JPH0549278B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

産業上の利用分野 本発明は、生物学的液体、例えば血清をアルカ
リホスフアターゼに関して分析する乾式分析要素
に関する。 従来の技術 生物学的液体、殊にヒトの血清中のアルカリホ
スフアターゼ及びその同位酵素の定量的測定は、
種々の肉体的疾患の診断及び治療に極めて重要に
なつた。このような測定は、このような病気に伴
つてアルカリホスフアターゼ濃度が上昇する点で
骨及び肝臓の病気の検出に極めて重要である。従
つて、アルカリホスフアターゼを定量的に測定す
るため、種々の分析方法が長年にわたつて開発さ
れてきた。 アルカリホスフアターゼを測定するため乾式試
験要素を使用し、これにより溶液分析を回避し、
乾燥粉末の使用及びそれに伴う問題を回避するこ
とは望ましい。 しかしながら、アルカリホスフアターゼ分析に
使用される最も一般的で、好ましい試薬〔即ち、
PNPP基質及び２−アミノ−２−メチル−１−プ
ロパノール（2A2M1P）緩衝剤及び燐酸塩受容
体〕を米国特許第3992158号明細書に記載されて
いるような常用の乾式試験要素の試薬層中に配合
する場合には、PH調節の際に重大な問題に遭遇し
た。このような要素を２週間冷蔵して保存する場
合でさえ、測定される酵素活性の30％低減が観察
された。 液体試料中のアルカリホスフアターゼを測定す
る場合、試料のPHを最適な酵素活性のため約9.7
〜10.5に保持することが必須上限である。
2A2M1P（２−アミノ−２−メチル１−プロパノ
ール）は、アルカリホスフアターゼ溶液分析用の
緩衝剤であり、かつ燐酸塩受容体であるが、アル
カリホスフアターゼ分析に使用される乾式要素に
は必要な緩衝能を及ぼさないことが判明した。乾
式要素に緩衝剤として2A2M1Pを使用する場合に
は、PHは時間の経過と共に低下する傾向がある。
このPHの変化は前記の酵素活性の重大な損失を起
こす。 ９〜11.5のpKaを有する緩衝剤であるアルカリ
金属塩又はアンモニウム塩は、乾式試験要素に必
要なPH調節を生じることができる。アルカリホス
フアターゼ検出用の乾式試験要素に、このような
緩衝剤を使用することは、例えば米国特許第
3905872号明細書に記載されている。この緩衝剤
はアルカリホスフアターゼ基質と同じ帯域に含ま
れている。しかし、このような緩衝剤はPNPP基
質の自然な非酵素加水分解を促進する。このよう
な加水分解は、試薬を被覆して要素を形成すると
直ちに始まり、貯蔵の間続く。このように基質が
不安定である結果、最終的にアルカリホスフアタ
ーゼに対する乾式要素に感度の不所望の低下を起
こし、この低下は貯蔵の間続く。 本発明の目的は、PHが最適なレベルに調節され
ており、同時に貯蔵の間、基質の安定性及び酵素
に対する対応する要素の感度を保持している、ア
ルカリホスフアターゼ測定用乾式要素を提供する
ことである。 発明の構成 本発明によれば、アルカリホスフアターゼ用基
質及び緩衝剤を含む、水性液体中のアルカリホス
フアターゼ測定用乾式分析要素において、液体接
触状態の第一及び第二の被覆層を有し、前記第一
の試薬被覆層がアルカリホスフアターゼ用基質を
含み、前記第二の試薬被覆層が緩衝剤を含み、前
記緩衝剤が約９〜約11.5のpKaを有するアルカリ
金属又はアンモニウム塩であるアルカリホスフア
ターゼ分析用乾式分析要素が提供される。 詳細な説明 本発明に有用な緩衝剤及びアルカリホスフアタ
ーゼ基質を、要素の形成の間及びそれをアルカリ
ホスフアターゼ分析に使用する前は、別々に保持
することが必要である。要素を形成した後、それ
に使用する前は、別個の試薬層中の試薬は混合せ
ずに、それぞれの層に保持されている。しかしな
がら、常用の被覆手段により要素を形成する間、
個々の層を、例えば被覆された層として設ける場
合、それぞれの層は、その試薬がその上又は下の
別の層に通過しないような方法で被覆しなければ
ならない。これを達成しうる一つの方法は、一つ
の層の試薬が隣接層の溶剤に可溶性でないような
異なる溶剤から隣接層を被覆することによる。 本発明は、水性液体中のアルカリホスフアター
ゼの定量法に関する。本発明の実施は、ヒト又は
動物の生物学的液体、例えば全血、血漿、血清、
リンパ液、胆汁、尿、髄液、唾液、汗等を用いて
行われる。ヒト又は動物の組織、例えば骨格筋、
心臓、腎臓、肺、脳、骨髄、皮膚等の液体調製物
を使用することもできる。本発明の実施に好まし
い生物学的液体はヒトの血清である。ほとんどの
場合、血清を希釈する必要はないが、アルカリホ
スフアターゼの量が異常に高い場合に最適な結果
を得るため、希釈することができる。この場合、
その血清を高蛋白質溶液、例えばヒト又は動物の
血清で希釈することができる。 本発明の実施に、多数のアルカリホスフアター
ゼ基質のうち１種以上を使用することができる。
このような基質は一般に、燐酸の有機モノ−若し
くはジエステル又はその塩のように、酸素反応の
間に基質分子から脱離されるホスフエート基を有
する。有用な基質は、例えばｐ−ニトロフエニル
ホスフエート、フエノールフタレンモノホスフエ
ート、フエノールフタレンジホスフエート、チモ
ールフタレンモノホスフエート、インドキシルホ
スフエート、フエニルホスフエート、α−ナフト
ールホスフエート、β−ナフトールホスフエー
ト、βグリセロールホスフエート、ｏ−カルボキ
シフエニルホスフエート、ｏ−メチルフルオレセ
インホスフエート、これらのアルカリ金属塩又は
アンモニウム塩及び文献に公知の他の基質であ
る。好ましい基質は、ｐ−ニトロフエニルホスフ
エートである。アルカリホスフアターゼによつて
触媒される反応により生じるｐ−ニトロフエノー
ルを、比色法で測定することができる。 本発明の実施に有用な緩衝剤は、約９〜11.5の
pKaを有するアルカリ金属塩又はアンモニウム塩
である。緩衝剤は約9.5〜約11のpKaを有するの
が好ましい。有用な緩衝剤は硼酸及び炭酸のアル
カリ金属塩及びアンモニウム塩、シクロヘキシル
アミノプロパンスルホン酸及びシクロヘキシルア
ミノエタンスルホン酸等のアルカリ金属塩及びア
ンモニウム塩を包含する。これらの緩衝剤を単独
で又は混合物として使用することができる。特に
有用な緩衝剤は、炭酸のアルカリ金属塩、例えば
炭酸二ナトリウム、炭酸二カリウム、炭酸水素ナ
トリウム、炭酸水素カリウム等である。炭酸二ナ
トリウムは好適な緩衝剤である。 本発明の要素が更に１種以上の燐酸塩受容体を
含むことは好ましいが、含まなくてもよい。文献
には、このような化合物は、溶液分析においては
緩衝剤であると同時に基質から解離したホスフエ
ート基の受容体として作用するので、燐酸基転移
可能な緩衝剤としても知られている。有用なホス
フエート受容体は、アミノアルコール又はその誘
導体、又は脂肪族アミンを包含し、アミノアルコ
ールが特に有用である。有用な受容体は、例えば
２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、２
−ジメチルアミノエタノール、２−アミノ−２−
メチル−１，３−プロパンジオール、２−アミノ
−２−エチル−１，３−プロパンジオール、３−
ジメチルアミノ−１，２−プロパンジオール、２
−メチルアミノエタノール、２−イソプロピルア
ミノエタノール、２−エチルアミノエタノール、
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、トリ
ス（２−アミノ−２−ヒドロキシメチル）プロパ
ン−１，３−ジオール、シクロヘキシルアミン、
ジエタノールアミン及びその他、文献に公知のも
のを包含する。好ましいホスフエート受容体は、
２−アミノ−２−メチル−１−プロパノールであ
る。 前記の試薬を適当な型の乾式分析要素中に混入
させる。代表的な乾式要素の型は、文献に公知で
あり、例えば米国特許第3992158号、同第4042335
号、同第4144306号、同第4132528号、同第
4050898号、同第4258001号明細書及び再発行特許
第30267号明細書に記載されている。 本発明の要素は文献に知られているような試薬
紙又は乾式試験指示薬の形を取ることができる。 本発明の乾式分析要素は、前記の試薬を含む試
薬層の少なくとも２つ有する。第一の試薬層は、
アルカリホスフアターゼ用基質を含み、第二の試
薬層は前記の９〜11.5のpKaを有する緩衝剤を含
む。これらの層は自立性（即ち、その一体性を保
持するのに十分に硬い材料から成る）であつてよ
いが、適当な支持体上に担持されているのが好ま
しい。このような支持体は寸法安定性で、好まし
くは透明（即ち、輻射線透過性）で、約200〜
900nｍの波長の電磁線を透過する任意の適当な
材料である。有用な支持体材料は、ポリスチレ
ン、ポリエステル〔例えばポリ（エチレンテレフ
タレート）〕、ポリカーボネート、セルロースエス
テル等である。第一試薬層は支持体に隣接するの
が好ましい。これらの層は相互に液体接触する
（液体並びにその液体中の試薬及び反応生成物が、
層が湿つているときに隣接層の重ねられた領域の
間を通過しうることを意味する）。換言すれば、
液体接触とは、液体接触している層の間に液体の
成分を輸送しうる能力を言う。前記した第一及び
第二の試薬層は要素のただ一つの層にすることも
できるが、別々の被覆層とするのが好ましい。 試薬層は、試薬（即ち、反応性化合物、緩衝再
剤等）を分配、即ち溶解又は分散する１種以上の
マトリツクス物質を含む。有用なマトリツクス物
質は親水性物質を含んでいてよい。好ましいマト
リツクス物質はゼラチンである。マトリツクス物
質は文献に公知の被覆量で存在する。 試薬層の一方又は両方が拡散層として作用して
もよい。付加的に、又は択一的に、要素は１個以
上の別の拡散層を有してもよい。拡散層を製造す
るため有用な物質は、例えば前記の米国特許第
3992158号及び同第4258001号明細書及び米国特許
第4292272号明細書及び英国特許出願第2052057号
明細書に記載されている。 本発明の要素は、場合により特別の機能を有す
る付加的層、例えば分析能を改良するか又は要素
の製造を一層便利にする層を含んでいてもよい。
例えば、他の層の間の付着を促進又は調節するた
めの付加的層を使用することは一般的に行われて
いる。このような層は、一般に、「バインダー」
層又は「下塗」層と言われ、文献によく知られて
いる。 本発明の要素に使用される各試薬の被覆量は、
分析すべき液体に応じて広く変動することができ
る。例えば、前記の９〜11.5のpKaを有する緩衝
剤は、一般に、約６ｇ／m²以下、好ましくは約２
〜約５ｇ／m²の被覆量で存在する。アルカリホス
フアターゼ用基質は、一般に約５ｇ／m²以下、好
ましくは約0.3〜約３ｇ／m²の被覆量で存在する。
任意成分であるホスフエート受容体を使用する場
合、これは一般に約５ｇ／m²以下、好ましくは約
0.5〜約２ｇ／m²の被覆量で存在する。受容体は、
試薬層、拡散層又は下塗層を含めて、要素の１個
以上の層に存在することができる。受容体は約９
〜約11.5のpKaを有する乾燥剤を含む層に存在す
るのが好ましい。 有用な酵素活性化剤は２価陽イオン、例えば、
塩の形（例えばアスパラギン酸塩、酢酸塩、塩化
物、硫酸塩等）で入手しうるMg⁺⁺、Co⁺⁺、
Mn⁺⁺、Ca⁺⁺、Zn⁺⁺、Sr⁺⁺、Fe⁺⁺等である。 一つの実施態様で、本発明の要素は支持体と、
その上に順次、液体接触で、 緩衝剤を含む第一試薬層、 下塗層、 アルカリホスフアターゼ用基質の含む第二試薬
層、及び 拡散層 を有してなる。 別の実施態様では、要素は支持体とその上に順
次、液体接触で、 アルカリホスフアターゼ用基質を含む第一試薬
層、 下塗層、 緩衝剤を含む第二試薬層、及び 拡散層 を有してなる。 更に別の実施態様では、本発明の要素は支持体
と、その上に順次、液体接触で、 緩衝剤を含む第一試薬層、 アルカリホスフアターゼ用基質を含む第二試薬
層、及び ホスフエート受容体を含む試薬／拡散層 を有してなる。 更に別の好ましい実施態様では、要素は支持体
とその上に順次、液体接触で、 アルカリホスフアターゼ用基質を含む第一試薬
層、 下塗層、及び 緩衝剤及びホスフエートを含む第二試薬／拡散
層 を有してなる。この場合、試薬／拡散層は試薬層
としても拡散層としても作用する。 実施例 次に、実施例に基づいて本発明を詳述する。 例１……乾式アルカリホスフアターゼ要素中の炭
酸塩緩衝剤の作用 この例は、２−アミノ−２−メチル−１−プロ
パノール（2A2M1P）で緩衝した要素に比べて炭
酸ナトリウム緩衝剤を含む要素のPH調節が改善さ
れていることを示す比較例である。この例は更
に、炭酸ナトリウム緩衝剤及び基質を含み、これ
らの試薬が分離されていない要素の基質安定性が
乏しいことを示す。 Ａ部 アルカリホスフアターゼ測定用乾式分析要素に
炭酸塩緩衝剤を使用して達成されるPH調節の改善
を照明するため、ポリ（エチレンテレフタレー
ト）フイルム支持体の２つの試料（Ａ及びＢ）
を、試料Ｂが更に炭酸二ナトリウム（3.4ｇ／m²）
を含む以外は、下記の組成物で被覆することによ
つて２つの乾式要素を製造した。被覆した組成物
を乾燥して各支持体上に試薬層を形成した。 試薬組成物 ｇ／m² ｐ−ニトロフエニルホスフエート 0.3〜３ ２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール
１〜４ トライトン（Triton）Ｘ界面活性剤 0.1〜0.25 ポリ（アクリルアミノ−コ−２−ヒドロキシエチ
ルアクリレート（85：15重量比） ５〜15 各試料要素の試薬層上に微晶性セルロース〔ア
ビセル（Avicel）〕を含む拡散層を形成した。 要素の形成直後及び25℃（78〓）及び相対湿度
50％で２週間保存した後に、各試料要素の表面PH
を測定した。これらの保存試験の結果を下記の第
表に示す。これらの結果は試料Ｂの要素中の炭
酸二ナトリウムによつてPH調節が改善されたこと
を証明する。

【表】 Ｂ部 前記のＡ部に記載した要素を更に、要素の形成
直後（新しい）及び25℃（78〓）及び相対湿度50
％で２週間保存した後に、基質安定性について評
価した。これらの保存試験の背景密度の結果を第
表に示すが、これは試料Ｂ中の炭酸塩緩衝剤の
存在が、通常時間の経過と共に起こるより基質の
不安定さを著しく増加することを証明する。約
10μの水又はゼロレベル検定液、即ち熱処理し
て酵素を含まないようにした検定液で要素にスポ
ツトをつけることによつて背景密度を得た。この
場合、常用の分光光度計を使用して、スポツトを
付けた要素400nｍでの吸光度を読み取ることに
よつて密度を測定した。

【表】 Ｃ部 次に、炭酸ナトリウム緩衝剤及び基質が分離さ
れている要素の基質安定性が、これらの試薬が分
離されていない要素に比べて改良されていること
を示す。 それぞれ下記の構造及び組成を有する２つの乾
式分析要素を製造した。 ｇ／m² 試薬／ 硫酸バリウム 108 拡散 酢酸セルロース 8.5 層 ポリウレタン １ ノニオン界面活性剤 2.15 ｐ−ニトロフエニルホスフエートトリス
塩 2.4 トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン 4.8 下塗 ポリ（ｎ−イソプロピルアクリルアミ
ド）層 0.4 ゲル ゼラチン 1.08 パツド 界面活性剤10G 0.1 ビスビニルスルホニルメチルエーテル硬
化剤 0.1 試薬 ゼラチン 20 層 アルカノールXC 0.4 酢酸マグネシウム 0.03 炭酸二ナトリウム 4.3 ポリ（エチレンテレフタレート）支持体 各要素における試薬／拡散層の表面PHを、下記
の第表に挙げる化合物で10.15に調節した。支
持体に隣接する試薬層のPHを同様にHClを用いて
10.1に調節した。 要素を形成した直後に（新しい）、例１のＢ部
に記載した操作によつて背景密度を測定した。新
しい要素の背景密度を下記の第表に挙げる。次
に、要素を25℃（78〓）で相対湿度15％で16週間
まで貯蔵し、背景密度の測定を定期的に行つた。
これらの測定の結果を図面に示す。図面のデータ
は、炭酸ナトリウムを使用してアルカリホスフア
ターゼ用基質（ｐ−ニトロフエニルホスフエート
トリス塩）を含む層のPHを調節する場合に、その
要素の背景密度が炭酸ナトリウムによつて起こる
基質の非酵素加水分解により急速に増加すること
を示す。PHを水酸化リチウム及び炭酸塩緩衝剤で
調節した要素を基質から分離して保存したが、長
い保存時間にわたつて比較的に一定した背景密度
を示すことによつて証明されるように、前記のよ
うな基質の加水分解を示さない。対照要素の背景
密度は、２週間後に測定装置の限界に達した。

【表】 例２……アルカリホスフアターゼ測定用乾式分析
要素 本発明により下記の構造及び組成を有する乾式
分析要素を数個製造した。被覆の間、水酸化リチ
ウムを用いて試薬層のPHを8.5に調節した。 ｇ／m² 試薬／ 硫酸バリウム 108 拡散 酢酸セルロース 8.6 層 ポリウレタン １ ノニオン界面活性剤 1.3 硫酸マグネシウム 15 ２−アミノ−２−メチル−１−プロパノ
ール １ 無水炭酸ナトリウム 4.3 下塗層 ポリ（ビニルピロリドン） 1.08 試薬層 ゼラチン 5.4 ビスビニルスルホニルメチルエーテル硬
化剤 0.5 アルカノールXC 0.06 ｐ−ニトロフエニルホスフエートトリス
塩 0.27 ポリ（エチレンテレフタレート）支持体 これらの要素を種々の条件下に貯蔵し、要素の
形成直後（新しい）及び２週間及び４週間保存後
に背景密度を測定した。下記の第表に示した結
果は、これらの要素が種々の保存条件にさらした
後４週間にわたつて安定であることを証明する。

【表】 発明の効果 本発明の乾式要素は、長期間にわたつてこの分
析に対する最適PH範囲（即ち８〜12）において優
れたPH調節を示す。更に、このPH調節は、基質の
不安定によるアルカリホスフアターゼに対する要
素の感度を犠牲にすることなく達成される。本発
明の要素はむしろ、改善された基質安定性を有
し、酵素活性を測定する能力を著しく失うことな
く、長期間貯蔵することができる。

【図面の簡単な説明】

図面は、本発明の要素及び本発明に属しない対
照要素に関する背景密度の経時変化図である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ アルカリホスフアターゼ用基質及び緩衝剤を
   含む、水性液体中のアルカリホスフアターゼ測定
   用乾式分析要素において、液体接触状態の第一及
   び第二の被覆層を有し、前記第一の試薬被覆層が
   アルカリホスフアターゼ用基質を含み、前記第二
   の試薬被覆層が緩衝剤を含み、前記緩衝剤が約９
   〜約11.5のpKaを有するアルカリ金属塩又はアン
   モニウム塩であることを特徴とするアルカリホス
   フアターゼ分析用乾式分析要素。