JPS62257400A - クレアチニン又はクレアチンの測定要素及び測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、臨床化学に関し、更に詳しくは、水性液体、
例えば生物学的液体中のクレアチニン又はクレアチンを
測定するための分析要素及び方法に関する。

〔従来の技術〕

蛋白質代謝の中間生成物及び最終生成物の測定は、臨床
化学及び特に腎臓機能の診断において重要である。この
代謝生成物は、クレアチニン及びクレアチンを含む。

クレアチニンは、筋肉の内在代謝の生成物である。尿中
のクレアチニンの量は、総筋肉質量及び筋肉活性度を反
映する。ヒトの尿中のクレアチニンの量は、一般に一定
であり、日によってほとんど変化しない。

尿クレアチンは、筋ジストロフィーの初期、筋肉破壊が
急速に起こっている時、及び組織異化作用の増加する消
耗性疾患において増加する。これは、苛酷で、激しい筋
肉活動の間及び甲状腺機能亢進症において増加する。尿
クレアチニンは、筋ジストロフィーの後期及び腎臓機能
が損なわれている場合に減少する。尿クレアチンは、尿
クレアチニンが増加するのと同じ症状で増加する。

クレアチニンの測定方法は、しばしば説明されてきた。

初期の試験は、アルカリピクレート溶液を用いて橙赤色
色素を生成させる非酵素ジャソフ（Ｊａｆｆｅ）反応に
基づくものであった。しかし、この方法は、クレアチニ
ンに類似した多数の物質がアルカリピクレートと反応す
るので、クレアチニンに対して特異的でない。

クレアチニン及びクレアチンに対してそれぞれ特異的な
酵素及び下記の反応を使用する、クレアチニンの酵素分
析法が開発された： （１）タレアチニン＋水璽＝廿クレアチン（２）クレア
チン＋水−−→尿素士ザルコシン第一の反応は、クレア
チニンアミドヒドロラーゼによって触媒され、第二の反
応はクレアチンアミジノヒドロラーゼによって触媒され
る。

クレアチニンに関する分析法は、米国特許第４．２１５
．１９７号明細書に記載されており、その方法では、前
記の酵素をザルコシンオキシダーゼ及びテトラゾリウム
指示薬と組み合わせて使用している。分析は溶液として
又は試薬が吸収されている乾式デバイスを用いて実施す
ることができる。

〔発明が解決しようとする問題点〕

米国特許第４，２１５，１９７号明細書に記載されてい
る分析法では、分析組成物に全試薬が含まれている場合
にしか、クレアチンを測定できない。この米国特許明細
書の例１　　（５欄６４行〜６欄２４行）に記載されて
いるように、この分析には、長いインキュベーション時
間（すなわち、６０分まで）並びに使用した試薬及び内
在クレアチンから生じるバンクグラウンドを除去するた
めのブランキング（ｂｌａｎｋｉｎｇ）工程を必要とす
る。感度は、組成物中にホルムアルデヒドデヒドロゲナ
ーゼ、ジアホラーゼ及びＮＡＤを配合することによって
増加すると言われている。この付加的試薬及び酵素反応
の使用は、分析を著しく複雑にする。クレアチン又はザ
ルコシンは、その分析法を用いて適切な酵素を省く場合
に測定することができる。しかし、これには、各被分析
物を測定するために別の組成物又はデバイスが必要であ
る。

クレアチニン又はクレアチン測定に等しく有用であり、
高感度であり、そして迅速であり、かつプランキング工
程を必要としない、比較的簡単な自動乾式分析を得るこ
とが望まれている。

〔問題点を解決するための手段〕

公知の分析で遭遇した前記問題点は、ザルコシンオキシ
ダーゼ、過酸化水素及び過酸化性物質（ｐｅｒｏｘｉｄ
ａｔｉｖｅ　５ｕｂｓｔａｎｃｅ）の存在下に検出可能
な色素を生成しうるイミダゾールロイコ色素又は染料、
前記ロイコ色素又は染料に対して実質的に不活性な状態
で存在するクレアチンアミジノヒドロラーゼ並びに律速
量（ａ　ｒａｔｅ　ｌｉｍｉｔｉｎｇ　ａｏ＋ｏｕｎｔ
）で存在するクレアチニンアミドヒドロラーゼを含む、
クレアチニン又はクレアチンの測定用の分析要素を用い
て克服される。

クレアチニン又はクレアチンの測定方法は、Ａ、過酸化
性物質の存在下に、クレアチニン又はクレアチンを含む
と思われる液体試料をザルコシンオキシダーゼ、過酸化
水素及び過酸化性物質の存在で検出可能な色素を生成し
うるイミダゾールロイコ色素、前記ロイコ色素に対して
実質的に不活性な状態で存在するクレアチンアミジノヒ
ドロラーゼ並びに律速量で存在するクレアチニンアミド
ヒドロラーゼを含む分析要素と接触させて検出可能な色
素を生成させ、そして、 Ｂ、クレアチニン又はクレアチンの存在の結果として生
成した検出可能な色素を測定する工程を含む。

以下（１白 〔実施態様〕 本発明は、水性液体中のクレアチニン又はクレアチンの
測定（定性又は定量的測定）に関する。

特に、本発明は、動物及びヒトの生物学的液体を分析す
るために使用することができる。このような液体は、全
血、血漿、血清、リンパ液、胆汁、尿、を髄液、痰、汗
等及び糞便排泄物を含むが、これらに限定されない。骨
格筋、心臓、腎臓、肺、脳、骨髄、皮膚等のようなヒト
又は動物の組織の液体調整物を分析することもできる。

本発明を用いてヒト血清又は尿を分析するのが好ましい
。

本発明方法は乾式分析要素を使用して実施される。最も
簡単な要素は、分析に必要な試薬を含む吸収性担持物質
、例えば自立性吸収性又は吸水性物質の薄いシート、例
えば口紙又はストリップから成る。要素を担持物質の個
々の帯域に異なる試薬を組み込んだ２個以」二の別々の
帯域に分割することができる。このような要素は、従来
、試験ストリップ、診断要素、浸漬スチノク、診断剤等
として知られている。

有用な吸収性担持物質は、水又は生物学的液体、例えば
尿又は血清にさらされても不溶性であり、その構造的一
体性を保有するものである。有用な要素は、紙、多孔性
粒状構造体、多孔性ポリマーフィルム、セルロース、ガ
ラス繊維、織布及び不織布（合成及び非合成）等から製
造することができる。このような要素を製造するために
有用な物質及び操作は、文献に良く知られている。

本発明の乾式分析要素は、多孔性拡散帯域を有するのが
好ましい。この帯域は、自立性（すなわち、その一体性
を保持するのに充分に硬い物質から成る）であってよい
が、別の非多孔性支持体上に担持されているのが好まし
い。このような支持体は、任意の適当な寸法安定性で、
好ましくは、２００〜９００ｎｍの波長の電磁線を透過
する非多孔性で透明な（輻射線透過性）物質である。特
定の要素に対して選択される支持体は、所定の検出方法
（透過又は反射分光分析）と矛盾しないものであるべき
である。有用な支持体は、紙、金属箔、ポリスチレン、
ポリエステル〔例えば、ポリ（エチレンテレフタレート
）〕、ポリカーボネート又はセルロースエステルから作
ることができる。

多孔性拡散帯域は、米国特許第４，２９２，２７２号、
同第３，９９２．１５８号、同第４，２５８，００１号
及び同第４．４３０，４３６号明細書並びに日本特許公
報５７（１９８２）−１０１７６０号に記載されている
ような任意の適当な繊維状若しくは非繊維状物質又はそ
の一方若しくは両方の混合物から製造することができる
。拡散帯域は等方性に多孔性である（すなわち、孔度が
粒子、繊維、ポリマーストランド等の間の連続空間又は
孔によって生じるように、帯域のどの方向でも同一であ
ることを意味する）のが望ましい。

要素は、２個以上の別々の帯域を同じ層内に又は重ねら
れて有することができ、その帯域の少なくとも１個は多
孔性拡散帯域であるのが好ましい。

他方の帯域は、試薬帯域又は記録帯域（これらの帯域は
文献に公知である）、付加的拡散帯域、輻射線遮断若し
くはフィルター帯域、下塗帯域又はバリヤ帯域であって
よい。帯域は、一般に、相互に液体接触〔すなわち、一
般に液体、試薬及び反応生成物（例えば着色色素）が隣
接帯域の重なった傾城の間を通過又は移動しうろことを
意味する〕している。帯域は、別々に塗布され、重ねら
れた層であるのが好ましい。

本発明の分析は、下記の順序の反応（１）〜（４）で達
成される： （１）タレアチニン＋水［＝ヨクレアチン（２）クレア
チン＋水−□→尿素＋ザルコシン（３）ザルコシン＋酸
素＋水−→グリシン士ホルムアルデヒド＋過酸化水素 （４）過酸化水素＋ロイ３色素−検出可能な色素これら
の反応は、クレアチニンアミドヒドロラーゼ、タレアチ
ンアミジノヒＦロラーゼ、ザルコシンオキシダーゼ及び
過酸化性物質によってそれぞれ触媒される。

ごこに記載する酵素ば、本発明の実施に純粋な形で、発
酵溶液として又は酵素の不純な抽出物として単独で又は
−緒に使用することができる。

クレアチニンアミドヒドロラーゼ及びタレアチンアミジ
ノヒＦロラーゼは、多数の供給源から市場で得られる。

種々の微生物資源から単離された各酵素の若干の種類が
文献に知られている。３７℃で６．５の最適ｐｌ＋を有
するクレアチニンアミドヒドロラーゼ及び３７℃で７．
７のＪｉｆｔ適ｐＨ全ｐＨるクレアチンアミジノヒドロ
ラーゼ（両者とも、フラボバクテリウムの菌株から得ら
れ、米国特許第４．０３９，３８４号明細書に記載され
ている）が好ましい。

ザルコシンオキシダーゼも、多数の供給源から市場で得
られる。この酵素は、例えば米国特許第４．２１６．２
９２号明細書　並びに日本特許公報５６（１９８１）　
−０９２，７９０号及び日本特許公報筒５７（１９Ｂ２
）　−０３６，９８５号に記載されている。本発明の実
施には、任意の供給源からのザルコシンオキシダーゼが
有用である。

本発明に有用な過酸化性物質は、ペルオキシダーゼを包
含する。ペルオキシダーゼは、過酸化水素が別の物質を
酸化する反応を触媒する酵素である。ペルオキシダーゼ
は、一般に鉄ポルフィリンを含む共役蛋白質である。ペ
ルオキシダーゼは、西洋わさび、バレイショ、いちじく
の樹液及びかぶら、牛乳及び白血球中に存在する。ペル
オキシダーゼは、微生物中にも存在し、発酵によって製
造することができる。また、ある種の合成ペルオキシダ
ーゼが知られている。ペルオキシダーゼは好ましい過酸
化性物質であるが、酵素ではない他の物質も有用である
。これらの多数は市販されている。

本発明に有用なロイコ色素は、一般に、ロイコ形では無
色であるが、過酸化水素及び過酸化性物質の存在で酸化
されて検出可能な着色色素を生成しうるイミダゾールロ
イコ色素である。有用なロイコ色素は、ジー及びトリア
リールイミダゾール、例えば米国特許第４，０８９，７
４７号明細書、欧州特許公報箱１２２，６４１号及び日
本特許公＠５Ｂ（１９８３）　−０４５、５５７号に記
載されているものを包含する。特に有用なイミダゾール
ロイコ色素は米国特許第４．０８９，７４７号明細書に
記載されているトリアリールイミダゾールであり、２−
　（３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−
４，５−ビス（４−ジメチルアミノフェニル）イミダゾ
ール、２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）
−４，５−ビ（ｐ−ジメチルアミノフェニル）−１Ｈ−
イミダゾール、２−（３−エトキシ−４−ヒドロキシフ
ェニル−４，５−ビス（ｐ−ジメチルアミノフェニル）
−１Ｈ−イミダゾール、２−（４−ヒドロキシ−３，５
−ジメトキシフェニル）−４−（４−（ジメチルアミノ
）−フェニル）−５−（２−フリル）−イミダゾール、
２−（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシフェニル）
−４，５−ジ（２−フリル）−イミダゾール、２−（３
，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−４−（
４−（ジメチルアミノ）フェニル〕−５−フェネチルイ
ミダゾール及び２−　（３，５−ジメトキシ−４−ヒド
ロキシフェニル）　−４−（４−（ジメチルアミノ）フ
ェニル〕−５−ベンジルイミダゾールを包含する。

本発明の要素は、種々の製造上又は操作上の利点のため
要素中に共通して含まれる１種以上の他の添加剤を含ん
でいてもよい。このような添加剤は、界面活性剤、イオ
ンキレート化剤、緩衝剤、溶剤、硬化剤、酸化防止剤及
びカプラー溶剤（ｃｏｕｐｌｅｒ　５ｏｌｖｅｎｔｓ）
を包含する。

クレアチニンアミドヒドロラーゼが要素中に律速量で存
在することが重要である。これは、クレアチンアミジノ
ヒドロラーゼの量に対するこの酵素の量が、前記の反応
（１）の前進方向が律速（ｒａｔｅ　ｃｏｎｔｒｏｌｌ
ｉｎｇ）であるような程度であることを意味する。クレ
アチニンアミドヒドロラーゼの特定量は、熟練した臨床
化学者によって容易に決定されうる。一般に、その量は
２５００１．Ｕ、／ｄ未満、好ましくは１００〜１００
０１，１１．／ｒｒｒである。クレアチンアミジノヒド
ロラーゼは、律速量でない限り任意の量で存在すること
ができる。

換言すれば、前記の反応（２）は、分析において律速状
態ではない。この酵素の特定量は、熟練した臨床化学者
によって容易に決定されうる。

クレアチンアミジノヒドロラーゼ及びクレアチニンアミ
ドヒドロラーゼの量については、これらが一般に、少な
くとも５０；１の活性（１，Ｕ、／イ）の被覆量比で存
在すると表現することもできる。この比は少なくとも１
００：１であるのが好ましい。

本明細書において、ｙ、　ｕ、は酵素活性に関する国際
単位であり、その酵素に関する標準ｐｌ＋及び温度条件
下に１背当たりに１マイクロモルの基質の変換を触媒す
るのに必要な酵素活性の量をｌ　　Ｉ。

Ｕ、と定義する。本発明に使用する、好ましい酵素製剤
に関して、これらの標準状態は、クレアチニンアミドヒ
ドロラーゼについては３７℃、ｐＨ７，５であり、クレ
アチンアミジノヒドロラーゼについては３７℃、ｐｌ＋
７．５、ザルコシンオキシダーゼについては３７℃、ｐ
Ｈ７，５及びペルオキシダーゼについては３７℃、ｐｌ
＋７．５である。

分析に有用な他の試薬は、熟練した臨床化学者によって
容易に決定される適当な量で存在する。

代表的な量は、下記の実施例に説明する。

本発明の実施においては、クレアチンアミジノヒドロラ
ーゼ及びロイコ色素が、酵素が色素に対して実質的に不
活性であるような状態で存在することが重要である。こ
のことは、２種の試薬が、酵素がロイコ色素に悪影響を
与えないような方法で要素中に混入されていることを意
味する。これは、多数の方法で達成することができる。

例えば酵素をロイコ色素が任意の不純物によって影響さ
れない程、極めて純粋な形で使用することができる。し
かし、実際には、酵素は極めて純粋な形では得られない
。このような場合には、酵素及び色素の一方又は両方を
分析が実施されるまでカプセルに封入するか、又は要素
中で相互に分離しておくことができる。酵素及びロイコ
色素を要素の異なる帯域又は層に存在させて、分析時ま
で混合しないようにするのが好ましい。

本発明により、分析方法に応じて異なる種々の要素を製
造することができる。任意の所望の幅の長いテープ、シ
ート、スライド又はチップを含めて種々の形で要素を構
成することができる。

本発明の分析は、手操作で又は自動的にすることができ
る。一般に、乾式要素を使用する場合、要素を供給ロー
ル、チップ包装物又は他の供給源から採取し、試験すべ
き液体の試料（例えば１〜２００μｌ）と、試料と試薬
が要素内で混合されるように物理的に接触させることに
よってクレアチニン又はクレアチンを測定する。このよ
うな接触は、任意の適当な方法で、例えば要素を試料中
に浸漬するか、又は好ましくは適当な分配手段を用いて
一滴の試料を手で又は機械で要素に落とすことによって
達成される。

試料を施した後、要素をコンディショニング、例えばイ
ンキュベーション、加熱等、任意の試験結果を得るのを
促進又は容易にするのに望ましい処理に付す。

次に、適当な反射又は透過分光光度測定装置及び操作を
用いて色素形成の割合を測定する。一般に、クレアチン
の測定には、クレアチニンの実質的変換の前、すなわち
、試料と要素との接触の直後、例えば試料と要素との接
触後１分以前に色素測定を行う。この測定は、要素中の
クレアチニンアミドヒドロラーゼの律速量がこの時点で
クレアチニンをクレアチンに実質的に変換しないので、
内在クレアチンを測定する。

クレアチニンの測定には、実質的にすべての内在クレア
チンが酵素により反応生成物に変換された後に、少なく
とも２回の色素測定を行う。一般に、第一回の測定は、
試料と要素との接触後生なくとも４分に行う。もう−回
の測定は、その後、色素形成の速度及び従ってクレアチ
ニンの量を測定するために行う。この測定順序により、
本発明の要素をクレアチニン及びクレアチンの一方又は
両方の測定のため使用することが可能となる。

〔実施例〕

鼾；クレアチン　はクレアチニンの この例は、クレアチニンの測定のための本発明の詳細な
説明するものである。この分析は、下記の成分を有する
要素を用いて実施した。

（以下余白） 二酸化チタン　　　　　　　　５０ｇ／ｎ（酢酸セルロ
ース　　　　　　　　７　ｇ／イ拡散　　ＢＩｉｌＪ　
７８界面活性剤　　　　　０．８ｇ／ｒｄ層　　　トリ
ト：／　（ＴＲＩＴｏＮ）Ｘ−４０５界面活性剤１．７
　ｇｉｒｄ ニスタン（ＥＳＴＡＮＥ）１」旨　　　　　′ＬＵ可下
塗　　ポリ　（Ｎ−イソプロピルアクリルアミ：＞　　
　　　　　　　　　０．４　　％ゼラチン　　　　　　
　　　１０．８　ｇｉｒｄＮ−）リス−（ヒドロキシメ
チル）− メチル−２−アミノメタンスルホン 酸緩衝剤　　　　　　　　　　２．７ｇ／ｎｆ（エチレ
ンジニＩ・リロ）四酢酸０．３　ｇ／ｒｒｆ試薬　　タ
レアチンアミジノヒドロラーゼ層　　　　　　　　　　
　　　　２７，０００１．Ｕ、／イアスコルビン酸オキ
シダーゼ ５４００１、Ｕ、／ｒＪ ザルコシンオキシダーゼ　３３００１．Ｌｌ、／ｎ（ペ
ルオキシダーゼ　　　３３，０００１．Ｕ、／ｍ＋５．
５−ジメチル−１，３−シクロ ヘキサンジオン　　　　　　０．０９　ｇ／％２．４−
ジ−ｎ−ペンチルフェノール ３．２ｇ／ｒｒｆ クレアチニンアミドヒドロラーゼ 記録／　　　　　　　　　　　　　　　５４０１．Ｕ、
／イ試薬　　Ｎ−）リス−（ヒドロキシメチル）一層　
　　メチル−２−アミノメタンスルホン酸緩衝剤　　　
　　　　　　　２．７　ｇ／ボ（エチレンジニトリロ）
四酢酸０．３２ｇ／ｎｆトリドアＸ−１００界面活性剤
　　０．５ｇ／ｎ（アルカノール（ＡＬＫＡＮＯＬ）　
ＸＣ界面活性剤　　　　　　　　　　　０．５　ｇ／ポ
２−（３，５−ジメトキシ−４− ヒドロキシフェニル）−４，５− ビス（４−メチルアミノフェニル） この要素を使用して、下記の方法で同時にクレアチニン
及びクレアチンを測定した。適切な検量液体の試料ｌＯ
μβを別々の要素に施し、生成した色素を６７０ｎｍで
測定することによってクレアチン及びクレアチニンにつ
いて別々の検量曲線を調製した。各試料を加えた後６０
秒、２３６秒及び３０９秒に反射濃度（ＤＩ）を読み取
った。６０秒に読み取った数値を使用してクレアチンに
関する検量曲線をプロットした。この曲線は、分析中に
初期に色素測定を行うときに試験試料中のクレアチンを
測定することを可能にする。クレアチニンに関する検量
曲線は２３６秒での読みを３０９秒に行った各読みから
差し引き、各検量試料について１．２１７で割ることに
よって同様に得られる。

この曲線は、クレアチニンに関する反応速度を測定する
ことを可能にする。

次に、本発明の要素を試験液体の試料を施し、適切な時
間に反射濃度を読み取り、適切な検量曲線から各被分析
物濃度を測定することによってクレアチン及びクレアチ
ニンを、これらの被分析物の未知量を含む試験試料中で
測定した。第１図は参照方法で測定したクレアチン値に
対して本発明により測定したクレアチン値をプロットし
た曲線を示す。第２図は、参照方法で測定したクレアチ
ニン値に対して本発明により測定した、多数の試験試料
に関するクレアチニン値をプロットした曲線を示す。

これらの図面は、本発明の要素を使用してクレアチニン
又はクレアチンの一方又は両方を迅速かつ精密に測定す
ることができることを示す。

〔発明の効果〕

本発明は、クレアチニン又はクレアチン又はその両方を
同じ分析要素を用いて迅速かつ経済的に測定するための
、比較的簡単な自動的手段を提供する。従って、異なる
被分析物に対して別々の分析用組成物又は要素は必要で
はない。本発明の分析法は、迅速であり、例えば５分以
内に被分析物を測定することができる。本発明によれば
長時間を要するプランキング工程を回避することもでき
る。従って、本発明によれば、文献に記載されている溶
液分析に使用された複雑な装置は回避される。

本発明によりこれらの利点が得られる理由は、本明細書
に記載した分析要素を用いてクレアチニンに関する反応
速度分析が行われることである。

この要素は、前記の２種の酵素反応（１）及び（２）を
促進するクレアチニンアミドヒドロラーゼ及びタレアチ
ンアミジノヒドロラーゼを含む。

しかしながら、クレアチニンアミドヒドロラーゼは、律
速量で存在して、内在クレアチンが完全に反応してしま
うと、色素形成速度は全体的にクレアチニンの存在によ
る。しかしながら、分析中、初期に色素形成量を測定す
ることによって本発明の要素を用いてクレアチンを精密
に測定することができる。要素中に試薬を、試薬が相互
に干渉しないような方法で置くことによってバックグラ
ウンドを最少にする。特に、タレアチンアミジノヒドロ
ラーゼは、ロイコ色素に対して実質的に不活性であるよ
うな状態で存在する。

【図面の簡単な説明】

第１図は参照方法によって測定されたクレアチンに対し
本発明方法によって測定されたクレアチンをプロットし
たグラフ図であり、 第２図は参照方法によって測定されたクレアチニンに対
し本発明方法によって測定されたクレアチニンをプロッ
トしたグラフ図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ザルコシンオキシダーゼ、過酸化水素及び過酸化性
   物質の存在下に検出可能な色素を生成しうるイミダゾー
   ルロイコ色素、前記ロイコ色素に対して実質的に不活性
   な状態で存在するクレアチンアミジノヒドロラーゼ並び
   に律速量で存在するクレアチニンアミドヒドロラーゼを
   含む、クレアチニン又はクレアチンの測定用分析要素。 ２、Ａ、過酸化性物質の存在下に、クレアチニン又はク
   レアチンを含むと思われる液体試料をザルコシンオキシ
   ダーゼ、過酸化水素及び過酸化性物質の存在下に検出可
   能な色素を生成しうるイミダゾールロイコ色素、前記ロ
   イコ色素に対して実質的に不活性な状態で存在するクレ
   アチンアミジノヒドロラーゼ並びに律速量で存在するク
   レアチニンアミドヒドロラーゼを含む分析要素と接触さ
   せて検出可能な色素を生成させ、そして、 Ｂ、クレアチニン又はクレアチンの存在の結果として生
   成した検出可能な色素を測定する 工程を含むクレアチニン又はクレアチンの測定方法。