JPH0269198A - 下塗り帯域に緩衝剤を使用するテオフィリン測定用分析要素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は臨床化学に関し、そして生物学的流体中のテオ
フィリンの測定用乾式分析要素に関する。

〔従来の技術〕

テオフィリンは、喘息および原性疾患の処置のためにし
ばしば投与される薬剤である。この薬剤をひどい副作用
を伴うことなく成功裏に使用するためには、テオフィリ
ンが使用の比較的狭い療法範囲（すなわち、１〜２ｍｇ
／ａ）を有するので患者内のそれを頻繁に注意深くモニ
ターしなければならない。

ヒト血清中のテオフィリン量を測定するために数多くの
技法が使用されてきた。これら技法の殆んどは重大な欠
点を有する。例えば、既知の分光光度法は、大量の試料
および広範囲にわたる前処理を要し、そして類似構造の
キサンチン類（例えば、カフェイン、およびテオブロミ
ン）による妨害を受ける。既知のガスクロマトグラフ法
は、より特異的であるが、誘導体化が必要であり時間が
かかる。

非放射性イムノアッセイは、迅速に結果を与えそして使
用が簡単であることから最も頻繁に使用さね、ている。

−船釣には、イムノアッセイ法により十分な感度が得ら
れるものの、患者の腎臓の状態およびアッセイで使用さ
れる抗体の特異性に応じて非常に高い結果を示す可能性
を有することが最近見い出された。さらに、イムノアッ
セイは安定性が限定された一般に高価な試薬を使用する
ことが必要である。

高性能液体クロー７トグラフイー技法も知られている。

これらの技法は試験試料の前処理を行うか否かによって
特異性が異なる。アッセイの精度と特異性を改良するに
は有機抽出工程が必要である。

多くのクロマトグラフィー的方法は、幾つかの通常の抗
生物質を含む多数の物質により妨害を受ける可能性があ
る。他の短所にはアッセイを実施する上で高価な機器お
よび専門的な技術スタンフの必要性が含まれる。

テオフィリンは、アルカリホスファターゼ活性に対する
その阻害作用を測定することにより定量できることが知
られている。しかしながら、この方法でヒトの生物学的
流体をアッセイする場合には、内因性アルカリホスファ
ターゼがアッセイに影響を及ぼす可能性があり、低い側
に不正確な結果を示す可能性がある。この課題を解決す
るには、アッセイに先立ってなんらかの方法で内因性ア
ルカリホスファターゼを失活または除去しなければなら
ない。

特開昭６３−７１１９８号公報には、アルカリホスファ
ターゼに関するアイソザイムとアンセイ！ＵＩ間を通じ
てｐＨ９以下に持続するための緩衝剤を有する要素が記
載されている。実質的にすべての緩衝剤は展開（前記公
報では拡散）層に配置されている。

要素の下塗り層には全く緩衝剤を含まない。

〔発明が解決しようとする課題〕

前記要素は、内因性アルカリホスファターゼが低域した
作用を示すテオフィリン用の簡便で迅速なアッセイを提
供するとはいえ、それが限定された範囲のものでありか
つ著しく偏った（ｂｉａｓ）アルカリホスファターゼを
有する。

〔課題を解決するための手段〕

前述の課題は、流体と接触する多孔質展開帯域、下塗り
帯域および少なくとも１個の追加の帯域を含んでなるテ
オフィリン測定用乾式分析要素であって、ｐｌ＋９以下
でアルカリホスファターゼのアイソザイムに対する基質
に作用することができる前記アイソザイムおよび前記ア
イソザイムに対する基質を含み、供給されたこれらのア
イソザイムと基質が前記要素の相違する帯域に存在し、
かつ前記下塗り帯域がポリビニルピロリドンおよび測定
期間を通じてｐＨ９以下に持続することができる緩衝剤
を含むことを特徴とする要素により改良される。

本発明は、前述の特開昭６３−７１１９８号公報で特許
請求され、記載されているアンセイ要素の全ての利点を
有するテオフィリン用の簡便かつ迅速なアッセイを提供
する。

これらの改良は、驚くべきことにその要素の下塗り帯域
に緩衝剤とポリビニルピロリドンを置くことにより達成
された。

本発明は、生物学的流体、特にヒトの生物学的流体中の
テオフィリンの測定に関する。本明細書で使用する「測
定ｊとは、試験試料中のテオフィリン■の定量的または
定性的測定をいう。特に本発明は、内因性アルカリホス
ファターゼ酵素産生物（例えば、肝臓、腸、胎盤または
骨）のいずれかのアルカリホスファターゼ（すなわち、
天然酵素）を含むヒトの生物学的流体中のテオフィリン
を測定するために使用することができる。例えば、本発
明は血清、全血、血漿、励液、喀痰、胆汁、唾液および
その他の生物学的流体をアッセイするために有利に使用
することができる。また、本発明を使用してヒトの骨格
筋、腎臓、胎盤、心臓、揚、肺または他のＭｉ織のよう
な１徂職の流動性調製物をアンモ・イすることも可能で
ある。本発明の実施に際して使用される好ましい生物学
的流体は、ヒト血清および全血である。

本発明の実施においては、検出可能な反応生成物を生ず
る各種の基質に作用し得る酵素、アルカリホスファター
ゼ活性を阻害することによりテオフィリンを測定可能で
ある。例えば、次の代表的な式は、典型的な基ＮＣｐ−
ニトロフェニルホスフェート）を使用するアルカリホス
ファターゼ作用による検出可能な色素の生成を示す： ｐ−二トロフェノール（色素）＋リン酸次に、その色素
をｉ！当な分光光度的検出装置を用いて比色的に検出す
ることができる。最終反応物中に存在するテオフィリン
量は、測定される色素量に逆比例する。

本発明は、ｐ１１９以下、好ましくはｐｌ（７〜９で実
施される。特開昭６１−１７０４００号公報に記載され
るように、ヒトの流体中の内因性アルカリホスファター
ゼはｐＨ９以下で活性が減少する。しかしながら、ｐ１
１９以下の環境下で失活しないアルカリホスファターゼ
の他のアイソザイムは、テオフィリンの存在を表示する
アッセイに使用することもできる。所期の性質（すなわ
ち、ｐ１１９以下で活性が測定可能）を有するいずれか
の適当な起源に由来する全てのアイソザイムが、本発明
を実施するに際して利用可能である。特に有用なアイソ
ザイムとしては、ウシ起源（例えば畜生または子牛の肝
臓のような組織または器官）より得られるものが挙げら
れる。各種他の起ａ（例えば、微生物、鳥ｘ■および非
ヒト咄乳頚源）に由来するアイソザイムも有用である。

本発明の実施に際して利用し得るであろうアイソザイム
を見い出すことは、臨床化学分野の当業者の技術水準内
に十分大る。

本発明を実施する上で、１種以上の各種アルカリホスフ
ァターゼ基質を使用することができる。

この基質は、前記アイソザイムとの酵素反応により直接
検出可能な変化が生ずるようなものでなければならない
。例えば、基質は１種以上の検出可能な反応生成物、例
えば色原体、螢光助剤、放射性標識種および他の適当な
検出可能生成物が転化される。アッセイを介して測定さ
れる検出可能な変化は、前述のような検出可能な生成物
の出現もしくは消失、またはある検出可能な生成物の他
のものへの変化であってもよい。また一方、検出可能な
変化は、基質に対するアイソザイムの作用により開始さ
れる一連の反応を介してもたらされるものであってもよ
い。例えば、基質にアルカリホスファターゼが作用して
、他の酵素または１種以上の反応に使用される試薬を放
出し、次いで検出可能な生成物を生成することもできる
。検出可能な生成物は、直接測定可能であるか、または
測定のために何等かの物理的分離もしくは処理を要して
もよい。

本発明の態様では、アッセイが酵素反応の検出可能な生
成物として色原体または螢光助剤を供給する。一般に、
このような反応で利用されるＭＷは、酵素反応により基
質分子から開裂されるリン酸基を有する。このような基
質としては、有機モノリン酸エステル、有機シリン酸エ
ステルまたはそれらの塩が挙げられる。特に有用な基質
の例には、ｐ−ニトロフェニルホスフェート、フェノー
ルフタレインモノホスフェート、フェノールフタレイン
ジホスフェート、チモールフタレインモノホスフェ−１
〜、インドキシルホスフェート、フェニルホスフェート
、α−ナフトールホスフェート、β−ナフトールホスフ
ェート、α−グリセロールホスフェート、０−メチルフ
ルオレセインホスフェート、０−カルボキシフェニルホ
スフェート、それらのアルカリ金属塩ならびに、例えば
米国特許第３，４２５，９１２号明細書およびヨーロン
バ特許公開第６Ｌ７３１号公報において当該技術分野で
既知の他のものが含まれる。好ましい基質は、ｐ−ニト
ロフェニルホスフェ＝１・および４−（４−ニトロ−２
−メチルスルホニルフェニルアゾ）ナフトール−１−ホ
スフェートである。

アイソザイムと基質は、液体試験試料と接触されるまで
、要素の別々の帯域に分離し続けねばならない。要素中
のアイソザイムおよび基質量は、広範に変えることがで
きる。一般に、要素は、アイソザイムを少なくとも１０
１．Ｕ、／ｎｆ含む。ある態様では、アイソザイムが少
なくともＬＱＯｌ、Ｕ、／ｒｄの塗布量、好ましくは１
２５〜２００！、Ｕ、／ｒｒｆの塗布量で存在する。こ
の態様は本出願人の出願である特開昭６３−７９６００
号公報に記載され、特許請求されている。本明細書の記
載に関して、ｒｉ、ｕ、Ｊは、アイソザイムに対する標
準的なｐＨおよび温度条件下で、１背当たり基質１マイ
クロモルの転化を触媒するのに必要とされるアイソザイ
ム活性量を有するものを１１．０．と定義した。

酵素に対する基質は、一般に１〜５ｇ／ボ、好ましくは
２〜４ｇ／ｒｒｆの量で存在する。当業者の常識の範囲
内の量で他の添加剤を要素に組み込んでもよい。

本アンセイは、ｐ１１９以下、好ましくはｐＨ７〜９で
実施される。本発明の実施に際しては、アンセイ期間を
通じてｐＨを９以下に持続し得るものであればいかなる
適当な緩衝剤または緩衝剤混合物をも使用することがで
きる。特に有用な緩衝剤としては、当該技術分野で標準
とされる多くの窒素含有有機緩衝剤〔例えば、Ｇｏｏｄ
ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ＋　　５　（２）　。

１９６６、４６７〜４７７頁、参照〕が挙げられる。限
定されるものではないが、代表的な緩衝剤としては、ト
リス（ヒドロキシメチル）アミノエタン・塩酸、グリシ
ルグリシン、Ｎ−１−リス（ヒドロキシメチル）−メチ
ル−２−アミノエタンスルホン酸、およびＮ−２−ヒド
ロキシエチルピペラジン−Ｎ′２−エタンスルホン酸か
らなる群から選ばれるものが挙げられる。最初に記載し
た緩衝剤が最も好ましい。

緩衝剤はまた、本発明の展開帯域または１個以上の他の
帯域、ならびに下塗り帯域に配置することもできる。反
応混合物のｐＨを所期のｐＨ９以下に持続するために、
個々の緩衝剤に応じて適切な量で下塗り帯域に緩衝剤を
存在させる。これらの緩衝剤量は、当業者により容易に
決定することができるが、一般に最低１　ｇ　／　ｒｄ
、好ましくは最低２．５ｇ／屑である。

場合により、他の任意の試薬を要素に添加してもよい。

例えば、金属イオン活性化物質は、アイソザイムを活性
化するために添加することができる。このような活性化
物質は、遊離または塩形（例えば、アスパラギン酸塩、
酢酸塩、塩化物または硫酸化物）で入手できる２価のカ
チオン、例えばＭｇ”、Ｃｏ”、Ｍｎ”、Ｃａ”◆、Ｚ
ｎ”、Ｓｒ・・およびＦｅ”を含む。また、試験試料中
の内因性アルカリホスファターゼ水準が異常に高い場合
には、酵素活性阻害剤を使用してもよい。利用可能な阻
害剤としては、フェニルアラニンおよびテトラミゾール
（ｔｅｔｒａｍｉｓｏｌｅ）が挙げられる。このような
阻害剤は一定の非ヒトアルカリホスファターゼアイソザ
イム活性に影響を及ぼさないものが有利である。

のリン酸受容体を含めることが好ましい。有用なリン酸
受容体には、アミノアルコールまたはその誘導体、ある
いは特に利用可能なアミノアルコールを有するアミン類
が含まれる。このような化合物の例は、当該技術分野で
周知である。

グリセリンまたは他の保湿剤を要素の１個以上の帯域に
添加して要素のカールを減少させることもできる。

要素は、下塗り帯域、多孔質展開帯域を含む少なくとも
３種の帯域に分割され、アイソザイムと基質は別個の帯
域に組み込まれる。これらの帯域は分離層または単一層
の限定分画であることができる。それらは同一または種
々の材料からなり、積層化または他の標準的技法により
一体化されていてもよい。

要素のそれぞれの帯域は、自立性、すなわちそれらの保
全性を維持するのに十分な強度の材料から構成すること
ができる。好ましくは、これらの帯域は支持体上に保持
される。このような支持体は、いずれかの適当な寸法安
定性を有し、好ましくは波長２００〜９００ｎｍの電磁
波線を透過する透明（すなわち、輻射線透過性）物質で
ある。特定要素用として具体的に選ぶ支持体は、意図す
る検出様式（反射または透過分光分析法）に適合しなけ
ればならない。利用し得る支持体材料としては、紙、金
属ホイル、ポリスチレン、ポリエステル、ポリカーボネ
ート、セルロースエステルおよび当該技術分野で既知の
他のものが挙げられる。

下塗り帯域は、イソプロピルアルコール、緩衝剤〔例え
ば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン・＋（（
Ｊ！　）およびポリビニルピロリドンを混練器に添加し
、室温で７２時間混練して調製する。

これは緩衝剤とポリビニルピロリドンのみを含む。

多孔質展開帯域は、いずれかの適当な繊維性もしくは非
繊維性材料またはそれら両者の混合物から調製すること
ができる。この帯域の排除容積および平均細孔サイズは
、使用目的に応し、て変えることができる。例えば、高
分子量物質を含有する全血または他の液体試料をアッセ
イする場合は、その排除容積および平均細孔サイズは血
清または尿がアッセイされるものより一般的に大きい。

有用な展開帯域は、米国特許第４，２９２．２７２号明
細書に記載されるように適当なバインダー材料と混合す
るか、または織布に織った繊維性材料を使用して調製す
ることができる。別法として、好ましくは、米国特許第
３，９９２．１５８号、同４，２５８，００１号および
同４．４３０．４３６号明細書ならびに特開昭５７−１
０１７６０号公報に記載されるようなポリマー組成物（
例えば、ブラッシングポリマー）または特殊な材料から
展開帯域は調製される。展開帯域は、等方性の多孔質（
多孔度が、連続空隙または粒子間、繊維間もしくはポリ
マーストランド間の細孔からもたらされる帯域における
各方向で同一であることを意味する）であることが好ま
しい。

最も好ましくは、多孔質展開帯域は前記米国特許第３，
９９２．１５８号明細書に記載されるようなプランジン
グポリマーと同様に調製される。

本発明の要素は、前述のように３種の必須帯域を有する
。良好な効果を上げるために要素へ含ませ得る他の帯域
は、当該技術分野で知られているものと同様な試薬帯域
または記録帯域である。要素は、限定されるものではな
いが、追加の展開帯域、輻射線遮断または輻射線濾過帯
域、もう一つの下塗り帯域または障害帯域を含む他の帯
域を有することもできる。好ましくは、すべての下塗り
帯域は２つの必須帯域間に配置される。下塗り帯域は、
アッセイに先立ってアイソザイムと基質が相互作用しな
いことを確実にするのに役立つ。要素中の全ての帯域は
、一般に流体と相互に接触する〔液体、試薬および反応
生成物（例えば、発色色素）が隣接帯域の重なった領域
間を通過または輸送することができることを意味する〕
。好ましくは、２種以上の帯域が単一層に存在するとし
ても、前記帯域は個別に塗布された層である。前述の引
例のほかにも、例えば米国特許第４，０４２，３３５号
、同４，１３２．５２８号および同４，１４４，３０６
号明細書にも適当な要素成分が記載されている。

本発明の好ましい態様は、順番に流体と接触する、本明
細書に記載したアイソザイムを含有する層、輻射線遮断
層、緩衝剤とポリビニルピロリドンを含有する下塗り層
およびアイソザイムに対する基質とさらに緩衝剤を含む
多孔質展開層を支持体上に仔する支持体からなる要素で
ある。アイソザイム層は多孔質展開層であってもよいが
、好ましくは、１種以りの親水性バインダー（例えば、
ゼラチン、ビニルピロリドンポリマーまたはアクリルア
ミドポリマー）、界面活性剤、媒染剤および他の添加剤
を含有する試薬層または記録層である。下塗り層は、当
業者に既知の１種以上の下塗り材料（例えばビニルピロ
リドンポリマー、アクリルアミドポリマーおよび当該技
術分野で既知の他のもの）を含むことができる。輻射線
遮断層は、一般に、当該技術分野で知られている１種以
上のバインダー、界面活性剤および反射材料を含む。

場合により、この好ましい態様の要素は、また、要素の
最外層に、一般に、第一多孔質展開層と隣接する第二多
孔質展開層を含んでいてもよい。第二条孔質展開層は、
アイソザイム基質を含仔する第一多孔質展開層中のもの
と同一または相異する材料から構成することができる。

例えば、緩衝剤を含有する第一展開層は、前述の米国特
許第３．９９２，１５８号明細書に従って調製されるプ
ランジングポリマーを含むことができ、第二展開層は前
述したような粒状材料から構成されていてもよい。

この第二展開層は、必要により緩衝剤を含んでいてもよ
い。

本発明に従い、アンセイ方法に応じた多種多様な要素を
調製することができる。要素は、いずれかの好ましい幅
を有する延伸テープ、シート、スライドまたはチップを
含む各種の形状に構成することができる。

本発明のアッセイは、手動であってもまたは自動的であ
ってもよい。一般に、乾式要素を使用するに際し、テオ
フィリン測定は供給ロール、チップパケットまたは他の
供給源から要素を取り出し、それを試験される液体試料
（例えば、２００　ｕ１未満）と物理的に接触させるこ
とにより行われる。このような接触は、いずれかの適当
な手段、例えば要素を試料中に軽く浸すかまたは浸漬す
ることによるか、あるいは好ましくは適当な分注器を用
いて試料の液滴を手または機械により要素にスポットす
ることにより遂行することができるや試料を適用した後
、要素をコンディショニング（例えば、インキュベーシ
ョンまたは加熱）して試験結果の人手を早めるか加速す
ることが好ましいであろう。

次に、要素中に存在するアルカリホスファターゼは、試
料中のテオフィリンにより阻害されないアルカリホスフ
ァターゼ量に応じた速度で基質の反応を促進する。反応
生成物の形成に帰因する検出可能な変化（例えば、色素
生成）速度は、反射または透過分光光度測定用の適当な
ａ器を使用して定量可能である。適当な分光光度測定機
器および操作は当該技術分野で知られている。他の適当
な検出手段には、螢光分光光度法、ラジオメトリーまた
は酵素標識法が含まれる。テオフィリン星は、測定され
た反応速度に逆比例する。

例えば、基質としてＰ−ニトロフェニルホスフェ−１・
を使用する場合には、非阻害酵素反応生成物ｐ−ニトロ
フェノールが標準的な分光光度計を使用して４００ｒ＋
ｎ＋で測定できる。次に、着色の変化速度は基質の反応
速度に直接関連し、次いで試料中のテオフィリン濃度に
間接的に関連する。

〔実施例〕

本発明の要素は、次の形式および成分を有するように調
製した。

対照要素は、緩ｆＪｉ剤濃度およびアルカリホスファタ
ーゼア・イソザイムを展開層中に緩衝剤と一緒に含めた
こと以外は前記ヨーロッパ特許出願第８７３０１４９７
．５号明細書に記ｊ成されるものと同一である。

アッセイの速度範囲（ｒａｔｅ　ｒａｎｇｅ）およびア
ルカリホスファターゼの偏差（ｂｉａｓ）は、各要素上
に各種濃度（・１０μｇ／ｍｌまで）のテオフィリン含
有血清をスポットし、次いでレートアナライザー（ｒａ
ｔｅａｎａｌｙｚｅｒ）を使用して７分経過後の反射濃
度を測定することにより評価した。結果を第１表に示す
。

大きい範囲は、テオフィリン測定における優れた（３度
を示す。本発明の要素は、対照要素に対して統計的に有
意な範囲の増大を示した。

番Ｖ−険 Ｔｒｉｓを展開層に含めたものに比べ下塗り層に含めた
ものの利点： 増大範囲−ＳＬに代え下塗り層をＴｒｉｓで塗布する場
合には、３種の層（第１表）のＰＶＰ濃度に応して塗布
範囲を５から１０％に増大させた。下塗り層中のＰＶＰ
Ｉ度が１００ｍｇ／ｆｔ２に減少したとき、塗布範囲は
対照塗布の５％まで減少する。

ＰＶＰの濃度が３００■／ｆｔ２に増大したとき、塗布
範囲は対照を１０％陵駕することになる。

アルカリホスファターゼ偏差−一対の液体にテオフィリ
ン１８．５　ｇ　／ｄを加え、さらにその液体の１つに
アルカリホスファターゼ１０００　Ｕ　／　ｍｌを加え
た。これらの液体を、下塗り層中にＴｒｉｓおよび各濃
度のＰＶＡを有するテオフィリン塗布物上にスポットし
た場合には、ＰＶＰＩの減少につれてアルカリホスファ
ターゼ偏差が減少した（第１表）。

最大減少率（・１３％）は、下塗り層にＰＶＰ　１００
ｍｇ／ｆｔ２　とＴｒｉｓ　５００ｍｇ／ｆｔ２を含む
塗布により観察された。

保肩寸し礪欠艮 すべての塗布物を、１５％かまたは５０％に調節した湿
度下で２５°Ｃに２週間持続した。予測されるテオフィ
リン濃度の平均偏差を、２６°Ｃに持続した類似の塗布
物に対する前記塗布物の応答の比較により決定した。一
般に、展開層にのみＴｒｉｓを有する対照塗布物に比べ
、各温度−湿度の組み合わせに関して、下塗り層のＴｒ
ｉｓｉｄ度を固定してＰＶＰ濃度を減少させるとその減
少に伴って偏差は減少する。さらに、偏差は低い湿度（
１５％）水準で一層低くなった。下塗り層中にＴｒｉｓ
とＰＶＰを有する塗布物は、対照の塗布物に比較して、
すべての湿度水準でも最も低い偏差値を有していた（第
■および■表）。

〔発明の効果〕

本発明の要素は、著しく改良されたｉｉ１囲、アルカリ
ホスファターゼ偏差および安定性を有する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、流体と接触する多孔質展開帯域、下塗り帯域および
   少なくとも１個の追加の帯域を含んでなるテオフィリン
   測定用乾式分析要素であって、ｐＨ９以下でアルカリホ
   スファターゼのアイソザイムに対する基質に作用するこ
   とができる前記アイソザイムおよび前記アイソザイムに
   対する基質を含み、供給されたこれらのアイソザイムと
   基質が前記要素の相違する帯域に存在し、かつ前記下塗
   り帯域がポリビニルピロリドンおよび測定期間を通じて
   、ｐＨ９以下に持続することができる緩衝剤を含むこと
   を特徴とする要素。 ２、順番に流体と接触する、 （ａ）緩衝剤およびｐＨ９以下で基質に作用することが
   できるアルカリホスファターゼのアイソザイムに対する
   基質を含む多孔質展開層、 （ｂ）下塗り層、 （ｃ）ｐＨ９以下でアルカリホスファターゼのアイソザ
   イムに対する基質に作用することができる前記アイソザ
   イムを含む試薬層、ならびに （ｄ）輻射線遮断層を支持体上に有する支持体を含んで
   なり、前記下塗り層がポリビニルピロリドンおよび測定
   期間を通じてｐＨ９以下に持続することができる緩衝剤
   を含むことを特徴とするテオフィリン測定用分析要素。