10mM PBS(pH7.4)缓冲液洗涤5遍，去除上清液，得到负载葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球，并按照巯丙基琼脂糖球：PBS＝1:2的体积比加入PBS，备份待用；
c)将负载酶的巯丙基琼脂糖球均匀滴加到检测试纸(玻璃纤维)的检测区域内，使巯丙基琼脂糖球能够充分负载到检测试纸里并固定好，形成葡萄糖检测区，如图1和图2所示，巯丙基琼脂糖球进入到玻璃纤维的空隙当中被“卡住”。
检测流程：
首先用葡萄糖固体粉末配制系列浓度的标准葡萄糖溶液，62.5、125、250、500、800、1000单位μM，溶剂是10mM的PBS(PH7.4)，将20μl不同浓度的标准葡萄糖溶液滴加到检测试纸条上，然后分别滴加0.05％DAB(含0.05％NiCl2)的混合溶液20μl(在加入20μl DAB后，使得其终浓度依次为31.25、62.5、125、250、400、500，单位μM)，反应10分钟。使用手机拍照，根据反应后得到检测试纸的颜色，并通过图片三原色(R,G,B)构建图像数据(图片三原色R,G,B)与β-D-葡萄糖浓度(C)之间的关系式，优化得到：G/(R+G+B)＝-6*10-5C+0.3394，R2＝0.9901。当检测待测尿液中葡萄糖含量时，按照前述步骤进行检测，采集反应后检测区域的颜色数据，导入上述公式，计算出葡萄糖浓度，实现对尿液中葡萄糖含量的快速检测。
实施例2
检测试纸(如图1)制备流程：
a)首先将2ml双蒸水加入到0.2ml干燥的巯丙基琼脂糖球Thiopropyl
Figure BDA0002559548750000071
6B中浸泡过夜，巯丙基琼脂糖球吸水膨胀，其体积大概是干燥状态下体积的3倍。离心弃去上清液，将二硫苏糖醇(DTT)溶液分别与上述巯丙基琼脂糖球、葡萄糖氧化酶溶液和过氧化氢酶溶液室温下反应1小时，使其双硫键打开。DTT溶液的浓度为10mM，溶剂为10mM Tris-HCl溶液，葡萄糖氧化酶溶液和过氧化氢酶溶液浓度为30μg/ml，溶剂为10mM PBS(PH7.4)。
b)将DTT处理过的激活的巯丙基琼脂糖球用10mM PBS(PH7.4)缓冲液洗涤5遍，去除上清液。接着加入1.5mlDTT处理过的激活的葡萄糖氧化酶溶液室温旋转反应1小时，使葡萄糖氧化酶负载到巯丙基琼脂糖球上。用10mM PBS(PH7.4)缓冲液洗涤5遍，去除上清液，然后加入1.5mlDTT处理过的过氧化氢酶溶液室温旋转反应1小时，最后用10mM PBS(PH7.4)缓冲液洗涤5遍，去除上清液，得到负载葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球，并按照巯丙基琼脂糖球：PBS＝1:2的体积比加入PBS，备份待用；
c)将葡萄糖检测试纸的检测区域浸泡在上述负载酶的巯丙基琼脂糖球的液体中，巯丙基琼脂糖球进入到玻璃纤维的空隙当中被“卡住”，使巯丙基琼脂糖球能够充分饱和负载到检测试纸里并固定好，形成葡萄糖检测区，如图1和图2所示。
检测流程：
首先用葡萄糖固体粉末配制系列浓度的标准葡萄糖溶液，62.5、125、250、500、800、1000单位μM，溶剂是10mM的PBS(PH7.4)，将20μl不同浓度的标准葡萄糖溶液滴加到检测试纸条上，然后分别滴加0.05％DAB(含0.05％NiCl2)的混合溶液20μl(加入20μl混合溶液使得终浓度依次为31.25、62.5、125、250、400、500，单位μM)，反应10分钟。根据反应后得到检测试纸的颜色，使用手机拍照，重复操作得到不同葡萄糖浓度对应的颜色条带，并制作成浓度-颜色标准比色卡，如图3，当检测实际葡萄糖含量的时候，把标准葡萄糖溶液换成尿液，根据检测试纸的颜色，与比色卡比对即可得到待检测葡萄糖的浓度，实现对尿液中葡萄糖含量的快速检测。
实施例3
负载酶的巯丙基琼脂糖球制备流程：
a)首先将2ml双蒸水加入到0.2ml干燥的巯丙基琼脂糖球Thiopropyl
Figure BDA0002559548750000081
6B中浸泡过夜，巯丙基琼脂糖球吸水膨胀，其体积大概是干燥状态下体积的3倍。离心弃去上清液，将三(2-羧乙基)膦(TCEP)溶液分别与上述巯丙基琼脂糖球、葡萄糖氧化酶溶液和过氧化氢酶溶液室温下反应1小时，使其双硫键打开。TCEP溶液的浓度为0.5mM，溶剂为10mMTris-HCl溶液，葡萄糖氧化酶溶液和过氧化氢酶溶液浓度为50μg/ml，溶剂为10mM PBS(PH7.4)。
b)将TCEP处理过的激活的巯丙基琼脂糖球用10mM PBS(PH7.4)缓冲液洗涤5遍，去除上清液。接着加入1.5mlTCEP处理过的激活的葡萄糖氧化酶溶液室温旋转反应1小时，使葡萄糖氧化酶负载到巯丙基琼脂糖球上。用10mM PBS(PH7.4)缓冲液洗涤5遍，去除上清液，然后加入1.5mlTCEP处理过的过氧化氢酶溶液室温旋转反应1小时，最后用10mM PBS(PH7.4)缓冲液洗涤5遍，去除上清液，得到负载葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球，并按照巯丙基琼脂糖球：PBS＝1:2的体积比加入PBS，备份待用；
检测流程：
首先用葡萄糖固体粉末配制系列浓度的标准葡萄糖溶液，62.5、125、250、500、800、1000单位μM，溶剂是10mM的PBS(PH7.4)，将200μl不同浓度的标准葡萄糖溶液分别加到1.5ml离心管内，每管加30μl负载葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球混合液，然后分别加入0.05％DAB(含0.05％NiCl2)的混合溶液170μl(在加入170μl DAB后，使得其终浓度依次为31.25、62.5、125、250、400、500，单位μM)，摇匀反应10分钟，最后把所有离心管静置，由于平均尺寸较大(90μm)，巯丙基琼脂糖球通过重力快速自然下沉，聚集在管底。根据反应后得到巯丙基琼脂糖球的颜色，使用手机拍照，重复操作得到不同葡萄糖浓度对应的颜色条带，并制作成浓度-颜色标准比色卡，如图3。当检测实际葡萄糖含量的时候，把标准葡萄糖溶液换成血浆，根据反应后巯丙基琼脂糖球的颜色，与比色卡比对即可得到待检测血浆中葡萄糖的浓度，实现对血葡萄糖含量的快速检测。
实施例4
检测试纸(如图1)制备流程：
a)首先将2ml双蒸水加入到0.2ml干燥的巯丙基琼脂糖球
Figure BDA0002559548750000091
6B(平均尺寸90μm)中浸泡过夜，巯丙基琼脂糖球吸水膨胀，其体积大概是干燥状态下体积的3倍。离心弃去上清液，将三(2-羧乙基)膦(TCEP)溶液分别与上述巯丙基琼脂糖球、葡萄糖氧化酶溶液和过氧化氢酶溶液室温下反应1小时，使其双硫键打开。TCEP溶液的浓度为0.1mM，溶剂为10mM Tris-HCl溶液，葡萄糖氧化酶溶液和过氧化氢酶溶液浓度为50μg/ml，溶剂为10mM PBS(PH7.4)；葡萄糖氧化酶的酶活为100—250units/mg，过氧化氢酶的酶活为≥250units/mg。
b)将TCEP处理过的激活的巯丙基琼脂糖球用10mM PBS(PH7.4)缓冲液洗涤5遍，去除上清液。接着加入1.0mlTCEP处理过的激活的葡萄糖氧化酶溶液室温旋转反应1小时，使葡萄糖氧化酶负载到巯丙基琼脂糖球上。用10mM PBS(PH7.4)缓冲液洗涤5遍，去除上清液，然后加入1.0mlTCEP处理过的过氧化氢酶溶液室温旋转反应1小时，最后用10mM PBS(PH7.4)缓冲液洗涤5遍，去除上清液，得到负载葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球，并按照巯丙基琼脂糖球：PBS＝1:2的体积比加入PBS，得到负载葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球的PBS溶液，备份待用；
c)将负载酶的巯丙基琼脂糖球均匀滴加到检测试纸(玻璃纤维)的检测区域内，使巯丙基琼脂糖球能够充分负载到检测试纸里并固定好，形成葡萄糖检测区，如图1和图2所示，巯丙基琼脂糖球进入到玻璃纤维的空隙当中被“卡住”。
检测流程：将本发明葡萄糖检测体系与Solarbio公司标准葡萄糖检测试剂盒(产品编号：BC2500)进行对比，检测葡萄糖含量，流程如下。
本发明体系：
首先用葡萄糖粉末配制系列浓度的葡萄糖溶液，62.5、125、250、500、800、1000，单位μM，溶剂是10mM的PBS(PH7.4)，将20μl不同浓度的标准葡萄糖溶液滴加到检测试纸条上，然后分别滴加0.05％DAB(含0.05％NiCl2，)的混合溶液20μl(在加入20μl DAB后，使得其终浓度依次为31.25、62.5、125、250、400、500，单位μM)，反应10分钟。根据反应后得到检测试纸的颜色，并通过图片三原色(R,G,B)与葡萄糖浓度(C)之间的关系式，G/(R+G+B)＝-6*10- 5C+0.3394，R2＝0.9901。得到相对应的葡萄糖检测浓度，重复3次取平均值，检测范围为0-500μM。
Solarbio公司标准葡萄糖检测试剂盒：
首先将试剂盒中标准葡萄糖溶液(0.5mM)用PBS缓冲液依次稀释至250,125,62.5，单位μM。混合试剂的配制：使用前将试剂二和试剂三1:1等体积混合。在1.5mL离心管中依次加入下列试剂：
Figure BDA0002559548750000101
混匀，置37℃保温反应15分钟，于505nm波长处读取吸光度。然后得到吸光度(A)和葡萄糖浓度(C)之间的标准曲线方程：A＝0.0099C+0.0021，回归系数R2＝0.9998。
用葡萄糖粉末配制系列浓度的葡萄糖溶液，62.5、125、250、500、800、1000，单位μM，溶剂是10mM的PBS(PH7.4)，然后按照Solarbio公司标准葡萄糖检测试剂盒的方法，对上述配制的不同浓度的葡萄糖溶液进行检测，得到相对应的标准浓度。
将本发明体系与Solarbio公司标准葡萄糖检测试剂盒进行对比，准确度最高可达90％以上，检测范围是0-500μM，显示本发明方法具有很高的检测精度。

Claims (9)

1.一种制备葡萄糖检测试纸的方法，包括如下步骤：
1)以巯丙基琼脂糖球为载体，通过化学反应在巯丙基琼脂糖球的表面和内部负载葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶，得到负载有葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球，即检测微单元；
2)将所述负载有葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球固定在试纸上，得到葡萄糖检测试纸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)中，所述负载有葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球通过包括如下步骤的方法制备得到：
(1)用水浸泡巯丙基琼脂糖球使其吸水膨胀，用三(2-羧乙基)膦(TCEP)或者二硫苏糖醇(DTT)与吸水膨胀后的巯丙基琼脂糖球反应，得到TCEP或DTT处理过的激活的巯丙基琼脂糖球；用TCEP或者DTT与葡萄糖氧化酶溶液反应，得到TCEP或DTT处理过的葡萄糖氧化酶溶液；用TCEP或者DTT与过氧化氢酶溶液反应，得到TCEP或DTT处理过的过氧化氢酶溶液；
(2)向TCEP或DTT处理过的激活的巯丙基琼脂糖球中加入TCEP或DTT处理过的葡萄糖氧化酶溶液，反应，得到负载有葡萄糖氧化酶的巯丙基琼脂糖球，向得到的负载有葡萄糖氧化酶的巯丙基琼脂糖球中加入TCEP或DTT处理过的过氧化氢酶溶液，反应，得到负载葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述巯丙基琼脂糖球为
Figure FDA0003683929080000011
6B；尺寸范围为45-165微米，平均尺寸为90微米；
步骤(2)中，TCEP或DTT处理过的激活的巯丙基琼脂糖球的巯丙基琼脂糖球与TCEP或DTT处理过的葡萄糖氧化酶溶液中的葡萄糖氧化酶、TCEP或DTT处理过的过氧化氢酶溶液中的过氧化氢酶的配比依次为：200μL：1-1000μg：1-1000μg；
葡萄糖氧化酶的酶活为100—250units/mg；
过氧化氢酶的酶活为≥250units/mg。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于：步骤2)中，所述试纸为：玻璃纤维，其空隙在50-200微米之间；
上述方法步骤2)的操作为：将负载葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球滴加到检测试纸的检测区域内，或者将检测试纸的检测区域浸泡在含负载葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球的中，使负载葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球负载到检测试纸里并固定，即可。
5.由权利要求1-4中任一项所述方法制备得到的葡萄糖检测试纸。
6.权利要求5所述的葡萄糖检测试纸在制备葡萄糖检测产品中的应用。
7.一种非诊断目的的体外检测葡萄糖的方法，包括：将待测葡萄糖样品加入到权利要求5所述的葡萄糖检测试纸的检测区域，然后加入无色的显色底物溶液，反应，采集检测区域的颜色数据，将之导入颜色数据与葡萄糖浓度之间的关系式或将之与比色卡进行比对，得到待测葡萄糖的浓度值；
所述无色的显色底物溶液中的溶质为3,3-二氨基联苯胺和氯化镍的混合物，溶剂为10mM的Tris-HCl缓冲液；
其中，3,3-二氨基联苯胺的质量浓度为0.05％，氯化镍的质量浓度为0.05％；
所述待测葡萄糖样品为血糖或尿糖。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于：所述颜色数据与葡萄糖浓度之间的关系式通过如下方法获得：首先用葡萄糖固体粉末配制系列已知浓度的标准葡萄糖溶液，将所述标准葡萄糖溶液依次加入到检测试纸的检测区域，然后加入无色的显色底物溶液，反应后，采集检测区域的颜色数据，通过图片三原色构建颜色数据与葡萄糖浓度之间的关系式：G/(R+G+B)＝-6*10-5C+0.3394，R2＝0.9901，即可。
9.根据权利要求7所述方法，其特征在于：所述比色卡通过如下方法制备得到：首先用葡萄糖固体粉末配制系列已知浓度的标准葡萄糖溶液，将所述标准葡萄糖溶液依次加入到检测试纸的检测区域，然后加入无色的显色底物溶液，反应后，采集检测区域的颜色，得到不同葡萄糖浓度对应的颜色条带，制作成葡萄糖浓度-颜色标准比色卡，即可。
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