RU2755073C1 - Способ выявления онкологических заболеваний и устройство для его осуществления - Google Patents

Abstract

Группа изобретений относится к области медицины, а именно к онкологии, и касается способов выявления онкологических заболеваний и устройства для их осуществления. Способы выявления онкологических заболеваний основаны на определении в пробе биологического материала содержания нитрит-ионов или раздельном определении содержания нитрат- и нитрит-ионов посредством проведения реакции диазотирования и азосочетания. Группа изобретений позволяет проводить оценку процессов развития онкологических заболеваний на ранних этапах. 3 н. и 13 з. п. ф-лы, 8 ил., 1 табл., 62 пр.

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Изобретение относится к области медицины, а именно к онкологии, и касается способов выявления онкологических заболеваний.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Известен способ выявления онкологических заболеваний с использованием морфологического исследования с забором биологического материала по месту предполагаемой локализации новообразования. Недостатком способа является сложность исполнения, травматичность, повышенная стоимость и необходимость предварительного установления локализации новообразования с помощью других методов, ввиду чего его трудно применять в качестве способа ранней и скрининговой диагностики. Известны способы выявления онкологических заболеваний на основе инструментальных методов диагностики, преимущественно лучевых методов, которые включают в себя рентгенологическое исследование, ультразвуковое исследование, магнитно-резонансную томографию (МРТ), и др. Рентгенологическое исследование имеет такие недостатки, как высокая стоимость и применение ионизирующего излучения высокой интенсивности. Магнитно-резонансная томография (МРТ) является безопасным способом, при котором отсутствует ионизирующее излучение, и превосходит другие методики диагностической визуализации, но связана с большими затратами, что является препятствием для широкого применения. Общим недостатком всех вышеописанных способов являются повышенные требования к квалификации исследователей, высокая стоимость расходных материалов, а также невозможность использования вышеописанных инструментальных методов повсеместно, в том числе для самодиагностики. Известны способы с использованием тестов, предназначенных для неинвазивного выявления онкомаркеров в биологических жидкостях человека. Примером таких наборов может служить тест на опухолевую М2-пируваткиназу (TU М2-РK) в кале, предназначенный для ранней диагностики колоректального рака, а также тест на опухолевую М2-пируваткиназу (TU М2-РK) в ЭДТА-плазме крови, предназначенный для диагностики рака почки, легкого, желудка, пищевода, поджелудочной и молочной желез. Однако эти способы имеют ограниченную применимость из-за узкой специфичности ранней диагностики, привязанной к конкретным онкомаркерам и клиническим проявлениям.

Близким к предлагаемому способу диагностики по совокупности химических аналитических реакций является способ, описанный в статье (Чеботарева А.А., Комаревцева И.А., Юсуф Р.М.С. и др. Метаболиты оксида азота в тканях, сыворотке крови, мононуклеарных и мезенхимальных стволовых клетках. Курский научно-практический вестник «Человек и его здоровье». Медико-биологические науки. 2016. № 2. С. 90-95. DOI: 10.21626/vestnik/2016-2/17), где для определения нитритов используют диазотирование на основе реакции Грисса, но нитраты при этом не регистрируются, затем нитраты должны быть восстановлены до нитритов «сухим восстановителем» (термин авторов статьи) с последующим диазотированием. Суммарное значение нитратов и нитритов по описанной методике определялось в биологических жидкостях организма человека фотометрическим методом с исследованием поглощения аналитического раствора при 540 нм (максимум поглощения азокрасителя, полученного в ходе аналитической реакции).

Наиболее близкими к предлагаемому нами способу по своей сущности являются неинвазивные способы, связанные с оценкой наличия в воздухе ротовой полости веществ, указывающих на наличие в организме новообразований. Известен способ неинвазивной диагностики рака желудка по патенту № RU 2472445 С1, в котором в качестве исследуемого газового компонента используют молочную кислоту, а в качестве тестовой нагрузки используют 20 мл 40%-ного раствора глюкозы, при этом осуществляют определение содержания молочной кислоты до приема и после приема тестовой нагрузки. В качестве прототипа нами выбран способ диагностики рака по воздуху ротовой полости, предложенный в патенте № RU 2639254 С2, в котором предложен способ анализа выдыхаемого воздуха для определения специфичных для рака молочной или щитовидной железы летучих органических соединений (ЛОС), выбранных из группы, состоящей из перфтордекановой кислоты, перфтор-н-пентановой кислоты, перфторнонановой кислоты, перфтороктановсй кислоты, перфтор-1-гептена, перфторциклогексана, 1Н,1Н-перфтор-1-гептанола, октафторциклобутана, перфтор(метилциклогексана) и их смесей путем детекции ионизированных фрагментов указанных ЛОС в образце выдыхаемого воздуха. Способ реализуется с применением прибора, выбранного из группы, состоящей из электронного носа, соединенного с масс-спектрометром, и прибора для газовой хроматографии - масс-спектрометрии (ГХ-МС).

Общим недостатком этих способов является использование сложной аппаратуры, предполагающей повышенные требования к квалификации исследователя и использование специализированного помещения.

В известном уровне техники не был найден непосредственный аналог устройства для применения в соответствии с заявляемым в настоящем изобретении способом, однако найдены конструктивно схожие аналоги.

Известно устройство (фиг. 1) по патенту № US 4434235 А, предназначенное для определения нитрит-ионов в жидкостях и представляющее собой систему из двух трубок, одна из которых расположена внутри другой, причем внутренняя и внешняя трубки разделены воздушным пространством, внутренняя трубка заполнена активированным углем, ограниченным фильтрующими элементами и предназначена для приведения в контакт с исследуемой жидкостью, а внешняя трубка заполнена реагентом для определения нитрит-ионов.

Известно устройство (фиг. 2) для определения нитрит-ионов в жидкостях по патенту № ES 2185462 В1, которое представляет собой полиэстеровую подложку с нанесенным на нее гелевым раствором 0,7 мг N-(1-нафтил)этилендиамина, 7 мг сульфаниламида и 0,6 мл раствора Nafion® - перфторированный ионообменный полимер приготовленный как сополимер тетрафторэтилена и префтор-(2-фторсульфонилэтокси)пропивинилэфира в смеси с низкомолекулярными алифатическими спиртами и 10% воды.

Известно устройство (фиг. 3) по патенту № US 4631255 А для определения нитрит-ионов, представляющее собой абсорбционный носитель (например, обработанная фильтровальная бумага) на подложке, содержащий диазотируемый амин, кислотный компонент и сочетаемый компонент (например, N-(1-нафтил)-3-аминопропаносульфокислота).

С учетом вышеозначенных факторов, имеется настоятельная потребность в разработке недорогого, атравматичного и общедоступного способа выявления онкологических заболеваний, обеспечивающего эффективную раннюю диагностику, а также устройства для его осуществления.

РАСКРЫТИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Задачей настоящего изобретения является создание неинвазивного способа выявления онкологических заболеваний на ранних стадиях.

Поставленная задача решается группой изобретений, объединенных единым изобретательским замыслом.

В части способа поставленная задача решается тем, что предложена группа способов выявления онкологических заболеваний, в которых оценивают содержание нитрит-ионов и/или нитрат-ионов, находящихся в пробе биологического материала или полученных из нее, при этом результат выявления считают положительным при суммарном содержании нитрат- и нитрит-ионов свыше 10 мг/л, при содержании отдельно нитрит-ионов свыше 10 мг/л, при раздельном содержании нитрат- и нитрит-ионов свыше 18 мг/л и 10 мг/л соответственно.

Оценку содержания нитрит-ионов предпочтительно проводить посредством реакции диазотирования ароматических аминов упомянутыми нитрит-ионами с одновременным проведением реакции азосочетания солей диазония, полученных в ходе упомянутого диазотирования, с фенолами бензольного или нафталинового ряда и/или аминами, выбранными из группы ароматических аминов и их производных, с одновременным переходом упомянутых нитрат-ионов в нитрит-ионы посредством химического или биохимического (ферментативного) восстановления.

Для оценки суммарного содержания нитрат- и нитрит-ионов вышеупомянутые реакции предпочтительно проводить с одновременным переходом упомянутых нитрат-ионов в нитрит-ионы посредством химического или биохимического (ферментативного) восстановления. С той же целью нитрат-ионы могут восстанавливаться до нитрит-ионов посредством восстанавливающего реагента.

Для оценки раздельного содержания нитрат- и нитрит-ионов предпочтительно проводить реакции диазотирования и азосочетания с упомянутыми нитритами, после чего образовавшийся в результате реакций азокраситель удалять из зоны реакции, а полученный раствор подвергать воздействию восстановителя, который восстанавливает нитраты до нитритов, после чего проводить реакции диазотирования и азосочетания с вновь образовавшимися из нитратов нитритами.

Оценку содержания нитрат-ионов предпочтительно проводить посредством взаимодействия с селективным к нитрат-ионам реагентом, выбранным из ароматических фенолов или аминов.

В упомянутых способах реакции могут быть проведены в присутствии биполярных апротонных растворителей, причем реакция диазотирования может проводиться в водной среде. При этом упомянутые реакции могут проводиться с реактивом Грисса или его аналогами.

В качестве одного из ароматических аминов могут использоваться аминосульфокислоты, причем реакцию азосочетания проводят между диазотированной ароматической аминосульфокислотой и веществом, выбранным из группы аминов и фенолов.

Также с целью улучшения реакционной способности упомянутые реакции могут проводить в присутствии вещества органического и неорганического происхождения, вызывающего повреждение клеточной стенки.

С целью раздельного определения содержания нитратов и нитритов предпочтительно проводить топохимическую реакцию, в которой зона реакции диазотирования нитрит-ионами и зона восстановления нитрат-ионов до нитрит-ионов с последующим их участием в реакции диазотирования разнесены в пространстве. Топохимическая реакция может проводиться посредством реакционной хроматографии, где реакция восстановления нитрат-ионов до нитрит-ионов проводится на сорбенте после сепарации продуктов реакции взаимодействия нитрит-ионов с фенолами и аминами, причем последующие реакции восстановления нитрат-ионов до нитрит-ионов, диазотирования, азосочетания и сорбции красителя происходят в зоне контакта пробы с восстанавливающим агентом, расположенным по ходу продвижения жидкой фазы по сорбционному слою хроматографической системы.

В упомянутых способах реакции диазотирования и азосочетания могут проводиться с участием одного или нескольких сорбентов, различающихся по своим свойствам (сорбция красителя, сорбция жидкой фазы анализируемой пробы, сорбция реагентов, участвующих в реакции) по отношению к реагентам, участвующим в упомянутых реакциях, при этом результат проведения реакций контролируют цветометрически по цветному эталону.

В части устройства поставленная задача решается тем, что предложено устройство для выявления онкологических заболеваний по оценке раздельного или суммарного содержания нитрат-ионов и/или нитрит-ионов в пробе биологического материала, которое содержит индикаторную рецептуру, состоящую из чувствительного элемента и реагентов, с возможностью оценки результата по изменению окраски чувствительного элемента, причем чувствительный элемент гидрофилен и обладает сорбирующей способностью по отношению к красителям.

Чувствительный элемент предлагаемого устройства предпочтительно содержит в своем составе сорбенты, выбранные из группы волокнистых (на основе текстильных и технических волокон), зернистых и гелевых сорбентов. Реагенты могут находиться на чувствительном элементе в виде дисперсии или могут быть формованы одним или несколькими тонкими слоями, которые уложены вплотную к чувствительному элементу по одну или разные стороны от него. В качестве реагентов предпочтительно использовать органические реагенты, выбранные из группы фенолов бензольного или нафталинового ряда, ароматических аминов и их производных, при этом в качестве реагентов дополнительно могут использоваться дисперсия металлического цинка, полимерное связующее и стабилизаторы рН. Дисперсия металлического цинка (если используется) и органические реагенты могут быть разделены слоем сорбента.

Проведенный нами поиск по научно-техническим и патентным источникам информации и выбранные из перечня аналогов прототипы в части как способа, так и устройства, позволили выявить отличительные признаки в заявляемом техническом решении. Следовательно, заявляемое техническое решение удовлетворяет критерию изобретения «новизна».

Проведенный заявителем дополнительный поиск известных технических решений с целью обнаружения в них признаков, сходных с признаками формулы заявляемого изобретения, показал, что эти признаки отсутствуют. Следовательно, заявляемое техническое решение удовлетворяет критерию «изобретательский уровень».

Критерий изобретения «промышленная применимость» подтверждается тем, что предлагаемое изобретение позволяет проводить оценку процессов развития онкологических заболеваний на ранних этапах.

Практическая реализуемость заявляемого изобретения подтверждается примерами реализации способа и поясняется чертежами и таблицами.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг. 1-3 показаны известные в уровне техники устройства для определения нитрит-ионов.

На фиг. 4 показана табл. 1, описывающая сопоставление результатов исследования онкологических патологий известными методами с результатами цветометрической оценки присутствия нитрат- и нитрит-ионов в пробе слюны с использованием тест-полосок «Чистая вода». На фиг. 5, 6а, 6б, 6в, 6 г, 6д, 7 показаны примеры устройств для осуществления предлагаемого способа.

На фиг. 8 показан пример результата работы одного из вариантов устройства для осуществления предлагаемого способа.

ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Ниже представлены примеры различных вариантов реализации настоящего изобретения. Приведенные ниже примеры использованы для упрощения понимания принципов изобретения, и никоим образом не ограничивают объем правовой охраны настоящего изобретения, при этом специалист в данной области техники относительно просто способен осуществить и другие пути осуществления изобретения.

Пример 1. В отделение гинекологии поступила пациентка К. 62 лет с жалобами на кровотечение в менопаузу, в анамнезе полип эндометрия и киста правого яичника. С ее письменного согласия до лечения и оперативного вмешательства была взята натощак до курения и приема лекарственных препаратов после полоскания рта водой проба слюны в стерильную тару в объеме 1-2 мл с последующим помещением пробы в холодильник и хранением в течение 2 дней при температуре +(5±2)°С. По истечении 2 дней пробу извлекали из холодильника, термостатировали до комнатной температуры и проводили определение в ней концентрации нитрит-ионов

и нитрат-ионов

и с использованием тест-полосок «Чистая вода» (производство ООО «Биосенсор АН», Россия), представляющих собой группу чувствительных элементов, закрепленных на носителе, выполненном из полимерного материала, причем первый (нитрит-селективный) чувствительный элемент содержит селективный по отношению к нитрит-ионам реагент, а другой (нитрат-селективный) - селективный по отношению к нитрат-ионам реагент. Начальные цветовые характеристики чувствительных элементов характеризовались близкими к белому.

Определение концентрации нитрит-ионов и нитрат-ионов проводили согласно инструкции посредством смачивания чувствительных элементов отобранной пробой слюны с последующей визуальной оценкой по цветному эталону концентраций нитрат- и нитрит-ионов через 1 минуту после нанесения пробы, а также компьютерной цветометрической оценкой количества красителя, образовавшегося на чувствительных элементах в ходе реакций диазотирования и азосочетания, проходивших при контакте пробы с чувствительными элементами.

В сравнении с цветным эталоном полученные результаты соответствовали концентрациям нитрат-ионов 100 мг/л, нитрит-ионов 10 мг/л, при этом нитрат-селективный чувствительный элемент приобрел розовую окраску (результат цветометрии в координатах RGB: (250, 185, 178), а нитрит-селективный чувствительный элемент приобрел розовую окраску (результат цветометрии в координатах RGB: (232, 140, 149).

В результате дальнейшего инструментального и лабораторного обследования (УЗИ яичников, КТ и МРТ, тест на онкомаркеры, в частности на СА-125, лапроскопия со взятием образца ткани) верифицирован рак правого яичника. Пример 2 аналогичен примеру 1 с той лишь разницей, что тест-систему с пробой на ней после проведения анализа по инструкции дополнительно помещали в сухое темное помещение на 24 часа для окончательного протекания реакции и естественного испарения влаги. По истечении 24 часов при визуальном контроле окраска чувствительных элементов осталась неизменной. С целью объективизации оценки изменения цвета чувствительных элементов проводили компьютерную цветометрическую оценку с помощью ПК и планшетного сканера с белой крышкой. Результат цветометрии в координатах RGB составил (255,147,129) для NO₃ и (251,168,197) для NO₂, что указывало на образование красителя в количествах, соответствующих концентрациям нитрат-ионов 100 мг/л и нитрит-ионов 10 мг/л соответственно.

Пример 3 аналогичен примеру 1 с той лишь разницей, что пациент был с его согласия обследован с целью выявления онкологических заболеваний в инициативном порядке, в анамнезе отсутствовали сведения о наличии патологических новообразований (включая изменения кожного покрова). Нитрат- и нитрит-ионы по результатам теста в слюне не были выявлены в значимых концентрациях (по цветному эталону соответствует 0 мг/л) Дальнейшее наблюдение за пациентом в течение трех лет онкологических патологий не выявило.

Пример 4 аналогичен примеру 1 с той лишь разницей, что пациент был с его согласия обследован с целью выявления онкологических заболеваний в инициативном порядке, в анамнезе отсутствовали сведения о наличии патологических новообразований (включая изменения кожного покрова). При этом пациент употреблял табачные изделия (сигареты) на постоянной основе в течение 2 лет. Нитрат- и нитрит-ионы по результатам теста в слюне были выявлены в незначительном количестве (нитрат-ионы в концентрации 25 мг/л и нитрит-ионы в концентрации 5 мг/л в соответствии с цветным эталоном) Дальнейшее наблюдение за пациентом в течение трех лет онкологических патологий не выявило.

Пример 5 аналогичен примеру 4 с той лишь разницей, что нитрат- и нитрит-ионы по результатам теста в слюне не были выявлены в значимых концентрациях (нитрат-ионы в концентрации 0 мг/л и нитрит-ионы в концентрации 0 мг/л в соответствии с цветным эталоном). Дальнейшее наблюдение за пациентом в течение трех лет онкологических патологий не выявило.

Аналогичным образом было проведено 29 сравнительных исследований (см. табл. 1) у больных с различными онкологическими заболеваниями разной степени тяжести и локализации, наличие которых было установлено онкологами с помощью известных методов, а также обследовано 35 добровольцев из контрольной группы, у которых отсутствие онкологических заболеваний не вызывало сомнения, исходя из их состояния здоровья, подтвержденного регулярными медицинскими обследованиями. Также с целью изучения азотистого обмена исследовали образцы слюны у 234 добровольцев, преимущественно лиц мужского пола в возрасте от 18 до 24 лет без вредных привычек (курение, алкоголизм). В результате исследования было установлено, что в слюне обследуемых нитрат- и нитрит-ионов не содержится в значимых концентрациях. У 3% обследуемых нитраты и нитриты были выявлены в незначительном количестве, что по мнению обследуемых связано с употреблением сигарет до обследования.

Пример 6. В эндокринологическое отделение поступил пациент П. 60 лет с жалобами на похудение на 15 кг за несколько месяцев, слабость, упадок сил, осиплость голоса, боли в правом подреберье, субфебрильная лихорадка. С его письменного согласия была взята натощак проба мочи (первая порция утренней мочи) для исследования с помощью устройства, представляющего собой плоский чувствительный элемент и сопряженные с ним реагенты в виде дисперсии. Плоский чувствительный элемент выполнен из неокрашенного вискозного волокна. В качестве реагентов взят аналог сухого реактива Грисса, в котором 1-нафтиламин заменен на 2-окси-4-диметиламино-нафталин, который используется в качестве азосоставляющей при проведении аналитической реакции. Чувствительный элемент, обладающий сорбционными свойствами к конечному продукту аналитической реакции (азокрасителю), совместно с реагентами составляют индикаторную рецептуру. Индикаторная рецептура закреплена на держателе из полипропилена посредством полиакрилатного клея.

На чувствительный элемент наносили образец мочи посредством погружения устройства в емкость с отобранной мочой на 3-7 секунд с последующим извлечением из емкости. По времени появления красной окраски на чувствительном элементе судили о концентрации в моче нитрит-ионов. Окраска возникала в результате реакции диазотирования сульфаниловой кислоты, содержащейся в аналоге сухого реактива Грисса, вышеупомянутыми нитрит-ионами с одновременным проведением реакции азосочетания соли диазония, полученной в ходе вышеупомянутого диазотирования, с 2-окси-4-диметиламино-нафталином в качестве азосоставляющей. При появлении красной окраски на чувствительном элементе за время менее 15 минут результат определения нитрит-ионов считали положительным. Минимально определяемая с помощью такого устройства концентрация нитрит-ионов составляла 10 мг/л, что определялось с помощью шкалы, построенной последовательным разведением калибровочного раствора с заданной концентрацией нитрит-ионов, причем упомянутый калибровочный раствор дополнительно содержал заданное количество хлорида натрия и карбамида.

Нитрит-ионы по результатам исследования были выявлены в концентрации 50 мг/л в соответствии с построенной шкалой.

В результате дальнейшего инструментального и лабораторного обследования (гистологическое исследование образца ткани, полученного биопсией) верифицировано новообразование щитовидной железы Т₄ N₁ M_1. с метастазами в печень и головной мозг.

Пример 7 аналогичен примеру 6 с той лишь разницей, что в качестве азосоставляющей вместо 1-нафтиламина использовали фенол. Чувствительный элемент при положительном результате определения приобретал желто-оранжевую окраску.

Пример 8 аналогичен примеру 6 с той лишь разницей, что в качестве азосоставляющей вместо 1-нафтиламина использовали 1-нафтол.

Пример 9 аналогичен примеру 6 с той лишь разницей, что в качестве азосоставляющей вместо 1-нафтиламина использовали 2-нафтол.

Пример 10 аналогичен примеру 6 с той лишь разницей, что в качестве азосоставляющей вместо 1-нафтиламина использовали дифениламин. Чувствительный элемент при положительном результате определения приобретал красно-оранжевую окраску.

Пример 11 аналогичен примеру 6 с той лишь разницей, что в качестве азосоставляющей вместо 1-нафтиламина использовали 2-нафтиламин. Чувствительный элемент при положительном результате определения приобретал более интенсивную окраску.

Пример 12 аналогичен примеру 6 с той лишь разницей, что в качестве азосоставляющей вместо 1-нафтиламина использовали резорцин. Чувствительный элемент при положительном результате определения приобретал оранжевую окраску.

Пример 13 аналогичен примеру 6 с той лишь разницей, что в качестве азосоставляющей вместо 1-нафтиламина использовали диметиловый желтый. Чувствительный элемент при положительном результате определения приобретал более интенсивную окраску.

Пример 14 аналогичен примеру 6 с той лишь разницей, что в качестве азосоставляющей вместо 1-нафтиламина использовали о-крезолфталеин.

Пример 15 аналогичен примеру 6 с той лишь разницей, что в качестве азосоставляющей вместо 1-нафтиламина использовали нафтилэтилендиамин дигидрохлорид (НЭДА), а чувствительный элемент был дополнительно импрегнирован диметилсульфооксидом (ДМСО).

Пример 16 аналогичен примеру 15 с той лишь разницей, что вместо ДМСО использовали N-метилперолидон.

Пример 17 аналогичен примеру 6 с той лишь разницей, что в качестве азосоставляющей вместо 1-нафтиламина использовали хромотроповую кислоту (4,5-дигидрокси-2,7-нафталиндисульфокислоту).

Пример 18 аналогичен примеру 6 с той лишь разницей, что в качестве азосоставляющей вместо 1-нафтиламина использовали 1-аминопирен.

Пример 19 аналогичен примеру 6 с той лишь разницей, что с целью оценки суммы нитрат- и нитрит-ионов в состав реагентов добавляли металлическую дисперсию цинка (цинковая пыль).

Пример 20 аналогичен примеру 19 с той лишь разницей, что в качестве азосоставляющей вместо 1-нафтиламина использовали 1-амино-6-сульфокислоту нафталина, а в состав реагентов добавляли цитратный буфер.

Пример 21 аналогичен примеру 20 с той лишь разницей, что вместо цитратного буфера использовали цитратно-фосфатный буфер.

Пример 22 аналогичен примеру 20 с той лишь разницей, что вместо цитратного буфера использовали тартратный буфер.

Пример 23 аналогичен примеру 20 с той лишь разницей, что в качестве азосоставляющей вместо 1-нафтиламина использовали Н-кислоту (4-амино-5-гидроксинафталин-2,7-дисульфокислота), а вместо цитратного буфера использовали фосфатный буфер.

Пример 24 аналогичен примеру 6 с той лишь разницей, что в состав реагентов добавляли фермент мурамидазу с целью ускорения повреждения клеточной стенки пробы.

Пример 25 аналогичен примеру 6 с той лишь разницей, что чувствительный элемент был дополнительно закрыт слоем полипропилена таким образом, чтобы оставить открытой для непосредственного контакта с исследуемым биологическим образцом часть торцевой поверхности чувствительного элемента.

Пример 26 аналогичен примеру 19 с той лишь разницей, что вместо дисперсии металлического цинка использовали дисперсию металлического железа.

Пример 27 аналогичен примеру 19 с той лишь разницей, что вместо дисперсии металлического цинка использовали порошок гидрида лития.

Пример 28 аналогичен примеру 19 с той лишь разницей, что вместо дисперсии металлического цинка использовали порошок нитратредуктазы.

Пример 29. В отделение урологии поступил пациент Ч. 65 лет с жалобами на жжение при мочеиспускании, ощущение незавершенного опорожнения после мочеиспускания, снижение напора и прерывистость струи во время мочеиспускания. С его письменного согласия были взяты пробы мочи, секрета предстательной железы и слюны для исследования с помощью устройства (фиг. 5), представляющего собой подложку, состоящую из соединенных вместе слоев полиэтилентерефталата (ПЭТ) и этиленвинилацетата (ЭВА) и имеющую глухое отверстие со стороны слоя ПЭТ на часть глубины подложки до слоя ЭВА. На слой ЭВА со стороны отверстия в виде мелкой дисперсии нанесены реагенты, а именно мелкокристаллическая дисперсия реактива Грисса, поверх которого наклеен чувствительный элемент, выполненный из волокнистого сорбента (хлопчатобумажной ткани) и предназначенный для приведения в контакт с исследуемой пробой, впитывания жидкой фазы пробы, фильтрации твердой фазы упомянутой пробы, а также для сорбции красителя, образующегося в ходе взаимодействия нитрит-ионов, содержащихся в жидкой фазе упомянутой пробы, с реактивом Грисса в результате реакции диазотирования сульфаниловой кислоты вышеупомянутыми нитрит-ионами с одновременным проведением реакции азосочетания солей диазония, полученных в ходе вышеупомянутого диазотирования, с 1-нафтиламином в качестве азосоставляющей. Чувствительный элемент совместно с реагентами составляют индикаторную рецептуру.

Образец мочи наносили на чувствительный элемент посредством погружения устройства в тару с отобранной мочой на 3-7 секунд с последующим извлечением из тары. Образцы слюны и секрета предстательной железы наносили на чувствительный элемент посредством смачивания. Минимально определяемая с помощью такого устройства концентрация нитрит-ионов составляла 10 мг/л, что определялось с помощью шкалы, построенной последовательным разведением калибровочного раствора с заданной концентрацией нитрит-ионов, причем упомянутый калибровочный раствор дополнительно содержал заданное количество хлорида натрия и карбамида. Во всех случаях по времени появления красной окраски на чувствительном элементе судили о концентрации нитрит-ионов в образцах. При появлении красной окраски на чувствительном элементе за время менее 15 минут результат определения нитрит-ионов считали положительным. Положительный результат определения был выявлен для образца слюны (30 мг/л в соответствии с построенной шкалой). В результате дальнейшего инструментального и лабораторного обследования (анализ крови на онкомаркер ПСА; трансректальное УЗИ; мультифокальная игольчатая биопсия под ультразвуковым контролем с последующим гистологичесаким исследованием отобранного материала) верифицировано новообразование предстательной железы Т₂ N₀ М₀.

Пример 30 аналогичен примеру 29 с той лишь разницей, что в качестве азосоставляющей вместо 1-нафтиламина использовали 2-окси-4-диметиламино-нафталин, и с целью оценки суммарного содержания нитрат-ионов и нитрит-ионов в состав реагентов была добавлена дисперсия металлического цинка, а также добавлен фосфатный буфер с целью ускорения проведения реакций, и с целью улучшения реакционной способности металлического цинка слой ЭВА был импрегнирован водорастворимым клеем на основе полиакрилата. По истечении 15 минут чувствительный элемент устройства приобрел более интенсивную окраску в сравнении с чувствительным элементом устройства, описанного в примере 29, что указывает на наличие нитратов в биологическом образце.

Пример 31 аналогичен примеру 29 с той лишь разницей, что с целью улучшения реакционной способности металлического цинка слой ЭВА был импрегнирован водорастворимым клеем на основе карбоксометилцеллюлозы.

Пример 32 аналогичен примеру 29 с той лишь разницей, что с целью улучшения реакционной способности металлического цинка слой ЭВА был импрегнирован водорастворимым клеем на основе козеина.

Пример 33 аналогичен примеру 29 с той лишь разницей, что в качестве азосоставляющей вместо 1-нафтиламина использовали 1-окси-4-сульфокислоту нафталина.

Пример 34 аналогичен примеру 29 с той лишь разницей, что вместо волокнистого сорбента использовали гелевый сорбент на основе поливинилового спирта с добавлением мелкодисперсного оксида титана и мелкорубленых хлопчато-бумажных волокон.

Пример 35 аналогичен примеру 29 с той лишь разницей, что вместо волокнистого сорбента использовали гелевый сорбент на основе агар-агара.

Пример 36 аналогичен примеру 29 с той лишь разницей, что в состав реагентов добавляли гексаметапол, а сами реагенты были нанесены на чувствительный элемент.

Пример 37. В отделение гепатологии поступил пациент К. 34 года с жалобами на ноющую боль в правом верхнем квадранте живота и общее недомогание в течение 2 месяцев. С его письменного согласия до лечения и оперативного вмешательства была взята натощак до курения и приема лекарственных препаратов после полоскания рта водой проба слюны для исследования с помощью устройства (фиг. 6а), состоящего из полипропиленового корпуса цилиндрической формы, внутрь которого помещен слой волокнистого сорбента (хлопчато-бумажной нити), предварительно обработанного реагентами, а именно реактивом Грисса, и служащего в качестве чувствительного элемента, обладающего сорбционными свойствами к конечному продукту аналитической реакции (азокрасителю). Чувствительный элемент совместно с реагентами составляют индикаторную рецептуру. Чувствительный элемент расположен внутри корпуса таким образом, что его нижняя граница расположена на одном уровне с одним из торцевых отверстий корпуса устройства, а верхняя расположена внутри корпуса, оставляя незаполненным часть внутреннего пространства корпуса до второго торцевого отверстия. Пробу слюны наносили на чувствительный элемент посредством погружения конца корпуса с чувствительным элементом в отобранную слюну, после чего жидкая фаза засчет капиллярного эффекта поднималась вверх по чувствительному элементу. По мере смачивания происходила химическая реакция взаимодействия жидкой фазы пробы с реактивом Грисса с образованием азокрасителя, создававшего окрашенное пятно на чувствительном элементе. Окрашенное пятно поднималось по чувствительному элементу по мере прохождения фронта жидкой фазы. Величина и интенсивность окрашенного пятна характеризовала концентрацию нитрит-ионов. Минимально определяемая с помощью такого устройства концентрация нитрит-ионов составляла 10 мг/л, что определялось с помощью шкалы, построенной последовательным разведением калибровочного раствора с заданной концентрацией нитрит-ионов, причем упомянутый калибровочный раствор дополнительно содержал заданное количество хлорида натрия и карбамида. При появлении красной окраски на чувствительном элементе за время менее 15 минут результат определения нитрит-ионов считали положительным.

Нитрит-ионы по результатам исследования были выявлены в концентрации 10 мг/л в соответствии с построенной шкалой.

В результате дальнейшего инструментального и лабораторного обследования (УЗИ, КТ и МРТ, биопсия печени под контролем УЗИ с дальнейшим гистологическим исследованием ткани) у пациента верифицирована гепатоцеллюлярная карцинома Т₂ N₀ М₀.

Пример 38 аналогичен примеру 37 с тем лишь отличием, что слой сорбента незначительно выступал за границу корпуса с возможностью непосредственного отбора жидкой фазы пробы (фиг. 6б).

Пример 39 аналогичен примеру 37 с тем лишь отличием, что индикаторная рецептура была зафиксирована фильтрующим ограничителем (фиг. 6в), выполненным из полиэстера и обработанным ДМСО.

Пример 40 аналогичен примеру 39 с тем лишь отличием, что фильтрующий ограничитель был обработан мурамидазой.

Пример 41 аналогичен примеру 37 с тем лишь отличием, что чувствительный элемент был обработан дисперсией металлического цинка с целью совместного определения нитрат- и нитрит-ионов. Окраска чувствительного элемента обладала большей интенсивностью, что указывало на наличие нитрат-ионов в пробе.

Пример 42 аналогичен примеру 37 с тем лишь отличием, что индикаторная рецептура занимала всю длину корпуса.

Пример 43 аналогичен примеру 41 с тем лишь отличием, что индикаторная рецептура занимала всю длину корпуса.

Пример 44 аналогичен примеру 39 с тем лишь отличием, что внутрь корпуса в качестве чувствительного элемента были помещены два слоя зернистых сорбентов (силикагель), первый из которых обработан реактивом Грисса, а второй - реактивом Грисса и дисперсией металлического цинка, при этом в дополнение к фильтрующему ограничителю с целью закрепления сорбентов внутри корпуса добавлен инертный ограничитель из триацетата. Длина слоев определялась калибровкой по калибровочным растворам. Жидкую фазу отбираемой пробы пропускали через устройство последовательно от первого слоя ко второму с помощью шприца. В каждом из слоев возникала окраска, связанная с образованием конечных продуктов аналитической реакции, в частности, азокрасителя: в первом слое - под действием нитрит-ионов пробы, во втором слое - под воздействием нитрат-ионов пробы. Такое устройство (фиг. 6г) позволяет выявлять раздельное содержание нитрат-ионов и нитрит-ионов.

Пример 45 аналогичен примеру 44 с тем лишь отличием, что слои сорбентов разделяли слоем сорбента на основе хлопчато-бумажного волокна (фиг. 6д), выполняющего роль чувствительного элемента, а ограничитель для закрепления сорбентов внутри корпуса был выполнен из хлопчатобумажного волокна и также выполнял роль чувствительного элемента.

Пример 46 аналогичен примеру 44 с тем лишь отличием, что слой сорбента, примыкющий к фильтрующему ограничителю, был выполнен из мраморного песка зернистостью 0,2-0,3 мм.

Пример 47 аналогичен примеру 44 с тем лишь отличием, что с целью улучшения адсорбции красителя и чувствительности устройства внутри корпуса были размещены четыре слоя зернистых сорбентов, первый из которых состоит из кварцевого песка и обработан реактивом Грисса, второй - состоит из карбоксометилцеллюлозы и не обработан реагентами, третий - состоит из кварцевого песка и обработаны реактивом Грисса совместно с дисперсией металлического цинка, четвертый - состоит из карбоксометилцеллюлозы и не обработан реагентами (на фиг. не показано), причем слои, не обработанные реактивом Грисса, выполняли роль чувствительных элементов, сорбирующих азокраситель, а инертный ограничитель, ограничивающий индикаторную рецептуру, был выполнен из фторопласта (тефлона).

Пример 48 аналогичен примеру 47 с тем лишь отличием, что слои, обработанные реактивом Грисса, состояли из волокнистых сорбентов (хлопчато-бумажная нить).

Пример 49 аналогичен примеру 47 с тем лишь отличием, что слои, обработанные реактивом Грисса, состояли из вискозных волокон (вискозная пряжа).

Пример 50 аналогичен примеру 47 с тем лишь отличием, что слои, обработанные реактивом Грисса, состояли из целлюлозных волокон.

Пример 51 аналогичен примеру 47 с тем лишь отличием, что слои, обработанные реактивом Грисса, состояли из комбинированных волокон (хлопок 50%, акрил 50%).

Пример 52 аналогичен примеру 47 с тем лишь отличием, что слои, обработанные реактивом Грисса, состояли из комбинированных волокон (шерсть 50%, лавсан 50%).

Пример 53 аналогичен примеру 47 с тем лишь отличием, что слои, обработанные реактивом Грисса, состояли из комбинированных волокон (лен 50%, триацетат 50%).

Пример 54 аналогичен примеру 45 с тем лишь отличием, что слои сорбентов разделяли инертным ограничителем из полистирола.

Пример 55 аналогичен примеру 45 с тем лишь отличием, что слои сорбентов разделяли инертным ограничителем из поликарбоната.

Пример 56 аналогичен примеру 45 с тем лишь отличием, что слои сорбентов разделяли инертным ограничителем из стекла.

Пример 57. В отделение гастроэнтерологии поступил пациент А. 44 лет с жалобами на кишечные колики и неприятные ощущения в животе без четкой локализации. С его письменного согласия до лечения и оперативного вмешательства была взята проба кала для дальнейшего исследования с помощью устройства (фиг.7), представляющего собой пластину 12 см х 12 см на полимерной основе (полиэтилентерефталат) с нанесенным на нее слоем фракционированного сорбента с использованием силиказоля в качестве связующего, причем сорбционная поверхность пластины предварительно обработана раствором реактива Грисса в этиловом спирте, при этом часть поверхности дополнительно обработана дисперсией металлического цинка. Исследование отобранной пробы кала проводили по методу тонкослойной хроматографии при температуре 25°С. Вначале на участке пластины без дисперсии металлического цинка отмечали линию старта, расположенную на расстоянии 1 см от края пластины параллельно части поверхности пластины с дисперсией металлического цинка. На линию старта точечно на расстоянии 1 см друг от друга наносили образцы последовательно разведенных стандартных растворов нитрат- и нитрит-ионов для построения градуировочной зависимости по наличию и интенсивности цветового пятна. Таким образом было определено, что минимально определяемые с помощью такого устройства концентрации нитрат- и нитрит-ионов составляли 10 мг/л и 10 мг/л соответственно. Пластину затем высушивали посредством инфракрасного излучателя мощностью 500 Вт в течение 15 минут на расстоянии 30 см. Отобранную пробу кала разводили в воде в пропорции 1 часть кала на 5 частей воды. Полученный раствор помещали в хроматографическую кювету, заполненную слоем высотой 8 мм смеси этилового спирта и воды в пропорции 1 часть этилового спирта на 1 часть воды, после чего пластину поместили в кювету под углом 30°. По истечении 20 минут на пластине образовалось пятно п форме параболы с ветвями, направленными в сторону линии старта, что свидетельствовало о наличии в пробе нитрат- и нитрит-ионов (положительный результат исследования). Характерный размер центра пятна составил 2 см, продвижение линии фронта составило 8 см. Интенсивность окраски центра пятна согласно построенной градуировочной зависимости соответствовала концентрации нитратов 18 мг/л и концентрации нитритов 16 мг/л. Пример результата работы такого устройства показан на фиг. 8.

В результате дальнейшего инструментального и лабораторного обследования у пациента верифицирована опухоль сигмовидной кишки T₁ N₀ М₀.

Пример 58 аналогичен примеру 57 с тем лишь отличием, что растворенную пробу наносили точечно посредством пипетки.

Пример 59 аналогичен примеру 57 с тем лишь отличием, что с целью улучшения локализации пятна пластина была выполнена на основе алюминиевой фольги, покрытой слоем силикагеля и использующей крахмал в качестве связующего.

Пример 60 аналогичен примеру 57 с тем лишь отличием, что с целью улучшения локализации пятна пластина была выполнена из матового стекла с нанесенным на него слоем оксида алюминия (диаметр зерен 0,25-0,4 мкм) в виде порошка.

Пример 61 аналогичен примеру 60 с тем лишь отличием, что вместо оксида алюминия использовалась кристаллическая целлюлоза.

Пример 62 аналогичен примеру 60 с тем лишь отличием, что пластина была выполнена из листа хроматографической бумаги.

Таким образом, использование предлагаемого изобретения позволяет обеспечить объективную диагностику рака различной локализации и степени тяжести, повысить качество диагностических исследований, обеспечить возможность раннего обнаружения патологии и улучшить качество контроля результатов лечения при наличии онкологических заболеваний на ранней стадии их обнаружения.

Заявляемый способ может быть применен в отделениях общей диагностики, специализированных кабинетах диагностики и для скрининговых исследований. Для выполнения заявляемого способа затраты времени минимальны, результат может быть получен незамедлительно.

Claims (23)

1. Способ выявления онкологических заболеваний, заключающийся в том, что оценивают содержание нитрит-ионов, находящихся в пробе биологического материала или полученных из нее, причем оценку проводят посредством реакции диазотирования ароматических аминов упомянутыми нитрит-ионами с одновременным проведением реакции азосочетания солей диазония, полученных в ходе упомянутого диазотирования, с аминами, выбранными из группы ароматических аминов и их производных, и/или фенолами бензольного или нафталинового ряда, и при содержании нитрит-ионов от 10 мг/л до 50 мг/л результат выявления считают положительным.

2. Способ выявления онкологических заболеваний, заключающийся в том, что оценивают раздельное содержание нитрат- и нитрит-ионов, находящихся в пробе биологического материала или полученных из нее, причем оценку проводят посредством проведения реакции диазотирования и азосочетания с упомянутыми нитритами, после чего образовавшийся азокраситель удаляют из зоны реакции, а полученный раствор подвергают воздействию восстановителя, который восстанавливает нитраты до нитритов, после чего проводят реакции диазотирования и азосочетания с вновь образовавшимися из нитратов нитритами, и при содержании нитрат- и нитрит-ионов от 18 мг/л до 100 мг/л и от 10 мг/л до 16 мг/л соответственно результат выявления считают положительным.

3. Способ по любому из пп. 1, 2, в котором реакцию диазотирования проводят в водной среде.

4. Способ по любому из пп. 1, 2, в котором упомянутые реакции проводят в присутствии биполярных апротонных растворителей.

5. Способ по любому из пп. 1, 2, в котором в качестве одного из ароматических аминов используют аминосульфокислоты, причем реакцию азосочетания проводят между диазотированной ароматической аминосульфокислотой и веществом, выбранным из группы аминов и фенолов.

6. Способ по любому из пп. 1, 2, в котором упомянутые реакции проводят с реактивом Грисса или его аналогами.

7. Способ по любому из пп. 1, 2, в котором с целью улучшения реакционной способности упомянутые реакции проводят в присутствии вещества органического и неорганического происхождения, вызывающего повреждение клеточной стенки.

8. Способ по п. 2, в котором с целью раздельного определения содержания нитрат-ионов и нитрит-ионов проводят топохимическую реакцию, в которой зона реакции диазотирования нитрит-ионами и зона восстановления нитрат-ионов до нитрит-ионов с последующим их участием в реакции диазотирования разнесены в пространстве.

9. Способ по п. 8, в котором топохимическая реакция проводится посредством реакционной хроматографии, где реакция восстановления нитрат-ионов до нитрит-ионов проводится на адсорбенте после сепарации продуктов реакции взаимодействия нитрит-ионов с фенолами и аминами, причем последующие реакции восстановления нитрат-ионов до нитрит-ионов, диазотирования, азосочетания и адсорбции красителя происходят в зоне контакта пробы с восстанавливающим агентом, расположенным далее по ходу продвижения жидкой фазы по сорбционному слою хроматографической системы.

10. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором упомянутые реакции проводят с участием одного или нескольких сорбентов, различающихся по своим свойствам по отношению к реагентам, участвующим в упомянутых реакциях, при этом результат проведения реакций контролируют цветометрически по цветному эталону.

11. Устройство для выявления онкологических заболеваний, которое содержит индикаторную рецептуру, состоящую из чувствительного элемента и реагентов, с возможностью оценки результата по изменению окраски чувствительного элемента, причем:

- индикаторная рецептура является селективной по отношению к нитрит-ионам, содержащимся в пробе биологического материала или полученным из нее;

- чувствительный элемент гидрофилен и обладает сорбирующей способностью по отношению к красителям;

- реагенты находятся на чувствительном элементе, содержащем биполярный апротонный растворитель в микроколичествах, в виде дисперсии или формованы несколькими тонкими слоями, уложенными вплотную к чувствительному элементу по разные его стороны;

- в составе индикаторной рецептуры в качестве одного из реагентов используют органические реагенты, выбранные из группы фенолов бензольного или нафталинового ряда, ароматических аминов;

- в составе чувствительного элемента используют сорбенты, выбранные из группы зернистых и гелевых сорбентов.

12. Устройство по п. 11, в котором в составе индикаторной рецептуры в качестве одного из реагентов используют восстанавливающий реагент, причем восстанавливающий реагент и органические реагенты дополнительно разделяются одним или несколькими сорбентами.

13. Устройство по п. 12, в котором восстанавливающий реагент и органические реагенты дополнительно разделяют одним или несколькими инертными материалами.

14. Устройство по п. 11, в котором восстанавливающий реагент выбран из группы, состоящей из реагентов, выделяющих водород при взаимодействии с водой.

15. Устройство по п. 14, в котором упомянутые реагенты, выделяющие водород при взаимодействии с водой, выбраны из группы, состоящей из металлов и их гидридов.

16. Устройство по п. 14, в котором в качестве восстанавливающего реагента используют нитратредуктазу.

17. Устройство по любому из пп. 11-16, в котором в составе индикаторной рецептуры в качестве одного из реагентов используют полимерное связующее.

18. Устройство по любому из пп. 11-16, в котором в составе индикаторной рецептуры в качестве одного из реагентов используют стабилизаторы рН в виде буферных смесей.

Images